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Resumos de Gentica Molecular

ndice
cido desoxirribonucleico .................................................................................................... 1
Cdigo gentico ................................................................................................................... 7
Replicao do DNA ............................................................................................................. 9
Transcrio ....................................................................................................................... 16
Tipos de RNAs e processamento de RNAs ........................................................................... 20
Traduo e sntese proteica ............................................................................................... 26
Recombinao Gentica .................................................................................................... 31
Mapeamento .................................................................................................................... 37
Gentica de Bactrias ........................................................................................................ 39
Gentica de Fagos.............................................................................................................. 44
Vrus ................................................................................................................................. 46
Mutaes do DNA .............................................................................................................. 63
Mecanismos de reparao ................................................................................................. 69
Tcnicas de DNA recombinante .......................................................................................... 78
Aplicao das tcnicas de DNA recombinante ..................................................................... 96
Regulao da expresso gentica em Procariotas ............................................................. 102
Regulao da expresso gentica em Eucariotas ............................................................... 111
Regulao do ciclo celular ................................................................................................ 120
Mecanismos de induo do cancro ................................................................................... 129

1) cido desoxirribonucleico

Genes:
Elementos biolgicos constitudos por DNA;
Unidade de informao gentica;
Segmento de DNA com regies codificantes exes e regies no codificantes
intres;
Contm regies anteriores montante (5) e regies posteriores jusante (3);
Regio promotora (onde se liga a RNA polimerase) com sequncias consenso;
Local de inicio de transcrio +1

Eucariontes:
Vrios cromossomas, pares de cromossomas homlogos Diploidia;
Material gentico armazenado no ncleo, envolvido por uma membrana;
Genes com intres e exes formao de hnRNA (sofre processamento: splicing,
capping e poli-adenilao);
Cromossomas no estado de condensao tm diferentes regies (telmero,
cetrmero, cinetocoro).


2
Procariontes:
Tm um nico cromossoma (haploidia) circular cromossoma bacteriano;
No tm compartimentos;
No tm ncleo nem membrana nuclear, mas sim um nucleide;
No se forma o hnRNA;
RNA sem intres.

Genoma: material gentico de um conjunto de cromossomas de uma dada espcie.

Polmeros de DNA Eucromatina (genes activos) menos compactada
Heterocromatina Facultativa (genes inactivos) crom. X
Constitutiva (genes activos) seq.
Cromatina repetidas do centrmero
e do telmero
Protenas Histnicas (mais carcter bsico)
No histnicas (ex.: RNA polimerase)

As histonas esto presentes em grandes quantidades nas clulas de maneira que a sua massa
total de cromatina quase igual do DNA. So responsveis pelo 1 e mais bsico nvel de
organizao cromossmica, o nucleossoma. Este contm um cerne de protenas constitudo
por oito molculas histnicas. A parte central do nucleossoma libertada da cromatina pela
digesto do DNA-linker com uma nuclease, s degrada o DNA exposto.

A heterocromatina uma regio do cromossoma que permanece anormalmente condensada e
transcricionalmente inactiva durante a interfase. Funes da heterocromatina:
1. Participao no emparelhamento;
2. Estabilizao de certas regies cromossmicas;
3. Proteco da eucromatina;
4. A heterocromatina facultativa est associada manuteno da estrutura e organizao
do cromossoma.

A eucromatina outra regio do cromossoma que, durante a interfase, cora difusamente; a
cromatina normal, menos condensada.
Alelos:
Formas alternativas do mesmo gene responsveis pela expresso de uma
caracterstica particular.
Alelo dominante: caracterstica expressa mesmo em heterozigotos.
Alelo recessivo: caracterstica s expressa em homozigotos recessivos.
Alelos co-dominantes: o fentipo do heterozigoto (Aa) diferente do fentipo AA e aa.

Cromatideos irmos: duas cpias de um cromossoma replicado durante a fase S da interfase,
separam-se durante a mitose.

Cromossomas homlogos: emparelham durante a meiose correspondem a cromossomas de
espcies diferentes que mantm o mesmo n de genes durante a evoluo.

As clulas germinativas so haplides e as clulas somticas so diplides.

Caritipo: n, tamanho e forma do conjunto de cromossomas metafsicos de uma clula
eucaritica.

Locus: local do gene no genoma.

3
Griffit transformao
S forma lisa, ou seja, com cpsula polissacaridica;
R forma rugosa, sem cpsula, logo no patognica.
Ratos + cocos S morre
Ratos + cocos R sobrevive
Ratos + cocos S mortos sobrevive
Ratos + cocos S mortos + cocos R morre

Ao aquecer a estirpe S, as bactrias morrem, libertando o seu DNA que ser captado pelas
bactrias R. Assim o DNA das S incorporado no DNA das R e estas adquirem a capacidade
(genes) de sintetizar a cpsula proteica que as torna patognicas. Logo, foi comprovado que o
DNA o responsvel pela transformao e no os outros constituintes.
Alfred Hershey e Marta Chase
Cpsula, constituda por protenas, marcada com enxofre radioactivo
DNA marcado com fsforo radioactivo
Fago infecta a bactria e injecta-lhe o seu DNA, assim o enxofre radioactivo encontra-
se fora da bactria e o fsforo radioactivo dentro. Ocorre o ciclo lisognico e o ciclo
ltico e verifica-se que nem todos tm fsforo radioactivo, pois a replicao
semiconservativa demonstra que o material gentico o DNA e no as protenas.

Estrutura do DNA e do RNA
Nucletido = base azotada + pentose + 1 grupo fosfato
Nuclesido=base azotada + pentose (indicar o n P: adenina = adenosina-monofosfato)

DNA RNA
Bases Pricas (duplo anel) A, G A, G
Pirimidicas (anel simples) T, C U, C
Pentose Desoxirribose Ribose
Grupo fosfato PO
4
3-
PO
4
3-


Na cadeia de polinucletidos, a ligao pentose-base faz-se entre o C1 da pentose e o
N1 da pirimidina ou o N9 da purina. A ligao pentose-grupo fosfato, faz-se entre o
PO
4
3-
em C5 da pentose e o C3 da pentose seguinte. Isto ocorre no sentido 5-3 pela
DNA ligase.
Os nucletidos formados so trifosfatados e depois d-se a hidrlise dos fosfatos e ,
ficando monofosfatado e adiciona-se um OH a 3.
T=A e CG o emparelhamento complementar das bases.
A dupla hlice do DNA constituda por duas cadeias anti-paralelas, sendo a ranhura
maior de 22 A
o
e a ranhura menor de 12 A
o
e o comprimento de uma volta completa
de 34 A
o
. A sua estabilidade conferida por pontes de hidrognio e interaces
hidrofbicas.

Conformaes do DNA:
A DNA: mais grosso que o B DNA pois possui um maior n de pares de bases por volta.
Enrolamento positivo (sentido dos ponteiros do relgio).
B DNA: forma mais comum. O enrolamento positivo e possui 10bp por volta.
C DNA: s existe in vitro DNA resultante da actuao da transcriptase reversa.
Z DNA: enrolamento negativo. A forma B DNA pode ser convertida em Z DNA por
metilao das citosinas, em ambas as cadeias:
Fractura na cadeia, ao lado da citosina a metilar;
Ligao do metilo pela DNA metilase;
Espaos fechados pela DNA ligase.
do fago
4
Tautomerismo:
Por isomerizao amino imino
ceto enol
Adenina = Timina (ligao amino) Adenina tautomrica = citosina (ligao imino)


Guanina Citosina (ligao ceto) Guanina tautomrica Timina (ligao enol)
Origina emparelhamento incorrecto e pode ser responsvel por mutaes
espontneas.

Sequncias invertidas / Palindromas:
Sequncia de DNA de cadeia dupla que a mesma quando as duas cadeias so lidas
numa direco definida.
A maioria das sequncias para locais de restrio so palindromas.
Os palindromas so responsveis pela formao de estruturas secundrias
(condicionam a expresso dos genes) no DNA e no RNA.
Estrutura cruciforme (DNA): as sequncias inversas so simtricas e so
suportadas por uma sequncia no inversa. Forma-se uma estrutura
cruciforme, constituda por duas cadeias em alfinete, em que o eixo de
simetria do palindroma no emparelha.
Estrutura em alfinete (RNA): a cabea corresponde regio que emparelha
(eixo de simetria da sequncia que separa as sequncias invertidas). Forma-se
uma dupla hlice correspondente a emparelhamento das bases
complementares do palindroma.
Loop: forma-se do mesmo modo que a estrutura em alfinete, s que na
primeira temos 5-10bp na cabea e no loop so 50bp.

Desnaturao e renaturao do DNA:

As foras no covalentes que estabilizam a dupla hlice podem ser quebradas por aumento da
temperatura (Tm) ou aumento da *+ salina desnaturao.
O rastreio do aumento de temperatura e passagem do Tm pode ser feito pela medio
simultnea da absorvncia a 280nm Tm corresponde ao ponto de inflexo da curva.
Quanto maior o teor em G e C maior o Tm, pois devido s triplas ligaes mais difcil
quebrar a dupla hlice.
Agentes desnaturantes: calor (>94C), aumento da [] salina, amnia, ureia, formamida
(os dois ltimos baixam Tm e a formamida quebra as pontes de Hidrognio evitando
situaes drsticas).
Efeito hipocrmico: resultante da interaco entre os electres das bases empilhadas
na dupla hlice. Desnaturao aumento da hipercromicidade.
Para o DNA se manter no estado desnaturado deve ser conservado em gelo.

Sob condies especiais, pode voltar conformao nativa renaturao.

Compactao do DNA:
DNA bacteriano (regio do nucleide): nas bactrias, o DNA encontra-se enrolado a
protenas que so semelhantes s histonas (protenas bsicas que neutralizam o
carcter cido dos eucariontes) dos eucariontes formam-se laos (loops) (estrutura
nucleide). Essas protenas so: Hu, H, IFH, H1, HPL1 e P.
DNA eucarionte (nucleossoma) cromatina: nos eucariontes, a estrutura bsica da
compactao do DNA o nucleossoma, formado por um octmero de histonas (2H
2
A,
2H
2
B, 2H
3
e 2H
4
) volta das quais o DNA se enrola. A estrutura mantida pela
histona H
1
.
Mudana
tautomrica
5
Das protenas no histnicas destacam-se a nucleoplasmina, protena N1, RNA
polimerase e protenas de elevada mobilidade.
Atravs da digesto com endonucleases sabemos que:
DNA linker: possui 8-114bp (DNA entre dois nucleossomas)
DNA core: possui 146bp (DNA que se enrola volta do octmero)

Nucleossoma: 1 nvel de compactao (200bp de DNA enrolado em torno de um octmero de
histonas + H
1
e protenas no histnicas, DNA core e DNA linker.
Fibra de 30nm: 2 nvel de compactao, estrutura helicoidal com 6 nucleossomas por volta.

Ansas: 3 nvel de compactao, enrolamento da fibra de 30nm 700nm crom. metafsico.

Cromossoma metafsico: dois cromatideos irmos, centrmero (heterocromatina), cinetocoro,
telmeros (heterocromatina constitutiva).

Existe um cinetocoro por cromatdeo que responsvel pela placa equatorial microtubulos
cinetocorianos.

O centrmero, que mantm os dois cromatdeos irmos unidos, a zona mais apertada do
cromossoma e rico em DNA satlite pequenas sequncias repetidas ricas em T e A,
estando relacionado com a estrutura e organizao do DNA.


Bandeamento dos cromossomas
Permite identificar e localizar os diferentes genes ao longo do cromossoma;
Utiliza corantes gerais e especficos (ex.: Giemsa);
Brao mais pequeno: P
Brao maior: Q
O sistema de numerao das bandas permite localizar um certo segmento (ex.: p13,
brao p, seco 1 e subseco 3).

Tipos de bandas:
Banda Q (quinacrina): rica em A e T, sequncias repetidas com poucos genes de mRNA;
Replica no final da fase S; podem, tambm, chamar-se bandas G (corante Giemsa).
Bandas C: DNA altamente repetitivo; marcam o centrmero. Replicam mesmo no final
da fase S (Giemsa).
Bandas R: rica em G e C. Contm muitos genes de mRNA, no repetitivo e replica no
inicio da fase S.

Tipos de DNA:
Sequncias nicas: genes que so expressos e que esto contidos na eucromatina;
Sequncias muito repetitivas:
Constitudas por sequncias simples de DNA DNA satlite que tem
coeficientes de sedimentao diferentes do DNA normal e rico em A e T.
O DNA satlite pode ser separado do restante DNA atravs de um gradiente de
cloreto de csio, por centrifugao.
Localizao preferencial no centrmero e no telmero heterocromatina
constitutiva.
Formadas por unidades de 5-10bp que se repetem e podem atingir 20-200bp.
Tm como funo intervir na organizao e estrutura do cromossoma.


Mamferos
Cada mononucleossoma
(11nm dimetro e 6nm
de altura) possui 200bp
20-40% DNA satlite;
Dividido em famlias (9, 27,
117, 234bp);
Formam uma hierarquia de
unidades de repetio.
6

Drosophila




Sequncias moderadamente repetitivas: elementos de DNA mveis.
Elementos de transposes (ET): eucariontes;
Transposes ou sequncias de insero (IS) bactrias movimentam-se
atravs de um intermedirio de DNA;
Retrotransposes ou retroposes vrus movimentam-se atravs de um
intermedirio de RNA que depois inserido na forma de DNA de cadeia
dupla.

Transposio mediada por DNA:
a) Elementos de transposio (ET) transposes eucariotas
Sequncias de DNA que tm a capacidade de saltar ao longo do genoma (ex.:
ET do cromossoma I que salta para o cromossoma II);
Os ET possuem nas extremidades sequncias invertidas que reconhecem uma
sequncia chave no DNA-alvo. Quando se inserem nele, duplicam-lhe a
sequncia chave e inserem-se no meio, tornando o DNA-alvo maior;
No podem viver fora do genoma, so parasitas moleculares (selfish DNA);
Responsveis por arranjos no genoma;
O salto no genoma catalisado pela transposase;
Na Drosophila, o ET mais comum o elemento P;
Na levedura, o ET mais comum o elemento Ty1;
Nos eucariotas (milho) aparecem os elementos Ac e Ds.

b) Transposes bacterianos
Elementos de transposio (ET) das bactrias;
Possuem elementos IS:
Cerca de 50bp nas repeties invertidas a ladear a transposase;
Fazem a exciso ou copiam o DNA e a insero no local-alvo;
IS1 e IS10.
Contm genes que conferem resistncia a antibiticos entre os elementos Is;
Salto no genoma catalisado pela transposase.

c) Retrotransposes ou retroposes vricos transposio mediada por RNA
So derivados de retrovrus;
So capazes de inserir cpias de DNA (provrus) a partir de intermedirios de
um genoma de RNA nico no cromossoma alvo;
Forma-se um RNA intermedirio complementar do DNA a inserir, por aco da
transcriptase reversa o RNA passa a DNA de cadeia dupla e depois este insere-
se no DNA da clula hospedeira.

Retrotransposes vricos
Tm sequncias LTR (long terminal repeats) nas extremidades ();
Cerca de 250-600bp nas sequncias repetidas directas (LTR) que ladeiam
a transcriptase reversa, integrase e protenas retrovricas tipo Gag
protease;
Contribuem com cerca de 4% para a constituio do DNA humano;
40% DNA satlite;
Unidades de repito de
7-8bp de vrios tipos: I,
II, III e crptico.
7
Saltam via intermedirio de RNA feito a partir da RNA polimerase II que
se liga ao promotor do LTR esquerdo e inserem-se no local alvo sob a
forma de DNA de cadeia dupla (integrao) via transciptase reversa e
DNA polimerase.

Retrotransposes no vricos (LINES e SINES)
Mobilizam-se na forma de RNA;
No possuem sequncias LTR;
Repetem-se vrias vezes no genoma;
No esto agregados em Adn satlite;
Comprimento varivel com regies ricas em A e T que codificam para a
transcriptase reversa;
Transcrio para RNA a partir de um promotor interno;
Transcriptase reversa forma DNA de cadeia dupla e insere-o no local alvo;
Elementos F e G (Drosophila), sequncia Alu (humanos), elementos LINES
e SINES (mamferos).

LINES (long interspersed elements)
Formam-se dos transcriptos da RNA polimerase II;
Cerca de 6-7kbp;
Podem ter ORF, mas no tm promotor;
So homlogos da transcriptase reversa;
Podem existir entre 20000-40000 cpias por genoma
Elemento mais comum: L1 LINE
600000 cpias no genoma humano;
Faz a transposio atravs de um intermedirio de RNA;
Tem duas ORFs: ORF
1
, RNA binding protein, ORF
2
, semelhante a uma
transciptase reversa;
Tem regies ricas em A e T, contribuindo cerca de 15% para o DNA humano total;
Um elemento L1 intacto assegura a transposio dos restantes.

SINES (short interspersed elements)
Originam-se a partir de transcriptos da RNA polimerase III;
Sequncias de 300bp;
As famlias mais caractersticas so:
B1 no hamster;
Alu no genoma humano: 10% genoma total; muitos intres e sequncias
adjacentes a genes que tm sequncias Alu; so reconhecidas pela enzima de
restrio Alu I.

2) Cdigo gentico

Decifrado no sentido 5-3;
Codo: sequncia de trs nucletidos do mRNA;
Quadro de leitura (reading frame): tripla possibilidade de leitura da sequncia de
nucletidos em sries de tripletos;
ORF (open reading frame) quadro de leitura aberto: constitudo por tripletos que
representam um aminocido;
URF (unidentified reading frame): ORF para o qual nenhuma protena foi ainda
identficada;
Polinucletido fosforilase: catalisa a sntese de ligaes fosfodister 3-5
internucleotidicas e conduz formao de RNA, mesmo na ausncia de um molde.
8

Caractersticas do cdigo gentico:
No tem vrgulas (lido na totalidade, sem interrupes);
universal, com excepo nas mitocndrias;
degenerado (h vrios codes para um mesmo aminocido);
Codes de iniciao AUG (metionina);
Codes de terminao UGA, UAG, UAA;
64 codes = 444 nucletidos (61 codificam aminocidos e 3 codes de terminao);
8 famlias de codes, em que os dois primeiros nucletidos so iguais e o terceiro no
tem significado na especificao do aminocido: CU, GU, UC, CC, AC, GC, CG, GG;
7 pares de codes que representam o mesmo aminocido independentemente do
terceiro nucletido poder ser qualquer uma das pirimidinas;
5 pares de codes cujo significado determinado pela presena de uma base
particular na terceira posio: AUG, UGG, UGA;
C e U nunca tm significado quando ocupam a terceira posio;
Pirimidinas na segunda posio originam aminocidos hidrofbicos;
Purinas na segunda posio originam aminocidos polares.

Conceito de wobble:
Determina que o emparelhamento das bases entre o codo e o anticodo seguem as
mesmas regras de emparelhamento A=T e GC, excepto em relao ao terceiro
nucletido do codo / primeiro do anticodo.
Reconhecimento de um nico codo pelo anti-codo s se verifica quando a terceira
base do codo um G ou U.
A iosina na primeira posio do anti-codo reconhece C, A e U.

1 base do anti-codo C A G U I
3 base do codo reconhecida G U C, U A, G C, A, U
O conceito de wobble determina o aparecimento de 32tRNAs.


Mitocndria

Nela ocorre a fosforilao oxidativa e a formao de ATP;
DNA genmico da mitocndria (mtDNA) de cadeia dupla com 16569bp:
Circular
Pouco DNA no codificante, poucos intres
Genes fortemente empacotados

Alteraes no cdigo gentico da mitocndria
Codo UGA: codifica para o triptofano, ao contrrio, no DNA genmico um codo
STOP;
Metionina iniciadora codifica por: AUG, AUA, AUU e AUC;
Metionina interna codificada por: AUG e AUA;
Codes de terminao: UAA, UAG, AGA e AGG (os dois ltimos, no DNA genmico,
codificam para a arginina);
Existem 22 tRNAs;
Todos os tRNAs tm na posio 5 (1 posio de wobble) um resduo de U que pode
emparelhar com qualquer um dos nucletidos possveis para a 3 posio do codo.


Posio de wobble
9
GATC
CTAG

Alteraes na sntese e funo do mRNA
As duas cadeias do mtDNA so transcritas a partir de promotores localizados prximo
do local de origem e os mRNAs encontram-se separados por sequncias de tRNAs.
Os codes de iniciao esto muito prximos da extremidade 5 do mRNA processado
e no emparelham com o terminal 3 da subunidade menor do rRNA.
Por vezes, no apresentam codes de terminao, sendo muitas vezes o terminal do
mRNA clivado pelo tRNA adjacente e a adio da polia feita enzimaticamente, criando-
se, entre eles, um codo de terminao UAA.

Mutaes no DNA mitocondrial
Neuropatia hereditria ptica de Lebers: conduz degenerescncia do nervo ptico
cegueira. Mutao sem sentido (missense) no gene que codifica para a subunidade
4 da NADH-CoQ redutase.
Sndroma de Kearns-Sayre: deleces grandes no mtDNA defeitos oculares,
alteraes no batimento cardaco e degenerescncia do SNC.


3) Replicao do DNA

DNA possui toda a informao gentica;
Tem capacidade de se autoreplicar;
Sintetiza protenas via intermedirio mRNA;
Para a sntese de cDNA necessrio um primer;
Transcriptase reversa tambm sintetiza a segunda cadeia do cDNA;
cDNA no possui intres.

Ocorre na fase S do ciclo celular tambm h sntese de histonas;
A replicao do DNA semi-conservativa cada nova dupla hlice possui uma cadeia
do DNA que lhe deu origem, servindo de molde.
Replico: unidade do genoma que contm o local para o inicio da replicao origem
de replicao (Ori), rico em A e T (como se ligam por duplas ligaes mais fcil de
separar as duas cadeias do que se a Ori fosse rica em C e G). Nas bactrias s existe um
replico. As ARS (autonomously replicating sequences) funcionam como origens nas
leveduras, igualmente ricas em A e T.
Replicao unidireccional: a partir da Ori, a replicao feita apenas num sentido
uma forquilha de replicao.
Replicao bidireccional: a partir da Ori, a replicao d-se em dois sentidos (opostos)
duas forquilhas de replicao.

Bactrias e marcador de replicao
Bactrias tm um nico replico uma Ori;
Replicao mais rpida:
S tm um Ori;
S tm um cromossoma.

Sequncia (palindroma) tem que ter as duas adeninas metiladas, pela Dam
metilase, para que se active o replico (Ori);
O DNA resultante da replicao hemimetilado a cadeia me tem a adenina
metilada mas a cadeia-filha no. Para haver nova replicao, a Dam metilase tem de
metilar a Adenina da sequncia do replico da cadeia-filha.


10
Eucariontes e replicao
Existem vrios replices vrias Ori que podem ser activadas espontaneamente;
Replicao bidireccional;
Forquilhas de replicao avanam at que se fundem umas com as outras;
No h metilao das cadeias com activador da origem.

A sntese do DNA descontnua:
As duas cadeias so sintetizadas no sentido 5-3 formando-se dois tipos de cadeias:
Cadeia leading ou condutora: sntese directa e contnua no sentido 5-3. Necessita
apenas de um primer;
Cadeia lagging ou lenta: sntese descontnua em fragmentos de okasaki na direco
5-3. Exige vrios primers, um para cada fragmento de okasaki.
Em cada forquilha de replicao h os dois tipos de cadeias.

Protenas e enzimas requeridas para a replicao de DNA em PROCARIOTAS:
Origem de replicao activa sequncias GATC metilada;
Helicases II e III (sentido 5-3) e Protena Rep (sentido 3-5) associada cadeia lenta
separam as duas cadeias de DNA materno por quebra das pontes de hidrognio entre
as bases, requerendo hidrlise do ATP.
Protenas que se ligam ao DNA: SSB (liga-se ao DNA de cadeia simples, estabilizando-
o), DnaA e DnaC.
Primer ou iniciador providencia um grupo 3-OH livre para se ligarem os
nucletidos.
Primase (enzima que sintetiza o primer; uma RNA polimerase) e protenas
associadas: DnaB, DnaC, DnaT, priA, priB e priC.
DNA polimerases I, II, III.
Ribonuclease H ou Rnase H remove os primers.
Topoisomerase I (corta s uma cadeia) e Topoisomerase II (corta as duas cadeias e
necessita de ATP) cortam os superenrolamentos, mas tambm os podem criar.
DNA ligase ligao dos nucletidos e dos fragmentos de okasaki.

Primossoma primase + DnaB + DnaC + DnaT + priA + priB + priC + helicase.
Replissoma primossoma + DNA polimerase.

DNA polimerase: funes nos PROCARIONTES
DNA polimerase I DNA polimerase II DNA polimerase III
Elongao 5-3 Sim Sim Sim
Exonuclease 3-5 Sim Sim Sim
Exonuclease 5-3 Sim No No

Na elongao 5-3, adicionam os nucletidos na forma trifosfatada, libertando-se dois grupos
fosfatos quando se d a ligao ligao ao 3-OH livre.
As DNA polimerases com funo exonuclesica 3-5 verificam os nucletidos que adicionam e
se um no for emparelhado correctamente ela volta atrs (sentido 3-5) e age como uma
exonuclease,removendo o nucletido e substituindo-o pelo correcto processos simultneos.

DNA polimerase I e enzima de Klenow:
a nica DNA polimerase procariota com actividade exonuclesica 5-3;
A sua parte C-terminal, fragmento maior, designa-se klenow e realiza a elongao;
A sua parte N-terminal possui actividade exonuclesica 3-5;
11
Outro fragmento desta enzima que possui actividade exonuclesica 5-3 que
permite remover pequenos grupos de nucletidos de cada vez.


Actividade coordenada com actividade polimerase (fragmento de klenow) a
DNA polimerase I tem a capacidade de iniciar a replicao in vitro com o corte no
DNA

Ligao fosfodister quebrada 3-OH livre e 5-P livre a DNA polimerase
remove os nucletidos que estavam a seguir ao corte (5-3) e insere novos
nucletidos, em sintonia com o fragmento de klenow


O fragmento de klenow permite inserir nucletidos radioactivos Nick translation

Complexo de iniciao de PROCARIOTAS (sintetiza a cadeia lenta e a condutora):
Requer o reconhecimento de uma sequncia de 245bp existentes na Ori rico em A e T;
Primer;
DNA polimerase;
Girase (topoisomerase II) / DNAgirase;
Primossoma.

Sntese de DNA
1. Desnaturao da dupla hlice pela aco das DnaB e DnaC, com hidrlise de ATP,
formando duas forquilhas de replicao, s quais se vo ligar as SSB;
2. Formao do primer nas cadeias leading e lagging pela primase;
3. Ligao de topoisomerases para remover a tenso dos superenrolamentos;
4. DNA polimerase I: reparao de DNA, remove os primers de RNA nos fragmentos de
Okazaki e substitui-os por DNA, por nick translation. DNA polimerase II: reparao de
DNA, funo no muito bem esclarecida. DNA polimerase III: Sintetiza cadeias de DNA.
Faz parte dum grande complexo, o holoenzima da DNA polymerase III. Uma das sub-
unidades deste holoenzima a subunidade , que mantm a polimerase III associada
ao DNA;
5. As topoisomerases libertam-se e a Rnase H e a DNA polimerase I removem o primer;
6. Libertam-se as SSB;
7. DNA ligase promove a ligao dos nucletidos dos fragmentos, necessitando de ATP.

Topoisomerases
Topoisomerases tipo I: enzimas que hidrolisam uma cadeia de DNA.
Topoisomerase I e III
Topoisomerases tipo II: enzimas que hidrolisam duas cadeias de DNA.
Topoisomerase II / girase

A topoisomerase I introduz um nick no DNA, permitindo a rotao duma cadeia em torno da
outra e aliviando a fora de toro que se acumula frente da forquilha replicativa. O nick
transitrio, sendo religado imediatamente aps a topoisomerase I ter libertado a outra cadeia.

Algumas topoisomerases s reconhecem super-enrolamentos negativos, outras s
reconhecem superenrolamentos positivos.

As topoisomerases de tipo II (que incluem a DNA girase de E. coli) levam a cabo o mesmo tipo
de reaces, mas hidrolisam as duas cadeias, tambm transitoriamente.
12
As topoisomerases tambm podem levar a cabo a reaco inversa, ou seja, introduzir mais
voltas na hlice, causando o seu super-enrolamento.

As topoisomerases de Eucariotas so semelhantes, mas reconhecem enrolamentos positivos
ou negativos. Ligam-se covalentemente cadeia de DNA que hidrolisam.

As topoisomerases separam os cromossomas no final da replicao.

Decatenizao remoo de laos no DNA; Catenizao induo de laos no DNA.


Protenas e enzimas requeridas para a replicao de DNA em EUCARIOTAS:
Complexo de pr-replicao (pre-RC);
Helicases antignio T;
SSB, PCNA (desloca com a DNA polimerase , permitindo a ligao da DNA polimerase
na cadeia contnua), RFC (replication factor C, estimula a actividade da DNA
polimerase e actua em conjunto com o PCNA) e RPA, uma SSB, liga-se ao molde de
cadeia simples que foi aberto pela progresso da forquilha de replicao;
Primer;
Primase;
Exonuclease MF1 remove o primer Rnase H;
DNA polimerases , , , e ;
DNA ligase;
Topoisomerases I e II;
Telomerase.

Reunio e activao do complexo de pr-replicao (pr-RC):
ORC (Origin Replication Complex): complexo que reconhece o local onde est situada a
Ori, determinando onde se inicia a replicao.
Factores de licenciamento: permitem que se inicie a replicao. Intervm as seguintes
protenas:
ORC1 e ORC2;
Cdc6 e RLF-B (replication licensing factor B).
As Mcm
2-7
(com actividade de helicase) funcionam em conjunto com a Cdc6 formando
o pre-RC ORC1 + Cdc6 + RLF-B + Mcm
2-7


As cinases ciclinaE-Cdk2 e ciclina A-Cdk2 fosforilam componentes dos complexos pr-
replicao o que desencadeia o incio da replicao do DNA e a transio definitiva
G1/S.

Aps a fosforilao dos complexos pr-replicao, a protena CDC6 liberta-se do
complexo de iniciao e transportada do ncleo para o citoplasma.

A sada da protena CDC6 parece estar relacionada com o facto de a replicao ocorrer
apenas uma vez para cada origem de replicao.

Uma vez na fase S, o complexo ciclina A-Cdk2 fosforila o factor de transcrio EF2 e
inibe a aco impedindo a sua ligao ao DNA.

A progresso da fase G2 para a fase M (transio G2/M) controlada pelo complexo
molecular ciclina B-Cdk1 (Cdc2) tambm designado factor promotor da maturao
(MPF) e factor promotor da mitose.
13
Este complexo atravs da fosforilao de vrios substratos assegura a transio fase
G2/M.

Nota: Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) uma protena que actua como um factor de
processamento para a DNA polimerase em clulas eucariticas. Ela actua cercando o DNA,
criando, assim, uma ligao topolgica ao genoma.

Telomerase
Enzima que permite que a molcula de DNA no v encurtando (nas clulas
germinativas);
Permite a replicao das zonas muito repetitivas do telmero;
A telomerase posiciona-se na cadeia de DNA protuberante por emparelhamento de
bases com a sua molcula de RNA ribozima. Assim, a telomerase pode ser
considerada uma transcriptase reversa. Vai adicionando as bases de acordo com o
molde. O ciclo recomea de novo aps a adio duma unidade completa (GGGTTG);
Quanto mais velhas forem as clulas, maior a quantidade de telomerase necessria,
pois os cromossomas vo encurtando a cada diviso celular.

Defeitos na replicao e reparao do DNA
Sndrome de Werners causada por mutaes na DNA polimerase .
Ataxia telangiectasia portadores tm aumentado o risco de cancro na mama; risco
aumenta com exposio a raios X; protena ATM afectada, uma cinase activada pela
quebra da cadeia dupla.
Sndroma de Cockayne defeito no mecanismo de reparao de DNA durante a
transcrio; no aumenta a predisposio para o cancro; sensibilidade luz solar.
Sndroma de Bloom causado por mutaes num gene da helicase; risco de cancro
aumenta com a exposio a raios X; sensibilidade luz solar.
Pigmentos Xenoderma (Xenodermia) causada por mutaes nos genes envolvidos
na reparao de nucletidos removidos por exciso; aumento da propenso para
cancros de pele induzidos pela luz solar e outros tipos de cancro com os melanomas.
Anemia de Fanconi aumenta a propenso para o cancro com os raios X; o reparp do
cruzamento entre cadeias de DNA est afectado; sensibilidade luz solar.

