ARTIGO ORIGINAL/ ORIGINAL ARTICLE

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Comparao de mtodos analticos para determinao
de lipdios e cidos graxos polinsaturados por
cromatografia gasosa em frmula infantil
Comparison of analytical methods in the determination
of lipids and polyunsaturated fatty acids by gas
chromatography in infant formula
Mahyara Markievicz Mancio KUS
1*
, Sabria AUED-PIMENTEL
2
, Jorge MANCINI-FILHO
1

*Endereo para correspondncia: Rua Boa Vista, 128, Centro, Mogi das Cruzes, SP, Brasil, CEP 08717-140,
e-mail: mahyarakus@yahoo.com.br
1
Laboratrio de Lipides, Faculdade de Cincias Farmacutica, Universidade de So Paulo, So Paulo, SP, Brasil.
2
Diviso de Bromatologia e Qumica, Instituto Adolfo Lutz, So Paulo, SP, Brasil.
Recebido: 10.02.2009 Aceito para publicao: 26.03.2009
RESUMO
Os cidos graxos polinsaturados de cadeia de longa participam em diversos processos siolgicos e metablicos no
organismo humano, alm de serem importantes na nutrio infantil. Os cidos graxos so suplementados em frmulas
infantis utilizadas como substituto de leite materno. A quanticao dos cidos graxos polinsaturados, em virtude da
presena de vrios stios reativos na molcula, requer processos de extrao da gordura em condies brandas. No presente
trabalho foram comparadas as metodologias analticas para determinao de lipdios totais e cidos graxos polinsaturados
em frmula infantil. Nessa anlise foi utilizada uma amostra de frmula infantil (NIST) e foram empregadas as metodologias
descritas nas Normas do Instituto Adolfo Lutz e pela AOAC (Association of Ofcial Analytical Chemistry). A quanticao
dos cidos graxos foi realizada utilizando-se diferentes padres interno e fatores de correo do detector de ionizao
em chama. Foram observadas diferenas signicativas (p<0,05) entre os resultados de lipdios totais e cidos graxos
polinsaturados obtidos por meio de diferentes mtodos de extrao de gordura. As menores taxas de disperso (%CV) de
cidos graxos polinsaturados foram obtidas pela metodologia ocial AOAC, que indica a preservao desses componentes,
porm com menor recuperao dos lipdios. O uso de padro interno do ster metlico de cido graxo 23:0 e de fator
de correo terico do detector de ionizao em chama em relao ao prprio padro interno mostrou-se como o mais
adequado para efetuar o clculo dos cidos graxos polinsaturados.
Palavras-chave. cidos graxos polinsaturados, frmula infantil, mtodo analtico, cromatograa gasosa, lipdeos.
ABSTRACT
Long chain polyunsaturated fatty acids are involved in several physiological and metabolic processes of human organism.
Considering the fatty acids as crucial compound in the infantile nutrition, they have been supplemented in infant formula
to substitute maternal milk. For quantifying the long chain polyunsaturated fatty acids requires a fat extraction process in
mild conditions, due to the occurrence of reactive sites in their molecules. In the present work the analytical methods for
determining the polyunsaturated fatty acid and lipids in infantile formula were compared. For these purposes, a sample
of infantile formula from the National Institute of Standards and Technology was analyzed, following methodologies
described in the Normas Analticas do Instituto Adolfo Lutz and the Association of Ofcial Analytical Chemistry (AOAC).
The polyunsaturated fatty acid contents were assessed by using distinct internal standards and correction factors for ame
ionization detector. Signicant differences (p<0.05) were found among the total lipids and polyunsaturated fatty acids
results, in infantile formula analyzed on different lipid extraction methods. The lowest dispersions results (rsd %), of
polyunsaturated fatty acid were observed by the AOAC methodology. According to these data, the use of fatty acid methyl
ester 23:0 internal standard and of theoretical correction factors of ame ionization detector in relation to the internal
standard itself were the most suitable for determining the polyunsaturated fatty acid.
Key words. polyunsaturated fatty acid, infantile formula, analytical methodology, gas chromatography, lipids.
RIALA6/1184
Rev Inst Adolfo Lutz, 68(1):12-20, 2009
Kus MMM, Aued-Pimentel S, Mancini-Filho J. Comparao de mtodos analticos para determinao de lipdios e cidos graxos poli-insaturados
por cromatograa gasosa em frmula infantil. Rev Inst Adolfo Lutz, So Paulo, 68(1):12-20, 2009.