Tipos de replicao

1. Replicao tipo olho: ocorre nas bactrias para DNA de cadeia dupla
circular, sendo uma replicao bidireccional.
O complexo de iniciao requer o reconhecimento de uma sequncia de
245bp rica em A e T, tendo 3 elementos de 13mer e 4 elementos de 9 mer,
Propriedades
Localizao Ncleo Ncleo Mitocndria Ncleo Ncleo
Funo Sntese da
cadeia lenta e
do primer
Reparao Reparao e
sntese
Sntese da
cadeia
condutora
Reparao
5-3
polimerase
Sim Sim Sim Sim Sim
3-5
exonuxlease
No No Sim Sim Sim
5-3
exonuclease
No No No No No
Associao com
PCNA
No No No Sim No
14
que existe no local Ori, sendo este nico.
As estruturas de 9mer formam um loop em torno das protenas DNAa, que obrigam a
parte da sequncia que possui as 13mer a separar as suas cadeias (toro auxiliar). A
distoro, por sua vez, d-se na zona GATC qual se iro ligar as enzimas necessrias
replicao.
A sequncia GATC tem de estar metilada, processo realizado pela DAM metilase. Na
zona de terminao existem 4 sequncias Ter (duas de cada lado da sequncia de
terminao) que so reconhecidas pelas protenas Ts que se ligam e inibem a
helicase.
A replicao termina quando as duas forquilhas de replicao se encontram na zona de
terminao.



2. Replicao em circulos rolantes: Ocorre no DNA
ribossmico de ocitos de Xenopus e em alguns
bacterifagos.
Requer um corte numa das cadeias de DNA
circular, realizados por endonucleases. Assim,
as extremidades 3OH e 5fosfatada ficam
livres. Ento ocorre deslocamento de uma das
cadeias (esta servir de molde cadeia lagging)
e a outra serve de molde cadeia condutora,
formando-se simultaneamente.
A formao da cadeia condutora induz a
ontinuao do deslocamento da cadeia que
serve de molde cadeia lenta.



3. Formas Replicativas (RFs):ocorre em
vrus de DNA de cadeia simples
(DNA+) como o M13 e o 174 e em
fagos.
O DNA vrico injectado na clula
hospedeira, como se trata de DNA(+)
tem de estar protegido, o que feito
pelas SSB, do ataque das nucleases.
Ento, forma-se a cadeia
complementar, DNA(-), por aco de
uma srie de enzimas: primase, DNA
polimerase III, DNA polimerase II,
girase e ligase, formando-se DNA de
cadeia dupla (RFI (+)(-)).
A protena A, que codificada pelo
genoma do vrus, corta o DNA no
local de origem de replicao (RFII),
permitindo a replicao de cadeias
de DNA (+) em crculos rolantes,
formando-se vrias molculas de
DNA.
Quando o DNA vrico quiser sair da
15
clula hospedeira, ligam-se as protenas Rep (helicases) que separam as duas cadeias
do RFI e sai DNA de cadeia simples juntamente com as SSB.






4. Replicao tipo D-loop: ocorre na mitocndria, portanto, para DNA de cadeia dupla
circular, constitudo pela cadeia H e a cadeia L.
O primeiro local de origem de replicao (apresenta uma salincia em forma de D) a
ser reconhecido na cadeia H. Quando a cadeia H se replicou cerca de 2/3 vai
encontrar o local Ori da cadeia L, iniciando-se a sua sntese.
Quando a replicao de ambas as cadeias termina, libertam-se duas molculas de DNA
independentes.
Portanto, existem 2 locais Ori independentes que no so simultaneamente activados;
no h cortes, ou seja, no h cadeia lagging, logo no h fragmentos de okasaki;
alteraes ou mutaes neste tipo de replicao podem conduzir a citopatias
mitocondriais.

16
4) Transcrio






































Sntese do RNA
Apenas uma das cadeias do DNA fornece a informao cadeia codificante anti-
sense.
Como a sntese do mRNA feita 5-3 usa-se a cadeia complementar da codificante
(3-5) cadeia molde cadeia sense.
A sntese catalisada pela RNA polimerase.
Em geral, iniciada por A ou G trifosfatada.

Formao de hbridos DNA-RNA
Verificar se dois RNAs so iguais ou se um RNA provm de um certo DNA:
Desnaturar o DNA e manter as cadeias separadas;
Adicionar o RNA;
Se houver complementaridade forma-se uma dupla hlice DNA/RNA hbrido
DNA/RNA
17
O RNA ou foi sintetizado a partir desse DNA ou semelhante ao RNA a partir dele
sintetizado.

Formao de hbridos RNA/RNA
Cadeia sense mRNA
Cadeia anti-sense RNA antisense
RNA antisense emparelha com o mRNA bloqueando a traduo hbrido RNA/RNA

Regulao da transcrio
Regio promotora e sequncia consenso = Promotor:
Rico em A e T;
A montante do local +1;
Permite a ligao da RNA polimerase.
Sequncia consenso:
Sequncias especificas que existem no promotor
Local de ligao da RNA polimerase.
Protenas activadoras e repressoras controlam a eficcia da ligao da RNA
polimerase aos promotores.
Topoisomerases desenrolam o DNA.

Sntese de RNA nos PROCARIOTAS

1. Pr-iniciao: reconhecimento do DNA molde
Um promotor tpico possui 3 componentes: a sequncia a 35 (5-TTGACA-3), a
sequncia a 10 (5-TATAAT-3) e o incio da transcrio.
Uma das cadeias de DNA no promotor possui os pontos de contacto para a RNA
polimerase.
Aminocidos da subunidade
70
contactam bases especficas na cadeia no
transcrita da sequncia 10 do promotor Pribnow box.

2. Iniciao da cadeia de RNA pela adio dos primeiros 2-9 ribonucletidos
A RNA polimerase de procariotas:
um grande complexo proteco, constitudo por 5 subunidades: 2 subunidades
idnticas (liga-se a seq. reguladoras), uma subunidade (forma ligaes
fosfodister), uma subunidade (liga-se a DNA sense) (constituem o core da
enzima) e uma subunidade
70
(holoenzima) (reconhece o promotor e inicia a
sntese).
Transcreve todos os tipos de RNAs: mRNA, rRNA e tRNA.
A subunidade dissocia-se facilmente da enzima. Logo aps o
reconhecimento, ficando apenas o enzima core durante as restantes fases da
transcrio.

3. Elongao da cadeia de RNA na direco 5- 3 pela adio de ribonucletidos
Para se dar a elongao da cadeia, junta-se RNA polimerase a protena NusA e
depois liga-se o factor P.

4. Terminao e libertao da polimerase e da cadeia de RNA completa
a) Terminao independente de Rho
Formam-se sequncias invertidas que emparelham e levam formao de
uma estrutura em alfinete, imediatamente aps esta existem quatro
adeninas no DNA que formam uma ligao U-A (RNA/DNA) instvel;
Liberta-se o mRNA em alfinete e a RNA polimerase.
18
b) Terminao dependente de Rho
No se formam estruturas em alfinete;
No RNA encontra-se o local Rut (Rut site) que reconhecido pela Rho que
se liga a;
O factor Rho no local Rut leva libertao da RNA polimerase e do mRNA
com hidrlise de ATP.

Footprinting de uma protena:
Esta tcnica baseia-se no facto da ligao de uma protena a uma cadeia de DNA
proteger este ltimo contra a aco de clivagem de um agente qumico ou de uma
enzima. Assim, quando uma cadeia de DNA marcada numa das extremidades sofre a
aco degradante de uma substncia qumica ou enzima de maneira controlada (as
condies da reaco so estabelecidas para que ocorra preferencialmente apenas um
ataque por molcula de DNA), uma srie de fragmentos de diversos comprimentos
gerada. Todos estes fragmentos tero uma extremidade comum e o seu nmero e
comprimento depender da especificidade de sequncia do agente utilizado na
reaco.
Por outro lado, se a ligao de uma protena a esta cadeia de DNA produzir um ou
mais pontos de proteco contra o ataque, fragmentos de uma determinada faixa de
comprimento no sero produzidos quando a reaco de clivagem for precedida por
incubao da fita de DNA com esta protena nuclear.
Quando produtos de clivagem gerados na presena e na ausncia de protena ligadora
de DNA so resolvidos lado a lado numa electroforese em condies desnaturantes,
observar-se-o falhas na linha correspondente ao DNA incubado com a protena. Estas
falhas so os footprints.

Sntese de RNA nos EUCARIOTAS

RNA polimerase I nuclolo sintetiza rRNA, excepto a
fraco 5S 18s, 5.8s e 28s;
RNA polimerase II nucleoplasma sintetiza mRNA e
snRNA (intervm no splicing);
RNA polimerase III nucleoplasma tRNA e fraco 5S do rRNA.
Regio promotora:
TATA Box, a -25 correspondente Pribnow Box (-10) nos procariotas: 5-TATAAA-3;
CAAT Box, a -80 correspondente sequncia de reconhecimento (-35) nos
procariotas: 5-GGCAATCT-3;
GC Box regies a montante e a jusante da TATA Box, ricas em G e C.

Enhacers
Os enhancers so sequncias de DNA que aumentam a afinidade da maquinaria de
transcrio por um certo promotor. Essas sequncias podem estar localizadas acima
(upstream), abaixo (downstream) ou dentro do gene a ser transcrito e podem tambm
estar distantes muitos milhares de pares de base deste, e em qualquer uma das
cadeias.
Alguns enhancers actuam apenas em clulas especficas e isso , provavelmente,
regulado atravs da presena de determinadas protenas estimuladoras tecido-
especficas que se ligam a acentuadores especficos.
Acredita-se que as protenas que se ligam a enhancers causem uma curvatura no DNA
e permitam um acesso mais fcil das protenas da maquinaria de transcrio a um
determinado promotor.

Todas tm 8-14
subunidades
19
Complexos de iniciao das RNA polimerases com promotores contendo TATA Box

Para qualquer umas das RNA polimerases, o inicio da transcrio implica o reconhecimento da
TATA Box pela TBP (TATA Binding Protein) que posiciona a enzima no promotor.

Complexo de iniciao da RNA polimerase I (rRNA 5.8s, 18s, 28s)
Upstream Control Element (UCE) uma protenas que se situa a -170/-190 e que
aumenta a eficincia da transcrio funciona como a protena que se liga ao
enhancer;
Forma-se um loop que permite que a UCE s ligue UBF (Upstream Binding Factor, que
reconhece a sequncia consenso G-C) que funciona como activador da transcrio;
Liga-se a SL1 (Startpoint Localization factor, responsvel pelo posicionamento da RNA
polimerase I) ao complexo UCE/UBF;
RNA polimerase I liga-se ao core promotor e comea a transcrio, pois a TBP
reconhece a TATA Box.

Complexo de iniciao da RNA polimerase II (mRNA e snRNA)
Ligao do complexo TF II D (formado pela TBP e por 8 subunidades de TAFs) TATA
Box;
Podem ligar-se activadores ou inibidores ao promotor;
Liga-se a TF II A ao complexo TF II D-promotor para evitar que se liguem inibidores;
Liga-se a TF II B ao complexo TF II D-TF II A-promotor (complexo D-A);
Liga-se depois um complexo pr-formado entre a RNA polimerase II e a TF II F;
Liga-se a TF II E, ocorre a abertura do complexo, que promove a sada da RNA
polimerase II do promotor;
No h transcrio enquanto no se ligar a TF II H (complexo de reparao) e a TF II J).

Complexo de iniciao da RNA polimerase III (tRNA e 5S rRNA)
Genes do tRNA:
Existem duas sequncias a jusante do local +1: box A e box B;
A TF III C liga-se box B, com grande afinidade, e depois box A, com menor
afinidade;
As TF III C funcionam como um factor de ligao para o trmero TF III B;
A TBP uma das subunidades da TF III B;
A TF III B liga-se a montante do local +1;
Aps esta ligao, libertam-se as TF III C e liga-se a RNA polimerase III.

Genes do rRNA (fraco 5S):
No inicio da transcrio, TF III A primeiro reconhece a C box e liga-se;
A ela liga-se a TF III C que induz a ligao do trmero TF III B, contendo TBP, ao
promotor e posiciona-se no local +1
Depois a RNA polimerase III liga-se ao local +1, librtam-se a TF III A e TF III C e
inicia a transcrio.

Terminao da transcrio:
Aps a reconhecimento do promotor, formao do complexo de iniciao e elongao,
surge um sinal de terminao e a RNA polimerase libertada, assim como os factores
a ela associados.


20
Anti-terminao:
Se s RNA polimerases for adicionado um factor de anti-terminao, ela fica
incapacitada de ler o sinal de terminao e continua, assim, a transcrio da sequncia
que se segue a esse sinal;
Formam-se protenas maiores do que aquelas que se formariam se no se tivesse
ligado o factor anti-terminao.

Inibidores da transcrio
Actuam sobretudo no inicio da transcrio e na elongao.

Inibidor Enzima-alvo Aco
Rifamicina Holoenzima bacteriana Liga-se subunidade e evita a
iniciao
Estreptolidigina Core enzimtico da bactria Liga-se subunidade e evita a
elongao
Actinomicina-D RNA polimerase I (eucariota) Liga-se ao DNA e evita a
elongao
-Amanitina RNA polimerase II, RNA polimerase III
(algumas espcies)
Inibidor selectivo da RNA
polimerase II


5) Tipos de RNAs e processamento de RNAs

5.1) RNA mensageiro
mRNA procariota:
Policistrnico:
Constitudo por vrios fragmentos em que cada um corresponde a um gene;
Cada mRNA codifica vrias protenas diferentes;
Os mltiplos genes esto separados por regies no codificantes regies
intercistrnicas.
Cistro:
Unidade gentica que codifica uma protena;
Definido pela complementao cis/trans;
Cada cistro separado por uma regio intercistrnica.
Colinear:
A sequncia de nucletidos corresponde sequncia de protena;
mRNA tem o mesmo tamanho que o DNA que lhe deu origem porque no se
forma hnRNA o DNA no tem intres.
Polaridade: Pode ocorrer na transcrio ou traduo devido a mutaes.
Traduo e transcrio simultneas citoplasma.

Algumas sequncias de DNA codificam para mais do que uma protenas: cada mRNA
possui 3ORFs diferentes e geralmente dois deles levam ao aparecimento precoce de
codes STOP, agora cada protena traduzida consoante o ORF seleccionado.

Zonas do mRNA procariotas:
5-leader: sequncia 5 a montante do codo de iniciao (no traduzida);
Regio codificante: codifica para a protena e situa-se desde o codo de iniciao ao
codo de finalizao cistro;
3-trailer: sequncia terminal que ocorre aps o sinal de terminao, no conduz
formao de uma protena (no traduzida) e confere estabilidade ao mRNA;
Regio intercistrnica: separa duas sequncias codificantes e tem 1-40 bases;
21
Sequncia Shine-Dalgarno: 5-UAAGGAGG-3, situadas na regio 5-leader, 7-10 bases a
montante do codo AUG e complementar sequncia 3 da subunidade 16S do rRNA
importante para a ligao mRNA/rRNA;
O mRNA cortado excepto na regio protegida pelo ribossoma.

Elementos genticos que codificam para mRNAs procariotas:
No DNA necessrio um Promotor com sequncia consenso a -10 e a -35;
Local de inicio de transcrio, +1;
Sequncia leader com sequncia Shine-Dalgarno (5-UAAGGAGG-3 a montante do codo
AUG);
Codo de iniciao;
Regio codificante;
Codo de terminao;
Regies intercistrnicas;
Sequncia 3trailer.

mRNA eucariota:
Monocistrnico: codifica para apenas uma protena s possui um cistro;
No colinear;
Forma-se um pr-RNA ou hnRNA mesmo tamanho que o DNA que lhe deu origem, ou
seja, tem intres e exes, logo o gene interrompido;
hnRNA sofre processamento/splicing remoo de intres, capping e poli-adenilao;
Transcrio ocorre no ncleo;
Splicing ocorre no ncleo;
mRNA maduro sai para o citosol pelos poros nucleares;
Traduo no citosol.

Capping:
Adio da estrutura CAP (7-metil-G-ppp) na extremidade 5 pela enzima guanidil transferase:
Importante para a ligao do mRNA ao ribossoma;
Importante para o transporte do mRNA do ncleo para o citosol;
Substrato para vrias metilaes;
Indica o local de inicio da traduo.

Poli-adenilao:
PAP (Poli A polimerase);
PBP II (Poli A Binding Protein II);
AAUAAA sinal de poli-adenilao;
Cauda adicionada na extremidade 3 confere estabilidade ao mRNA.

Splicing (Remoo dos intres):
SnRNA sintetizada pela RNA polimerase II SnRNP.
Podem ser removidos os intres ou os exes entre os anteriores.

22
Processamento alternativo de CGRP (Calcitonine Gene Related Peptide):














Modelo de clivagem e poli-adenilao do hnRNA em mamferos:
Sequncia de poli-adenilao: AAUAAA provm da sequncia de DNA (cadeia
codificante) AATAAA, que pode, em alguns casos ser ATTAAA;
A sequncia de poli-adenilao reconhecida pela CPSF (Cleavage and Poli-adenilation
Specifity Factor) que se liga a ela;
Liga-se o CStF (Cleavage and Stimulatory Factor);
Ligam-se os factores de clivagem CFI e CFII;
Liga-se a PAP e inicia-se a sntese da cauda Poli-A (adicionam-se 12 cidos nucleicos de
forma lenta);
Libertam-se os factores de clivagem (CStF, CFI e CFII);
Liga-se a PBP II e inicia-se uma adio rpida de cerca de 200 adeninas;
O complexo dissocia-se.

Elementos genticos que codificam para o mRNA eucariota:
Enhancer (zona do DNA que pode estar muito longe da regio promotora e no qual se
ligam as protenas activadoras);
Promotor com sequncias consenso (CAAT box e TATA box + GC box) + regies
reguladoras a montante do promotor;
Local de inicio de transcrio, +1;
Regio que transcrita, mas no traduzida, a montante do AUG;
Codo de iniciao AUG;
Regio codificante;
Codo de terminao, UGA,UAG,UAA;
Regio transcrita mas no traduzida onde se situa o sinal de poli-adenilao;
Sequncia de terminao.


5.2) RNA de transferncia

Extremidade 5 termina sempre em CCA extremidade onde se ligam os
aminocidos;
Possui bases diferentes das que se encontram geralmente, atribuindo ao tRNA uma
estrutura terciria em forma de L:
Pseudouridina ();
Metilinosina (mI);
Metilguanosina (mG);
Dimetilguanosina (m
2
G);
Dihidrouridina (DHU).
23
Possui 5 hastes:
Haste TC lado 3, importante para a ligao ao ribossoma;
Haste do anticodo importante para a ligao codo-anticodo;
Haste DHU (DHU-loop) rica em dihidrouridina;
Extra lao entre a haste TC e a haste anti-codo;
Haste aceitadora lado 5, possui a sequncia CCA onde se liga o aminocido.

Processamento do pr-tRNA:
Remoo da extremidade 5-leader pela RNase P;
Remoo da extremidade 3-trailer pela RNase D;
Adio da extremidade 3-CCA;
Splicing na haste do anti-codo para que este fique exposto.


5.3) RNA ribossmico

Ribossoma procaritico:
TOTAL: 70S
Subunidade maior: 50S

Subunidade menor: 30S

66% rRNA

Ribossoma eucaritico:
TOTAL: 80S
Subunidade maior: 60S

Subunidade menor: 40S

60% rRNA

Genes do rRNA procariota:
A separar as diferentes regies que separam as subunidades e a sequncia que leva
formao do tRNA encontram-se sequncias que no so traduzidas;
Corte das sequncias feito pela RNase III, pela RNase P e pela RNase E 23s, 5s e
16s.

Estrutura do ribossoma em E.coli:
Separao das subunidades 50S e 30S por sedimentao e das protenas a elas
associadas gradiente de cloreto de csio;
Identificao das protenas por electroforese em gel de poliacrilamida.

Reconstituio do ribossoma:
possvel reconstituir ribossomas a partir das subunidades e das protenas associadas,
o que implica modificaes da temperatura.


Genes do rRNA eucariota:
Os genes que codificam para o rRNA codificam as 3 fraces (28s, 5.8s e 18s) num
nico transcrito;
23s + 5s + 31 protenas
16s + 21 protenas
28s + 5.8s + 5s
18s + 33 protenas
24
A fraco 5s sintetizada no nucleoplasma pela RNA polimerase III;
O DNA que codifica o rRNA chamado rDNA;
A parte codificante de cada agregado tem a forma de rvore de Natal e est separada
das restantes por ETS (External Transcriber Spacers);
No interior de cada agregado existem os ITS (Internal Transcriber Spacers);
No processamento do pr-rRNA intervm protenas ribossomais e snoRNAs
pequenos RNAs nucleolares.
Inicialmente ocorre a clivagem dentro do espaador transcrito externo (ETS) prximo
da extremidade 5 do pr-rRNA 45S. Esta clivagem feita pelo snoRNA U3, o snoRNA
mais abundante do nuclolo.
Segue-se a remoo do ETS da extremidae 3. Depois, ocorre a clivagem na
extremidade 5 da regio 5.8S que separa 2 precursores, 1 para o rRNA 18S e outro
para o rRNA 5.8S + 28S. O snoRNA U8 responsvel pela clivagem do pr-rRNA que
forma os rRNAs 5.8S e 28S; o snoRNA responsvel pela clivagem do pr-rRNA que
forma o rRNA 18S.
















Processamento de rRNA
Processamento autocataltico: o RNA apresenta a capacidade de actuar como uma
ribozima, envolvendo transesterificaes.
Self-splicing tipo I:
Uma guanina fosforilada ataca a ligao intro-exo;
Ocorre uma reaco de transesterificao que corta essa ligao;
A extremidade 3-OH do exo fica livre e ataca a extremidade 5 do
outro exo;
O intro no cclico removido.
Self-splicing tipo II:
Neste caso, o atacante uma adenina fosforilada e o intro no sai na
forma linear.
Ento, a adenina fosforilada ataca a ligao intro-exo;
Reaco de transesterificao corta esta ligao e deixa a extremidade
3-OH livre;
Esta ataca a extremidade 5 do exo seguinte;
Ocorre libertao de um intro cclico estrutura em Lariat.
Pode ocorrer processamento sem formao da ribozima, ocorrendo atravs de um
intermedirio spliciossoma, actuando da mesma forma que o self splicing tipo II.


25
Processamento tRNA
Processo essencialmente enzimtico;
A RNase D remove os intres externos nas duas extremidades;
O intro removido directamente e num nico passo pela RNase P;
Fica um espao entre os dois exes;
A ligase fosforila a extremidade 5 do exo e faz com que se exponha um grupo OH na
extremidade 3 do outro exo, juntando os dois exes (requer ATP e GTP);
A transferase tRNA nucleotidil adiciona uma sequncia ACC extremidade 3 do tRNA.











Nota: os pontos vermelhos so bases raras: como a inosina, DH, pseudouridina e ribotimidina.

Processamento do RNA mitocondrial
Ocorre nas mitocndrias dos eucariotas inferiores que possuem intres;
O DNA transcrito a hnRNA, com dois intres, e vai sofrer processamento;
O primeiro intro removido autocataliticamente;
Unem-se os dois exes;
A sequncia do segundo intro traduzida formando-se a protena maturase;
Esta promove a remoo do segundo intro e a unio dos exes;
Por traduo da sequncia resultante forma-se o citocromo b;
Aps a remoo do segundo intro no se forma mais protena maturase.

Processamento do mRNA
A formao do spliciossoma requer:
Sinais de splicing:
Esto na extremidade do intro: 5-GUAG-3;
Regio rica em pirimidinas na extremidade 3 (15kb de AG-3);
Regio/Ponto de ramificao A entre 20-50 bases da extremidade 3 do
intro.
SnRNAs ou Snurps:
Nucleares;
Designadas por U
1
, U
2
, U
3
, U
4
, U
5
e U
6
, muito ricas em Uracilo;
No citoplasma tm a designao de scRNA (small cytoplasmatic RNA).
SnRNPs:
Small nuclear ribonucleoproteins;
So SnRNAs associadas a protenas nucleares.

Complexo E: U
1
liga-se ao local de corte 5 (GU) e U
2
AF liga-se ao local rico em
pirimidinas.Ocorre a hidrlise de 1ATP.
Complexo A: U
2
liga-se ao local de ramificao.
Complexo B1: forma-se um loop e a U
1
e U
2
ficam em contacto, ento, liga-se o
trmero U
4
, U
5
e U
6
. U
5
fica ligado ao exo perto da extremidade 5 do intro e U
6
fica
ligado U
2
. O U
2
AF continua ligado ao local rico em pirimidinas.
26
Complexo B2: liberta-se a U
1
, U
5
passa do exo para a extremidade 5 do intro, U
6

liga-se tambm extremidade 5do intro. Ocorre a hidrlise de ATP.
Complexo C1:liberta-se a U
4
, U
5
liga-se ao local 3 do intro, U
2
/U
6
catalizam a
transesterificao que leva ao corte da extremidade 5 do intro, forma-se uma
estrutura de Lariat. Ocorre a hidrlise de ATP.
Complexo C2: U
2
,U
5
e U
6
continuam ligados estrutura em Lariat, uma nova
transesterificao leva ao corte da extremidade 3 do intro, unem-se as extremidades
dos exes.

RNA Editing:
Processo no qual a informao muda a nvel do mRNA;
Por substituio de uma s base:
Catalizado pela citidina desaminase (troca de C por U) ou pela adenosina
desaminase (troca de A por I);
Ex.: gene da apolipoprotena B:
No fgado, a protena tem 512kDa e no intestino tem 250kDa

Por remoo ou insero de bases:
Adio de uridinas por um RNA guide (gRNA) complementar ao mRNA e
codificado por unidades de transcrio independentes presentes no genoma;
O RNA guide possui uma sequncia que complementar ao pre-edited RNA;
Existem lacunas no pre-edited RNA;
Para que se forme uma sequncia de mRNA vlida vo adicionar-se 8 uridinas;
O gRNA providencia a insero das uridinas nas lacunas do local de
complementaridade entre os dois RNAs:
Endonuclease corta o mRNA;
TUTase (terminal uridil transferase) insere ou remove a uridina para
haver emparelhamento com o gRNA;
RNA ligase faz a ligao do nucletido (inserido ou removido) no
mRNA.

Pseudogenes ():
No podem ser traduzidos a protenas funcionais;
Resultam de mutaes que envolvem:
Abolio de sinais de iniciao;
Remoo de intres e das junes exo-intro;
Presena de sinais de terminao prematuros;
Por transcrio reversa de RNA a DNA de cadeia dupla que depois se insere em
qualquer parte do genoma.
Pseudogenes processados: genomas com sequncias inactivas semelhantes a
transcriptos de RNA;
A anlise das suas mutaes permite estimar quando se inactivou o gene activo;
Os pseudogenes, graas s mutaes, no conseguem produzir protenas activas,
embora tenham uma sequncia semelhante com as que as formam.


6) Traduo e sntese proteica

A ligao do aminocido ao tRNA catalisada pela enzima aminoacil tRNA sintetase;
Existem 20 aminoacil tRNA sintetases, um para cada aminocido;
H vrios tRNAs que se ligam ao mesmo aminocido.


27
Ligao do aminocido do tRNA
A aminoacil tRNA sintetase para a Phe carrega este aminocido e o tRNA especifico
para a Phe (tRNA
Phe
);
Atravs da hidrlise do ATP formando-se AMP e PPi, esta enzima promove a ligao da
Phe ao tRNA
Phe
, sendo uma ligao ster altamente energtica;
Em seguida, o tRNA
Phe
, com o anti-codo AAA, liga-se ao codo UUU.

Procariotas
1. Iniciao:
A sntese comea com tRNAf
met
ligando-se directamente ao local P, ficando o local A
livre para a ligao do seguinte aminoacil tRNA:
Cuja extremidade 5 possui um C que emparelha com o A da extremidade 3;
Possui trs bases emparelhadas (GGG-CCC);
Possui metionina formilada, gerada pela formilao do tRNA
met
, atravs do
formil-tetrahidrofolato como cofactor;
As metioninas internas no so formiladas;
Apenas tRNAf
met
pode ser usado na iniciao pelas subunidades 30S, todos
os outros aminoacil tRNAs podem ser usados na elongao pelas 70S dos
ribossomas.
A subunidade menor (30S) do ribossoma carrega consigo todos os factores de
iniciao IF1, IF2 e IF3;
Para que o mRNA se ligue subunidade 30S necessrio existir a sequncia Shine-
Dalgarno (5-UAAGGAGG-3) no 5-leader do mRNA.
O IF2 vem ligado ao local P do 30S e forma um complexo com o aminoacil tRNA
iniciador, que facilita a sua ligao subunidade menor e verifica que mais nenhum
aminoacil tRNA pode participar na iniciao;
O IF1 previne a ligao prematura de tRNAs ao local A e, aquando da ligao do
tRNAf
met
ao mRNA, liberta-se o IF3 cuja funo era evitar a ligao precoce da
subunidade 50S;
Libertam-se o IF1 e o IF2, estando este associado hidrlise do GTP;
Liga-se a subunidade 50S ao complexo e o local A fica livre.

Eucariotas
1. Iniciao:
Podemos encontrar as subunidades do ribossoma eucaritico das seguintes formas:
Subunidades 40S e 60S ligadas entre si;
Subunidade 60S ligada ao eIF6;
Subunidades 60S e 40S separadas;
Subunidade 40S ligada ao eIF3.
A subunidade 40S ligada ao eIF3 vai ligar-se ao eIF1A e, em seguida, a um complexo
ternrio constitudo por: eIF2 associado ao GTP e Met-tRNA
met
complexo de pr-
iniciao;
Este liga-se ao eIF4 (cap-binding complex) e ao mRNA complexo de iniciao;
O complexo de iniciao sofre uma hidrlise do ATP e ocorre a libertao do eIF1A,
eIF3, eIF4 e do eIF2 associado ao GDP + Pi;
Liga-se o mRNA ao Met-tRNA
met
e subunidade 40S;
A subunidade 60S acoplada ao eIF6 e ao eIF5 associado ao GTP liga-se ao complexo
anterior e libertam-se o eIF6 e ao eIF5 associado ao GDP + Pi, constituindo o
ribossoma 80S.

2. Elongao:
O aminoacil tRNA iniciador encontra-se no local P do ribossoma, carregado com
metionina (euc) ou N-formil-metionina (proc);
28
O local A est livre para que se adicione um novo aminoacil tRNA com o anti-codo
complementar ao codo a seguir ao AUG:
Para isso, o aminoacil tRNA correspondente est ligado ao complexo
proteico Tu (proc) / EF (euc) e ao GTP;
Pela hidrlise do GTP a GDP, o complexo Tu/EF-GDP liberta-se, sendo
regenerado o GDP e, portanto o complexo, pela Ts (proc) /EF1

(euc) e o
aminoacil tRNA liga-se ao local A.
A peptidil-transferase, existente na subunidade maior do ribossoma, promove a
ligao dos dois aminocidos no local onde o peptidil tRNA e o aminoacil tRNA se
aproximam;
Translocao pela hidrlise do GTP a GDP e pelos factores de elongao G (proc) /
EF
2
(euc), o ribossoma avana trs nucletidos ao longo do RNS para expulsar o
tRNA que no se encontra carregado com o aminocido, ficando o local A
novamente livre.

3. Terminao:
Quando se atinge um codo de terminao, que no tem nenhum aminoacil tRNA
complementar, ligam-se os factores de terminao:
RF1 UAG;
RF1 e RF2 UAA;
RF2, RF3 e GTP UGA.
Ocorre a hidrlise do GTP a GDP + Pi, as subunidades do ribossoma dissociam-se e
liberta-se o peptideo completo e o tRNA.

Funes do GTP na sntese proteica:
Capacidade de verificao: verifica se o primeiro tRNA o correcto e todos os outros
aminoacil tRNAs;
Alteraes conformacionais: altera as conformaes de modo a que se liguem os
factores de iniciao, elongao e terminao.

Polissoma:
Capacidade de um mesmo mRNA estar a ser traduzido simultaneamente por vrios
ribossomas protenas a ser sintetizadas ao mesmo tempo;
A sntese proteica feita de N-terminal para o C-terminal.

Inibidores da sntese proteica:

Alvo Inibidor Eficiente em Aco ou natureza de mutaes resistentes
Iniciao Casugamicina

Estreptomicina
Bactria

Bactria
Os mutantes no possuem grupos metilo em
16S rRNA
Mutaes na protena S12 30S
Elongao Quirromicina

Puromicina
Bactria

Bactria
O EF-Tu-GDP no pode ser libertado

Aceita a cadeia peptidica da peptidil-tRNA
Peptidiltransferase Eritromicina

Cloramfenicol

Cicloheximida
Bactria e
mitocndria
Bactria e
mitocndria
Citoplasma
eucaritico
Mutaes ocorrem na modificao da 23S rRNA
Mutaes ocorrem na sequncia da 23S rRNA
Mutaes ocorrem nas protenas 50S
Mutaes ocorrem na sequncia da 23S rRNA
Inibe a peptidiltransferase na 60S

Translocao cido fusidico
Tioestreptano
Bactria
Bactria
EF-G-GDP no pode ser libertado
Inibe a actividade da GTPase

29
Dissociao das subunidades
50S e 30S do ribossoma durante
a sntese proteica:















Funes dos factores de iniciao:
Bactria
Factor Funo
IF-1 Previne a ligao prematura de tRNAs ao local A
IF-2 Facilita a ligao da fMet-tRNA
fmet
subunidade 30S do ribossoma
IF-3 Liga-se subunidade 30S, previne a associao prematura da subunidade 50S e
reala a especificidade do local P para a fMet-tRNA
fmet

Eucariontes
Factor Funo
eIF2 Facilita a ligao da Met-tRNA
met
iniciadora subunidade 40S ribossomal
eIF2B, eIF3 Primeiros factores a ligarem-se subunidade 40S, facilitam os seguintes passos
eIF4A Possui actividade RNA helicase que remove a estrutura secundria do mRNA
permitindo a ligao subunidade 40S, faz parte do complexo eIF4F
eIF4B Liga-se ao mRNA, facilitando a explorao do mRNA para localizar o primeiro
AUG
eIF4E Liga-se ao 5-cap do mRNA, faz parte do complexo eIF4F
eIF4G Liga-se ao eIF4E e poliA biding protein (PAB), faz parte do complexo eIF4F
eIF5 Promove a dissociao de vrios outros factores de iniciao da subunidade 40S
para a posterior associao da subunidade 60S formando-se o complexo de
iniciao 80S
eIF6 Facilita a dissociao do ribossoma 80S inactivo em subunidades 40S e 60S

30
Localizao e funo das protenas sintetizadas:
Procariontes:
Membrana interna transporte e metabolismo de nutrientes;
Periplasma enzimas hidrolticas e associadas ao transporte de nutrientes;
Membrana externa transporte de nutrientes e receptores para
bacterifagos.
Eucariontes:
Protenas solveis actuam no citosol com locais catalticos;
Complexos macromoleculares ex.: centrolos (responsveis pelo fuso
mittico);
Protenas nucleares cromatina, matriz e lmina nuclear;
Organelas citoplasmticas R.E., complexo de Golgi e lisossomas;
Protenas secretadas sequncia leader, sequncia adicional, SRP (signal
recognition particle).

Sequncia sinal (ou leader):
As sequncias leader permitem protena que as possui reconhecer as superfcies de
mitocndrias ou cloroplastos atravs de um processo de ps-translaco.
Esta sequncia , portanto, reconhecida por receptores na membrana das organelas e
passa atravs delas. No interior da organela, a protena clivada libertando-se a
sequncia leader.

Partcula reconhecedora do sinal (SRP):
um complexo RNA-protena presente em todos os organismos conhecidos.
Nos eucariotas a SRP est envolvida na translocao de protenas para o retculo
endoplasmtico e nos procariotas est envolvida na translocao de protenas para a
membrana celular e mais alm. Contudo, existem diferenas estruturais e funcionais
bastante substanciais entre as SRP dos eucariotas e procariotas.

Sequncia adicional (ou anchor):
As protenas do Grupo I promovem a extenso da membrana uma vez, com o N-
terminal para o exterior e o C-terminal para o citosol;
As protenas do Grupo II promovem a extenso da membrana uma vez, com o C-
terminal para o exterior e o N-terminal para o citosol;
As protenas com um n mpar de segmentos -helicoidais inseridos na membrana
tm o N- e o C-terminal em lados opostos;
As protenas com um n par de segmentos -helicoidais inseridos na membrana tm o
N- e o C-terminal no mesmo lado.

Protenas secretadas no R.E.:
O ribossoma inicia a sntese proteica no citosol;
A sequncia leader exposta;
A SRP liga-se ao local A do ribossoma, parando a sntese proteica;
A SRP liga-se ao receptor de SRP que existe na membrana do R.E. e o ribossoma liga-se
a esta;
Por hidrlise do GTP a GDP, a SRP dissocia-se;
Retoma-se a sntese proteica para o interior da organela;
A sequncia leader cortada por peptidases;
Ligam-se os chaperons protena em crescimento;
Termina a sntese proteica e os chaperons dissociam-se, com hidrlise de ATP;
A protena adquire a sua conformao.

31

7) Recombinao Gentica
Requer:
Sequncias idnticas do mesmo DNA ou de DNAs diferentes;
DNA de cadeia simples ou de cadeia dupla com um corte numa das cadeias.

Permite:
Reparao do DNA mutado;
Manipulao de genes;
Eliminao de genes mutados (terapia gentica);
Regulao da expresso gentica;
Expresso de protenas diferentes;
Determinao da distncia e posio relativa entre genes.

Pode originar:
Duplicaes;
Deleces;
Inactivao de genes;
Crossing-over ilegtimo.
Tipos de replicao:
Homloga ou crossing-over;
Local especfica;
Por transposio.

1. Recombinao homloga ou crossing-over:

Processos propostos para o crossing-over (verificado com estudos da recombinao com
istopos pesados):
Quebra e reunio: aps a replicao do DNA surgem cortes nos cromatdeos e ocorre a
troca de segmentos cromossmicos mecanismo mais aceite pois a replicao e
recombinao so independentes.

Escolha de cpia: a recombinao ocorre durante o processo de replicao, em que h
troca de segmentos de cromossomas enquanto ocorre a replicao.
32
A recombinao e a replicao do DNA so processos independentes:
Infectando bactrias com DNA leve em meio leve com fagos de DNA pesado (AB) e
fagos de DNA pesado (ab) verifica-se que aps replicao e recombinao surgem
espcies totalmente leves, hbridas e totalmente pesadas o que no se verificava se
estes processos fossem interdependentes.

Recombinao em E.coli
Protena RecA:
Promove o emparelhamento de bases entre DNA de cadeia simples e
complementar de cadeia dupla responsvel pela troca de cadeias;
Necessita do produto dos genes recB, recC e recD para se activar;

Tem actividade protesica na resposta SOS e requer ATP degrada o
repressor lexA activando um mecanismo de reparao do DNA, expressando
as protenas SOS
ou
Degrada o repressor que permite mudar de uma via lisognica para uma via
ltica, para a expresso da protena Cro;
Corrige mutaes provocadas por raios X.

Protenas RecBCD:
Promovem o desemparelhamento do DNA com uma extremidade livre na
cadeia dupla;
Reconhecem a sequncia Chi (5-GCTGGTGG-3) e cortam-na (actividade
nuclesica);
As protenas RecBCD percorrem o DNA, desenrolando-o e enrolando-o at
encontrarem as sequncias Chi que reconhecida e cortada formam-se as
orelhas de coelho, pois a velocidade de desenrolamento maior do que a de
enrolamento;
Ocorre hidrlise de ATP e a energia libertada serve para se juntar a protena
RecA que se poder ligar ao segmento cortado recombinando-o com outros
DNAs.

Aco da RecA:
Associa-se a partir da extremidade 5 do DNA de cadeia simples;
DNA de cadeia dupla homlogo emparelha, formando um complexo, com o anterior
molcula de DNA triplo;
H deslocamento de uma das cadeias de DNA de cadeia dupla (Branch Point, local a
partir do qual o DNA ainda est emparelhado), a partir da extremidade 5, libertando-
se por hidrlise de ATP e ficando o DNA simples emparelhado com a outra cadeia de
DNA duplo Branch Migration.
Em mutaes provocadas por raios X, pode surgir uma lacuna no DNA e a RecA
poder-se- ligar a ele e provocar Branch Migration a partir de um DNA de cadeia
dupla homlogo. Forma-se um DNA reparado e uma estrutura de Holliday entre
a cadeia de DNA mutada e a outra cadeia do DNA que desemparelhou.

Estrutura de Holliday e heteroduplexes
Estrutura de Holliday: estrutura intermediria que se forma na
recombinao de dois DNAs de cadeia dupla e que formada por
uma cadeia de cada molcula de DNA.
Heteroduplexes: DNA de cadeia dupla, em geral como produto da recombinao,
formado por cadeias complementares derivadas de dois DNAs com sequncias
semelhantes.
33
Os DNAs resultantes de uma Estrutura de Holliday dependem do eixo segundo o
qual se d a resoluo da estrutura.


Funo dos genes ruvA, ruvB e ruvC:
ruvA: reconhece a Estrutura de Holliday e aumenta a formao de heteroduplexes;
ruvB: aumenta a formao de heteroduplexes e tem actividade de helicase;
ruvC: tem actividade de endonuclease e resolve a juno da Estrutura de Holliday.


Heteroduplexes e migrao de braos
Migrao de braos: capacidade de uma cadeia de DNA, emparelhada com a sua
complementar num duplex, em estender e deslocar a cadeia residente da qual
homloga.
Um genoma pode no ser recombinante e ter regies
de heteroduplexes s considerado recombinante
se ocorrer recombinao (corte e formao de
heteroduplexes) de forma a alterar a combinao
original dos alelos (o que no acontece na figura).
A recombinao durante a meiose ocorre na Profase I.


Converso gentica

Processo no recproco que pode ocorrer na recombinao, em que um alelo
convertido noutro por emparelhamento incorrecto.
A converso gentica durante a meiose, por recombinao homloga normal entre
dois cromatdeos, conduz formao de clulas haplides cujos alelos esto na
proporo de 2:2.
Na converso gentica durante a meiose, evidencia-se um evento no recproco que
resulta numa segregao de alelos na proporo de 3:1, sendo um alelo convertido
noutro.


1 4


2 5


3 6
34
Inverses e delees resultantes de recombinao:

Inverso: por recombinao, um segmento de DNA que estava orientado de uma
forma passa a estar orientado no sentido oposto:















Se o segmento estiver invertido o primeiro promotor est inactivo, no se
traduzindo o gene H2 nem o repressor, e o segundo promotor est activo
traduzindo-se o gene H1.



Deleo: por recombinao, vai ocorrer a remoo de uma parte do DNA entre as duas
zonas de recombinao.










Como um dos cromossomas est mais atrs, a troca de segmentos (crossing-
over) faz com que um dos cromossomas fique com um segmento duas vezes
(duplicao), enquanto que o outro fica sem essa sequncia (deleco).


35
Fago contm integrase que
favorece a integrao do DNA
vrico no cromossoma bacteriano
e contm xis excisionase que
catalisa a sada do profago.
E.coli possui IHF (integration host
factor) facilita a integrao do
DNA do fago, formando-se DNA
lisognico.
Integrao ocorre entre attP
(reconhece o local P, do fago) e
attB (reconhece o local B, da
bactria).
Exciso ocorre entre attL e attR.
2. Recombinao local especfica

Recombinao entre o fago e E.coli




















Recombinao entre fagos mutantes (teste de complementao)

Complementao: capacidades de genes independentes fornecerem produtos
difusveis que restauram o fentipo selvagem quando dois mutantes so testados na
configurao trans.
Determina se as duas mutaes esto no mesmo gene ou em genes diferentes.
Verifica se uma regio do cromossoma tem
um ou mais genes, em funo de um ou mais
produtos que esses genes produzem.

Dois mutantes rII (fagos) infectam uma
bactria;
Um mutante rII no tem a capacidade
de provocar a lise da bactria nem de
gerar descendncia, ao contrrio do que
aconteceria se os dois mutantes fossem
complementares (mutaes em genes
diferentes).


36
3. Recombinao por transposio
Recombinao por transposio
simples ou directa
Transposio: o movimento de
uma sequncia de DNA de um
local para outro dentro do
genoma;
Transposio simples: tipo de
movimento de um elemento
transponvel em que ele
cortado do DNA e inserido num
novo local por uma enzima
transposase especial;
Transposo: tipo de elemento
transponvel que existe como
DNA por todo o seu ciclo de
vida;
Retrotransposo: tipo de
elemento transponvel que se
move por ser inicialmente
transcrito numa cpias de RNA
que , ento, reconvertida a
DNA por uma transcriptase
reversa e inserida noutro lugar
dos cromossomas.

Recombinao por transposio
replicativa:
S dois cortes no transposo;
Resolvase: recombinase local
especifica, que se liga a
sequncias especificas (local res)
em cada uma das cpias do elemento de transposio e dissocia a estrutura co-
integrada.

Complementao e recombinao (teste cis/trans):
Cistro: gene associado a produtos difusiveis com funo e capacidade de
complementao regio gentica sem a qual no h complementao entre
mutantes.
O teste cis/trans usa a complementao para verificar se os dois locais mutados se
encontram na mesma unidade funcional, ou seja, no mesmo cistro ou em cistres
diferentes. Mutaes no mesmo cistro no se podem complementar, no havendo
descendncia.
Configurao cis ambas as mutaes se situam no mesmo cromossoma;
Configura trans mutaes em cromossomas diferentes.

37
8) Mapeamento
O mapa gentico:
Corresponde sequncia de genes num cromossoma;
Representa a localizao de marcadores genticos dentro de um fragmento de
DNA;
Permite compreender as consequncias fenotpicas das alteraes que
ocorrem nos cromossomas;
Pode determinar quais os genes que podem vir juntos com uma certa
caracterstica que est a ser seleccionada;
Compara o contedo da informao gentica de um cromossoma em espcies
diferentes.

Mapa fsico: corresponde ao mapa obtido aps
a actuao de uma enzima de restrio e,
portanto, sequncia de genes num
cromossoma.

Locus:
Posio ocupada por um gene no mapa
gentico;
Representa 1 caracterstica particular;
Os alelos tm a mesma posio nos
cromossomas individuais.

Unidade de mapa: uma unidade ou centiMorgan
(10
6
bp) corresponde a 1% de crossing-over.


H identidade entre mapa gentico e mapa fsico no cromossoma.














38
Elaborao de mapas fsicos, genticos (de
restrio), de cromossomas e localizao de
genes

Clculo da distncia entre dois genes:
Frequncia de recombinao:
corresponde proporo de clulas
haplides que representam uma
recombinao entre dois locus.
tanto maior, quanto maior a
distncia entre os genes.
Clculo da distncia entre dois
genes: dada pelo n total de
recombinantes resultantes do
cruzamento entre um duplo
heterozigoto e um duplo homozigoto recessivo:







Numa populao de 100 indivduos os fentipos obtidos foram:
41 Indivduos AB e 41 indivduos ab;
9 Indivduos Ab e 9 indivduos aB;
A frequncia de recombinantes 18%;
A distncia entre o locus A e o locus B 18unidades de mapa.


Clculo da posio relativa entre trs genes:
Dada pelo n total de recombinantes simples entre cada dois locus mais a frequncia
de duplos recombinantes, resultante do cruzamento de um triplo heterozigoto e um
triplo homozigoto recessivo.











Classes Gmetas Gentipos Fentipos
No recombinantes AB ab
ab ab
Aa Bb
aa bb
AB
ab
Recombinantes Ab ab
aB ab
Aa bb
aa Bb
Ab
aB
A-----B a-----b
x
a-----b a-----b
A-----B-----C a-----b-----c
x
a-----b-----c a-----b-----c
A b c
A B C
A b c
A b c
A B C

a b c
a B C
a b c
A b c
a b c
39









Numa populao de 1000 indivduos os fentipos obtidos foram:
430 Indivduos ABC e 452 indivduos abc;
45 Indivduos aBC e 38 indivduos Abc;
16 Indivduos abC e 17 indivduos ABc;
1 Indivduo aBc e 1 indivduo AbC.

A distncia entre o locus A e o locus B dada pela soma de:
Recombinantes simples: Abc + aBC (38 + 45 = 83%);
Recombinantes duplos: aBc + AbC (1 +1 = 2%).
A e B distam de 8,5 unidades de mapa.
A distncia entre o locus B e o locus C dada pela soma de:
Recombinantes simples: ABc + abC (17 + 16 = 33%);
Recombinantes duplos: aBc + AbC (1 +1 = 2%).
B e C distam de 3,5 unidades de mapa.
As duas classes mais frequentes ou no recombinantes (ABC e abc) indicam que os
genes so cis.
Os duplos recombinantes (aBc e AbC) indicam que o gene do meio o B.


9) Gentica de bactrias

Tm um nico cromossoma (4,5x10
6
bp) circular e no ramificado;
90% dos genes so de cpia nica;
Genes do rRNA so de cpia mltipla (conjunto de 7 genes);
Possui sequncias Is (transposes);
Genes agrupados por funes relacionadas (biossntese ou degradao) em operes
com localizao e direco diferentes no cromossoma;
Dividem-se em 20-30min.
Opero: grupo de genes reguladores com um promotor e um operador
comum a dois ou mais genes estruturais. Numa bactria, um grupo de genes
consecutivos que so transcritos como uma nica molcula de mRNA.
Operador: pequena regio do DNA de um cromossoma bacteriano que
controla a transcrio de um gene adjacente.
Promotor: sequncia de nucletidos no DNA qual a RNA polimerase se liga,
iniciando a transcrio.

Gmetas Gentipos Fentipos
No recombinantes ABC Aa Bb Cc ABC
abc aa bb cc abc
Recombinantes (A-B) Abc Aa bb cc Abc
aBC aa Bb Cc aBC
Recombinantes (B-C) ABc Aa Bb cc ABc
abC aa bb Cc abC
Recombinantes duplos AbC Aa bb Cc AbC
aBc aa Bb cc aBc
40
Ex. Opero da lactose os genes estruturais levam sntese de enzimas que
degradam a lactose. Se no houver lactose no meio, no h produo dessas
enzimas. O gene regulador produz um inibidor que se liga ao operador
impedindo que a RNA polimerase se ligue ao promotor impede a expresso
dos genes estruturais. Havendo lactose no meio, a prpria lactose activa o
opero.

Utilidade dos estudos de bactrias:
Bactrias prototrficas: crescem em meio mnimo (glucose, gua e sais minerais) a
partir do qual sintetiza todos os nutrientes de que precisa;
Bactrias auxotrficas: para crescerem requerem a adio de um nutriente que
deixaram de ter capacidade de sintetizar meio mnimo tem de ser suplementado.

Permitem fazer o estudo dos genes, da sua regulao e do modo como o cdigo
gentico actua em funo da capacidade de actuao dos seus sistemas genticos s
diferentes condies ambientais que encontra;
Permitem a identificao de mutaes espontneas (isomerizao e tautomerismo) e
mutaes induzidas (mutagnios: radiaes ionizantes, raios U.V., agentes qumicos)
para replica plating, que conduzem ao aparecimento de diferentes fentipos. Ex.
Mutaes sensveis temperatura a -galactosidase normal funciona a 37C
(T
restritiva
), a -galactosidase mutada funciona a 30C (T
permissiva
).


Anlise de flutuao
Permite verificar agentes
mutagnicos;
Diz-nos se as bactrias
apresentam resistncia a
antibiticos;
Se so auxotrficas em
relao a algum
nutriente.
Cultura bacteriana
a crescer em
presena do fago
T1;
Incubado em 5
placas diferentes a
crescer em meio mnimo (agar) na presena do fago;
Lise das bactrias por infeco do fago;
Algumas colnias sobrevivem infeco dos fagos adaptao por parte das
bactrias, tornando-se resistentes aco do fago.

Deteco de bactrias auxotrficas
Tratamento da E.coli com um agente mutagnico. Ex. Nitrosoguanidina.
Plaqueamento em meio rico permite o crescimento de todas as bactrias que
resistiram ao mutagnico;
Replica plating, em trs placas:
1. Plaqueamento novamente em meio rico sobrevivem todas as resistentes;
2. Plaqueamento em meio mnimo algumas das sobreviventes morrem
(auxotrficas);
3. Plaqueamento em meio mnimo suplementado com um nutriente as
sobreviventes so auxotrficas em relao ao nutriente seleccionado.
41
Incubao
Replica plating:
Plaqueamento de bactrias em meio rico
Master Plate;
Replica plating pressiona-se na master plate um
filtro de nitrocelulose estril e as colnias em
desenvolvimento nessa passam para o filtro;
A cpia da master plate colocada em duas placas
diferentes:
Meio rico;
Meio rico + estreptomicina.
No primeiro, crescem todas as que cresceram na
master plate. Na segunda, s crescem as bactrias
que possuem o gene que confere resistncia
estreptomicina.




Enriquecimento de mutantes permite uma produo em grande escala
dos mutantes desejados que podem ser isolados segundo trs formas:

a. Seleco directa: aplicam-se condies de crescimento que favorecem apenas o
mutante que queremos seleccionar.
Colocamos as bactrias em presena de agentes qumicos (ex. antibiticos),
fsicos (U.V.) ou biolgicos (fagos) e plaqueamos s crescem as bactrias
resistentes a estes agentes.
b. Seleco fsica: usam-se parmetros para separar as bactrias mutantes. Ex.
Tamanho, mobilidade, temperatura e diferente metabolizao de nutrientes.
Bactrias que degradam a lactose (lac +) formam cidos durante o processo,
enquanto que as bactrias que no degradam a lactose (lac -) no os formam.
Plaquea-se num meio com indicador cido/base onde muda para a cor do
cido onde se localizam as bactrias lac +.
c. Contra-seleco:utiliza agentes que matam apenas as clulas em crescimento ex.
seleco de bactrias auxotrficas.
















42
Alteraes no cromossoma bacteriano
a) Recombinao gentica: verifica-se entre duas bactrias auxotrficas (em relao a
nutrientes diferentes) e leva produo de bactrias prototrficas.

A estirpe I auxotrfica em
relao metionina e biotina e
no cresce em meio mnimo;
A estirpe II auxotrfica em
relao treonina e leucina e
no cresce em meio mnimo;
A mistura das duas estirpes
permite o crescimento de
bactrias prototrficas em meio
mnimo, uma vez que ocorreu
recombinao gentica.

b) Transposio: a recombinao por transposio resulta da capacidade que os
elementos de transposio tm em se movimentarem de um local para o outro do
genoma.
Tm sequncias invertidas nas extremidades;
Reconhecem uma sequncia chave no DNA alvo e duplicam-na, inserindo-se
no meio dela;
Podem sair apenas com a sequncia de insero ou levar qualquer tipo de
DNA adjacente;
Em geral, os transposes integram-se nos hotspots onde h maior tendncia
para ocorrerem mutaes;
Transposio catalisada pela transposase;
Podem ser simples (transposo salta na integridade para o DNA alvo) ou
replicativas (por aco da resolvase, os dois DNAs vo ficar com um pouco da
sequncia do transposo).

c) Transformao: mecanismo pelo qual a bactria absorve DNA podendo ou no integr-
lo no seu genoma, alterando o gentipo e o fentipo.
O DNA que integrado provm geralmente de plasmdeos:
Pores de DNA com capacidade de replicao autnoma possuem 1 Ori;
Podem codificar para funes no essenciais;
Podem conferir funes nicas bactria:
Factor F (fertilidade);
Factores que conferem resistncia a antibiticos;
Podem integrar-se no genoma da bactria (epissoma) ou no;
Grupo de compatibilidade: determina que dois plasmdeos com origens de
replicao diferentes no podem replicar na mesma clula
necessrio trabalhar-se com clulas competentes clulas preparadas para
absorver DNA plasmdico.








Tratadas com soluo hipotnica
de CaCl
2
em gelo (0C)
formao de complexos Ca
2+
-DNA
e inibio das nucleases (gelo)
clulas incham.

Tratamento por choque trmico:
0C 37C (2)
42C (45 segundos)
43
Outro modo de permitir a entrada do DNA atravs da electroporao:
Uma fonte elctrica emite uma pequena descarga que leva formao de
canais na membrana celular, entrando o DNA plasmdico
Nota: nas estirpes usadas no laboratrio, no vai haver formao de epissoma pois as
bactrias no possuem a protena RecA que promove a recombinao (RecA
-
).

d) Transduo: a bactria, neste processo, infectada por 1 fago fago de transduo.
O fago insere o seu material gentico no genoma da bactria (forma um
profago). Quando o DNA do fago vai ser removido do genoma da bactria
(bactria de transduo) pode integrar algum gene pertencente bactria;


Se esse fago infectar outra bactria que no possua a caracterstica que
confere o gene que foi removido da bactria anterior, pode acontecer que a
nova bactria adquira uma nova caracterstica.

e) Conjugao: ocorre entre duas bactrias requer a fuso das paredes bacterianas
uma bactria masculina (F
+
) e outra feminina (F
-
).
Factor de fertilidade Factor F:
Funciona como um plasmideo;
DNA de cadeia dupla;
100kb;
Cerca de 60 genes;
Origem de replicao (OriV);
Origem de transferncia (OriT):33kb, possui genes tra e sintetiza a
fmbria sexual (pili F).











Ciclo sexual da bactria:
Ocorre conjugao entre a bactria F
+
e a F
-
:
Gene tra D forma o canal entre as duas bactrias;
Gene tra A sintetiza a pilina para que se forme o pili F, que mantm
apenas as duas bactrias ligadas, no promovendo a passagem do
DNA.
A transferncia do material gentico (Factor F) feita por conjugao:
Ocorre replicao do Factor F pelo mecanismo dos crculos rolantes, o que
requer um corte no DNA.
Quando todo o DNA replicou as duas bactrias so masculinas (F
+
).
Os genes tra S e tra T formam a protena de superfcie de excluso que
impedem o contacto entre as clulas masculinas.
O factor de fertilidade na clula que passou a masculina pode manter-se fora
do seu cromossoma, ou integrar-se nele, passando a chamar-se, neste caso,
HFR, demorando mais tempo a replicar.
*gene tra A: codifica para a pilina
que coloca a bactria feminina em
contacto com a masculina;
*gene tra D: faz parte do tubo de
conjugao por onde passa o DNA;
*gene tra S e tra T: codificam para
protenas de superfcie de
excluso que impedem o contacto
com 2 clulas F+) pelo mecanismo
dos crculos rolantes.
44
As estirpes Hfr so importantes porque permitem estudar a localizao dos genes no
cromossoma bacteriano e demonstram que a maioria dos genes nas bactrias de
cpia nica.
O pili F sintetizado pelas bactrias F
+
. Quando ela produz o pili F, induz a formao de
determinados receptores especficos para fagos F
+
so mais susceptveis para
infeces do que as F
-
.
As estirpes Hfr tm o Factor F integrado no seu cromossoma e podem conjugar com
clulas F
-
mas no as modificam para F
+
.

Recombinao em E.coli:



























10) Gentica de Fagos

So vrus que parasitam e matam bactrias;
Dois fagos com gentipos diferentes podem cruzar-se por avaliao da recombinao
e do mapa gentico;
Permitem estudos genticos na bactria.
Forma dos fagos:
Filamentosa: material genmico enrolado em hlice, protegido por
protenas. Ex: TMV, vrus do mosaico do tabaco.
Forma esfrica ou icosadrica: fago possui cabea (onde se encontra o DNA),
pescoo, colar, core, revestimento, placa basal e fibras da cauda.


45
Infeco por bacterifagos
1. Coliso entre o fago e a bactria:
Maltose aumenta a expresso da protena Ompc (porina);
Magnsio facilita a adeso do fago.
2. Injeco de material genmico:
DNA de cadeia dupla ();
DNA de cadeia simples (M13);
RNA de cadeia simples (MS2);
RNA de cadeia dupla (reovrus).
3. Expresso de genes:
Genes iniciais: asseguram a replicao do material gentico do fago,
suspendendo os processos metablicos que estavam a decorrer na bactria;
Genes mdios: protenas activadoras dos genes tardios;
Genes tardios: asseguram a sntese das protenas da cabea (cpsula), cauda,
pescoo, colo e fibras de cauda formao do virio.

Os fagos podem seguir dois ciclos:
Ciclo ltico no h integrao do material gentico do fago no genoma da bactria.
Infeco da bactria pelo fago (coliso e adeso);
Injeco do material genmico;
Infeco inicial (expresso dos genes iniciais) sntese de DNA;
Infeco tardia (expresso dos genes tardios) sntese da cabea e da cauda;
Self-assemble dos viries;
Lise da bactria por produo de lisozima;
Libertao da descendncia vrica.

Placas fgicas: permitem a deteco da infeco dos fagos. Cada placa fgica representa a lise
de uma bactria o gel de agarose restringe o movimento dos fagos de forma a que eles s
infectem clulas contguas.

Formao do virio
Expresso pelos diferentes genes do fago (iniciais, mdios e tardios);
Virio: partcula vrica completa;
Modelo morfogentico ou self-assembly: a partir das diferentes partes constitutivas do
fago, ele encaixa as diferentes peas para formar o virio.

Ciclo lisognico
DNA do fago integrado no cromossoma da bactria por recombinao local
especifica, formando-se um profago;
Quando a bactria infectada por um fago, ela fica resistente infeco por
novas partculas vricas;
A bactria que contm o DNA do fago integrado a bactria lisognica e o
fago integrado designa-se fago lisognico.

Infeco do fago
O DNA do fago injectado na forma linear e depois circulariza pela ligao das
extremidades cs;
Segue a via ltica ou a via lisognica;
Seguindo a via lisognica, o DNA do fago integrado no genoma da bactria,
por recombinao local especifica (reconhecimento dos locais P e B, attP e attB,
integrase e IHF);
Seguindo a via ltica, ocorre replicao do DNA:
Replicao bidireccional tipo olho (fase inicial);
46
Replicao tardia crculos rolantes (fase tardia).
Um fago s consegue encapsular cerca de 50kb de DNA, logo as molculas de DNA
possuem extremidades cos que so reconhecidas e cortadas de forma a se obterem
segmentos de 50kb.
O genoma , ento, inserido sob a forma de concatmeros conjunto de genomas
uns a seguir aos outros e que esto separados pelas extremidades cos (local cos).
Fago temperado: segue a via ltica ou a lisognica. Ex: herpes labial.

Recombinao entre fagos
Uma bactria s pode ser infectada por uma estirpe de fagos, mas que podem ter
diferentes mutaes;








Geralmente, a replicao do DNA dos fagos d-se independentemente, mas pode
ocorrer recombinao formando-se mutantes duplos os restabelecendo-se o genoma
selvagem.











11) Vrus
Parasitas intracelulares constitudos por complexos supramoleculares, que necessitam
de uma clula hospedeira apropriada para replicar.

Constituio do genoma vrico:
DNA de cadeia simples ou de cadeia dupla (3-200kb);
RNA de cadeia simples ou de cadeia dupla (7-20kb);
Os genomas de DNA podem ser lineares ou circulares;
Os genomas de RNA nunca so circulares;
No existem formas vricas de DNA segmentado, excepto nas plantas;
No h formas vricas de RNA circular nos eucariotas.

Origem:
Fragmentos de DNA nucleide;
Fragmentos de cromossomas derivados de clulas vivas;
Cpias de RNA desses fragmentos.
47
Diversidade vrica:

Estrutura:
Forma icosadrica, filamentosa ou esfrica;

Vrus sem envelope:














Virio: forma extracelular de uma partcula vrica completa;
Nucleocpside: formada pelo genoma mais a cpside proteica, pode estar envolvida
por um envelope.
Normalmente causam doenas: varicela, sarampo, influenza, poliomielite, herpes,
papeira
Clulas infectadas por vrus produzem interfero:
Glicoprotena de vrios tipos:
Interfero (linfcitos);
Interfero (fibroblastos);
Interfero (mitognios).
Podem ser usados na terapia genica:
Gene da CFTR (receptor transmembranar da fibrose cstica) quando recombinado
com o adenovrus usado no tratamento de doentes com fibrose cstica.

Vrus com envelope:

48
Entrada e sada do vrus na clula
1. Ocorre interaco do virio com glicoprotenas (receptores) da superfcie celular.
2. Mecanismos de entrada:
Mecanismo de fuso: o vrus codifica
uma protena com actividade
protoltica (Protena F ou fusognica)
que cria buracos na membrana e
promove a fuso entre duas ou mais
clulas forma-se uma clula
polinucleada;
Mecanismo de endocitose:
formao de coated-pits e vesculas
revestidas de clatrina que sero
encaminhadas para os endossomas
(com o virio), onde ocorre a
digesto do envelope, libertando-se
a partcula vrica. As protenas da
cpside so removidas, ficando o
material gentico livre. Este usado
para a sntese de novos vrus, de
protenas da cpside e do envelope.
3. O vrus abandona a clula por budding reunio da nucleocpside com protenas
transmembranares vricas com formao do envelope, cuja constituio varia em
funo do local onde a clula se forma.


Classificao dos vrus:

Feita com base na classificao dos genomas e na
via pela qual se forma o mRNA.
O mRNA vrico designado por cadeia (+), que
sintetizado a partir de uma cadeia (-) de DNA ou
RNA.