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superiores de cido -linolnico preconizado pela legis-
lao daquele pas. Em um pequeno nmero, especial-
mente aquelas para necessidades especiais, encontrou-se
alto contedo de cido linoleico e para a razo de cido
linoleico/cido -linolnico obtiveram-se valores en tre
17:1 e 55:1. Recentes estudos indicam que a formao
do cido docosahexaenoico inibida pela alta disponi-
bilidade do cido linoleico. A razo de cido linoleico e
cido -linolnico e a presena de cidos graxos polin-
saturados de cadeia longa em algumas formulas infantis
comercializadas na Dinamarca demonstrou que houve
uma melhora no perl dos cidos graxos, entretanto o
contedo de -linolnico ainda baixo e o de cido li-
noleico alto comparado com a recomendao e com o
leite das dinamarquesas. Somente algumas das frmulas
infantis estudadas continham cidos graxos polinsatura-
dos de cadeia longa.
As recomendaes de organismos internacionais
e de legislaes locais para frmula infantil baseiam-se
na composio do leite materno humano
9
. A legislao
brasileira, Portaria n 977 (1998)
10
, preconiza valores
para gordura total e cido linoleico, entre outros macro
e micronutrientes. A Norma Codex Alimentarius stan 72-
1981
11
, depois de uma reviso realizada em 2007, aceitou
as recomendaes de um grupo da The European Society
for Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition
(ESPGHAN)
9
, o qual recomenda valores alm dos lipdios
totais e cido linoleico, para cido -linolnico, razo de
cido linoleico/-linolnico, cido araquidnico, cido
docosahexaenoico, cidos graxos trans, soma dos cidos
mirstico e palmtico e cido ercico.
A quanticao dos lipdios nos alimentos
realizada, tradicionalmente, por extrao com solventes
orgnicos (ter etlico, ter de petrleo, clorofrmio e
metanol) e determinao gravimtrica. A habilidade de
recuperar os vrios componentes dos lipdios varia com
o solvente de extrao. Solventes mais polares como
clorofrmio/metanol extraem lipdios polares, incluindo
fosfolipdios, esteris, terpenos, graxas, hidrocarbonetos
e materiais no lipdicos
12
. Matrizes alimentares ainda
podem ser previamente tratadas, com hidrlise em
meio bsico para solubilizar protenas, adio de
cido para quebrar emulso ou hidrolizar lipdios de
matrizes complexas
12,13
. No caso das frmulas infantis
a quanticao dos cidos graxos polinsaturados,
devido presena de vrios stios reativos na molcula
(insaturaes), deve envolver processos de extrao
da gordura em condies amenas, pois, podem
INTRODUO
A partir de meados dos anos de 1950 surgiu a ideia de
alimentar crianas com o uso de frmulas infantis desde
o nascimento
1
. Nos ltimos anos houve uma notvel
melhoria nas frmulas infantis. Atualmente h vrias
opes e esto sendo suplementadas para se tornarem
parecidas com a composio do leite materno humano
2
.
Os lipdios nas frmulas infantis so compostos
por diferentes fontes de gordura, podendo ser de origem
animal (gordura lctea), vegetal (leo de canola, leo
de milho, leo de coco, leo de palma) e cidos graxos
polinsaturados microencapsulados
3
. Na gordura lctea
h predomnio de cidos graxos saturados e no leite
humano h uma maior quantidade de cidos graxos
insaturados quando comparado com o leite de vaca.
Havendo diferenas nas propores de cidos graxos
saturados e insaturados nestas fontes de lipdicas, torna-
se importante a anlise do perl de cidos graxos nestes
alimentos, pois quanto maior for o tamanho da cadeia e
mais saturada, menor sua absoro no organismo
4
.
O cido linoleico (18:2 -6) e o cido

-linolnico
(18:3 -3) so cidos graxos essenciais, pois no podem
ser sintetizados endogenamente pelos seres humanos e
alguns animais. Alm disso, so precursores das sries
-3 e -6, originando os cidos graxos polinsaturados de
cadeia longa, entre eles o cido araquidnico (20:4 -6) e
o cido docosahexaenoico (22:6 -3)
2
. O recm-nascido,
entretanto, tem um limite na capacidade de produo
de cidos graxos polinsaturados de cadeia longa, em
particular quando a dieta pobre em seus precursores
5
.
Dessa maneira, h a necessidade da suplementao desses
cidos graxos nas frmulas infantis
2
.
cidos graxos polinsaturados atuam em diversos
processos siolgicos e metablicos, e so importantes
na nutrio infantil pelo seu rpido aumento no crebro
durante o primeiro ano de vida
6,7
. O cido araquidnico
importante precursor da srie 2 dos eicosanoides,
que so importantes biomediadores. Os cidos graxos
araquidnico e docosahexaenoico so os principais
componentes da membrana fosfolipdica das clulas e
so os cidos graxos polinsaturados predominantes no
sistema nervoso central. O cido docosahexaenoico o
cido graxo mais abundante na membrana foto receptora
da retina
2
.