Classes de vrus:
1. Classe I:
DNA de cadeia dupla que passa directamente a mRNA (+) por cpia da sua cadeia.
DNA de cadeia dupla com protenas ligadas covalentemente nas extremidades. Ex:
adenovrus sem envelope;
DNA de cadeia dupla circular. Ex: simian vrus 40 (SV40) papovirus;
DNA de cadeia dupla linear. Ex: herpes e T4 com envelope;
DNA de cadeia dupla e extremidades seladas. Ex: poxvirus com envelope.

2. Classe II:
DNA de cadeia simples (+ ou -) sntese da complementar, obtendo-se DNA de cadeia
dupla sntese do mRNA (+) por transcrio da cadeia (-).
DNA de cadeia simples. Ex: parvovrus sem envelope;
DNA de cadeia simples circular. Ex: M13 e 174.


49
herpes, T4

3. Classe III:
RNA de cadeia dupla usa a cadeia (-) para sintetizar o mRNA (+).
Reovrus sem envelope.

4. Classe IV:
RNA de cadeia simples (+) tem que sintetizar um intermedirio RNA (-) s depois
que se forma o mRNA (+).
4.1) Classe IV a): RNA de cadeia simples (+) que s faz um mRNA. Ex: poliovirus.
4.2) Classe IV b): RNA de cadeia simples (+) que faz dois mRNAs. Ex: sindbis vrus.

5. Classe V:
RNA de cadeia simples (-) que sintetiza o mRNA directamente.
5.1) Classe V a): RNA de cadeia simples (-) no segmentado. Ex: vesicular
stomatitis vrus (VSV).
5.2) Classe V b): RNA de cadeia simples (-) segmentado. Ex: influenza.

6. Classe VI:
RNA de cadeia simples (+) que forma, como intermedirio RNA de cadeia (-), DNA de
cadeia dupla e s depois mRNA.
Retrovirus.

7. Classe VII:
DNA de cadeia dupla, cuja cadeia (+) est incompleta quando o vrus infecta a
clula, completa logo a cadeia (+) e depois sintetiza o mRNA. Ex: hepatitis DNA vrus.











Estratgias de replicao
Ocorre no ncleo da clula hospedeira;
Excepo: poxvirus e poliovirus citoplasma.

RNA replicase:
Existe nas protenas da cpside;
Sintetiza RNA (-) a partir de RNA (+).
Transcriptase:
Sintetiza mRNA a partir de RNA (-).
Transcriptase reversa:
Sintetiza DNA de cadeia dupla, a partir de RNA.

1) Vrus de DNA de cadeia dupla (classe I)
Usam a RNA polimerase da clula hospedeira para sintetizar o mRNA (excepto:
poxvirus replicao no citoplasma);
Codificam protenas da cpside e as necessrias replicao dos seus genomas.
2) Vrus de DNA de cadeia simples (+) ou (-) (classe II)
Codificam para protenas da cpside;
TMV, R17, poliovirus

parvovirus


polioma, S40

Reovirus

M13, 174


Poxvirus

adenovirus

50
Usam os sistemas de transcrio e de traduo da clula hospedeira;
Codificam para enzimas que se encontram no virio capazes de sintetizar mRNA a
partir deste tipo de molde.

3) Vrus de RNA (+) (classes III e IV)
RNA (+) funciona, logo a seguir infeco, como mRNA;
RNA (+) tem cauda poli-A na extremidade 3 e possui modificaes a 5
semelhantes s observadas no mRNA eucariota;
Codificam para enzimas que podem replicar o RNA atravs de um intermedirio de
cadeia (-).

4) Vrus de RNA (-) (classe V)
O RNA (-) serve de molde na sntese de mRNA, por aco da transcriptase vrica do
virio logo aps a infeco.

5) Retrovrus (classe VI)
Cadeia de RNA (+) serve de primeiro molde para a sntese de DNA de cadeia dupla
atravs da transcriptase reversa;
Este DNA integra-se no genoma do hospedeiro e serve como molde para a
transcrio de mRNA.

6) Vrus da hepatite B (classe VII)
Possuem genomas com uma cadeia de DNA (-) completa e uma cadeia de DNA (+)
incompleta;
Aps a infeco, a DNA polimerase completa a cadeia (+), forma-se a molcula de
DNA de cadeia dupla (completa) e ocorre a transcrio do mRNA.

Estratgias de replicao
a) RNAs vricos
Clivagem proteoltica: sntese de poliprotenas e posterior
digesto com protease que as quebra em mltiplas protenas.
Genomas segmentados: alguns genomas de RNA vrico so
constitudos por mltiplas partes de RNA, em que cada uma
delas codifica para uma ou mais protenas.
Nested mRNAs: expressam um conjunto de mRNAs com
extremidades 3 idnticas e com extremidades 5 diferentes, em que cada um deles
produz uma protena especfica. Existe um quadro de leitura diferente para cada um.
Sntese sequencial: sntese de uma unidade longa de RNA (+) que depois separada
em mRNAs para cada protena, por clivagem ou terminao.

b) DNAs vricos
Codificam para mRNAs monocistrnicos;
Promotores de transcrio para todos os genes;
Requerem a formao de um primer;
Splicing alternativo (mRNAs sempre com a mesma extremidade 5).



Coronavirus
(SARS)
Adenovirus
51
Estratgias de replicao por classes vricas

Replicao na classe I (dsDNA)

Poxvrus:
Replica-se no citoplasma;
o nico que codifica para a sua RNA
polimerase;
Possui dsDNA com 130-375kb
covalentemente seladas nas
extremidades;
Forma estruturas em hairpin em cada
extremidade e com sequncias
repetidas (10kb) associadas
replicao;
Codifica para 150-300 protenas;
Regies codificantes esto espaadas,
mas no tem intres;
Regies codificantes nas duas cadeias
do genoma.

1. Entrada na clula e remoo do
core (mecanismo desconhecido);
2-5. Sntese de mRNAs iniciais,
proliferao celular e supresso
imune local;
6-9. Sntese de DNA para
empacotamento e como molde para
a expresso de genes intermedirios
que depois especificam factores da
expresso gentica tardia;
10-18. Transcrio e traduo de protenas estruturais vricas, partculas que se
renem no Golgi e libertao do virio na clula lisada ou infeco de clulas
adjacentes.

SV40 (vesicular stomatis vrus)
Expresso e replicao do genoma circular so feitas
no ncleo;
Utiliza as polimerases celulares;
O seu genoma constitudo por:
Regio inicial:
Codifica para as protenas T (20-90kDa)
requeridas para o inicio da replicao.
Regio tardia:
Codifica para as protenas da cpside (VP1,
VP2 e VP3) que se formam por splicing
alternativo de RNAs sobrepostos.
Regio de regulao:
Contm local de origem de replicao,
promotores (sequncia TATTTAT
equivalente TATA Box) e reguladores de
expresso.

52
Adenovrus:
Replicao ocorre no ncleo;
Usa o splicing alternativo, genes sobrepostos e duas cadeias de DNA para
maximizar a utilizao do seu genoma;
O primeiro transcrito pode formar uma protena inteira ou vrias protenas
consoante o splicing sofrido.


















Replicao na classe II (ssDNA)
Parvovrus:
Podem possuir cadeias (+) ou (-) mas em viries separados;
Genomas muito pequenos (4,5-5kb);
Codificam para protenas da cpside por traduo de mRNAs derivados
do splicing alternativo;
Multiplicam-se:
Na presena de vrus mais complexos. Ex: adenovrus;
Em clulas com multiplicao rpida. Ex: clulas sanguneas e tumorais.
Facilmente transmissveis;
Responsveis por infeces do tracto respiratrio inferior;
Eritema infeccioso.

Fagos M13 e 174:
DNA de cadeia simples circular;
Replicao por formas replicativas.


Replicao na classe III (dsRNA)
Reovrus:
RNA de cadeia dupla em 10 segmentos;
Codificam para a transcriptase e polimerase;
Fazem o mRNA a partir da cadeia (-);
Pr-core:
Estrutura que contm as cadeias de RNA (+);
A sntese da cadeia dupla de RNA feita pela
polimerase dentro do pr-core.
Replicao na classe IV (ssRNA (+))
Poliovrus:
53
Replicao ocorre no citoplasma;
Possui uma cadeia de RNA (+) que funciona como mRNA na fase inicial da
infeco;
No modifica o mRNA celular, mas afecta a traduo por bloqueio da sntese
proteica na fase de iniciao;
A replicao iniciada atravs da traduo do poli-RNA (+) numa poliprotena
precursora NCVP (240kDa).
Patognese:
Entrada pela boca;
Replicao na faringe, tracto gastrointestinal e sistema nervoso;
Atinge vasos linfticos, fibras nervosas e sistema nervoso central;
Destruio dos neurnios motores;
Paralisias e asfixia.

NCVP:
clivada nos locais nascent cleavages e forma as protenas vricas VPO
(VP4 e VP2), VP3 e VP1 que vo formar a estrutura pr-vrica;
A regio carboxlica possui as protenas necessrias replicao:
VPg: associada formao do primer;
Replicase: RNA polimerase RNA-dependente formao de cadeia (-) a
partir da cadeia (+);
Proteases: cliva os resduos de glutamina-glicina da poliprotena.

Replicao do RNA:
feita por intermedirios replicativos;
As cadeias (-) servem de molde para a sntese de novas cadeias (+);
As novas cadeias (+) servem de:
Molde para a sntese de novas cadeias (-);
mRNA para a sntese de protenas;
genomas de novos viries.
















54
Togavirus:
Genoma dicistrnico (2 AUG);
Cistro 5 codifica para a replicase vrica;
Cistro 3 codifica para o precursor das protenas vricas;
Rubola e encefalites vricas equinas.



Coronavirus:
Genoma com nested mRNAs;
7 cistres distintos (7AUG);
Severe Acute Respiratory Symdrome (SARS): cefaleias,
tosse, pneumonia, diminuio do n glbulos brancos,
dores articulares, febre alta e garganta seca.



















Replicao na classe V (ssRNA (-))

VSV:
Genoma de RNA (-) no segmentado serve de molde para a sntese de mRNA
(sem CAP e cauda poli-A), pela transcriptase vrica, que traduzido em:
Protena M (matriz): situada entre a cpside e o invlucro;
Protena G (glicoprotena): interage com os receptores celulares;
Protenas L e NS: na forma de complexo formam a transcriptase vrica;
Protena N: reveste o genoma, promove a sntese de cadeias (+) e
replicao. Em baixas concentraes, no forma mRNA.

55





















Influenza A:
Orthomyxoviridae;
Esferas de 100nm;
8 nucleocpsides por virio;
13kb genoma de RNA (-)
dividido em 8 segmentos;
Replicao no ncleo e reunio
no citoplasma;

Protenas do envelope:
HA (hemaglutinina): trmero de
glicoprotenas envolvido na adeso.
NA (neuraminidase): tetrmero
envolvido na libertao do endossoma.
M1: protena membranar da matriz.
M2: protena membranar dos canais de
ies. Ausente nos tipos B e C.

Ribonucleoprotenas:
8 Segmentos de RNP por genoma;
Cada um dos 8 (-) segmentos est
envolvido por NP (protenas da
nucleocpside);
Uma cpia do complexo da polimerase
(PB1, PB2, PA e produtos dos segmentos
1-3) no terminal 3 de cada segmento.

56
Protenas no estruturais:
NS1 e NS2 localizadas no ncleo, codificadas
por ORFs sobrepostas dos RNAs spliced;
NS2 a forma de fuso da NS1.

Etiologia:
Passa de pessoa para pessoa por aerossol,
directa ou indirectamente (no tem vectores), animais de criao e aves;
Causa cefaleias, mialgias, febre e tosse;
Perodo de incubao 1-3 dias;
Sintomas duram 2-7 dias;
Intensidade dos sintomas depende da espcie vrica;
Espcies so descritas com a antigenicidade de HA e NA (designadas por nmeros).

Replicao na classe VII (incomplete dsDNA)
Hepadnavirus:
Cadeia de DNA (-) completa;
Cadeia de DNA (+) incompleta;
DNA polimerase vrica, presente na nucleocpside, completa a cadeia (+);
O RNA molde para a sntese de cadeias de DNA (-) completas o pr-genoma;
Responsvel pelas hepatites vricas sricas e cancros do fgado.

Ciclo de infeco:

1-4. Vrus entra na clula, via receptores dos
hepatcitos;
5-6. Sntese do pr-genoma e transcritos sub-
genmicos que depois so exportados para o
citoplasma;
7-9. Traduo de protenas de superfcie e protenas
X a partir de pequenos RNAs. As protenas da
cpside e a polimerase (TR) so transcritas a partir
do pr-genoma;
10-11. Empacotamento do pr-genoma com a TR e
posterior sntese de DNA;
12. infeco inicial e direcionacmento do DNA para
o ncleo;
13-15. Reunio da partcula, aquisio de membrana
e sada.




Replicao na classe VI (ssRNA (+))
Retrovrus:
Genoma de RNA (+) que serve de molde para a sntese de DNA de cadeia dupla,
pela transcriptase reversa;
Fazem parte dos retrovirus, os agentes causadores do cancro e da SIDA;
Os genes gag, pol e env fazem parte do genoma destes vrus:
gag: codifica para um precursor poliproteico que depois clivado e forma as
protenas da cpside;
pol: codifica para a transcriptase reversa e para a integrase;
env: codifica para o precursor das glicoprotenas do envelope.
57
No genoma existem:
Duas regies no traduzidas, U5 (5) e U3 (3), necessrias replicao e
transcrio;
Uma sequncia repetida (R) em cada extremidade do genoma;
Uma molcula de tRNA de extremidade 5 que serve de primer transcriptase
reversa.

Ciclo de vida do retrovirus:
Retrovirus (ssRNA (+)) infecta a clula
hospedeira;
Nucleocpside perde as protenas da
cpside no citosol e liberta o RNA;
Transcriptase reversa sintetiza uma
cadeia de DNA a partir da cadeia de
RNA;
Forma-se um hbrido RNA-DNA;
A transcriptase reversa forma a
segunda cadeia de DNA;
DNA de cadeia dupla integrado no
cromossoma da clula hospedeira
integrase do gene pol;
O DNA vrico transcrito a mRNA;
mRNA vrico traduzido, formando-se
as vrias protenas vricas;
Formam-se novos retrovirus;
Virio libertado.

Transcriptase reversa:
Sntese de DNA a partir de RNA;
Degrada o RNA dos hbridos RNA-DNA (actividade
RNase H);
Sntese de DNA de cadeia dupla, a partir de DNA de
cadeia simples;
Cliva o RNA da extremidade 5 da sequncia U3.



Na extremidade 3 temos a sequncia R e a U3.
Na extremidade 5 temos a sequncia R, a U5 e o PBS, ao qual est ligado o tRNA que
serve de primer.
H sntese do U5 e do R, sentido 5-3.
A RNase H remove o RNA hibridado com o DNA recm formado, ou seja, remove a
sequncia R e U5 do RNA).
O tRNA salta de 5 para 3 emparelhando a sequncia R copiada com a sequncia R em
3 do RNA.
Ocorre sntese da cadeia de DNA at extremidade inicial, copiando-se a sequncia
PBS.
O RNA hibridado removido pela RNase H, excepto uma pequena poro que vai
servir de primer para a 2 cadeia de DNA.
Inicia-se a sntese da 2 cadeia de DNA, sentido 5-3.
58
removido o primer pela RNase
H e o tRNA da cadeia inicial.
D-se um novo salto na 2
cadeia de DNA de modo a que a
sequncia PBS emparelhe com
essa mesma sequncia, na 1
cadeia.
Ocorre a sntese completa do
DNA.
Ambas as cadeias ficam com um
tamanho superior ao RNA que
lhe deu origem pois possuem
nas extremidades as sequncias
LTR (U3+U5+R) (LTR 5 funciona
como um promotor e LTR 3
como um sinalizador de poli-
adenilao), com funes
diferentes.
Entre cada LTR esto o gene gag,
sinal de terminao, gene pol e
gene env.





SIDA
HIV (retrovirus):
Enfraquecimento do sistema imunitrio;
Clulas-alvo:
Linfcitos T-helper (com receptores CD4);
Macrfagos;
Clulas dendrticas.
Infeco a curto prazo: alta concentrao de vrus;
Infeco a longo prazo: baixa concentrao de vrus.

Na imagem, v-se que os antignios CD4 na
superfcie celular dos linfcitos T-helper so os
receptores do HIV. As clulas HeLa no podem ser
infectadas pelo HIV e no possuem antignios CD4.
Nesta experincia tenta-se comprovar que se se
expressarem os antignios CD4 nas clulas HeLa o
suficiente para as tornar susceptveis para a
infeco por HIV.
Um plasmdeo contendo os elementos de um
vector retroviral e o cDNA para CD4 foi transferido
para uma placa de cultura. As clulas G418-
resistentes foram isoladas e testadas para a
expresso das CD4 pela tcnica das rosetas: um
anticorpo de ratinho para as CD4 adicionado s
clulas, e as colnias ligadas ao anticorpo (e,
portanto, expressando nas superfcie celular as
CD4) foram identificadas por adio de eritrcitos humanos conjugados com
59
imunoglobulinas anti-ratinho de coelho. As clulas sanguneas juntas s colnias
que se ligaram ao anticorpo de ratinho, formam rosetas. Estas clulas produzem
retrovirus carregando o gene das CD4 que infecta as clulas humanas.
Estas clulas produtoras foram tratadas com mitomicina de forma a prevenir a sua
diviso e infectarem as clulas HeLa. As clulas G418-resistentes foram de novo
seleccionadas e as colnias expressando as CD4 foram detectadas pela tcnica das
rosetas. Estas clulas HeLa CD4-positivas foram testadas para verificar se poderiam
agora ser infectadas por HIV, o que se comprovou.
Assim, a CD4 o receptor para o HIV.

Patologias associadas:
Sarcoma de Kaposis: Reticulose maligna, multifocal, com metstases, cujas
caractersticas recordam as de um angiossarcoma, e que afecta
principalmente a pele, se bem que se observem por vezes leses viscerais;
Pneumonia (pneumocystis carinii).

Maior susceptibilidade a infeces oportunistas;

Transmisso:
Via sexual;
Transfuses (sangue, factores de coagulao);
Utilizao de agulhas comuns na administrao de drogas;
Transmisso materna pela placenta (30% das mes infectadas transmitem o
vrus descendncia.

Ciclo de infeco do HIV:


O DNA integrado no cromossoma da clula, por aco da integrase, e o HIV passa a designar-
se por provirus. A regulao da transcrio do RNA depende da quantidade de protena Tat e
Rev .
No inicio do ciclo, devido ausncia de protena Rev, s sai do ncleo RNA processado, de
modo a que aps a traduo se obtenham as protenas Tat, Rev e Nef. A protena Tat estimula
a produo de mais RNA.
60
Quando a quantidade de protena Rev muito elevada, o RNA sai do ncleo sem ser
processado, permitindo a formao de protenas da cpside, transcriptase reversa
resultado da expresso dos genes gag, pol e env.
O vrus sai da clula, adquirindo um envelope lipdico.

Funes dos genes do HIV:
gag: codifica para protenas estruturais. A protena Pr55 cortada pela protease em
quatro protenas estruturais menores;
pol: codifica para a transcriptase reversa e para a protease, que quebra a Pr55, que faz
parte da Pr160 produzida pelo RNA-gal-pol que d origem transcriptase reversa e
integrase;
env: codifica para protenas da cpside. A protena Pr160 clivada em gp120 (salienta-se
do envelope e liga-se s CD4) e gp41 (protena transmembranar associada ao gp120 e que
requer fuso). Estimula a sntese de RNA;
rev: controla o splicing e a transferncia do RNA no processado (9kb) e parcialmente
processado (4kb, sem um intro) e bastante processado (2kb, sem dois intres) para o
citoplasma, depois de reconhecer uma sequncia especifica Rev Response Element
(RRE) que existe na
extremidade 3 destes
RNAs;
nef: mantm um elevado
nvel de infeco;
vif: aumenta a capacidade
de infeco do vrus;
vpr: codifica para um
activador da transcrio in
vitro;
vpu: participa na reunio do
vrus, no budding e na
libertao dos viries das
clulas infectadas;
tat: codifica para a prot. Tat
induz um elevado nvel
de expresso dos genes do
HIV.



Tipos de terapias:
a. Terapia pela AZT (azidotimidina) e DDI: a AZT
actua como um terminador da cadeia (pois, ao ser
adicionada, a cadeia fica com a extremidade 3
sem OH livre, logo mais nenhum nucletido
poder ser acrescentado) durante a sntese do
DNA provrico. Logo, no permite o crescimento
do DNA e afecta todas as clulas. A DDI tem sido
usado no tratamento de crianas com HIV.

b. Terapia por inibidores das proteases: Os Inibidores de Proteases so uma classe de
ARV que actuam bloqueando a funo da protease, uma protena de que o HIV
necessita para fazer cpias de si mesmo.

61
c. Terapia por molculas de CD4 solveis (sCD4): se se fizer molculas de CD4
(receptores dos vrus) com a sequncia KDEL, as molculas no saem da clula,
ficando retidas no Reticulo Endoplasmtico.

d. Terapias para o futuro:











Tipos de diagnstico para uma possvel terapia:
a) Sinais e sintomas: o paciente observado para a deteco de manifestaes tpicas de
uma infeco vrica;
b) As clulas do paciente so recolhidas para serem examinadas de forma a evidenciar a
infeco vrica, como efeitos citopticos e antignios vricos;
c) Tcnicas de cultura;
d) Uso de microscopia electrnica para a visualizao directa do vrus;
e) Anlises genticas (PCR);
f) Testes serolgicos para anticorpos.


Agentes com propriedades semelhantes aos vrus:
Viries:
Agentes infecciosos que causam doenas nas plantas superiores;
No Homem, causam Hepatite D, por sequestro ou destruio do 7S RNA heptico
(componente da SRP) o viride est na cpside do vrus da Hepatite B;
Compostos por RNA de cadeia simples, circular que pode formar regies de dupla
cadeia;
RNA cataltico (ribozima) com capacidade de quebrar e formar ligaes covalentes;
Replicam-se por crculos rolantes;
Codificam para uma protena antignio .

Pries:
Agentes infecciosos compostos exclusivamente por uma nica sialo-glicoprotena
(PrP
27-30
);
No possuem cidos nucleicos;
Produto do gene humano PrP localizado no cromossoma 20;
A protena PrP encontrada nas clulas neurais e a sua funo sequestrar Cu
2+
;
Pries no ser humano:
Sndroma de Alper (em crianas).
Espordico (>85%):
Doena de Creutzfeldt-Jacob (CJD) perda do controlo motor,
demncia, paralisia e morte. Transmitida por instrumentos cirrgicos
mal esterilizados ou por transplantes de orgos;
Insnia fatal espordica (FFI) insnia progressiva e atrofia severa e
selectiva do tlamo.

62
Gentica (<15%):
Aparentemente autossmica dominante;
CJD familiar (
f
CJD);
Sndroma de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS) ataxia cerebral,
problemas motores, demncia. Ocorre aos 40-50 anos;
FFI;
Ambiental/iatrognica (<1%):
Kuru devido ao canibalismo;

v
CJD nova variante, proveniente do consumo de produtos animais
com BSE;
Contaminao com hormona de crescimento humana;
Transplantes da crnea e dura mater.
Equipamento contaminado:
Elctrodos de EEG:
Instrumentos neurocirrgicos.
Transmisso: horizontal, directamente de pessoa para pessoa ou atravs da
ingesto de carne contaminada.
Infeco:
Adquirida: cirurgias, injeco de hormonas e transplantes da crnea.
Aparentemente transmitida de uma forma autossmica dominante:
alteraes no gene que codifica para a PrP.
PrP
c
:
PrP celular;
Glicoprotena da superfcie celular da membrana;
Estrutura secundria em -hlice;
Solvel;
Facilmente digerida por proteases.

PrP
sc
:
Estrutura primria semelhante PrP
c
;
Estrutura secundria em camada ;
Insolvel;
Tem a capacidade de transformar a PrPc em PrPsc;
Agregam-se entre si, depositam-se na forma de placas de amilide, provocando
degenerescncia e deteriorao cerebral.

Pries nos animais (perodo de incubao de 2-8 anos):
Encefalopatia espongiforme bovina (BSE) (doena das vacas loucas) Agitao e
agressividade, perda das funes motoras, perda de apetite, convulses, cegueira,
auto-mutilao e dificuldade em engolir.
Scrapie (carneiros e ovelhas);
Encefalopatia transmissvel da marta (TME);
Chronic Wasting Disease (CWD) (veados e alces).

Mtodos laboratoriais para a confirmao do diagnstico:
No h testes sanguneos para a deteco de pries ou para o rastreio de portadores;
Identificao por exame: microscpio de tecido cerebral;
Tcnicas de microscopia e colorao para deteco das formas resistentes protelise
da protena do prio modificado (PrP
res
).


63
12) Mutaes do DNA

Espontneas:
Por interaco com o meio ambiente;
Por mecanismos celulares normais:
Isomerizao: por tautomerismo das bases;
Depurinao: por perda de uma base;
Desaminao: por converso de citosina em uracilo;
Leso oxidativa: por espcies reactivas com o oxignio (O
2
-
, H
2
O
2
e OH).
Induzidas:
Fsica:
Radiaes U.V.;
Radiaes ionizantes (raios X e raios ).
Qumica (mutagnios):
Anlogos das bases nucleotidicas, agentes qumicos e intercalantes;
Elementos de transposio.
Recombinao.
Rearranjos cromossmicos.


Mecanismos de mutagnese:
Desemparelhamento especifico: mutagnios alteram especificamente uma base no
DNA e causam mutaes:
Agentes alquilantes: etilmetano sulfunato e nitrosoguanidina;
Agentes interalantes: proflavina, acridina e compostos ICR;
Agentes que causam desaminao: io bissulfito e cido nitroso.
Incorporao de bases anlogas: compostos que so semelhantes s bases do DNA,
que so incorporados numa das cadeias do DNA e provocam mutaes:
5-bromouracil e 2-amino-purina.

Perda de especificidade do emparelhamento: mutagnios que provocam a leso de
uma ou mais bases o que impede o correcto emparelhamento:
Luz U.V., aflatoxina B
1
, benzo(a)pireno.

Consequncias da mutagnese:
Substituio de um par de bases, que pode ser observado:
A nvel do DNA:
Transies: substituio de uma purina por outra purina ou substituio
de uma pirimidina por outra pirimidina;
Transverses: substituio de uma purina por uma pirimidina ou vice-
versa;
Mutaes pontuais.
A nvel da protena:
Mutaes silenciosas;
Mutaes neutras;
Mutaes absurdas;
Mutaes em sentido.
Mutaes frameshift (alterao do quadro de leitura que pode levar
terminao prematura);
Adies e delees;
Pontos quentes (hotspots): zonas do DNA com maior tendncia para serem
mutadas.

64
Mutaes espontneas

a) Isomerizao: ocorre por tautomerismo de bases: amino imino ou ceto enol.
b) Depurinao: perda de uma base por no haver a ligao glicosdica entre a base e a
desoxirribose local apurnico/local apirimidnico. As clulas de mamferos sofrem
10000 depurinaes no DNA, em cerca de 20h a 37C, que depois so corrigidas pelos
sistemas de reparao.

c) Desaminao: por converso de uma citosina em
uracilo durante a replicao do DNA, o que causa
transies. O par de bases U-G resultante
reconhecido como anormal e ser reparado de
forma a restaurar o par C-G selvagem.
Alternativamente, a mutao pode ser corrigida
atravs da replicao.
Aps uma ronda da replicao, uma molcula de
DNA filha ter o par mutado e a outra o par
selvagem. O uracilo ser removido e recolocada a
timina, gerando um DNA mutante em que o par T-A
substitui o par C-G.



d) Leso oxidativa:
Resultante do mecanismo aerbio normal das
bases;
Causa a oxidao e formao de espcies
reactivas de oxignio, como radicais superxido
(O
2
-
), perxido de hidrognio e radicais
hidroxilo;
Provocam transverses (purina pirimidina)
que podem ser reparadas pelo Sistema GO.

65
Adio Deleo
Mutaes induzidas

a) Desemparelhamento especfico: Mutagnios alteram especificamente uma base no DNA e
causam mutaes.
Hidroxilamina (HA): provoca transies.









b) Agentes alquilantes: no so incorporados no DNA mas causam transies. Cedem grupos
alquilo s bases, levando ao emparlhamento incorrecto.
Etilmetano sulfonato (EMS);
Nitrosoguanidina (NA): tem afinidade para as forquilhas de replicao.













c) Agentes intercalantes: podem provocar
adies ou delees, alterando o
quadro de leitura. S so activos
durante o processamento do DNA
(reparao ou recombinao).
Proflavina;
Acridina;
Compostos ICR;
Brometo de etdio.



66
Adio Deleo
d) Slipped-strand mispairing:










e) Desaminao oxidativa: cido nitroso e ies bissulfto.



















f) Incorporao de bases anlogas: compostos que so
semelhantes s bases do DNA so incorporados numa das
cadeias do DNA, provocando mutaes:
BrdU (bromodesoxiuridiba) susceptvel de sofrer
isomerizao estabelecendo trs pontes de hidrognio,
emparelhando com uma purina;
2-AP (2-aminopurina).



g) Perda de especificidade de emparelhamento: causada por agentes qumicos (aflatoxina B1
e benzo(a)pireno) por metabolizao do compostos solveis e com afinidade para o DNA.
Aflatoxina B1 que provoca cancro do fgado;
Benzo(a)pireno que cria locais apurnicos e causa transverses.

Uracil-DNA glicosilase
67
Mutaes pontuais

Resultam da troca de pares de bases que se reflectem nas protenas:
a) Mutaes silenciosas: ocorre a troca de uma base, mas na traduo incorporado o
mesmo aminocido que seria adicionado no DNA selvagem, levando formao da
mesma protena, logo com a mesma funo. DNA , Protena =, funo =;
b) Mutaes neutras: h troca de uma base que conduz
insero de um aminocido diferente do que seria
incorporado no DNA selvagem, formando-se uma protena
diferente, mas com a mesma funo da esperada. DNA ,
Protena , funo =;
c) Mutaes absurdas (nonsense): h troca de uma base que
leva ao aparecimento precoce de um codo STOP. Forma-se
uma protena menor, logo diferente, e, portanto, cm
diferente funo. DNA , Protena , funo ;
d) Mutaes sem sentido (missense): a alterao sofrida pelo
DNA leva formao de uma protena com uma sequncia
diferente, logo tem diferente funo. Porm, neste caso, a
funo da protena condicionada pela temperatura.
Mutaes termossensveis. DNA , Protena , funo ;
e) Mutaes frameshift: ocorre alterao do quadro de leitura
por adio ou deleo de bases. O quadro de leitura pode
ser restaurado se o n de adies = n de delees e se
houver adio/deleo de mltiplos de trs bases.

f) Anomalias cromossmicas: envolvem alteraes em grandes egmentos do DNA.
Surgem devido a erros nos mecanismos de reparao das quebras de DNA de cadeia
dupla.
Inverso: segmento correcto de um cromossoma invertido, ou seja, passa a
possuir uma orientao incorrecta;
Deleo: quando um fragmento de um cromossoma cortado e removido;
Translocaes balanceadas: trocas recprocas de segmentos de DNA
cromossomais. Surgem quando as quebras so religadas nos cromossomas
incorrectos;
Insero: quando um fragmento de um cromossoma inserido noutro.

g) Perda de especificidade de emparelhamento:
Luz UV:
Leva formao de dmeros de timina;
Leva formao do 6-4-fotoproduto (timina e citosina);
Causa transies (substituio de uma purina por outra purina ou
substituio de uma pirimidina por outra pirimidina) e raramente
transverses (substituio de uma purina por uma pirimidina ou vice-versa);
Xerodermia: cancro da pele por formao de dmeros de timina.

Identificao de mutagnios
Teste de Ames:
Avalia o poder mutagnico de compostos carcinognicos para deteco de
revertentes (passagem de mutantes ao estado selvagem);
Muitos carcinognios so s mutagnios depois de serem activados por
metabolizao heptica;
Agentes mutagnicos:
68
Oxidantes (tabaco e dicloreto de etilo): levam formao de radicais
de oxignio que tm afinidade para as bases do DNA;
Alquilantes (etilmetano sulfonato, nitrosoguanidina);
Anlogos de bases (bromo-uracil e 2-aminopurina);
Intercalantes (proflavina, acridina e
compostos ICs).



Teste de Ames em bactrias:
Estirpe de Salmonella auxotrfica relativamente
a um certo aminocido;
Sistema de reparao por exciso encontra-se
inactivo;
No possui camada lipopolissacardica.




Teste de Ames com enzimas de ratinho:
Removem-se as clulas do fgado do ratinho e homogenezam-se e centrifuga-
se de forma a remover as enzimas hepticas;
As enzimas so adicionadas s estirpes bacterianas em estudo e colocadas em
presena de um mutagnio, excepto no ensaio de controlo;
Plaqueamento em meio mnimo;
Comparao do n de revertentes nos ensaios com o mutagnio em relao
ao ensaio de controlo.

Outras mutaes

a) Mutaes por transposio: causadas por elementos de transposio (ET) que tm a
capacidade de saltar ao longo do DNA. Causam alteraes cromossmicas (delees,
inverses, inseres e translocaes);

b) Mutaes reversveis: a base alterada reposta pela original havendo correco das
mutaes criadas inicialmente.
Inseres e mutaes pontuais so reversveis;
Delees so irreversveis.

c) Mutaes ribossomais: substituio de aminocidos que distorcem a subunidade
menor do ribossoma (30S) e induzem a entrada de uma molcula de aminoacil tRNA
errada;

d) Mutaes supressoras: eliminam o efeito de uma mutao sem reverterem a alterao
inicial do DNA, ou seja, suprimem as mutaes existentes sem alterarem as mutaes
que existiam inicialmente.
Intragnicas: h uma nova mutao no mesmo gene, mas num local diferente,
como no caso da insero de uma base, sendo inseridas mais duas bases para
restaurar o quadro de leitura;
69
Extragnicas: h correco da mutao por um tRNA mutante que l o codo
mutado, com o mesmo significado que o codo original. O tRNA mutante
corrige:
Mutaes absurdas;
Mutaes sem sentido;
Mutaes frameshift.

13) Mecanismos de reparao

As clulas possuem sistemas de reparao enzimticos que tm como objectivo a eliminao
de mutaes. A falncia destes sistemas est relacionada com a manuteno das mutaes e o
desenvolvimento de doenas humanas.

Preveno de erros

Detoxificao: a superxido dismutase previne a formao de leses oxidativas ao
converter ao perxidos em H
2
O
2
que ser neutralizado pela catalase, formando-se H
2
O e
O
2
.

Remoo directa de leses
Reparao da alquilao: 6 metiltransferase:
Codificada pelo gene ada;
Transfere grupos metilo e etilo da base para a enzima, revertendo a mutao;
Um grupo cistena consegue deslocar o grupo alquilo para a metiltransferase.
Esta s actua uma vez porque o grupo alquilo que est agora acoplado enzima
no pode ser removido: tem que ser sintetizada uma nova enzima.

Fotorreactivao: Fotoliase/PRE:
Codificada pelo gene phr;
Existe na bactria e em certos eucariotas inferiores mas no no
homem;
A fotorreactivao permite reparar as mutaes provocadas por
aco dos raios UV (ex.: formao de dmeros de timina e do 6-4-
fotoproduto (certas plantas e Drosophila)).
A fotoliase liga-se ao dmero de timina e na presena de luz visvel
(320-360nm), usa a energia absorvida para quebrar a estrutura
dimrica em 2 timinas separadas.
Na ausncia de luz visvel, no removido apenas o local
incorrecto, mas tambm cerca de 15-20 nucletidos. O espao
removido preenchido pela aco da DNA polimerase e da DNA
ligase. Recorre-se a outros mecanismos de reparao: exciso,
sntese por transleso, propensa a erros, ps-replicao.


70
AP endonuclease
DNA ligase
Reparao por exciso
Geral: Sistema UvrABCD:
Corrige leses que causam distoro na dupla hlice
do DNA (fotoprodutos, UV e adio de quimicos);
Precisa do produto dos genes UvrABCD, ou seja, as
respectivas protenas;
UvrA reconhece a leso, liga-se a UvrB, UvrC liga-se
depois de se ter libertado a UvrA e faz um corte de
cada um dos lados da leso, UvrD desenrola o DNA
cortado (correspondente leso) e liberta-o, DNA
polimerase I sintetiza a cadeia e a DNA ligase liga o
DNA sintetizado.

Especfica (BER):
DNA glicosilase:
DNA glicosilase reconhece e repara bases desaminadas (uracilo e
hipoxantina (adenina desaminada)), bases metiladas e oxidadas;
Remove a base, cria locais AP, depois corrigidos pela AP endonuclease.
AP endonuclease:
Esta cliva as ligaes fosfodister junto ao local AP ( removida no s a
base mutada como tambm alguns nucletidos adjacentes, formando-se
uma lacuna no DNA, preenchida pela DNA polimerase I e ligados os
nucletidos pela DNA ligase.


Sistema Go:
O sistema Go (guanina oxidada) corrige
mutaes causadas por leso oxidativa:
MutM: produto do gene mutM, reconhece o C-Go, eliminando
a guanina oxidada e restabelece o gentipo;
MutY: produto do gene mutY, reconhece o A-Go, removendo
A;
MutT: produto do gene mutT, hidrolisa a 8-oxo-dGTP a 8-
oxodGMP.


71
Reparao ps-replicao

Por recombinao:
Um DNA com uma mutao numa das cadeias quando replica origina um DNA
selvagem (cadeia sem mutao) e um DNA com uma lacuna na cadeia
complementar mutao.
A protena RecA promove a troca de cadeias e o produto das protenas RecBCD
permite o desenrolamento das cadeias de DNA, com formao de orelhas de
coelho, e corta a sequncia no local Chi.
Assim as protenas RuvA reconhecem as estrutura de holliday, a RuvB funciona
como helicase e a RuvC corta a estrutura resolvendo-a, e o DNA fica com a lacuna
preenchida por aco da DNA polimerase (ver pgina 32).

Por recuperao:
Neste caso o DNA reparado mas no na totalidade, ou seja, a falha corrigida
mas a mutao mantm-se.
Temos uma molcula de DNA com um dmero de timina no corrigido, este
replica e origina um DNA normal e outro com uma falha na cadeia complementar
ao dmero de timina, j que a DNA polimerase no o reconhece.
Atravs das protenas RecA, RuvB, RuvC e RuvA, RuvB e RuvC ocorre migrao de
um brao da cadeia do DNA normal que igual lacuna do DNA mutado.
A DNA polimerase preenche a nova lacuna formada no DNA selvagem;
O DNA mutado continua com a mutao, mas j no tem lacuna, sendo activado
o sistema SOS.

Por emparelhamento incorrecto (mismatch repair):
O local de origem de replicao das bactrias (GATC) tem que ter as duas
adeninas, das duas cadeias complementares, metiladas, pela Dam metilase, para
que se inicie a replicao;
Formam-se 2 DNA hemimetilados, em que a cadeia me a que metilada;
Pode-se formar um emparelhamento incorrecto durante a replicao (GT ou CT,
GA ou CA) que tem de ser reparado;
A cadeia me serve de molde, sendo reparada a cadeia filha, sendo o
reconhecimento das cadeias feito pela adenina metilada na seq.GATC;
As enzimas que vo actuar so codificadas pelos genes mut:
72
mutS e mutL: originam as protenas mutS e
mutL que interagem com o local GT;
mutH e mutL: originam as protenas mutH e
mutL que interagem com o local GT e CT;
mutY origina a protena mutY que interage
com o local GA (e CA);
mutH: origina a protena mutH que cliva a
cadeia filha removendo no s o
emparelhamento incorrecto como tambm
alguns nucletidos adjacentes, o corte pode
ser feito aps ou entre as 2 seq.GATC;
mutU: origina a protena mutU que tem
funo de helicase, separando as duas
cadeias.
Tambm actuam as SSB que estabilizam as cadeias
de DNA separadas; a DNA polimerase e a DNA
ligase.





Por emparelhamento incorrecto (mismatch repair) nos
mamferos:
A sndroma HNPCC atribuda a mutaes nos genes que
codificam as protenas MMR. Os genes mais frequentemente
envolvidos so o MLH1, MSH2 e o MSH6. Os outros trs
genes do sistema MMR, PMS1, PMS2 e MLH3, s raramente
tm sido associados doena.
A falncia do sistema MMR habitualmente s se manifesta
quando h inactivao de ambos os alelos (fentipo
recessivo). Uma manifestao precoce desta insuficincia o
aparecimento de instabilidade dos microssatlites.

MutS (Msh2/Msh6): reconhecem o emparelhamento
incorrecto de 1bp;
MutS (Msh2/Msh3): reconhecem 2-12bp;
MutL (Msh1/Pms2): funo desconhecida;
PCNA: necessrio para a maquinaria replicativa e interage
com Msh2 e Msh6;
RPA: protege o DNA de cadeia simples e previne a aco
as exonucleases II;
Exonuclease I;
Pols /: refazem a cadeia de DNA.


Sistema bypass reparao propensa a erros (circuito secundrio):
um sistema indutvel que permite a sobrevivncia da clula em situaes de
stress, em que a replicao pra quando chega leso.
Utiliza o produto dos genes umuC e umuD que codificam para protenas
associadas DNA polimerase III que introduz bases mesmo na ausncia de um
molde (o que conduz a mais mutaes) e requer a protena RecA.

73
Sistema SOS:
um sistema indutvel, geralmente usado para reparar leses provocadas por
raios UV, que quando, durante a replicao, encontrada uma mutao, a
sntese pra;
Em condies normais mantm-se um nvel basal de protena RecA que se
envolve essencialmente na recombinao do DNA, mas estes nveis aumentam
quando a bactria apresenta mutaes em que necessrio activar o sistema
SOS.
Os genes que intervm neste sistema funcionam como um opero cujo repressor
o LexA.
A protena RecA liga-se ao DNA de cadeia simples, actuando no opero e clivando
o seu repressor que est ligado sua regio promotora e os genes do sistema
SOS so expressos, uvrT e uvrB;
O DNA , ento, reparado por recombinao, exciso, sntese bypass, alquilao
ou sistema Go, cujos genes esto sob o controlo de LexA.



Mecanismo de sntese de transleso do DNA
Poli eta ():
Insere adenosinas no local oposto a dmeros de TT;
Baixa fidelidade;
Baixa processividade;
Pode dar origem a erros noutro tipo de leses;
o produto do gene XPV.

Pol zeta () e Rev 1:
Rev 1 insere bases ao acaso no local oposto a TT;
Pol zeta () faz a extenso de vrias bases;
Baixa fidelidade;
Baixa processividade.
74
Inibio da transcrio
RNA polimerase II
parada
Remoo da RNA polimerase
II parada por enzimas de
reparao
Vias BER em Mamferos:

APE1: nuclease de
exciso;
XRCC1: x-ray-cross-
complementing protein 1;
PAPP: poli-ADP ribose
polimerase;
PNK: polinucleotide
kinase;
FEN1: enduclease de
exciso.














Reparao ligada via BER e NER
Reparao por exciso de bases (BER): Este
mecanismo corrige a maior parte das alteraes
do DNA incluindo a depurinao espontnea;
A base removida por uma DNA glicosilase;
Uma AP endonuclease e uma
fosfodiesterase removem o complexo
desoxirribose-fosfato;
Uma DNA polimerase adiciona o nucletido;
Uma ligase faz a ligao final entre o 3OH e
5 fosfato livres.

Reparao por exciso de nucletidos (NER):
Responsvel pela remoo de dmeros de timina
e grandes aductos. Disfunes desta via esto na
origem da doena Xeroderma pigmentosum,
caracterizada por uma extrema sensibilidade
luz UV. Os doentes desenvolvem cancro da pele
em reas expostas ao sol.
Usa enzimas diferentes do sistema anterior e
mesmo quando apenas uma base est alterada
remove sempre cerca de 30 nucletidos. O segmento de bases removido por aco
de complexos proteicos que incluem nucleases e DNA helicases. O segmento
ressintetizado por aco de uma DNA polimerase e de uma ligase. Este sistema
complexo e envolve cerca de 30 protenas.
75
Vias NER em mamferos (GGR e TCR)
XPC: reconhece o dano;
XPB e XPD: DNA helicases;
CSA e CSB: possvel funo no processamento da RNA polimerase II;
XPA e RPA: confirmam o corte e estabilizam o complexo;
ERCC1-XPF: promovem o corte na extremidade 5;
XPG: promovem o corte na extremidade 3. Juno de endonucleases especficas.

Reparao genmica global (GGR):
Repara todas as regies do genoma;
Requer XPC e os outros factores NER;
No requer CSA nem CSB.

Reparao ligada transcrio (TCR):
Reparao da cadeia codificante durante a transcrio da RNA polimerase II;
No repara 6-4-fotoprodutos;
Requer CSA e CSB;
Requer todos os factores NER, excepto o XPC.
Genes (25) envolvidos no NER:
Factores necessrios exciso: XPC-HHR23B, XPA, Replication Protein A (RPA) (p70,
p32, p14), TFIIH (XPB, XPD, p62, p44, p34), XPG e ERCC1-XPF.
Factores necessrios para a sntese de reparao: factor de replicao C (RFC) (5
subunidades), Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA), DNA polimerases e , DNA
ligase I.
Factores adicionais para a reparao ligada transcrio: CSA e CSB.
XPA e RPA
76
Reparao por juno das extremidades no homlogas
(NHEJ)
um mecanismo de recurso. Os segmentos incompletos
so removidos e as duas extremidades so unidas. Pode
evitar a morte celular mas custa de deleces extensas.



Patologias associadas:
Sndroma de Bloom:
Doentes apresentam um maior nmero de
rearranjos e delees no DNA;
Causa atrasos no crescimento e veias dilatadas (telangietasias) na pele,
particularmente, na face;
Doentes tm maior probabilidade de desenvolverem o cancro antes dos 30 anos;
Possveis defeitos na recombinao homloga.

Ataxia telangiectasia:
Causada por mutaes no gene ATM;
H aumento na sensibilidade a radiaes ionizantes;
H rearranjos cromossmicos;
Linfomas.

Sindroma de Werner:
Nmero elevado de delees cromossomais;
Atraso no crescimento;
Progeria doena gentica da infncia extremamente rara, caracterizada por um
dramtico envelhecimento prematuro;
Possveis defeitos na reparao por recombinao e na sntese por transleso;
Mutaes no gene que codifica para a protena WRN DNA helicase da famlia
RecQ.

Sindroma de Cockayne:
Defeitos no sistema de reparao associado transcrio (TCR) por alteraes
causadas pela radiao UV;
Atraso mental, envelhecimento precoce e nanismo.

Tricotiodistrofia:
Defeito no sistema TCR conduzindo ao aparecimento de mutaes pontuais;
Este defeito inicia a apoptose, a qual pode dar proteco contra o cancro induzido
por radiao UV.

Desordem tipo AT:
Defeito no mecanismo de reparao da dupla cadeia de DNA que se encontra
quebrada, conduzindo a alteraes cromossomais;
Aparecimento de linfomas.

Sindroma de quebra Nijmejem:
Defeito no mecanismo de reparao da dupla cadeia de DNA que se encontra
quebrada, conduzindo a alteraes cromossomais;
Aparecimento de linfomas.
77
BRCA1/BRCA2:
Defeito na recombinao homloga formando-se aberraes cromossmicas;
Cancro da mama e do ovrio.

Sindroma de Rothmund-Thomson:
Defeito na recombinao homloga formando-se aberraes cromossmicas;
Osteosarcoma.

HNPCC:
Defeito na reparao por emparelhamento incorrecto, formando-se mutaes
pontuais;
Cancro colorectal.



Reparao por tRNAs mutantes

Supresso de mutaes nonsense:
Mutao nonsense quando se altera uma base, levando formao prematura
de um codo STOP, logo a protena sintetizada fica mais curta.
A aminoaciltRNA sintetase carrega um tRNA com um dado aminocido, mas aps
estar carregado, o aminoaciltRNA pode sofrer mutaes no anti-codo sem que
lhe seja removido o aminocido. Assim, aps a mutao das bases do anti-codo,
pode resultar um novo anti-codo complementar com o codo de terminao
que foi introduzido pela mutao nonsense. Ento, o codo de terminao
lido como se de um codo normal se tratasse e a sntese proteica prossegue
como se no tivesse ocorrido mutao.

Supresso d mutaes missense:
Numa mutao missense o tamanho da protena o mesmo, mas uma base
mutada leva a que seja introduzido um aminocido diferente do que seria
incorporado normalmente, logo a protena ter funo diferente.
A aminoaciltRNA sintetase carrega o tRNA com o aminocido correspondente ao
seu anti-codo, mas o aminocido que transporta no alterado.
O tRNA mutado acaba por reconhecer o codo mutado como se do codo inicial se
tratasse, anulando a mutao missense.

Supresso de mutaes frameshift:
Mutaes frameshift consistem na adio ou deleo de bases o que leva a uma
alterao do quadro de leitura.
O tRNA supressor tem a capacidade de avanar uma base (frameshift +1) no caso
de uma adio, ou recuar uma base (frameshift -1) no caso de uma deleo de
uma base.
O ribossoma est atrasado em relao frameshift e permite o correcto
emparelhamento do DNA.

78
14) Tcnicas de DNA recombinante

Permitem:
Fazer o estudo de processos biolgicos;
Obter benefcios de vrias reas: sade, biologia, bioqumica, microbiologia, gentica,
biotecnologia e agricultura.

Possibilitam:
Clonagem, identificao e regulao dos genes;
Estudo de doenas hereditrias e terapia genica;
Produo em larga escala de protena e vacinas;
Melhoramento de culturas e animais;
Estudo da gentica molecular e da gentica reversa.

Utilizam: DNA, RNA, vectores, enzimas de restrio e enzimas de modificao.

Gentica reversa: sequncia proteica sequncia de DNA alelo mutante
fentipo mutante;
Gentica molecular: fentipo mutante alelo mutante sequncia de DNA
sequncia proteica.

Enzimas de restrio:
So endonucleases especificas que reconhecem pequenas sequncias especficas
(geralmente palindromas e as sequncias no so metiladas) com 4 a 6 pares de bases;
So designadas por trs letras: EcoRI, HindIII;
Ao cortarem geram extremidades do tipo:
Coesivas ou Sticky ends:
Coesivas a 5 (HindIII):




Coesivas a 3 (PstI):



Cegas ou abruptas ou blunted ends (HpaI):



Podem reconhecer sequncias degeneradas, ou seja, sequncias que no so
especficas (nas quais uma das bases pode ser qualquer purina ou qualquer pirimidina
ou ento qualquer base dentro das quatro possveis):








5- AAGCTT-3
3- TTCGAA-5
5- A AGCTT-3
3- TTCGA A-5
5- CTCGAG-3
3- GAGCTC-5
5- CTCGA G-3
3- G AGCTC-5
5- GTTAAC-3
3- CAATTG-5
5- GTT AAC-3
3- CAA TTG-5
5- CP
i
CGP
u
G-3
3- GP
u
GCP
i
C-5
5- C P
i
CGP
u
G-3
3- GP
u
GCP
i
C-5
AvaI
5- GGNCC-3
3- CCNGG-5
AsuI
5- G GNCC-3
3- CCNG G-5
79
Enzimas do tipo I: para actuarem necessitam de ATP, SAM (s-adenosil-metionina) e
Mg
2+
. Reconhecem uma sequncia do DNA, mas o local de corte dentro dessa
sequncia aleatrio.
Enzimas do tipo II: requerem apenas Mg
2+
para actuarem. Reconhecem um local
especfico e cortam essa sequncia sempre no mesmo local.

Isosquismeros:
Enzimas de restrio provenientes de espcies diferentes, mas que reconhecem o
mesmo local de restrio. Ex: MspI e HpaII reconhecem a sequncia 5-CCGG-3.
Podem ser isosquismeros perfeitos se o corte se der no mesmo local da sequncia
para as duas enzimas, ou isosquismeros imperfeitos se o corte se der em locais
diferentes da sequncia.

Enzimas de modificao:
Reconhecem a mesma sequncia que as respectivas enzimas de restrio, mas em vez
de a cortar, modificam-na.


Mapa de restrio:

Corresponde ao arranjo linear dos locais do
DNA cortados com diferentes enzimas de
restrio;
Os fragmentos de DNA obtidos por aco de
enzimas de restrio podem ser separados
por electroforese em gel de agarose de
acordo com o tamanho, em pares de bases
(bp) ou em quilobases (Kb), sendo
determinado por comparao com um DNA
padro.
Digesto simples 1 enzima de restrio;
Digesto dupla 2 enzimas de restrio;
Digesto mltipla vrias enzimas de
restrio.
As bandas obtidas so visualizadas luz UV
ficando florescentes graas aco de um
agente intercalante brometo de etdio.


80
Outras enzimas usadas nas tcnicas de DNA recombinante:

Endonuclease tipo II: cortam o DNA em locais especficos da sequncia de restrio;
DNA ligase: liga duas molculas de DNA ou dois fragmentos de DNA. Necessita de um
grupo OH na extremidade 3 e um monofosfato na extremidade 5;
DNA polimerase I (E. coli): requer um primer para funcionar, pois no tem a
capacidade de iniciar uma nova cadeia. Possui actividade polimersica 5 3,
exonuclesica 3 5 e exonuclesica 5 3;
Klenow: deriva da DNA polimerase I (C-terminal). Possui actividade 5 3 polimerase
e actividade exonuclesica 3 5. Permite a realizao do nick translation;
Transcriptase reversa: sintetiza DNA de cadeia dupla a partir de um molde de RNA,
mas pode tambm sintetizar DNA a partir de ssDNA. Necessita de um primer e possui
actividade de RNase, pois degrada o RNA dos hbridos RNA-DNA. Requer Mg
2+
;
Terminal transferase: adiciona extremidades homopolimricas, ou seja, adiciona
nucletidos iguais (C ou G) nas extremidades 3 do GNA. Permite a insero de
plasmdeos;
Exonuclease III: digere dsDNA, mas s actua na extremidade 3 quando esta no
saliente. Se a extremidade for 5 saliente consegue digerir, mas tem de ser a partir da
extremidade 3. Necessita de Mg
2+
;
Cinase polinucletidica: adiciona um grupo fosfato extremidade 5-OH do nucletido
de forma a permitir a sua ligao;
Exonuclease do fago : remove nucletidos do terminal 5 de um DNA para exportar o
terminal 3 da cadeia adjacente;
Fosfatase alcalina: remove grupos fosfato dos nucletidos;
S1 nuclease: digere DNA ou RNA de cadeia simples. Ex: queremos um DNA com
extremidades cegas e a enzimas de restrio formou extremidades coesivas, ento, a
S1 nuclease digere a salincia;
Taq DNA polimerase: actividade 5-3 polimerase, s actuando a temperaturas muito
elevadas. Necessita de Mg
2+
e usada no PCR.

Vectores de clonagem

Clonagem: termo aplicado a um fragmento de DNA que foi isolado e inserido num
vector de clonagem, constituindo um DNA quimrico, hbrido ou recombinante, que
aps transformao permite a produo de grandes quantidades desse mesmo
fragmento.

Clone: conjunto de clulas ou molculas idnticas clula ou molcula original, de
onde o fragmento foi isolado.

Vector de clonagem:
Plasmdeo ou fago que capaz de transportar uma sequncia de DNA estranho
dando origem a um DNA hbrido ou recombinante;
Capacidade de se auto-replicar, com replico;
Conter, pelo menos, um gene que confira resistncia a um antibitico;
Possuir locais de restrio especficos polylinker que permitem a entrada do
DNA a clonar;
Facilmente purificveis.


81
DNA ligase
ATP




Para inserir um fragmento de DNA a clonar no local de
restrio EcoRI, temos de fazer o corte nessa sequncia
com a mesma enzima de restrio EcoRI, para que o
fragmento que queremos inserir se ligue nesse local;

Para seleccionar as colnias recombinantes, plaqueamos
num meio com o antibitico ao qual as bactrias
recombinantes so resistentes. Aps incubao, as
colnias existentes correspondem s bactrias recombinantes.



Tipos de vectores de clonagem:

Plasmdeos (pBR322): transportam DNA de 2-20kb;
Fagos (): transportam DNA de 2-25kb. Anteriormente, viu-se que o fago s pode
encapsular 50kb no seu genoma, mas os genes que codificam para as 4 protenas da
cpside podem ser removidos, podendo ser adicionados fragmentos deste tamanho;
Fasmdeos ou fagemdeos: transportam DNA de 2-25kb. Tanto se comportam como
fagos como plasmdeos;
Cosmdeos (pBR322 com extremidades coesivas): transportam DNA de 30-45kb;
Bacterifago P1: transportam DNA at 100kb;
BACs, YACs e PACS (cromossomas artificiais de bactria, levedura e fagos):
transportam DNA 200-1000kb.























Cromossomas artificiais de bactrias:

Cromossomas artificiais de levedura:

82
Vectores de expresso:
So vectores de clonagem que permitem a expresso de uma protena e
tm de possuir:
Resistncia a um antibitico;
Local de origem de replicao;
Promotor;
Codo d iniciao seguido de polylinker;
Local de ligao ao ribossoma;
Facilmente purificveis.
DNA a clonar inserido no polylinker que se encontra no opero da
lactose nos plasmdeos recombinantes o opero no funciona pois o
seu quadro de leitura est alterado no se forma -galactosidase
colnias brancas so recombinantes e as azuis so no recombinantes.







Introduo de DNA dentro de clulas










Transformao:
Mecanismo pelo qual a bactria absorve o DNA que pode
ou no ser integrado no seu genoma;
Obtm-se clulas competentes:
Tratamento com soluo de CaCl
2
, ligeiramente
hipotnica, a 0C;
Choque trmico a 37C durante 2 ou 45 segundos
a 42C.
Haemophilus e Neisseria possuem protenas especficas
para mediar a entrada do DNA de espcies relacionadas
nas suas clulas.








a. Bombardeamento DNA
revestido com tugnstnio;
b. Microinjeco;
c. Transformao, electroporao
e transfeco;
d. Infeco por vrus.

83
Electroporao:
Mecanismo pelo qual a bactria ou as clulas em cultura absorvem o DNA atravs
de uma descarga elctrica breve.

Animais clonados (entre outros):
Dolly:
Nasceu a 5 de Julho de 1996, Roslin Institute, Edinburgh, Scotland;
Foi clonada a partir de uma clula retirada de uma ovelha de 6 anos;
Fizeram-se 277 experincias de embries clonados para produzir uma ovelha;
Aos 3 anos de idade revela sinais de envelhecimento precoce;
Morre passado 6 anos com doena progressiva do pulmo (sintoma de
envelhecimento).


Bibliotecas

Permitem a insero de fragmentos de DNA de qualquer genoma, depois de digeridos
com enzimas de restrio, em vectores de clonagem;

a) Bibliotecas genmicas:

Genoma em estudo cortado com enzima de restrio, formando-se fragmentos de
diversos tamanhos;
Corta-se o plasmdeo com a mesma enzima de restrio que se usou para o corte dos
fragmentos;
A DNA ligase liga os fragmentos ao plasmdeo plasmdeo recombinante;
Insero do DNA recombinante num fago que ir infectar uma bactria, levando cada
fago um fragmento diferente e, portanto, um gene diferente;
Plaqueamento e formao de placas fgicas;
Procede-se ao rastreio ou screening de uma biblioteca genmica com uma sonda de
cidos nucleicos (fragmento de DNA de sequncia conhecida e marcado
radioactivamente), de forma a encontrar o gene pretendido;
Quando as placas fgicas crescerem o suficiente e estiverem visveis, faz-se replica
plating e o filtro de nitrocelulose com a cpia das placas incubado com uma sonda
radioactiva de cidos nucleicos;
Esta sonda a cadeia complementar do gene que se procura e foi obtida por nick
translation com a enzima klenow;
Pode ocorrer hibridao entre o DNA do genoma em estudo e o da sonda;
Lavagem cuidadosa do material no hibridado;
O local onde ocorreu hibridao surge como uma mancha negra luz UV;
Por sobreposio do resultado da radiografia com a master plate pode-se identificar o
clone desejado;
No caso de estarmos presente genes muito grandes de tal forma que no caibam num
s plasmideo, surge complementaridade com a sonda em mais do que uma placa
fgica.



84
b) Bibliotecas de cDNA:

Procede-se recolha de todo o RNA da clula em estudo (mRNA, tRNA e rRNA);
Isolamento do mRNA por passagem dos RNAs numa coluna cromatogrfica que possui
apenas timinas ligadas matriz de celulose ou agarose;
mRNA com cauda poli-A emparelha com o olio-T da coluna e fica retido, enquanto que
os restantes tipos de RNA so eluidos;
Adio de soluo tampo de baixa fora inica para eluir o mRNA hibridado com o
oligo-T o mRNA eluido no trs as timinas;
Converso do mRNA a cDNA pela aco da transcriptase reversa utiliza como primer
timinas que hibridiza com a cauda poli-A;
Remoo do RNA dos hbridos RNA-DNA pela transcriptase reversa;
Formao de dsDNA a partir do molde de cDNA pela DNA polimerase adiciona-se
uma cauda poli-C extremidade 3 do cDNA primer poli-G;
Insero do DNA num plasmdeo o DNA tem extremidades abruptas, logo tem de se
proceder adaptao de extremidades homopolimricas pela terminal transferase, de
forma a ficarem salientes para
ocorrer o emparelhamento do
vector de clonagem;
Adio das mesmas
extremidades no vector de
clonagem para que haja ligao
e formao de um plasmdeo
recombinante;
Clonagem do vector numa
bactria que no possua
resistncia ao antibitico cujo
plasmdeo confere resistncia;
Seleco das bactrias
recombinantes num meio com
o antibitico cuja resistncia
conferida pelo plasmdeo.



85
c) Bibliotecas de expresso:

Permitem a expresso da protena codificada pelo DNA
clonado num vector de expresso;
Vector de expresso: promotor + operador da lactose +
polylinker + sinal de terminao da transcrio;
O cDNA a clonar inserido no polylinker, logo aps o
operador da lactose;
O anlogo da lactose IPTG (isopropil tio--
galactopiransido) liga-se ao repressor da lactose
dissociando-se do operador, activando-o;
Forma-se uma protena de fuso formada pela -
galactosidase no terminal amina e pela protena
codificada pelo cDNA no terminal carboxilico;
Utiliza-se um cromogneo X-gal que muda para a
cor azul na presena de -galactosidase.
Assim, as bactrias recombinantes so brancas, pois as
protenas produzidas no so -galactosidases, mas
sim as protenas de fuso;
As bactrias no recombinantes so azuis, pois forma-
se -galactosidase.

Rastreio ou screening de bibliotecas de expresso com anticorpos:
Plaqueamento das bactrias recombinantes e no
recombinantes formao de protena de fuso e -
galactosidase, respectivamente;
Replica plating;
Incubar com um anticorpo especfico para as protenas de fuso;
Tratamento com um novo anticorpo marcado radioactivamente que reconhece o
primeiro;
Autorradiografia luz UV para detectar as colnias reconhecidas pelos anticorpos
bactrias recombinantes;
Comparao com a master plate para saber a que colnias correspondem;

Nota: atravs das bibliotecas de expresso possvel determinar o tamanho do fragmento de
cDNA clonado, pois se ao tamanho do fragmento que codifica para a protena de fuso
subtrairmos o tamanho do gene que codifica para a -galactosidase (gene lacZ), obtemos o
tamanho do cDNA inserido no vector.


Sntese qumica de oligonucletidos

uma tcnica de laboratrio que permite:
Formao de primers;
Estudo da funo de parte de um gene ou protena;
Isolamento de genes ou protenas. Ex: preparao de anticorpos;
Mutagnese in vitro;
Est limitada produo de sequncias pequenas (60 nucletidos).
O primeiro nucletido (monmero 1) est ligado a um suporte de vidro atravs
do 3-OH, estando o terminal 5-OH livre;
A sntese da primeira ligao internucleotdica feita misturando o monmero
1 com o monmero 2 que contm na extremidade 3 um composto reactivo, o
[(IP)
2
+ ligado a um grupo metilo e na extremidade 5 um DMT;
86
Na presena de um cido fraco, os dois nucletidos formam uma ligao
fosfodister, por oxidao pelo I
2
e destritilao com ZnBr2. Os grupos metilo
nos fosfatos so depois removidos em pH alcalino, no final da sntese.

Radioistopos

Utilizam-se para a:
Marcao de sondas para pesquisa de DNAs ou RNAs homlogos;
Determinao do tempo de semi-vida e estabilidade de RNAs;
Estudos de sequenciao;
Determinao do tamanho de protenas e cidos nucleicos;
Reunio de macromolculas e sua distribuio na clula;
Tempo de semi-vida especfico: tempo em que a actividade ou concentrao de
radioactividade passa para metade do valor inicial;
Actividade especfica: quantidade de radioactividade por unidade material.