Estudo realizado por Straarup et al. (2006)
8
, na
Dinamarca, demonstrou que apenas quatro das 28 fr-
mulas infantis analisadas encontravam-se com nveis
Kus MMM, Aued-Pimentel S, Mancini-Filho J. Comparao de mtodos analticos para determinao de lipdios e cidos graxos poli-insaturados
por cromatograa gasosa em frmula infantil. Rev Inst Adolfo Lutz, So Paulo, 68(1):12-20, 2009.
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ocorrer reaes de degradao e/ou isomerizao nas
insaturaes dos cidos graxos polinsaturados, podendo
gerar resultados discrepantes na quanticao destes
cidos graxos
12
.
Estudos de comparao de metodologias para
cidos graxos polinsaturados so muito importantes e
de difcil execuo, pois so realizadas diversas etapas e
em cada uma delas h parmetros que inuenciam na
quanticao nal dos cidos graxos. Alm disso, gera
subsdios para padronizao de metodologia nos diversos
laboratrios, fato este relevante, pois, os alimentos esto
sendo suplementados com estes cidos graxos, e sua
correta quanticao torna-se necessria para uma clara
informao ao consumidor.
O objetivo desse estudo foi comparar os mtodos
de extrao de lipdios e quanticao (fatores de
resposta do detector de ionizao de chama e padres
interno) dos cidos graxos polinsaturados: cido
linoleico, cido -linolnico, cido araquidnico e
cido docosahexaenoico em amostra de referncia de
frmula infantil da Nacional Institute of Standard and
Tecnhological (NIST 1849/2006).
MATERIAL E MTODOS
Material
Para o estudo foi utilizada uma amostra de frmula
infantil da NIST 1849/2006, que tem indicados os teores
de cido linoleico, cido -linolnico, cido araquidnico
e cido docosahexaenoico. A amostra foi armazenada
em freezer. As anlises foram realizadas entre os anos de
2006 a 2008.
Reagentes e padres
Os solventes e reagentes utilizados para as etapas de
extrao de gordura e preparao dos steres metlicos
de cidos graxos foram de grau analtico: metanol,
clorofrmio, ter de petrleo, ter etlico, etanol a 95%,
cido clordrico, hidrxido de amnio, hidrxido de
potssio, sulfato de sdio e hidrxido de sdio. Foram
tambm utilizados os seguintes solventes de grau
cromatogrco: n-hexano e metanol.
Foram utilizados dois padres cromatogrcos
de triacilgliceris 11:0 e 13:0 e de ster metlico de cido
graxo 13:0, 21:0 e 23:0, marca Sigma com alta pureza.
Para identicar os componentes foram utili-
zados: uma mistura com quantidades certicadas de
37 steres metlicos de cidos graxos, variando de 4:0 a
24:0, marca Supelco; uma de steres metlicos de cidos
graxos dos ismeros cis-trans do cido linoleico (18:2)
e cido -linolnico (18:3), marca Sigma; e padres de
steres metlicos de cidos graxos individuais, marca
Sigma, sendo: eladico (18:1 9t); vacnico (18:1 11c);
trans vacnico (18:1 11t); (18:1 7c); (18:1 12c); CLA
(18:2 9c, 11t e 18:2 10t, 12c); palmitoeladico (16:1 9t),
palmitico (16:0); linoleladico (18:2 9t, 12t); EPA (20:5
5c, 8c, 11c, 14c, 17c); araquidnico (20:4 5c, 8c, 11c, 14c);
docosahexaenoico (20:6 4c, 7c, 10c, 13c, 16c, 19c).
Mtodos
Determinao de lipdios totais
A determinao de lipdios totais foi realizada de acordo
com os mtodos gravimtricos descritos por Bligh e
Dyer
14
; AOAC 963.15
15
(hidrlise cida) e Roese Gottlieb
16

(AOAC 989.05) e mtodo de clculo pela somatria
de cidos graxos como triacilgliceris de acordo com a
AOAC 996.06
16
(hidrlise cida).
Preparao dos steres metlicos de cidos graxos
Trs metodologias foram comparadas para a preparao
dos steres metlicos de cidos graxos: Hartman e Lago
17
,
modicado por Maia e Rodrigues-Amaya
18
(catlise mista,
bsica e cida), o qual possui reagentes menos txicos
que o mtodo ocial do AOAC, que utiliza triuoreto
de boro; IUPAC
19
(meio bsico, KOH), sendo que este
mtodo utiliza reagentes simples e de rpida execuo;
in situ
20
(bsico, com metxido de sdio), metodologia
amplamente estudada por realizar em uma nica etapa
a extrao de gordura e preparao dos steres metlicos
de cidos graxos.