Deteco de radioistopos:
a. Autorradiografia: impresso de uma emulso sensvel radiao e posterior
revelao;
b. Ensaios quantitativos: deteco da incorporao de compostos radioactivos com um
contador Geiger e quantificao dos mesmos por contador de cintilaes;
c. Pulse- chase: permite seguir o movimento de um composto radioactivo no interior
da clula, aps a adio de uma pequena quantidade dessa composto radioactivo
(pulse) que ao fim de algum tempo removido e substitudo por um no radioactivo
(chase).

Sequenciao do DNA

Permite saber a ordem ou sequncia de bases em qualquer DNA.

1) Mtodo quimico ou Maxam-Gilbert:
DNA tratado com reagentes qumicos que destroem de um modo especifico uma
ou duas bases das 4 bases que constituem o DNA.
Os fragmentos obtidos correm em gel de poliacrilamida.

2) Mtodo de determinao de cadeia por didesoxinucletidos ou
mtodo de Sanger:
Utilizam-se didesoxinucletidos (ribose sem OH em 2 e 3);
Numa cadeia em crescimento quando adicionado o
didesoxinucletido a sntese pra porque no pode ser
introduzido o nucletido seguinte pois no h 3OH;
Os fragmentos obtidos correm em gel de poliacrilamida e
procede-se sequenciao do DNA.

87
Mtodo de terminao da cadeia por
didesoxinucletidos:
Temos a cadeia de ssDNA cuja sequncia
pretendemos determinar;
A partir de um primer, a DNA polimerase vai
sintetizando a cadeia de DNA complementar
anterior, adicionando dNTPs no local
correspondente;
Quando adicionado um dNTP a sntese pra,
pois no existe extremidade 3-OH livre para a
adio do prximo nucletido;
O DNA desnaturado e as cadeias filhas so
separadas por electroforese em gel de
acrilamida;
Os fragmentos obtidos e visualizados permitem
obter a sequncia de nucletidos da cadeia
original de DNA.


Sequenciao automtica: procedimento idntico ao
anterior mas o resultado pode ser visualizado em
cromatograma;



Delees unidireccionais do DNA:
O plasmdeo recombinante cortado com
enzima de restrio no local A, linearizando;
tratado com exonucleases e forma sequncias cada vez mais pequenas;
O DNA volta a circularizar cada uma delas por aco da DNA ligase (no interior dos
fragmentos existe USP Universal Sequencial Primer);
A partir do USP forma-se ssDNA cujo tamanho varia consoante o fragmento de DNA
original;
Anlise computorizada das sequncias: permite comparar sequncias de aminocidos
das protenas, detectando sequncias idnticas e comparar genomas de diferentes
espcies. uma comparao funo/sequncia.


DNA ligase
88
Chromossome walking ou
Hibridao sobreposta:
Deteco de clones de
bibliotecas que tm
sequncias sobrepostas a
partir de um local conhecido
por hibridao, subclonagem
e mapa de restrio;
No aplicvel a genomas de
animais ou plantas
superiores, pois estes tm
muitas sequncias repetidas.




3) Southern-Blot:
Deteco de sequncias particulares por hibridao com sondas radioactivas
especficas, ou seja, deteco para autoradiografia;
Mapa fsico dos locais de restrio de um gene;
N de cpias de um gene no genoma;
Grau de semelhana de um gene com outros homlogos;
Anlise da expresso de genes e organizao do DNA genmico;
Deteco de mutaes e rearranjo num gene;
Deteco de polimorfismo gentico, ou seja, variaes genticas que se verificam
numa populao que so caracterizadas pela presena ou ausncia de locais de
restrio particulares no DNA (RFLP). As molculas so transferidas para o filtro de
nitrocelulose por capilaridade.
Os RFLP:
Permitem a deteco dos fragmentos nicos numa populao;
Avaliam a presena de mutaes (delees ou inseres) em diferentes alelos;
So caracterizados pela presena ou ausncia de locais de restrio particulares no DNA;
Correspondem impresso digital de cada indivduo (regies hipervariveis e repetidas).



89
4) Northern Blot:
Deteco de molculas
especificas de RNA;
Avalia a presena, tamanho e
quantidade de um mRNA
particular;
Compara mRNAs especificos com
o de outros organismos
diferentes;
Hibridao feita com o cDNA
correspondente ao mRNA ou
sonda de RNA.
As molculas so transferidas
para o filtro de nitrocelulose por
capilaridade.


5) Western-Blot:
Deteco de protenas especificas
com anticorpos radioactivos ou
fluorescentes o que desencadeia
uma reaco antignio-anticorpo
quando em presena da protena
que identifica;
As molculas so transferidas
para o filtro de nitrocelulose por
aco de um campo elctrico.







90
6) Fingerprinting:
Permite a comparao de vrias amostras de DNA, RNA ou protenas,
sem haver necessidade de sequenciao das mesmas, a comparao
feita por anlise do padro de fragmentos obtidos aps digesto
enzimtica:
Estudos de paternidade:
Por anlise de elementos hipervariveis com sequncias core
caractersticas;
VNTR (Variable Number Tandem Repeats): classe especial de
repeties de n varivel (15-100 nucletidos) em diferentes locus e
diferentes indivduos. O corte com enzimas de restrio nos VNTR
produz diferentes fragmentos de DNA que so altamente
caractersticos de cada indivduo.
Medicina forense: identificao de vtimas ou suspeitos.

7) Mutagnese in vitro:
Permite a adio, deleco e modificao de uma (mutao pontual) ou mais bases
do DNA;
Possibilita fazer a mutagnese direccionada.

Deleo:
Plasmdeo recombinante cortado com a EcoRI;
Formam-se extremidades coesivas a 5;
Tratamento com a S1 nuclease que remove algumas bases de forma a obterem-se
extremidades cegas;
DNA ligase volta a ligar as extremidades do plasmdeo, sendo este mais curto do
que o plasmdeo inicial.


Adio:
Plasmdeo recombinante cortado com a EcoRI;
Formam-se extremidades coesivas a 5;
DNA polimerase adiciona os nucletidos necessrios a cada extremidade para que
se formem extremidades cegas;
DNA ligase volta a ligar as extremidades do plasmdeo, sendo este maior do que o
plasmdeo inicial.


SSCP: permite detectar diferenas de um nucletido no DNA de cadeia simples e pode ser
visualizada pela diferena de mobilidade das cadeias normal e mutada em gel de
electroforese.
O DNA genmico foi isolado de uma clula heterozigtica possuindo uma mutao
pontual (troca de A por T) no codo 61 do gene N-RAS;
Um fragmento de 103bp contendo a mutao expandida foi sintetizado atravs de
PCR;
As extremidades 5 dos primers, usados em PCR, foram marcadas
radioactivamente;
Aps a amplificao, os fragmentos de dupla cadeia foram desnaturados de forma
a separar as cadeias e sofreram electroforese num gel de poliacrilamida;
Surgem duas bandas na amostra normal (N) correspondentes s duas bandas do
fragmento amplificado;
91
Surgem duas bandas semelhantes
no mutante homozigtico (M),
mas com difernte localizao,
pois diferem nos nucletidos T e
A;
As clulas dos heterozigotos
(N/M) mostram quatro cadeias,
duas do alelo normal e duas do
alelo mutante.








Determinao do local de inicio da transcrio:
a RNA polimerase liga-se ao local +1 do
promotor iniciando a transcrio.
a. S1 nuclease:
Usa DNA de cadeia simples (100
nucletidos), radioactivo numa
extremidade, com a sequncia
conhecida do promotor que permite a
ligao do mRNA;
Constroi-se uma sonda, isolando o
promotor e marcando este fragmento
radioactivamente;
A sonda hibridiza com o mRNA na zona
que lhe for perfeitamente
complementar, ficando uma
extremidade do RNA e outra de DNA
livres;
Estas extremidades so digeridas pela
S1 nuclease que deixa apenas a
sequncia hbrida, permitindo a
determinao exacta do local onde a
transio se inicia ( cortantado tudo a
montante do local +1 e tudo a jusante
da sonda).


92
b. Primer extension:
Utiliza um oligodesoxinucletido,
como primer (10 nucletidos)
radioactivo, numa extremidade que
corresponde regio a jusante do
promotor;
O primer que hibridiza com o RNA que
lhe complementar no contm a
regio do promotor, logo sero
adicionados desoxinucletidos
trifosfatados e a transcriptase reversa
sintetiza DNA a partir do RNA
aumentando o primer;
Assim, faz-se a sequenciao do
hbrido para determinar o local de
inicio da transcrio.


8) Hibridao in situ:
Baseia-se na complementaridade
de bases DNA/RNA,DNA/DNA e
RNA/DNA;
Localiza sequncias especificas de
DNA ou RNA, marcados com
corantes fluorescentes (FISH) em
cromossomas, ncleo e citoplasma de clulas
ou tecidos.

Chromossome painting: usa sondas de DNA com regies
especficas de cromossomas com corantes fluorescentes
cujos alvos so as repeties de segmentos de DNA que
so especficas de cada cromossoma.

9) DNA microarrays DNA chips:
Consistem em milhares de sequncias codificantes de vrios genes, previamente
amplificados por PCR, ligados superficie de uma lmina;
Mltiplos oligonucletidos de DNA (cerca de 20 nucletidos) sintetizados a partir de
um nucletido inicial;
Permitem a anlise de milhares de genes em simultneo;
Preparados e usados para analisar a expresso de genes em diferentes orgos e
tecidos;
Podem ser utilizados para anlise de padres de expresso em doenas e durante a
diferenciao celular.
93
10) PCR: permite a amplificao de pequenas sequncias conhecidas de DNA a partir de
dois primers. Requer:
Quantidades muito pequenas de
DNA;
Dois primers de oligonucletidos
que sejam complementares para
as 2 extremidades 3 da cadeia
dupla de DNA;
Magnsio;
Desoxinucletidos;
Taq DNA polimerase;
Banho programvel const tuido
por desnaturao (94C 5), ligao
dos primers (30-65C 30), sntese
de DNA (72C 3-4) e controlos (+) e
(-).







PCR assimtrico:
Para se obterem cadeias simples de DNA;
Um dos primers est numa concentrao menor;
A acumulao do DNA linear;
Sequenciao pelo mtodo de Sanger.









RT-PCR:
Isolar RNA de clulas ou tecidos;
Sintese de cDNA com Gene Specific Primers
(GSP), oligo-dT-primers ou random-hexamer
primers;
Transcriptase reversa e Taq DNA polimerase
para a sintese da cadeia dupla de DNA.
A transcriptase reversa com o primer
de dT oligonucletido produz a primeira cadeia de
cDNA;
A segunda cadeia de cDNA
produzida pela Taq DNA polimerase com um GSP
(GSP1);
94
Uma primeira srie de amplificaes por PCR surge com o dT oligonucletido e o
GSP1 como primers;
O GSP2 e o P so primers usados para uma segunda srie de amplicaes de forma
a se produzir cDNA da extremidade 3 do mRNA alvo.

11) LCR (Ligase Chain Reaction): requer:
Taq DNA polimerase e ligase
termoestvel;
Dois primers especificos para cada
cadeia de DNA;
Um primer comum a cada cadeia de
DNA;
Deteco de mutaes pontuais.



12) Produo de ratinhos transgnicos:
Permitem o estudo da funo e desenvolvimento de um organismo;
Possuem DNA proveniente de outra espcie nas clulas germinativas;
O DNA com o gene de interesse injectado no pr-ncleo de um ovo fertilizado, antes
deste ter sofrido fuso, e transferido para uma me receptora, logo os filhos
possuem o DNA introduzido e passam-no descendncia.

13) Produo de ratinhos Knockout:
Permitem o estudo da embriognese e do comportamento destes animais;
Avaliam certas doenas genticas do Homem (fibrose cstica);
Gene normal ou especificamente mutado tem um marcador gentico (cor);
Possuem DNA proveniente de outra espcie nas clulas germinativas;
O DNA com o gene de interesse introduzido em clulas embrionrias totipotentes ou
indiferenciadas (Stem cells) do blastocisto que depois so transferidas para uma me
pseudo-grvida.

14) RNA interference (iRNA):
Determinar a funo de um gene e expresso genica (transcrio, traduo e morte
celular);
Estudo das vias metablicas;
Identificao e validao de alvos para drogas;
iRNA constitui um mecanismo celular ancestral de defesa contra certos vrus e
elementos genticos mveis em plantas e animais;
Nas plantas, mutaes nos genes que codificam para Dicer e protenas RISC (RNA-
induced silence complex) aumentam a susceptibilidade para infeces por vrus com
RNA e a movimentao de transpose dentro do genoma.

um mtodo ainda em estudo e, portanto, em desenvolvimento que permite a anlise da
funo gentica pela integrao do RNAi no genoma da clula hospedeira pela transferncia
de genes virais que induz a longo termo e hereditariamente o silenciamento de genes pela
dupla cadeia de RNA (dsRNA), causando a degradao de sequncias especficas do mRNA.

(Normal)
A
(Mutante)
S

95
O mecanismo de RNAi abrange vrios passos e
leva, por ltimo, inibio da sntese de
protenas;
A primeira etapa inclui a introduo de dsRNA
(double stranded RNA), ou shRNA (short hairpin
RNA), por RNA viral, transposes ou genes
endgenos;
D-se a posterior ligao ao Dicer (Ribonuclease
requerida para a formao de siRNAs) e a
clivagem do dsRNA e shRNA em siRNA e miRNA,
respectivamente. Certos autores referem que a
ligao da dsRNA ao Dicer ATP-dependente;
Enquanto que o siRNA promove a degradao
do mRNA e consttuido por 21 a 25 sequncias
nucleotdicas de RNA compostas por 19 a 23
pares de bases de RNA de dupla cadeia, o
miRNA reprime a traduo do mRNA e
constitudo por 20 nucletidos com terminais 5
fosfato e 3 hidroxil;
A sequente actividade da RNA helicase promove
o desenrolamento e separao da dupla cadeia de siRNA (reaco ATP-dependente) e
logo depois d-se a incorporao do siRNA no RISC (RNA induced silencing complex)
(contm uma das cadeia de DNA), a partir da extremidade 5 desenrolada;
Temos de seguida a degradao da cadeia simples complementar a partir da
extremidade 3. Este complexo vai depender da complementaridade entre siRNA e o
mRNA alvo;
O RISC depois guiado pela cadeia antisenso de siRNA at sequncia complementar
de mRNA alvo e reconhece-a, promovendo a sua clivagem e consequente degradao;
Em vez da degradao, o mRNA alvo pode ficar incapaz de realizar a traduo (se no
houver uma total complementaridade entre o siRNA e o mRNA alvo). Deste modo, no
h sntese proteica: temos o desejado silenciamento da expresso gentica.

de notar que uma s molcula de siRNA pode levar inactivao de centenas ou milhares e
mRNAs. Nas plantas o mRNA clivado pode tambm servir como modelo para a RNA Polimerase
dependente do RNA (RdRP) sintetizar uma nova molcula de dsRNA, que depois pode sofrer a
aco dos Dicers.
Noutros organismos com mecanismos endgenos de RNAi, o RNAi tambm envolve outro
passo de amplificao em que a cadeia simples de siRNA no associada ao RISC se liga ao
mRNA alvo, servindo como primer para a RNA Polimerase polimerizar a cadeia antisenso de
mRNA.

Small Interference RNA (siRNA):
siRNAs tm 21-25 nucletidos;
Criados ao acaso a partir de RNAs de cadeia dupla ou por autoligao de RNAs;
Ligam com complementaridade perfeita a um nico local;
Descobertos com os iRNAs que
medeiam o complexo RISC;
Complexo RISC dirige a clivagem do
dsRNA (silenciamento dos genes aps
transcrio).

96
miRNAs:
Famlias de pequenos RNAs no
codificantes;
Formados por 21-25 nucletidos, depois de
processados de pri-miRNA a pr-mRNA.


Interagem com mRNAs alvo;
Sequncias especficas (3UTR) que podem
apresentar complementaridade imperfeita
em vrios locais;
O grau de complementaridade afecta a
funo de clivagem, supresso e
degradao;
Induzem a clivagem e inibem a
traduo;
1-2% dos genes conhecidos so
do miRNA (o genoma humano possui
250 genes do miRNA).

Funes especficas:
Inibio da expresso de genes
(gene knock down);
Desenvolvimento e organognese;
Apoptose e controlo do crescimento celular;
Regulam negativamente a expresso genica aps transcrio;
Complexo RITS (RNA induced transcriptional silencing) que liga as histonas metiladas e
induz a degradao do pr-mRNA transcrito pela RNA polimerase II.

Drosha e Pasha: medeiam a produo de miRNAs, por processamento dos miRNAs do ncleo.

iRNA = RNA interferncia:
Clonagem da sequncia codificante (genmica ou de cDNA) nas duas orientaes
(sense e anti-sense) junto a um promotor forte e por aco da RNA polimerase h
formao de RNAs sense e anti-sense;
Clivagem do RNA por enzimas especializadas, em pequenos fragementos que hibridam
com o mRNA endgeno.


97
15) Aplicao das tcnicas de DNA recombinante

Deteco de infeces vricas:
Vrus da SIDA: com primers da sequncia do HIV
A presena de sequncias de DNA nos doentes indica que o vrus est a ser
integrado no DNA das clula infectadas;
A presena de RNA vrico aponta para a existncia de uma infeco activa.

Deteco de infeces bacterianas:
Mycobacterium tuberculosis: com primers que detectam uma sequncia dentro
de um gene que est altamente conservado em todas as espcies deste gnero.

Deteco de bactrias nos alimentos:
Listeria monocystogenes (Gram +): existe no leite e pode provocar abortos.
Usar primers dos genes iap e do 16S rRNA da Listria.
Clostridium botulinum: anarobio que provoca butolismo para produo de
toxinas que bloqueiam a libertao de acetilcolina nas sinapses
neuromusculares causando paralisias flcidas.
Usar primers dos genes do 16S e 23S rRNA da bactria para detectar o DNA
contido nos esporos.

Deteco de contaminantes e falsificantes:
Doena celaca: intolerncia dos eritrcitos s protenas do trigo que esto
relacionadas com a gliadina, centeio e aveia.
Usar primers com a sequncia do gene gibberillin que detectam as
protenas do trigo;
Adio de soja a salsichas.
Usar primers do gene lectina le1.

Deteco de alimentos geneticamente modificados:
Introduo do gene que codifica para o RNA anti-sense da poligacturonase
enzima responsvel pela degradao da parede celular das pectinas impede a
expresso do gene da poligacturonase.
Deteco com dois primers especficos:
Gene que confere resistncia kanamicina;
Zona do promotor do vrus do mosaico da couve-flor (CaMV35S).

Deteco da sequncia de tamanho especfico:
Carne fresca 20 - 50 Kb de DNA
Carne congelada 10 - 20 Kb de DNA
Carne aquecida 300 bp de DNA
Salsichas de carne 20 Kb de DNA
Salsichas fermentadas 100 bp a 15 Kb de DNA
Po 300 bp de DNA

Deteco de diferentes espcies de carne por PCR-RFLP:
Isolar o DNA e amplificar por PCR;
Cortar com enzimas de restrio;
Deteco dos fragmentos por Southern Blot.
98
Produo de protenas e vacinas:
Clonagem de genes que codificam para protenas com interesse famacolgico ou/e
teraputico;
Podem ser produzidos na bactria;
Podem ser manipulados na bactria e depois introduzidos em clulas eucariotas onde,
em geral, ficam integrados no DNA cromossmico.
Hormona do crescimento, desoxiribonuclease, insulina humana, factor VIII da
coagulao, eritropoietina, anticorpos monoclonais, superxido dismutase,
factores de crescimento, vacina Hepatite B, interleuquinas e -interfero.


Produo de protenas em Procariotas:
Produo de insulina para tratamento da diabetes mellitus.
Diabetes: glicosmia, perda de electrlitos e gua, cetoacidose e coma;
Isolar o gene da insulina e clonar em E. coli;
A insulina possui cadeias (A e B) sendo cada uma sintetizada numa bactria
diferente;
As protenas de fuso -Gal-insulina so purificadas e tratadas com CNBR cliva a
ligao peptidica aps a metionina, onde comea a cadeia A ou B;
So depois purificadas e juntas, formando-se insulina activa.


Produo de protenas em Eucariotas:
Activador tecidual do plasminognio - activa a plasmina, enzima que dissolve os
trombos (ataque cardaco).
Isola-se o gene de interesse;
Injecta-se no pr-ncleo da ovelha;
Deteco da descendncia da ovelha transgnica por PCR;
Expresso do gene de interesse restringido ao tecido mamrio;
Protena produzida pelo gene de interesse secretada no leite;
Centrifugao do leite permite obter a protena pura.


Deteco da Hemofilia (Factor VIII):
Hemofilia A e B:
Deficincia recessiva ligada ao sexo;
Alterao na produo de factores de coagulao, em geral, o factor VIII.
Diagnstico pr-natal da hemofilia por PCR
H perda de um local de restrio;
Amplificam-se os genes das pessoas em teste, por PCR (gene da hemofilia) e se
possuirem uma cpia do gene mutado e uma do gene normal, no apresentam a
doena, so apenas portadores;
Se possuirem apenas a cpia mutada so hemofilicos pois uma doena recessiva.


Deteco da anemia falsiforme por Southern-Blot:
uma doena recessiva, com mutao A T no gene da -globina;
Produo de menos cadeias de hemoglobina;
Menor capacidade de transporte de oxignio e maior fragilidade capilar.


99
Diagnstico pr-natal da anemia
falsiforme:
A mutao A T leva
destruio de um local de
restrio no gene da -globina,
logo so detectados
fragmentos maiores por
Southern Blot e um fragmento
a menos.

Fenilcetonria:
O gene que leva a esta doena encontra-se no cromossoma 12;
Deficincia na fenilalanina hidroxilase que transforma a fenilalanina em tirosina, logo
h uma acumulao de fenilalanina no sangue e de cido fenilpirvico na urina,
responsvel por atrasos cerebrais graves;
A tirosina permite a formao de melanina. Como esta no produzida os doentes
tm a pele e cabelo claros e olhos azuis;
Pode ser detectada por monitorizao dos valores de fenilalanina, restringindo o
consumo de Fenilalanina na dieta.

Fibrose cstica:
Doena autossmica recessiva (cromossoma 7) que consiste em infeces
pulomonares crnicas
CFTR (Cystic Fibrosis Transmembranar Receptor) transporta pequenas molculas
(Cl
-
) atravs da membrana. Mutaes no CFTR provocam varies da doena;
Esta doena causada por deleco de 3bp que se traduz na remoo de uma
fenilalanina.
Diagnstico da fibrose cstica por ASO (Allelic Specific Oligonucleotides):
Tcnica que pode ser usada para o diagnstico de qualquer doena desde que a
sequncia de alelos mutados e normais seja conhecida;
Usa sondas especficas que so desenhadas para hibridar selectivamente com os
alelos mutado e normal.

Albinismo:
Doena autossmica recessiva (cromossoma 11);
Deficincia na tirosinase que transforma a tirosina em dopa e depois dopaquinona que
produz melanina;
A ausncia desta afecta a viso, cabelo, pele e audio.

Distrofia muscular de Duchenne:
Doena hereditria ligada ao cromossoma X;
Ausncia de distrofina, uma protena do musculo esqueltico, leva degenerescncia
das fibras musculares esquelticas que so substituidas por tecido gordo e fibroso;

Testes genticos podem detectar mes portadoras do gene DMD:
Este tem 7 exes numa pessoa normal;
O PCR mltiplo permite detectar delees no gene da DMD por ampliao dos
fragmentos que devem ser obtidos;
O Southern-Blot com sondas de cDNA permite a comparao de um indivduo
afectado com um normal.


100
Retinoblastoma:
Doena autossmica dominante (cromossoma 13);
Manifesta-se antes dos 3 anos de idade;
Provoca cancro nas clulas da retina, leva cegueira, que pode disseminar e
conduz morte;
RB1: gene repressor de tumores que produz a protena pRB. Pode ser hereditrio
ou espordico.

Clonagem de clulas tumorais por Alu-PCR:
A sequncia Alu:
Tem cerca de 300 bp e constitui 10%
do genoma total (cerca de 1.000.000
cpias por genoma haplide);
Possui muitos intres e
sequncias adjacentes a
genes tm sequncias Alu;
Estas sequncias so
reconhecidas pela enzima
de restrio AluI;
Alu-PCR tem permitido a
caracterizao e
amplificao de clulas
hbridas (de ratinho) para
a clonagem de clulas
tumorais.

Deteco do carcinoma humano da bexiga com o oncogene ras (retrovrus de ratinho):

Proto-oncogene ras: codifica para uma protena que transmite sinais do receptor para
as clulas alvo;
Oncogene ras: provoca linfomas malignos cuja diversidade se relaciona com as
diferentes mutaes que podem ocorrer neste oncogene.
Este oncogene deriva do proto-oncogene c-ras;
O DNA foi preparado a partir de clulas NIH 3T3 normais e a partir de clulas
NIH 3T3 transformadas com o oncogene ras;
O DNA foi clivado com uma enzima de restrio, aplicada em camadas
alternadas de gel de agarose, e fez-se Southern Blot;
Bandas de nitrocelulose transportando uma camada de cada um dos tipos de
DNA (normal e mutado) hibridaram com provas de diferentes oncogenes;
A prova ras revelou que os transformantes transpostavam um fragmento
hbrido, indicando a aquisio do novo gene ras, mostrando que este
responsvel pela actividade de transformao do DNA do carcinoma da bexiga.

Localizao da mutao que activa o oncogene ras:
O gene ras no desencadeia a carcinognese, mas o oncogene ras sim;
Procura-se a diferena entre estes dois genes de forma a isolar a sequncia que causa
a carcinognese, por formao de vrios hbridos nos quais se limita cada vez mais a
parte com o oncogene;
Sequencia-se apenas esse pequeno fragmento e localiza-se a mutao que ocorreu;
Neste ensaio, a carcinognese detectada por aumento da proliferao celular.


101
Monitorizao da terapia do cancro:
Permite detectar uma clula cancergena em 106 clulas normais;
Avalia a eficcia do tratamento usando primers com sequncias especficas adjacentes
aos locais de translocao ou quebra e reunio de cromossomas.

Diagnstico pr-natal do sexo por PCR:
Sequncia DYZ1:
caracterstica do cromossoma Y;
Pode ter 5000 cpias no cromossoma Y;
Determinao do sexo na fertilizao in
vitro;
Pode ser usada para a determinao do
sexo no sangue perifrico da mulher com 9
semanas de gestao;
Para doenas hereditrias ligadas ao
cromossoma X e que afectam o homem, a
determinao do sexo importante como
diagnstico pr-natal.

Terapia gnica:
Terapia ex vivo: material gentico removido do orgo e introduzido de novo depois
de cultivado e manipulado in vitro;
Terapia in situ: material gentico introduzido directamente no tecido desejado. Ex:
CFTR;
Terapia in vivo: material gentico introduzido directamente no sangue.

Vectores usados na terapia gnica:
Vrus:
Vrus adeno-associado (AVV), vrus do herpes simplex (HSV), vrus da varola,
alphavrus.
Nenhum destes vrus ainda considerado como o ideal, no entanto, cada um deles
pode, no futuro, ter uma aplicao teraputica particular;
Por exemplo os AAV so de grande interesse uma vez que so responsveis por
infeces respiratrias benignas nos humanos. So, ainda, formas naturais que se
integram no genoma humano, nomeadamente no cromossoma 19;
No entanto, estes vectores so incapazes de acomodar grandes molculas de DNA
exgeno. Os HSV, ao contrrio do AVV, no se integram no genoma do hospedeiro.
Mas so atractivos como vectores de transformao de neurnios, pois algumas
destas clulas retm estes vrus numa forma mais ou menos incua durante toda
vida do indivduo infectado. Os HSV so portanto, potenciais vectores para a terapia
gnica de doenas neurolgicas.

Lipossomas:
Estas molculas podem ser vectores plasmdicos contendo o gene teraputico ou
simplesmente fragmentos de DNA;
Este sistema permite, por exemplo, aplicar a estratgia do RNA antisense em que a
expresso de certos genes silenciada. Contudo, os lipossomas no so to
eficientes na transferncia gnica quanto os vrus.

Injeco directa, tratamento com presso e Gene Gun (DNA revestido numa
pequena partcula de ouro injectado no tecido).
102
Terapia gnica somtica: para as clulas somticas;
Terapia gnica germinativa: para as clulas germinativas;
Terapia gnica anti-sense: com RNA anti-sense (doena de Chron - uma doena crnica
inflamatria intestinal, que atinge geralmente o leo e o clon).

Drogas oligonucletidicas: com pequenas sequncias de DNA ou
RNA (SIDA e o cancro).
DNA anti-sense pode ligar-se extremidade 5 do mRNA
vrico e prevenir a ligao do ribossoma, logo nenhuma
protena vrica produzida.



Oligonucletidos anti-sense de DNA de cadeia simples:
So complementares a RNAs indesejveis ( RNAs vricos)
e impedem a traduo;
Formao de hlices triplas de DNA e interferem com a
transcrio;
DNA anti-sense pode ligar-se ao promotor, formando
hlices triplas de DNA, prevenindo a ligao da RNA
polimerase, logo o mRNA vrivo no produzido.



Ribozimas: que se ligam a molculas de RNA especficas e
impedem a formao de protenas.
RNA anti-sense na forma de ribozima pode ligar-se e
clivar o mRNA, destruindo-o.


Hormona de crescimento de rato sob o controlo do promotor da metalotionina
activada em resposta a metais pesados.
O gene que codifica para a hormona de crescimento sensvel a metais
pesados;
A hormona de crescimento sintetizada pelo gene RGH (Rat Growth
Hormone);
Ratinho ano transgnico insere-se o RGH num vector de clonagem e
insere-se o DNA plasmdico no ratinho;
O gene RGH est controlado pelo promotor de metalotionina e est
associado remoo de toxinas a nvel heptico, via citocromo p450;
Para estimular o gene RGH temos que alimentar o ratinho com metais
pesados, o que activa o promotor e leva expresso do gene, produzindo-se
hormona de crescimento ratinho cresce.

Avaliao do grau de poluio: hormona de crescimento do salmo do Pacfico
sob o controlo do promotor da metalotionina activada em resposta a metais
pesados. Quanto maiores forem os peixes, mais metais pesados ingeriram e
maior a poluio das guas.


103
16) Regulao da expresso gentica em Procariotas

feito primariamente por protenas que se ligam ao DNA e afectam a transcrio;
Estas protenas exercem um controlo positivo ou negativo na transcrio atravs da
produo de enzimas indutveis e repressveis;
A ligao entre a transcrio e a traduo rege esta expresso gentica;
O controlo est directamente relacionado com modificaes nutricionais ligadas ao
crescimento e diviso celular;
Bactria tem os genes organizados em operes e a sua expresso depende de
protenas que regulam o acesso da RNA polimerase ao promotor;
Genes reguladores - codificam para protenas reguladoras que ajudam a sentir os
sinais do meio exterior e regulam a velocidade de transcrio dos genes
estruturais;
Genes estruturais - codificam para as protenas requeridas.

Regulo: genes dispersos ao longo do mesmo cromossoma e regulados pela mesma regio
promotora. Semelhante ao opero, mas os genes estruturais esto dispersos pelo
cromossoma.

Protenas activadoras ou reguladoras positivas: ligam-se ao DNA e facilitam o acesso da RNA
polimerase activao da transcrio dos genes estruturais.
Quando uma protena activadora est em pequenas concentraes, requer que se
ligue um efector que vai facilitar a ligao da RNA polimerase;
Quando a protena activadora est em concentrao elevada, no necessita de um
efector para que seja activada a transcrio.

Protenas repressoras ou reguladoras negativas: ligam-se ao DNA e impedem o acesso da RNA
polimerase ao promotor bloqueiam a transcrio.
Dependem da aco dos efectores:
Indutores: diminuem a capacidade de ligao dos repressores facilitando o
acesso da RNA polimerase ao promotor (ligam-se aos repressores e removem-
nos);
Co-repressores: conjugam-se com os repressores e facilitam a ligao dos
mesmos bloqueiam o acesso da RNA polimerase ao promotr, no havendo
transcrio.

Opero da Lactose
Estrutura:
Genes reguladores: Promotor (P), Operador (O) e Repressor (lacI);
Genes estruturais: lac Z (-galactosidase que quebra a lactose em dois monmeros,
glucose e galactose), lac Y (Lactose Permease que deixa entrar mais lactose na clula) e
lac A (Transacetilase).

104
Meio sem lactose O gene
lacI forma constantemente
repressor que se liga ao
operador, impedindo a RNA
polimerase de se ligar ao
promotor, logo bloqueia a
transcrio dos genes
estruturais. Isto porque os
genes estruturais codificam
para a protena que degrada a
lactose, logo se esta estiver
ausente no meio, no h
necessidade de produzir
protenas que a degradem.

Meio com lactose a lactose
liga-se ao repressor
funcionando como um
indutor, ou seja, promove a
ligao da RNA polimerase ao
promotor, activando os genes estruturais que produzem as enzimas necessrias para a
degradao da lactose.

O funcionamento do opero da lactose foi compreendido com base em mutaes.

Anlise de mutaes:
Mutaes no operador (O):
O
c
= operador
constitutivo: o local de
ligao do repressor no
operador est alterado,
logo no se liga e no h
expresso dos genes. A
expresso dos genes
estruturais pode ocorrer
mesmo na ausncia do
indutor (lactose);


Mutaes no repressor (I):
I
-
= mutao que impede a
ligao do repressor ao DNA.
Apesar da mutao I- no
permitir a formao de
repressor, o cromossoma
com o gene lacI activo
produz repressor suficiente
para inibir os dois operes;

I
s
= mutao no gene I que
impede a ligao do indutor,
mas em ambos os
cromossomas, impedindo a
expresso;
105
I
q
= mutao no gene I que permite a formao de repressor e que impede a
expresso basal dos genes estruturais.

Mutaes no promotor (P):
P
-
= impedem a ligao da RNA polimerase, no havendo a transcrio dos genes
estruturais em nenhum dos casos nesse cromossoma.

Mutaes cis-acting ou cis-dominantes: afectam o promotor e o operador. Ex:
mutaes O
c
e P
-
.

Mutaes trans-acting ou trans-dominantes: afectam o inibidor.


Controlo catablico do opero da lactose

Uma pequena quantidade de glucose pode ser suficiente para reprimir o opero da lactose
atravs da CAP (catabolite activator protein) e dos nveis de cAMP.

1. Glucose presente, lactose ausente no h transcrio



2. Glucose presente (baixo cAMP), lactose presente baixa
transcrio

3. Glucose ausente (alto cAMP), lactose presente alta transcrio

Opero da Arabinose

Genes reguladores:
Promotor (P
C
e P
BAD
);
Operadores (O1 e O2);
Reguladores (I1 e I2);
Gene C: auto-regulado, codifica para a protena AraC, actua na forma de dmero e
funciona como activadora e como repressora, consoante a necessidade de degradar a
arabinose.
Para nveis elevados de Glucose,
um dos seus produtos metablicos
inactiva a ciclase adenlica,
prevenindo a converso do ATP a
cAMP, logo o opero da lactose
permanece inactivo
106
Genes estruturais:
Gene B cinase;
Gene A isomerase;
Gene D epimerase.

Controlo positivo e negativo do opero da araninose

Com glucose = sem arabinose no h cAMP RNA polimerase no faz a transcrio dos
genes estruturais;
Sem glucose = com arabinose h cAMP que se liga protena CAP e a AraC + Arabinose
activam os genes estruturais.

Regulao do opero da arabinose

Sem arabinose:
AraC dmerica liga-se ao Operador 2 e
ao regulador I1, formando um Loop
que impede a RNA polimerase de se
ligar ao promotor, no havendo,
portanto, transcrio dos genes
estruturais forma-se pouco araC
mRNA.

Com arabinose:
A arabinose liga-se ao dmero de araC
e estas duas ligam-se aos reguladores
I1 e I2, induzindo a RNA polimerase a
ligar-se ao promotor P
BAD
, dando-se a
transcrio dos genes estruturais. O
Loop O2/I1 desloca-se e passar a ser
O1/O2 forma-se muito araC mRNA.


Opero do triptofano

P = promotor;
O = operador;
L = sequncia leader:
Tem na extremidade 3 um terminador da transcrio formado por um lao de oito
uridinas que designado por atenuador;
Pode formar laos entre a regio:
3 e 4 = muito triptofano, pois as enzimas que o degradam no so expressas;
2 e 3 = pouco triptofano, pois previne a formao do lao 3-4, ocorrendo a
transcrio dos genes EDCBA, formando-se triptofanases;
1 e 2 e 3 e 4 = se o ribossoma no faz a traduo do pptido leader, logo as
triptofanases no so expressas.
Pptideo leader tem 14 aminocidos e 2 so triptofanos.
Genes estruturais = E, D, C, B, A.





107
1. Activao dos genes estruturais na ausncia de triptofano funciona como indutor:










2. Represso dos genes estruturais na presena de triptofano funciona como co-
repressor:











Mecanismo de atenuao:
1. Baixas concentraes de Trp: o ribossoma pra nos codes Trp. Forma-se o hairpin
entre 2 e 3 e a transcrio no pra.
2. Elevadas concentraes de Trp: no h paragem do ribossoma nos codes Trp. Forma-
se o hairpin entre 3 e 4 e a transcrio pra.
3. Se nenhum ribossoma iniciar a traduo do peptdeo leader AUG, forma-se o hairpin 1-
2, prevenindo a formao do 2-3, embora permitindo a formao do hairpin terminal
3-4, logo as triptofanases no so expressas.














108
Outras formas de regulao

Regulao dos sistemas de reparao
O sistema SOS regulado pelo repressor LexA, inibindo a expresso dos genes ligados
reparao;
A protena RecA mantm nveis basais na clula, importantes para a recombinao;
Quando ocorre uma mutao, aumenta a expresso de RecA que vai actuar sob o
represor LexA;
A RecA cliva o LexA, permitindo a expresso dos genes estruturais (Ex: umu, uvr, din)
que leva produo de protenas implicadas na reparao do DNA.


Regulao da terminao da transcrio
Independente do factor Rho: formao de uma
estrutura em alfinete entre o mRNA que est a ser
transcrito. Depois forma-se um emparelhamento RNA-
DNA de quatro uridinas com quatro adeninas, que
muito instvel, levando libertao do mRNA.




Dependente do factor Rho: h reconhecimento do local
Rut, liga-se o factor Rho e, por hidrlise do ATP, d-se a libertao do mRNA.
O factor Rho, ligado ao RNA, persegue a RNA polimerase;
Quando a polimerase abranda (ou pra) num stem-and-loop, o factor Rho,
consegue apanh-la;
Rho induz a terminao.








Polaridade gentica na transcrio e na traduo.

Anti-terminao:
Capacidade de passar os locais de terminao;
Liga-se o factor de anti-terminao que permite que a RNA polimerase continue a
transcrio.

Regulao de sistemas repressveis:
Requer o reconhecimento de promotores especficos;
Requer a ligao da RNA polimerases especficas.

Regulao na traduo:
Genes das protenas ribossomais osto organizados em 4 operes;
Controlo primrio feito a nvel da traduo do mRNA (por reduo da actividade do
mRNA como molde) e no na sntese das protenas.


109
Regulao atravs da aco de alarmonas (hormonas de alarme):
Formam-se na resposta estringente face a sinais de esgotamento da fonte
aminocidos (ppGpp e pppGpp), hidratos de carbono (AMPc), folatos (ZTP), dano
oxidativo AppppA);
Nos eucariotas est associado paragem da replicao do DNA.


Regulao do ciclo de vida do fago :

Genoma com cerca de 50 Kb;

Replicao:
Inicial bidirrecional;
Tardia - em crculos rolantes.

Ciclo ltico ou lisognico;

Infeco inicial (activao dos genes iniciais):
Gene N (esquerda):
Tem capacidade de anti-terminao (permite a expresso dos genes
esquerda de N direita de cro);
Associado ao ciclo lisognico.
Gene cro (direita):
Gene Q activa expresso de genes tardios;
Associado ao ciclo ltico;
Para se expressar a protena cro, necessria a degradao do repressor
.




a. Expresso dos genes iniciais:

Numa fase inicial da infeco pelo
bacterifago , a transcripo a partir
dos promotores P
L
e P
R
interrompida
nos locais T
L
e T
R
por terminao
dependente do factor Rho. Embora
sejam produzidos alguns transcriptos;

medida que a infeco prosegue, a
concentrao de protena N, que
possui actividade de anti-terminao,
aumenta, logo sobrepe-se
terminao dependente do factor Rho
e formam-se transcriptos maiores.



110
b. Anti-terminao:

Logo aps a RNA polimerase da E. coli se ligar
ao local P
R
e iniciar a transcripo do gene
cro, o factor liberta-se e substitudo por
um dmero de NusA que se associa ao core
da enzima;
Aps este complexo passar o local nutR, uma
molcula de protena N entra da consituio
deste complexo, ligando-se regio nut
formao de uma partcula de controlo de
elongao funcional, que pode ultrapassar a
aco do factor Rho no local T
R
;
Quando este complexo passa o local nut,
ligam-se mais trs protenas: NusB, NusE e
NusG;
Uma srie de eventos semelhantes ocorre no local P
L
;
Passam o local de terminao T
R
ou T
L
, o que permite a transcripo dos genes cII (
direita de T
R
) e cIII ( esquerda de T
L
).
cI: repressor tem mais afinidade para a regio operadora do que a
protena cro, mantendo a lisogenia;
cII: importante na estimulao do P
E
mantm a lisogenia;
cIII: inibe a aco da protease H
f
L.


















Esquerda Direita Resultado
1 Estgio
N (anti-terminador em T
R
ou T
L
) cro (repressor em P
R
ou P
L
) Anti-terminao
2 Estgio
cIII (inibe a HfL) cII (estimula P
E
) cII e cI aumentam o repressor
Enzimas de integrao
3 Estgio
cI
N
Enzimas de integrao
cI
cro
replicao
A transcripo diminui do P
R

ao P
L
e aumenta a partir do
P
RM
; lisogenia estabelecida


Hfl H
f
L

111
c. Manuteno do ciclo lisognico:

No ciclo lisognico, a ligao da
protena cI activa a transcripo do cI a
partir do P
RM
e reprime a transcripo
da cro a partir do P
R
.




d. Activao do ciclo ltico:

A clivagem proteoltica do repressor cI
entre domnios activada por radiao
UV permite a transcripo da protena
cro;
Um dmero de cro liga-se ao operador
O
R
3 bloqueando a transcripo de cI.





e. Efeito dos nutrientes no estabelecimento do ciclo ltico ou lisognico:

Meio nutricionalmente pobre Meio nutricionalmente rico
Nvel de Protease HfL Baixo Alta
Nvel de Protena cII Alta Baixa
Expresso de cI Alta Baixa
Expresso de cro Baixa Alta
Lisogenia Lise


17) Regulao da expresso gentica em Eucariotas

Componentes do controlo gentico em eucariotas:
Sinais:
Estmulos que promovem uma resposta por parte dum gene:
Hormonas: hormona de crescimento, prolactina, estrognios, testosterona;
Factores de crescimento;
Factores ambientais (fsicos, qumicos e nutricionais).

Nveis de resposta:
Como controlada (a que nvel) a sequncia de acontecimentos que permitem a
transcrio do mRNA, a partir do DNA, at sntese de protenas:
Incio e terminao da transcrio;
Processamento (splicing) alternativo;
Transporte e estabilidade de mRNAs;
Traduo de mRNAs e estabilidade das protenas.
112
Mecanisnos de controlo:
A que nvel feito o controlo gentico? - Por envolvimento de molculas
individuais e estruturas celulares que podem exercer efeitos iguais ou diferentes
em genes individuais:
Protenas activadoras;
Estado de metilao e acetilao;
Associao matriz nuclear;
Estado de condensao da cromatina.

Nveis de resposta

a) Controlo da actividade reguladora dos factores de transcrio:

A actividade reguladora de um factor de transcrio pode ser controlada pela sntese de
protenas, modificaes covalentes da protena, ligao de um ligando ou pela ligao de
inibidores que sequestram a protena ou afectam a sua capacidade de se ligarem ao DNA.

113
b) Genes do choque trmico (activao por fosforilao):

Activados por aumento da temperatura:
30C na Drosophila e 39-40 no homem.

Protenas do choque trmico (Hsp) esto altamente conservadas:
Hsp (Heat shock protein) da E. coli e da Drosophila tm, respectivamente, 50% e
85% de homologia com a HSP
humana.

A temperatura normal, abaixo de 30C para as
moscas, a transcrio dos genes do choque
trmico mnima, mas imediatamente aps o
choque trmico a transcrio elevada. Uma
protena designada factor do choque trmico
(HSF) existe livremente nas clulas antes do
choque trmico; aps o choque trmico, o HSF
passa para a forma activa (HSF*), ligando-se a
locais especficos do DNA, aumentando a
transcrio.


c) Genes dependentes de hormonas esterides:

Activao requer a ligao das hormonas aos elementos de resposta do DNA.
Uma hormona esteride entra na clula, disolvendo-se na membrana lipdica;
Receptor forma um dmero com um inibidor, sendo este removido aquando da
ligao da hormona ao receptor;
O dmero liga-se ao elemento de resposta, activando a transcrio do gene
dependente dessa hormona.


d) Genes regulados por remoo de inibidores (Ig) e por associao de duas protenas (-
interfero):

Activao por ligao de molculas a receptores;
Libertao de mensageiros secundrios:
Diacilglicerol;
Clcio;
AMPc e GMPc.

Um lipopolissacarideo da bactria liga-se a
receptores na superfcie celular, entra na clula,
remove o inibidor e activa os genes que codificam
para imunoglobulinas.
O IFN liga-se a receptores, entra na clula e liga-
se a outras protenas, activando os genes
estimulados por IFN.



114
e) Genes que so activados por mudana de parceiro:

Factores de transcrio que induzem a diferenciao em clulas musculares:
MyoD-1;
Miogenina;
MyD-1.
So protenas Helix-Loop-Helix
com carcter bsico (bHLH);
O factor de transcrio MyoD-
1 na forma de homodmero ao
mudar de parceiro (MyoD-E12
ou MyoD-E47) promove a
diferenciao celular;
A introduo de DNA humano
em fibroblastos de ratinho
conduz diferenciao dos
fibroblastos em clulas
musculares.

A sntese de grandes quantidades de MyoD-1 ou miogenina causa paragem de crescimento
celular e forma clulas musculares, a partir de clulas epiteliais.


f) Controlo da transcrio por ligao de protena a protena:

Activao positiva pelo gene GAL4:
Ligao ao DNA;
Activao da transcrio;
Ligao protena reguladora GAL80.
Regulao negativa pela protena GAL80

O controlo dos diferentes genes que levam degradao da galactose efectuado por duas
protenas: Gal4 e Gal80. Este controlo no feito pela ligao directa ao DNA, mas sim pela
ligao das protenas Gal4 e Gal80, s ento se activam os genes que vo degradar a galactose
na levedura.

115
g) Processamento diferencial da CGRP
(calcitonine gene related peptide):

Conforme se usa um ou outro local de poli-
adenilao, vai-se obter calcitonina (tiride)
ou CGRP (hipotlamo), aps processamento
e traduo.





h) Controlo da transcrio por unidades de transcrio sobrepostas:

A regulao feita nos diferentes tecidos pela frequncia da escolha do local de incio
da transcrio;
So responsveis por diferentes concentraes da mesma protena em diferentes
tecidos (-amilase existe em maior concentrao na saliva do que no fgado).


Transporte e estabilidade de mRNAs:
A estabilidade do RNA pode ser conferida por:
Nutrientes - transferrina estvel na presena de ferro, sendo facilmente
degradada na sua ausncia;
Hormonas - mRNA da casena mais estvel na presena de prolactina;
Autorregulao - agentes como a colquicina que impedem a formao do fuso
mittico fazem com que a tubulina favorea a degradao do seu mRNA;
Cauda poliA - estaliza o mRNA;
A sequncia A(U)nA - favorece o ataque de nucleases e a degradao do mRNA.

Determinao da estabilidade de mRNAs
Pulse-chase:
Adio de [3H-uracilo] a uma cultura de clulas e remoo do mRNA em tempos
diferentes com aferio da velocidade de queda da radioactividade.
Estado estacionrio:
Estudo da acumulao de um determinado mRNA (marcado radioactivamente)
em funo do tempo.
Ensaios de inibio:
Comparao dos nveis de um determinado mRNA endgeno na presena e
ausncia de um inibidor da transcrio (actinomicina).

Regulao na traduo do mRNA e estabilidade de protenas:
A traduo de mRNAs e a sntese proteica afectada por:
Choque trmico;
Mitose (cerca de 30% do normal);
Fertilizao - aumenta a sntese proteica;
Estruturas secundrias da protena CAP e estado de fosforilao do factor eIF2.

116
Mecanismos de controlo

a) Protenas activadoras:
Gerais e especializadas, consoante a sequncia de aminocidos que possuem;
Localizam-se a montante, dentro ou a jusante da regio de incio da transcrio;
Funcionam nas duas orientaes;
Algumas so caractersticas de determinadas clulas que esto associadas ao
desenvolvimento e maturao dos diferentes tipos celulares dos organismos;
Ligam-se ao DNA nas regies que activam a transcrio e UAS;
Agrupadas de acordo com sequncia de aminocidos que possuem.

Heterodmeros de protenas diferentes;

Zink finger:
Com 9 domnios repetidos contendo cistenas e histidinas
que ligam uma molcula de zinco e so separadas por
intervalos regulares em forma de lao.
Genes gap da Drosophila;
TFIIIA.

Helix-turn-helix:
Formadas por dmeros com 3 regies em -hlice separadas por
pequenas cadeias de aminocidos.
Genes hometicos da Drosophila (Antp, ftz e Ubx);
Genes cro e repressor (fago ).

Anfipticas:
Dmeros de -hlice com regies ricas em aminocidos
bsicos no terminal amino e prximo do domnio de
dimerizao.
Leucine zipper: factores de transcrio c-
fos, c-jun e APi;

Helix-loop-helix: contm duas hlices
ligadas por um loop de estrutura
desconhecida, E12 e E47 (sntese de Ig).

Modo de actuao do enhancer:

O enhancer pode estar longe, a montante, do promotor;
O enhancer ajuda o factor que reconhece a TATA box a ligar-se, para a RNA polimerase
tambm se poder ligar, o que leva libertao do enhancer;
O factor que reconhece a TATA box pode tambm ligar-se sem necessidade do
enhancer e s depois, para que se ligue a RNA polimerase, que ele necessrio.
117
Modo de actuao do repressor:

a) Ligao a DNA competitivo:
Quando estamos perante uma
situao em que os locais de
ligao do repressor e do
activador esto sobrepostos, o
activador no consegue exercer
a sua funo, pois o repressor
encontra-se ligado.

b) Mascaramento da superfcie
de activao:
Tanto o activador como o
repressor se encontram no
respectivo local de ligao, mas
a outra extremidade do
repressor liga-se superfice de
activao do primeiro.

c) Interaco directa com os
factores gerais de transcrio:
Tanto o activador como o
repressor se encontram no
respectivo local de ligao, mas
a outra extremidade do
repressor liga-se directamente
ao factor de transcrio TFIID que, por sua vez, est ligado TATA box.


Identificao de sequncias reguladoras no DNA:

Um gene de teste clonado (verde) contendo
potenciais sequncias de activao
introduzido numa clula como sendo um
plasmdeo recombinante;
A expresso do gene de teste verificada por
medio da produo de mRNA a partir do
local do promotor correcto ou pela medio
da produo de uma protena de teste
(enzima bacteriana);
Atravs do uso de formas do gene de teste
que sofreram deleo, as regies fora da
regio codificante que aumentam ou
diminuem a expresso podem ser
identificadas (2, 3 e 4);
Mutaes pontuais em quaisquer elementos
activos de DNA identificados podem localizar
mais precisamente as sequncias funcionais
(5). Por exemplo, uma mutao (vermelho)
no local 1 iria destruir a sua capacidade de
activao, visto que a mutao prxima no o
fez.
118
b) Associao matriz nuclear:

MAR (Matrix Attachment Regions):
Pontos de ligao da cromatina interfsica matriz nuclear;
Junto a promotores e fora dos locais de transcrio.

SAR (Scaffold Associated Regions):
Pontos de ligao dos cromossomas metafsicos aos scaffold:
Scaffold = estrutura proteica associada aos cromossomas desprovidos de histonas e outras
protenas no-histonas, aps aco do di-iodossalicilato de ltio.

c) Estado de condensao da cromatina:
A cromatina encontra-se empacotada, sendo difcil o acesso da RNA polimerase regio
promotora, so consideradas regies de hipersensibilidade:
Situam-se antes da regio promotora;
Esto associadas expresso de genes;
So zonas susceptveis aco de nucleases.


d) Estado de metilao do DNA:
Hipometilao = actividade gentica:

Genes housekeeping: esto hipometilados e so
expressos nos tecidos ricos em regies CG.
Tratamento do cromossoma X com 5-azacitidina
conduz sua activao, dado que este composto inibe
a 5-metiltransferase, a enzima que adiciona grupos
metilo citosina no DNA.

Hipermetilao = diminuio da expresso gentica.


e) Estado de acetilao do DNA:

Hiperacetilao = actividade gentica:
HATs - (histone acetyltransferase);
HDACs (histone deacetylases).

Hipoacetilao = diminuio da expresso gentica.

a. As CpGs metiladas no DNA esto ligadas por protenas de
ligao dos metilos (MBD), que recrutam HDACs.
b. HDACS catalisam a remoo de grupos acetil das extremidades
amino das histonas.
c. Recrutamento de metilases de histonas (HMTs) resulta na
adio de grupos metilo s extremidades histnicas, que sero
ento reconhecidas por silenciadores da cromatina (HP1)
induzindo um estado inactivo.
d. Este estado inactivo pode ser ainda mais propagado pelo
recrutamento de metilases de histonas pelo HP1.
119
Desenvolvimento na Drosophila
Drosophila melanogaster
Modelo do controlo gentico a nvel dos eucariotas;
Pequeno tempo de gestao (+/- 10 dias);
Genoma com 1,6 x 108 bp;
4 Cromossomas;
Ciclo de vida da Drosophila: embriognese, 3 estadios de larva, um estadio de pupa e
adulto.



Desenvolvimento do ocito de Drosophila em ovo maduro:

1. Uma clula indiferenciada (stem cell) divide 4X e
origina 16 clulas: 1 ocito e 15 clulas nurse;
2. Clulas nurse sintetizam mRNAs e protenas e
necessrios aos estdios iniciais da embriognese
e maturao do ocito;
3. O ocito maduro ou ovo libertado no oviducto e
fertlizado.

Aps fertilizao:

1. Syncytium ou Blastoderme syncytial: aps 13 divises
celulares que no so acompanhadas de divises
citoplasmticas;
2. Blastoderme celular: diviso celular at haver 6000 ncleos que migram para a
perferia da clula;
3. Celularizao: membrana evidente em cada ncleo.

Embriognese inicial na Drosophila:

Aps a celularizao, os mRNAs maternos so depositados nos plos anterior e posterior do
ocito que sero, aps fertilizao, activados e traduzidos originando duas protenas: bicide
(plo anterior) e nanos (plo posterior).
A traduo destas protenas, associada difuso das mesmas ao longo do embrio, permite a
criao de um gradiente de protenas que conduz a uma cascata de activaes:
As protenas sintetizadas vo activar os genes gap;
So activados os genes pair-nule;
Estes activam os genes segment-polarity;
So activados os genes hometicos.

Hierarquia da cascata de activao dos elementos A-P no modelo de segmentao da
Drosophila:
Genes gap: definem as primeiras sub-divises do embrio;
Genes pair-rule: determinam os pares de segmentos;
Genes segment-polarity: controlam a organizao e estrutura de cada segmento,
definem os eixos anterior /posterior de cada segmento;
Genes hometicos (complexo antennapedia e complexo bithorax): controlam o
destino e a identidade de cada segmento;
Discos imaginais: conjunto de segmentos com agregados de genes que constituem o
complexo de genes hometicos.
120
Complexo de genes hometicos:
Homeose processo responsvel pela converso de uma parte do corpo noutra;
H genes homlogos da Drosophila tanto no ratinho como no homem;
As protenas homeodomnicas interagem com elementos reguladores dos genes
hometicos permitindo a sua expresso e a regulao de funes especficas;
Mutaes nestes genes podem originar mutantes letais e/ou alterar o destino e a
identidade de cada segmento.

Genes Hox:
Comuns em todos os organismos;
Controlam o desenvolvimento do sistema nervoso central e do corpo.

Controlo experimental da transcrio por run-on permite:
Medir o aumento ou diminuio da sntese de RNAs;
A transcrio de genes diferentes na mesma clula com sondas de cDNA que
reconhecem o mRNA complementar;
Controlar o mRNA ps-transcrio: mRNA da actina 15 x mais concentrado no
crebro do que no fgado e nveis de actina nos dois orgos so semelhantes;
Permite medir a transcrio diferencial durante o desenvolvimento;
Requer a adio de dNTPs radioactivos aos ncleos isolados de clulas.


18) Regulao do ciclo celular

Ciclo celular

Processo em que a clula me se divide e origina duas clulas filhas que so geneticamente
idnticas clula me:
Interfase ou fase intermittica:
G1: crescimento e desenvolvimento, sntese de mRNA e protenas e incio do
ciclo centrossmico;
S: replicao do DNA e sntese de histonas;
G2: sntese de mRNA e protenas.
Diviso celular:
Mitose (diviso nuclear):
Profase: condensao da cromatina, desorganizao do nuclolo;
Pro-metafase: quebra do invlucro nuclear;
Metafase: alinhamento dos cromossomas na placa equatorial;
Anafase: migrao dos cromatdeos para plos opostos;
Telofase: reorganizao do invlucro nuclear do nuclolo e do ncleo, descondensao dos
cromossomas.
Citocnese (diviso citoplasmtica): por clivagem do anel contrctil (clulas
animais) ou por deposio de fibras de celulose (clulas vegetais).


G1 [Gap1]: Perodo de crescimento anterior replicao do DNA. Esta fase caracterizada
pela expresso gnica e pela sntese de protenas. Esta efectivamente a nica fase do ciclo
celular regulada primeiramente por estmulos extracelulares (tais como mitognicos e adeso).
Esta fase permite clula crescer e produzir todas as protenas necessrias para a sntese de
DNA.

121
S [Sntese]: Corresponde replicao do DNA (e dos centrolos). Nesta fase, a clula passa a
ter dois conjuntos completos de DNA, o que lhe vai permitir dividir-se em duas clulas-filhas,
cada uma das quais com uma cpia completa de DNA.

G2 [Gap 2]: Perodo de crescimento aps a replicao do DNA. Durante esta fase, a clula
continua a crescer e a sintetizar protenas.

M [Mitose]: Perodo de diviso celular. Durante a mitose, a clula divide-se em duas clulas-
filhas (processo denominado citoquinese). O ciclo celular est, assim, completo.
Aps a mitose, as clulas-filhas, podem reentrar na fase G1, ou avanar para a fase G0, na qual
o crescimento e a replicao do DNA param. Elas esto activas, realizando as suas funes no
organismo designadamente, secreo, conduo de impulsos nervosos, etc. Frequentemente
as clulas na fase G0 atingem um estadio terminal de diferenciao: no voltam a entrar em
ciclo celular, embora continuem a desempenhar as suas tarefas at que morrem.
Outras podem efectivamente reentrar no ciclo celular: o caso, por exemplo, da maior parte
dos linfcitos no sangue humano, que se encontram na fase G0; contudo, sob determinados
estmulos, como o caso de encontrarem o antignio apropriado, podem reentrar no ciclo
celular (na fase G1) e voltar a alternar as fases S e a mitose.
As fases do ciclo celular podem ser discriminadas com base na diferena no contedo em DNA,
excepto para as fases G2 e M, as quais tm, um contedo idntico em DNA.

Funes do ciclo celular:
Unicelulares:
Reproduo por diviso celular:
Na amiba, eucariota unicelular, a diviso celular forma duas novas clulas.
Pluricelulares:
Reproduo;
Reparao;
Crescimento e desenvolvimento.
Caractersticas da meiose:

Estdio Principais eventos
Meiose I

Profase I Condensao dos cromossomas, sinapse dos cromossomas homlogos, inicio
do crossing-over, quebra do envelope nuclear e o fuso acromtico forma-se.
Metafase I Alinhamento dos pares de cromossomas homlogos na placa equatorial.
Anafase I Os dois cromossomas, cada um com dois cromatdeos, de cada par de
homlogos separam-se e movem-se para plos opostos.
Telofase I Os cromossomas atingem os plos do fuso.
Citocinese O citoplasma divide-se formando duas clulas, cada uma contendo metade do
nmero original de cromossomas.
Intercinese Em algumas clulas, o fuso acromtico quebra-se, os cromossomas relaxam e o
envelope nuclear reorganiza-se, mas no ocorre a sntese de DNA.
Meiose II

Profase II* Condensao cromossmica, formao do fuso e desintegrao do envelope
nuclear. Esta fase ocorre apenas em clulas que sofreram intercinese, caso
contrrio, aps a citocinese, avanam para a Metafase II.
Metafase II Cromossomas alinham-se na placa equatorial.
Anafase II Cromatdeos irmos separam-se e migram para os plos do fuso.
Telofase II Cromossomas chegam aos plos do fuso; o fuso quebra e o envelope nuclear
reorganiza-se.
Citocinese O citoplasma divide-se.

122
Regulao do ciclo celular em eucariotas

Pontos de controlo (checkpoints):
G1 / S: verificao se ocorreram mutaes no DNA antes de se iniciar a sua
replicao;
G2 / M: factores ambientais e verificao se todo o DNA foi replicado e
verificao do tamanho celular (MPF);
Metafase / Anafase: alinhamento dos cromossomas na placa equatorial (APC)
reparao via protena Bub e Mad.

Reguladores externos qumicos e fsicos:
Disponibilidade de nutrientes;
Factores de crescimento;
Mitognios;
Aderncia.
CDKs = Complexos das Cinases Dependentes das Ciclinas;
Ciclinas = mitticas e da interfase;
CKIs = Inibidores da Cinases Dependentes das Ciclinas;
MPF = Factor Promotor da Mitose;
APC = Complexo Promotor da Anafase ou Ciclossoma.

Ciclinas:
Protenas que so sintetizadas ciclicamente ao longo do ciclo celular;
Ciclinas da interfase e da mitose;
Associam-se s Cdk.


Genes supressores de tumores:
pRb, p107, p130;
Inibem E2Fs;
pRb fosforilado pelo complexo ciclina D-Cdk4,6.

Factores de transcrio E2F:
Induzem a sntese de: Cdk2, ciclina E,
ciclina A, E2F.
A interaco dos E2Fs com a protena Rb
hipofosforilada inicialmente inibe a
actividade do E2F;
Quando a sinalizao, por parte dos
mitognios, suspensa, os complexos Cdk4-ciclina D e Cdk6-ciclina D resultantes iniciam a
fosforilao da protena Rb, convertendo algum E2F para a forma activa;
O E2F activo estimula a sua prpria sntese e a sntese de Cdk2 e ciclina E;
O complexo Cdk2-clina E estimula, depois, a fosforilao da protena Rb, logo ainda
maior a actividade do E2F.

CKIs (inibidores das Cdks):
Famlia Cip/Kip:
p21, p27 e p57;
Inibem os complexos de ciclina ligados a Cdk1, Cdk4 e Cdk6.
Famlia INK4:
p15, p16, p18 and p19;
Inibem os complexos de ciclina D ligados Cdk4 e Cdk6 (G1).

Fase Cdk Ciclinas
G1 Cdk4 e Cdk6 Ciclina D
G1 / S Cdk2 Ciclina E
S Cdk2 Ciclina A
G2 / M Cdk1 Ciclinas A e B
123
Factores citoplasmticos que controlam a progresso do ciclo celular:

Induo da unio de clulas em cultura em diferentes fases do ciclo celular;
Deteco de molculas nas fases S e M que controlam estas fases.

1. Quando uma clula na fase S se funde com
outra clula na fase G1, a clula G1 entra
imediatamente na fase S DNA
sintetizado.

2. Quando uma clula na fase M se funde com
outra clula na fase G1, a clula G1 comea
imediaamente a mitose forma-se o fuso
e a cromatina condensa, mesmo que o
cromossoma no tenha sido duplicado.



Ponto de restrio (G1 checkpoint):
a. Se a clula recebe um sinal para passar o ponto de restrio est determinada a
continuar ao ciclo celular.
b. Se a clula no recebe o sinal para continuar o ciclo celular no ponto de restrio a
clula entra em G0 ou fase estacionria.
Sada de G0 para o ciclo celular requer:
Early-reponse genes: c-fos e c-jun (factores de transcrio);
Delayed-response genes: E2F, ciclinas D e E, Cdk2, Cdk4 e Cdk6.


Progresso G1 / S:

Fosforilao do pRb permite a passagem de G1 fase S.














124
Origem e incio da replicao do DNA:
ORC (origin recognition complex):
Determina onde ocorre o incio da replicao
requer as protenas ORC2-6 (+ORC?) e ORC1;
Cdc6 e Cdt1 depositam as Mcm 2-7
(minichromosome maintenance) com actividade
helicase.

Complexo de pr-iniciao:
Cdc6 substitudo por Cdc45 e RPA, por aco da
Cdk2/ciclina A e Cdk2/ciclina E, que deposita a DNA
polimerase e DNA primase;
activado pelo complexo Cdc7/Dbf4.




Reunio e activao do complexo de pr-
replicao (pre-RC):

Determina onde ocorre o inicio da
replicao.
Cdc6 e Cdt1
Cdc45, RPA, DNA pol.
e DNA primase

Cdc6 e Cdt1
125
Deteco da replicao do DNA:

Por adio de factores de crescimento e na
presena de ciclina D, a clula sai de G0;
O incio da fase S pode ser determinado pela
incorporao de BrdU (5-bromo-2-deoxiuridina);
Ciclina D necessria para passar o ponto de
restrio:
Clulas microinjectadas com anticorpo anti-
ciclina D no fazem a incorporao de BrdU.

O BrdU, similar timidina, um nucletido modificado, que se
incorpora no DNA sintetizado de novo durante a fase S do
ciclo celular. O BrdU pode depois ser localizado usando um
anticorpo monoclonal especfico. A marcao por BrdU tem
sido usada em estudos de proliferao em vrios tipos de tecidos.

G2 checkpoint:
Deteco (sensores): ATR e ATM;
Emisso e amplificao de sinal:
Chk2 e Chk1;
Efectores: p53.
DNA danificado ou no
totalmente replicado:
p53 activado;
Induo de p21;
Inibio dos complexos
Cdk1, Cdk2, Cdk4 e Cdk6
ligados ciclina;
Pra as clulas em G1 e
G2.


MPF (Maturation Promoting Factor):
Factor que regula o incio da mitose em
eucariotas;
Constitudo pela ciclina B (ciclina mittica qe se
acumula na clula drante a interfase) e p34,
sendo activado por desfosforilao;
Inibio da sntese de ciclina B diminui
actividade de MPF;
Fosforila vrias protenas.

G2 checkpoint e activao do MPF:
wee1: fosforila Tyr15 e Thr14;
CAK: fosforila Thr161;
Cdc25: desfosforila Tyr15/Thr14 e activa MPF;
MPF activado promove:
Condensao cromossmica;
Dissoluo do invlucro nuclear;
Formao do fuso;
Fragmentao do Golgi e ER.

126
Poli-ubiquitinao das ciclinas mitticas:
Sequncia de destruio mittica
(sequncia PEST);
Ubiquitina:
Protena com 76
aminocidos;
activada pela ligao
tioster enzima E1.
E1: enzima activadora da
ubiquitina;
E2: enzima conjugadora da
ubiquitina;
E3: ligase da ubiquitina;
Proteossoma.

Todas as ciclinas mitticas tm Destruction-box homlogas (amarelo) perto do N-terminal. As
sequncias PEST de Xenopus revelam ter resduos de aminocidos conservados nas trs
protenas (vermelho) e resdos conservados em duas das trs protenas (preto).
Primeiro, a ubiqitinas encontra-se ligada sua enzima activadora, E1, que depois a passa sua
enzima conjugadora, E2. Depois da E2, junto com a ubiquitina ligase, E3 ou APC, reconhecerem
a sequncia PEST, a ubiquitina transferida para a protena. Repedindo-se este processo de
poli-ubiquitinao, sendo a protena depois degradada pelo proteossoma.


Identificao do MPF e ciclinas em ocitos de Xenopus:
Maturao do ocito na fase G2 para a metafase da meiose II pode ser obtida com a
microinjeco da progesterona (hormona esteride feminina);
A microinjeco de citoplasma da metafase II promove o mesmo efeito que a
progesterona;
A purificao do factor que medeia a maturao do ocito conduziu identificao
do MPF;
Nveis oscilam na meiose e na mitose durante os estadios iniciais de clivagem do
ocito aps a fertilizao;
Estas oscilaes so devidas sntese e degradao das ciclinas;
MPF corresponde ciclina B-Cdc2 ou complexo Cdk1.


Actividade do MPF e concentrao das ciclinas:





127
Mecanismos moleculares que regulam o ciclo celular:



















Transio metafase/anafase - spindle checkpoint:
bub 1, 2, 3 (Budding Uninhibited by Benomyl): benomyl:
despolimeriza microtbulos e previne a ligao aos
cinetocoros;
mad 1,2,3 (Mitotic Arrest Deficient): se todos os cromossomas
esto alinhados na placa equatorial, as protenas mad so
libertadas, forma-se o complexo CDC20-APC e avana-se para
a anafase.
Separina/separase (esp1) inactiva quando ligada (esp1-
pds1) a securina (pds1);
Securina (pds1) degradada pelo APC/CDC20;
Quando os cinotocoros esto correctamente ligados ao
fuso, o APC liga CDC20 e promove a degradao da
securina (pds1) e libertao da separase (esp1);
A separase (esp1) livre cliva a coesina (scc1) entre as cromatdas irms.



Paragem em metafase - spindle checkpoint:
Se os cinetocoros no esto todos ligados:
bub e mad inibem o complexo APC/CDC20;
Securina (pds1) no degradada;
Separase (esp1) no libertada das cromatdas;
PLK1 - aumenta a clivagem entre a coesina e separina;
Aurora - parece potenciar a separao das cromatdas
e ser um sensor da tenso/orientao das cromatdas.



Sntese de ciclina inicia-se na fase
S tardia e continua atravs da G2.
Como a ciclina est protegida da
degradao durante este estdio,
acumla-se.

Molculas de ciclina combinadas
com molculas recicladas de Cdk
produzem MPF suficiente para se
passer o checkpoint G2 e iniciar a
mitose.

O MPF promove a mitose por
fosforilao de vrias protenas. A
actividade do MPF atinge um
mximo durante a metfase.
Durante a Anafase, a componente
ciclina do MPF degradada,
terminando a fase M, entrando a
clula na fase G1.
Durante a fase G1, as condies
cellars favorecem a degradao
da ciclina e a component Cdk do
MPF reciclada.
128
Controlo da entrada na anafase e fim da mitose atravs do APC:

O APC inactivo (laranja claro) activado
(roxo escuro) directa ou indirectamente pelo
MPF (Cdc2-ciclina B) aps este ter induzido
os eventos anteriores da mitose durante a
metfase. O APC activo, primeiro, vai poli-
ubiquitinizar o inibidor da anafase
(castanho), que previne a separao dos
cromatdeos irmos, iniciando a anafase. Em
seguida, o APC poli-ubiquitiniza a ciclina B, o
que resulta na inactivao do MPF e na sada
da mitose.



Nveis de ciclina mittica e actividades do MPF e
do APC:

O APC activado apenas quando a actividade do
MPF elevada. O APC activo + E2, que esto
covalentemente ligados ubiquitina, ligam-se
ciclina B, baixando a actividade de destruio e
conduzindo telofase. Aps a citocinese, a sntese
de ciclina B ocorre na interfase das clulas filhas. A
actividade do APC permanece elevada at ao final
da fase G1 do prximo ciclo celular at ser
inactivado por m complexo Cdk da G1.



Regulao do ciclo celular em eucariotas:









129
19) Mecanismos de induo do cancro

Cancro

Definio: diviso celular incontrolada;
Incio: mutao no DNA;
Progresso:
Diviso de clulas mutadas no local de origem (tumor primrio);
Invaso dos tecidos adjacentes (cancro invasivo);
Formao de metstases (via sangue/vasos linfticos) e tumores secundrios
(ndulos linfticos, fgado, bao, pulmes, ossos).
Morte:
Esgotamento das fontes de nutrio;
Bloqueio de rgos vitais;
Hemorragias - diminuio da resistncia a infeces.

Classificao por tecidos:
Carcinoma:
Clulas epiteliais;
90% de todos os tumores;
Derivados da ectoderme (maioria) ou da endoderme (alguns).

Sarcoma:
Tecido conjuntivo;
2% de todos os tumores;
Derivados da mesoderme (msculo, osso, cartilagem, tecido gordo e conjuntivo).

Leucemia/linfoma:
Circulatrio ou linftico;
8% de todos os tumores;
Derivados da mesoderme.

Classificao por tipo de clulas:
Clulas descamativas: clulas epiteliais;
Clulas mielides: envolve as clulas responsveis pela produo de anticorpos
(linfcitos B);
Clulas linfides: linfcitos e macrfagos;
Clulas adenomatosas: clulas glandulares e do ducto.


Tumores benignos:
Em geral tm crescimento lento e esto envolvidos por
cpsula;
So relativamente incuos mas depende da localizao
(crebro);
No so considerados malignos;
Tm a designao de oma (osteoma benigno, mas
melanoma e osteosarcoma so malignos).


130
Tumores malignos:
Proliferam muito rapidamente e invadem os tecidos
vizinhos;
Formam metstases e espalham-se para outras zonas do
corpo;
Destroem os tecidos circundantes por compresso e
alterao do fluxo nervoso e sanguneo;
Designados de acordo com o tecido, tipo de clula ou
origem.

Caractersticas das clulas tumorais:
Translocaes:
Linfoma de Burkitts: translocao 8:14, fuso c-myc e Ig enhancer, que impede a
correcta maturao dos linfcitos B.

Linfoma folicolar: translocao 14:18, fuso bcl2 e IgH, que leva expresso
exagerada de bcl2 e impede a apoptose.

Leucemia mielide crnica:
Translocao 9:22 (cromossoma filadlfia),
fuso dos genes bcr1 e alb;
Forma protena com actividade cinase da
tirosina e envolvida na sinalizao celular;
Proliferao de precursores
hematopoiticos e inibio da apoptose.






Aneuploidia: nmero anormal de cromossomas.





Alteraes no crescimento e no comportamento:
Menor necessidade de nutrientes;
Menor aderncia e modificao da morfologia;
Crescimento em condies adversas;
Perda da inibio de contacto.




Alteraes da superfcie celular:
Reduo ou ausncia de fibronectina;
Aumento do transporte de glucose;
Protenas de superfcie com maior mobilidade:
Iludem o sistema imunitrio;
Escondem epitopes superficiais.

Caritipo Normal
131
Secreo de proteases: ajudam a clula a penetrar na membrana basal.
A clula tumoral apresenta receptores para a laminina inserida na lmina basal
constituda por colagneo tipo IV, qual se vo ligar;
Aps a ligao, a clula tumoral sintetiza colagenase tipo IV e degrada a lmina
basal, invadindo a clula.

Perda de filamentos de actina (diferente localizao).

Acumulao de mutaes: processo multietpico de transformao.

Factores de crescimento:
Libertao;
Diferente necessidade.

Alterao da transcrio.

Imortalidade: induzida por mitognios ou espontnea.

Culturas celulares
Estabelecem-se aps a remoo de clulas de um determinado orgo/organismo;
So mantidas num meio de cultura na presena de soro fetal, CO2 e a 37C;
Permitem:
Estudar o cancro;
A aco de mutagnios;
A expresso de protenas;
A manipulao gentica.
Podem passar a linhas celulares imortais depois de sofrerem uma transformao
causada por vrus, agentes qumicos ou radiaes;
Clulas HeLa e fibroblastos.


Mecanismos de induo do cancro

Processo com vrias etapas e consequncia de vrios acontecimentos
Genticos:
Genes supressores de tumores;
Oncogenes;
Genes da reparao do DNA;
Telomerase;
p53.

Ambientais:
Viroses:
pappilomavirus humano (cancro cervical);
hepaptite B e C (cancro heptico);
HIV (sarcoma de Kaposis e linfomas);
Retrovirus (cancros em animais mais do que em humanos).
Fumo tabaco (50-60% morte por cancro);
Alimentos (50-60% morte por cancro);
Radiao (90% cancros de pele);
Qumicos;
Poluio (25% cancro do pulmo).
132
Epigenticos;
Alterao de dois mecanismos celulares que controlam e mantm um balano
correcto do nmero de clulas no nosso organismo:
Proliferao celular;
Apoptose ou morte celular programada.

1. Factores ambientais:

1.1. Agentes qumicos:
Benzeno (leucemia mielide);
Pesticidas com arsnio (cancro pulmo);
Bifenilos policlorados (cancro da pele e fgado);
Fibras minerais (cancro do pulmo).

Aco directa: tm partida afinidade para o DNA. Ex: compostos electroflicos.

Aco indirecta: no tm logo afinidade para o DNA, mas ganham-na. Ex:
metabolizao via citocromo P450 e formao de radicais livres.

Podem actuar por sinergismo:
Iniciador - requer a metabolizao para ser activo;
Promotor:
No requer metabolizao;
Actua depois do iniciador;
Requer aplicaes repetidas;
Raramente reage com compostos electroflicos.

1.2. Agentes fsicos:
UV, raios-X, radiaes ionizantes;
Afectam o DNA e proto-oncogenes;
Afectam enzimas que reparam o DNA (fotolase mutada provoca cancros mltiplos de
pele).


2. Mutaes:

Em proto-oncogenes (celulares e vricos);
Em genes supressores
de tumores;
Resultantes:
Da quebra e reunio de
cromossomas;
Delees;
Mutaes pontuais;
Amplificaes.

133
3. Factores epigenticos

No alteram a sequncia de DNA;
Condicionados pelo meio ambiente;
Podem ser transmitidos descendncia (metilao do DNA);
Modificaes na conformao de protenas (pries);
Mecanismos:
Metilao do DNA;
Acetilao do DNA;
Imprinting.


Metilao do DNA:
Metilao (A 5 base 5-
metil citosina) inactiva
genes;
Locais de metilao so
CpG (vertebrados).









Imprinting:
Marcao permanente dos genes passados por cada um dos progenitores;
Metilao est habitualmente envolvida quer activando quer inactivando os genes;
Os dois sndromas so causados por delees no cromossoma 15: deleo paternal:-
obesidade, estatura pequena e atraso mental; deleo maternal: riso incontrolado,
descoordenao motora e outras alteraes motoras e mentais;
Expresso de cada sndroma dependente do imprinting genmico;
Dependente do progenitor que fornece o cromossoma mutado.

Metilao aberrante no cancro:
hipometilao global: instabilidade gentica;
hipermetilao das ilhas CpG: inactivao de genes supressores de tumores.

Acetilao do DNA:
Neutraliza a carga positiva das histidinas;
Destabiliza a interaco entre histonas e protenas estruturais.
Exemplo: a lisina acetilada formando-se acetil-lisina pela histona
acetiltransferase e desacetilada pela histona desacetilase.
Hipoacetilao: interaces internucleossomas fortes;
Hiperacetilao: interaces internucleossomas fracas que facilitam o acesso de
(histonas desacetilases).


134
Equilbrio entre a proliferao celular e a apoptose:

Pontos de controlo do ciclo celular:

Transio G1/S:
Tamanho da clula;
Meio ambiente;
Mutaes no DNA antes da replicao.

Cdk2 + A, E2F so sintetizados pelos Delayed
Response Genes;
Formao de um complexo pRb + E2F (E2F
inactivo);
Cdk2 + D fosforilam pRb;
E2F activado permitindo a traduo de
enzimas especificas para a sntese de DNA.


Ciclo pra em G1, S ou G2 com DNA danificado ou no replicado:

No Homem, os danos no DNA so detectados por sensores:
ATR e ATM;
O ATM :
Cinase que detecta DNA danificado;
Activa Chk2 que fosforila Cdc25;
Impede a desfosforilao de Cdc2;
No h activao de fase M.
135
ATRIP;
Rad1;
Rad9;
Hus1;
RFC2-5;
Rad17.
Depois procede-se a uma emisso e amplificao de sinal por parte de transmissores:
BRCA1?;
Chk2;
Chk1.
A proteco finalmente feita por efectores:
p53: Transcription Cell cycle arrest:
H2A-X: Repair.


O p53 activado por uma srie de tipos de stress e induz a expresso de vrias protenas que
esto envolvidas na inibio da proliferao celular ou na promoo da morte celular por
apoptose. Nas clulas tumorais, os efeitos de crescimento e de apoptose do p53 podem ser
minimizados devido a mutaes no gene a jusante do p53, no prprio gene de p53 ou
mutaes ou alteraes nos nveis de
protenas que modulam a funo do p53.

Um dano no DNA vai activar o p53
que pra as clula em G1 e G2;
Aumenta a [p53] que vai induzir a
traduo do p21 e, portanto, a
[p21] aumenta;
Este vai inibir a actividade da
ciclina/cdk2 (Bloqueio da
progresso celular) e inibir a
actividade do PCNA (activao da
apoptose).




Apoptose ou morte celular programada:

Mecanismo de auto-destruio que permite eliminar clulas danificadas por aco de
enzimas especficas caspases;
Activao:
Desenvolvimento, diferenciao e maturao:
Reabsoro da cauda dos girinos na metamorfose do sapo;
Eliminao das clulas e membranas que unem os dedos durante o
desenvolvimento do feto;
Eliminao dos linfcitos T autorreactivos (autoimunidade);
Eliminao de estruturas no desejadas;
Controlo do nmero de clulas.
Leses no DNA que no foram superadas pelos mecanismos de reparao.


Benzo(a)pireno - 175, 248, 273
Aflotoxina - transverso 249
136
Vias maioritrias da apoptose:
Via receptores da morte:
Extrnsecos todos tm um
motivo death domain (DD)
do tipo I:
FAS (FasL ,CTL, kill vir inf cells);
TNFR (1/2) (TNF Mphgs);
DR2 (dead receptor);
TRAIL receptors (TR1-4).
Intrnsecos (p53
importante):
Reticulo endoplasmtico (unfolded
protein);
Ncleo (DNA damage);
Citosol (ROS).

Confirmao de mecanismos com anlise dos
marcadores apoptticos:
p53 supressor tumoral;
Bcl-2 - Anti-apoptotico;
Bax - Pro-apoptotico;
Citocromo c - Pro-apoptotico;
Caspase 8 iniciador da apoptose;
Caspase 3 executor da apoptose.


Anti-apoptose
Famlia Bcl2 influencia a distribuio sub-celular do citocromo c;
Sobre-expresso de Bcl2 bloqueia a libertao do citocromo c.

Protenas inibidoras da apoptose IAP:
Ligam as procaspases e caspases activas para as manterem inactivas;
cIAP1, xIAP, cIAP2, p35 (baculovirus).

Pro-apoptose:
Bax e/ou Bak so essenciais para a apoptose;
Animais deficientes em Bax/Bak no sofrem apoptose;
Protenas BH3 so molcula pr-apoptticas quando produzidas em excesso mas
requerem o Bax e/ou Bak.

Activadores da apoptose:
Citocromo c;
AIF (factor indutor da apoptose);
Smac/Diablo (inibidores das IAPs).

Caspases:
Cystein aspartate proteases (local activo cistena, clivado depois do aspartato);
Sintetizadas na forma de precursores inactivos;
Activadas por clivagem (inter ou intra);
Caspases iniciadoras: clivam e activam caspases efectoras (amplificao);
Caspases efectoras: clivam vrios alvos celulares e conduzem fragmentao da clula
e do DNA.

137
Activao das caspases:
Ligao do ligando FasL ao receptor Fas da
clula;
Activao da protena Apaf (Apoptotic
protease activating factor) que forma um
complexo com a protena do citocromo c;
O complexo c-Apaf activa as caspases.






Apoptossoma:

Interaco do citocromo c, Apaf-1, dATP/ATP e pro-caspase 9 forma o complexo
apoptossoma.


Alguns substratos que conduzem apoptose:
gelsolin - depolym F-actin; membrane blebbing
PARP-1 - inibe a reparao do DNA;
ICAD active o CAD para clivar o DNA nuclear;
CAD = caspase-activating deoxyribonuclease
Lamin Desagrega a membrana nuclear;
Bcl-2 bloqueia a sinalizao anti-apopttica;
FAK - cell shrinkage and detachment
AKT - bloqueia a sinalizao anti-apopttica;
ainus condensa o DNA;
hnRNPs Pra a sntese de RNA.



Alteraes fenotpicas da clula em apoptose:
Fragmentao do DNA;
Ruptura de organelos;
Alterao da forma normal da clula;
Formao de corpos apoptticos.


Apoptose:
H fragmentao do DNA (200bp);
H condensao da cromatina;
H formao de corpos apoptticos e vesiculizao da membrana;
Inicia-se por um processo de transmisso de sinais (carncia de factores de
crescimento, influncia de hotmonas);
138
Processo activo que requer a sntese de macromolculas,
expresso de genes e activao das caspases;
Alteraes na forma e distribuio da fosfotidilserina das
mitocndrias;
No causa inflamao.

Necrose:
No h fragmentao do DNA;
No h condensao da cromatina;
No h formao de corpos apoptticos;
Inicia-se por dano directo sobre a clula (fsico,
qumico e anoxia);
Processo passivo que no requer a sntese de
macromolculas;
Rebentamento da membrana;
Vacuolizao;
Turgidez da clula e da mitocndria;
Causa inflamao.


Proto-oncogenes

Celulares (c-onc) ou vricos (v-onc):
Desempenham funes celulares normais;
So altamente conservados durante a evoluo;
Quando mutados do origem a oncogenes.

Classificao e funes dos proto-oncogenes:
Classe I: factores de crescimento;
Classe II: receptores para factores de crescimento e hormonas;
Classe III: transmissores e receptores intracelulares;
Classe IV: factores de transcrio;
Classe V: protenas anti-apoptticas;
Classe VI: protenas que controlam o ciclo celular;
Classe VII: protenas que reparam o DNA.

139
Oncogenes:
Derivam dos proto-oncogenes por:
Substituies (mutaes pontuais);
Inseres (DNA retrovrico);
Translocaes;
Amplificaes e delees nas sequncias de controlo e codificantes;
Recombinaes com DNA retrovrico.

Genes supressores de tumores:
Genes celulares normais cujos produtos inibem ou retardam o ciclo celular;
Ausncia ou inactivao pode conduzir ao cancro;
pRb e p53.


1. Classe I - factores de crescimento:

Oncogenes raramente derivam de genes que
codificam para factores de crescimento;
sis codifica para uma forma de PDGF
(platelet-derived growth factor):
S capaz de transformar as clulas
que possuem o receptor PDGF
(fibroblastos, clulas gliais e msculo
liso);
v-sis (produtos semelhantes ao PDGF) =
aumento da proliferao celular;
Sarcomas e astrocitomas (cancro intracraneal
que afecta os astrcitos clulas que nutrem
os neurnios);
Oncogenes artificiais da classe I (GM-GSF e
TGF-):
A insero do factor GM-GSF (granulocyte-
macrophage colony stimulating factor) numa
clula que possui o receptor GM-CSF leva
estimulao contnua do crescimento da clula
(induo autcrina).




2. Classe II - receptores para factores de crescimento, factores espcficos e hormonas:

Constitudos por domnios extracelulares, transmembranares e intracelulares;
Quando ligam um factor especfico emitem sinais;
Sinalizao endcrina, parcrina e sinalizao por plasma membrane-attached
proteins.

a. epo (rim) e receptor epo:
Necessrios para a proliferao, sobrevivncia e diferenciao da linha
eritride;
SFFV (spleen focus forming virus):
Retrovirus;
Liga receptor epo;
140
Estimula proliferao dos precursores eritrides no ratinho;
Induz eritroleucemia (semelhante policitemia vera em humanos).

b. Receptores das cinases da tirosina (RTKs):
Receptores para factores de crescimento, citoquinas (interfero);
Local activo das cinases est no domnio citoplasmtico;
Ligando promove a dimerizao do receptor.

c. Receptor Her2:
Receptor da cinase da tirosina (RTKs);
Ligao de um factor especfico emite sinais de crescimento para a clula
atravs da fosforilao de resduos de tirosina prprios e de protnas alvo;
As mutaes nestes genes fazem com que estes receptores se mantenham
activos mesmo na ausncia de um ligando:
Mutao pontual em Her2 conduz formao do oncogene neu;
Deleo no receptor EGF forma o ErbB.


3. Classe III - receptores e transmissores intracelulares:

Podem ser citoplasmticos e nucleares;
No tm domnios extracelulares ou trans-membranares;
Activam mensageiros secundrios: AMPc, inositol, protenas Smad;
Codificam para protenas que so cinases da tirosina (PTK) e cinases da serina/ treonina
que causam efeitos pleotrpicos.

a. Protenas ras:
Componente chave para transmisso de sinais
dos RTKs activados;
Codificam para a p21ras que liga o GTP e tem
actividade GTPsica;
Origem retrovrica:
Ha-ras (Harvey murine sarcoma) - Bexiga e pele;
Ki-ras (Kirsten murine sarcoma) - pulmo e clon.
Origem celular:
N-ras - neuroblastoma e leucemias.
Protena mutada tem uma valina em vez de
glicina na posio 12 (ou 13, 59, 61);
O efeito desta mutao missense recai sobre a
oncoprotena c que deixa de hidrolizar o GTP a
GDP. Assim, a oncoprotena Ras permanece no
complexo activo Ras-GTP e activa continuamente
o gene da serina/treonina cinase.

b. Protenas G:
Protena Gs controla a sntese de AMPc via
adenilciclase e atravs da ligao ao GTP;
Protena Gs mutada estimula a adenilciclase continuamente e promove a
formao de tumores da pituitria.

c. Protena pp60c-src:
Associada cnase lipdica que fosforila o inositol dos lpidos;
141
Tem vrios locais de fosforilao e
a tirosina 527 hipofosforilada
reduz a actividade cnase desta
protena;
A protena mutada tem actividade
cinsica aumentada pois carece
do terminal carbolico (18 aa) e
no fosforilada para ser
inactivada.


d. TGF (transforming growth factor ):
Inibe o crescimento das clulas
epiteliais e do sistema imune;
Activa receptores celulares com
actividade cinase serina/treonina;
As protenas Smad so os
transmissores intracelulares;
Induz a p15 que pra as clulas
em G1;
Mutaes nas Smad e TGF
conduzem proliferao celular.





4. Classe IV - factores de transcrio
nuclear:

Actuam directamente na transcrio por
ligao ao DNA ou por alterao da
velocidade de incio da transcrio;
Induzidos quando as clulas normais so estimuladas para crescer:
c-jun codifica para parte do factor de transcrio AP1;
c-fos e c-myc tm diferente expresso aps estimulao com soro fetal.
Formas mutadas podem actuar conjuntamente na transformao e induo de
tumores;
Diferente incidncia de aparecimento de tumores em transgnicos.


5. Classe V - protenas anti-apoptose:
bcl2 - inibidor da apoptose;
bax - pr-apopttico.


6. Classe VI - protenas que controlam o ciclo celular:

Anti-oncogenes ou genes supressores de tumores:
a. pRb (retinoblastoma):
Pode ser sequestrada pela protena T grande do SV40 (N-terminal);
Sofre mutaes que provocam:
Aumento da proliferao celular;
142
Perdas cromossmicas
e converso gentica;
Tm carcter
espordico e
hereditrio.
Regulador da transio G1/S.

b. p53:
Pode ser sequestrada pela
protena T grande do SV40 (C-terminal);
Sofre mutaes (dominantes negativas) que provocam:
Replicao do DNA no reparado o que induz mutaes e translocaes;
Alterao na apoptose.

c. pAPC (adenomatosus polyposis coli):
Quando no est funcional induz a activao de c-myc, o factor de transcrio que
induz a expresso de muitos genes da transio G1/S;
Associado ao desenvolvimento do cancro rectal;
Uma mutao no gene supressor de tumores APC numa nica clula epitelial provoca
a diviso dessa clula, apesar das clulas adjacentes no o fazerem, formando-se uma
massa de clulas que constituem um tumor benigno plipo;
Mutaes subsequentes conduzem expresso de uma protena Ras
constitutivamente activa e perda de dois genes supressores de tumores, DCC e p53,
o que gera uma clula maligna transportando todas as quatro mutaes.

d. p16:
Importante na transio G1/S: inibe a
CDk4/ciclina D;
Mutaes na p16 levam
hiperfosforilao da pRB e libertao
de E2F;
Nvel elevado quando as clulas no
possuem a pRB funcional;
Mdm2 inibe a actividade da p53 (Nh
terminal);
p53 induz a transcrio de Mdm2.


143
e. ciclina D:

Sobre-expresso conduz ao cancro;
Associada aos cancros da mama e
carcinomas da paratiride (D1):
O tumor cresce a partir de
uma nica clula cancergena
do tecido glandular mamrio;
Clulas cancergenas invadem
o tecido adjacente;
Clulas cancergenas
espalham-se atravs da linfa
e vasos sanguneos para
outras partes do organismo;
Uma pequena percentagem
de clulas cancergenas pode
sobreviver e estabelecer um
novo tumor.
BRCA1 - mama e ovrio;
BRCA2 mama;
BRCA1 e BRCA associados
reparao do DNA.



f. Telomerase:
Encurtamento dos telmeros pode levar senescncia das clulas em cultura;
Activao da telomerase nas clulas somticas aumenta a longevidade sem um
fentipo cancergeno bvio.


Replicao com DNA danificado:
Anormalidades cromossmicas;
Perda de genes;
Amplificao de genes.

O processo comea com um dano acidental no DNA de uma clula o que faz perder a funo
da protena p53. Em vez de parar no checkpoint dependente da p53 do ciclo celular, onde uma
clula normal com DNA danificado iria parar a diviso at ser reparado, a clula deficiente em
p53 avana para a fase S.
Uma vez o cromossoma apresentando uma duplicao e j sem um telmero, vrias rondas de
replicao e a fuso dos cromatdeos podem aumentar o nmero de cpias da regio
duplicada ainda mais. A seleco a favor das clulas com elevado nmero de cpias de um
gene da regio cromossmica afectada ir levar formao de mutantes nos quais o gene
ainda amplificado.


144
Encurtamento dos telmeros:
Instabilidade
cromossmica;
Cancro.

A maioria das clulas humanas
tem pouca telomerase. medida
que as cllas se dividem, os
telmeros que limitam os
cromossomas vo diminuindo.
Aps vrias divises, os
telmeros tornam-se to
pequenos que deixam de
funcionar correctamente,
produzindo um sinal intracelular
semelhante ao produzido pelas
quebras da dupla cadeia.





Perda de heterozigotia em genes
supressores de tumores:
No-disjuno durante a
meiose por falncia do
checkpoint na transio metafase/anafase;
Recombinao das cromatdas irms durante a mitose.


7. Classe VII - protenas associadas reparao do DNA:

Complexo de protenas associado reparao por exciso e xerodermia pigmentosa
e sndroma de Cockayne;
Mutaes nos genes mutS ou mutL (reparao por emparelhamento incorrecto) esto
associadas ao maior risco de desenvolvimento de cancro colorectal.


Oncogenes vricos

Tm a capacidade de integrar o seu material gentico na clula hospedeira;
Podem conter:
DNA - requerem 2 a 3 genes;
RNA - requerem 1 gene.
Actuam por:
Transformao (DNA):
Em clulas permissivas;
Em clulas no permissivas.
Transduo (RNA):
Retrovrus de transduo:
Contm oncogenes celulares;
Podem causar o cancro rapidamente;
Aumentam a velocidade de transcrio de genes celulares em diferentes tipos de
clulas;
Alteram a expresso de protenas de uma forma qualitativa e quantitativa;
145
Transformao por agentes vricos contendo RNA.
Src:
Cinase da tirosina (associado membrana);
Fosforila o inositol.
alb - cinase da tirosina (citosol);
ras - actividade GTPsica (associado membrana)


Retrovrus slow-acting:
No possuem oncogenes;
Induzem o cancro tardiamente (meses ou anos);
Inserem-se perto do c-myc;
Usados para localizar oncogenes;
Podem actuar por mecanismos de:
Insero no promotor: o DNA vrico insere-se no genoma da clula infectada, prximo do
c-myc. As sequncias LTR presentes nas extremidades do DNA vrico actuam como
promotor para os genes c-myc, permitindo um amento da sua transcrio.
Insero no activador: o DNA do retrovrus insere-se no genoma da clula infectada
prximo do c-myc a montante ou jusante destes. Se se inserir a montante, f-lo na
direco oposta transcrio. Nos dois casos, as sequncias LTR actam como um promotor
dos genes c-myc, mas no caso do DNA vrico se inserir a jusante dos c-myc, as sequncias
LTR servem no s de activador mas tambm de terminador da transcrio.


Transformao por agentes vricos que
contm DNA:
Em clulas permissivas:
Infeco celular;
Replicao e formao da descendncia
vrica;
Morte celular.
Em clulas no permissivas:
Inactivao de genes supressores de tumores
(p53 e pRb) que permitem a passagem de G0
a G1, de G1 a S e G2 a M;
Infeco por SV40 (expresso da protena T
grande) e papillomavirus (protenas E6 e E7)
com capacidade de sequestrar a pRb e a p53.