Anlise dos cidos graxos por cromatograa em
fase gasosa
Os cidos graxos foram analisados em cromatgrafo
gasoso com detector de ionizao em chama, da marca
Shimadzu e modelo 17A, com coluna capilar de slica
fundida com fase 100% bis-cianopropil polisiloxana
(SP 2560) de 100m, 0,25mm de dimetro e 0,20m
de espessura de lme. A otimizao das condies
cromatogrcas foi realizada em estudo prvio, descrito
por Aued-Pimentel
21
. Foram empregadas as seguintes
condies: temperatura do injetor e detector: 250C;
uxo 1,90 mL/min; rampa de temperatura: 45 C (1
min); 13 C/min at 175 C; 4 C/min at 215 C por 35
min; gs de arraste: hidrognio; presso na coluna: 175
Kus MMM, Aued-Pimentel S, Mancini-Filho J. Comparao de mtodos analticos para determinao de lipdios e cidos graxos poli-insaturados
por cromatograa gasosa em frmula infantil. Rev Inst Adolfo Lutz, So Paulo, 68(1):12-20, 2009.
15
kPa; razo de diviso da amostra 1:15.
Quanticao dos cidos graxos
A quanticao dos cidos graxos foi realizada pela
adio de padro interno gordura extrada das frmulas
infantis. Os padres utilizados foram os steres metlicos
de cidos graxos 13:0, 21:0, 23:0; e os clculos foram
realizados de acordo com a equao 1
15
e expressos em
g/100 g de amostra:
Onde:
M
PI
= massa do padro interno adicionada amostra;
A
AGi
= rea do ster metlico de cido graxo no
cromatograma da amostra;
K
AGi
= fator de correo de resposta de cada ster
metlico de cido graxos no detector de ionizao em
chama com relao ao 16:0, 18:0 ou 23:0;
f
AGi
= fator de converso de ster metlico de cido
graxos para cido graxo
15
;
L = teor de lipdios em gramas por cem gramas de
amostra;
m = massa da amostra em gramas;
A
PI
= rea do padro interno do ster metlico de cido
graxo no cromatograma da amostra.
No mtodo de determinao da gordura por
clculo adicionou-se o triacilglicerol 13:0 e steres
metlicos de cidos graxos 21:0 e 23:0 no comeo da
extrao, os cidos graxos foram calculados de acordo
com as equaes 2 e 3
16
, e a gordura total a partir da soma
dos componentes em forma de triacilglicerol, de acordo
com a equao 4
16
.
Onde:
M
EMAGi
= massa de cada componente de ster metlico
de cido graxo;
A
AGi
= rea do pico de cada componente;
m
PI
.= massa do padro interno;
1,0059 = fator de converso do padro interno de triacilglicerol
em ster metlico de cido graxo correspondente;
K
AGi
= fator de resposta experimental do detector de
ionizao em chama, em relao ao padro interno;
A
AGPI
= rea do pico do padro interno.
M
AGi
= massa de cada componente expressa como cido
graxo correspondente;
f
AGi
= fator de converso de ster metlico de cido graxo
em cido graxo
16
.
M
TAGi
= massa de cada componente expressa como
triacilglicerol correspondente ;
f
TAGi
= fator de converso de ster metlico de cido
graxo em triacilglicerol
16
.
Para a quanticao dos cidos utilizaram-se
fatores de resposta do detector de ionizao de chama
tericos em relao aos cidos graxos 16:0, 18:0 e 23:0,
calculados de acordo com as equaes 5 e 6
22,23
.
K
AGi
= fator de correo da resposta para o cido graxo
i.
M
AGi
= massa molecular do ster metlico de cido graxo
i.
n
AGi
= nmero de tomos de carbono do ster metlico
do cido graxo i.
A
c
= massa atmica do carbono (12,01).
K
AGi
= fator relativo de correo, para o ster metlico de
cido graxo i.
K
PI
= fator de resposta do detector de ionizao em
chama em relao ao 16:0, 18:0 ou 23:0.
K
AGi
= fator de resposta do detector de ionizao em
chama para o cido graxo i.
conc
AG
i
= (1)
M
PI
. A
AG
i
. K
AG
i

f
AG
i
. L
m.A
PI
M
EMAG
i
= (2)
A
AG
i
. m
PI
. 1,0059 . K
AG
i
A
AG
PI
M
TAG
i
= M
EMAG
i
. f
TAG
i
(4)
M
AG
i
= M
EMAG
i
. f
AG
i
(3)
K
AG
i
= (5)
M
AG
i
(n
AG
i
1) . A
c
K = (6)
K
AG
i
K
PI
Kus MMM, Aued-Pimentel S, Mancini-Filho J. Comparao de mtodos analticos para determinao de lipdios e cidos graxos poli-insaturados
por cromatograa gasosa em frmula infantil. Rev Inst Adolfo Lutz, So Paulo, 68(1):12-20, 2009.
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comparveis aos demais mtodos. Este mtodo considera
como lipdios totais a soma dos cidos graxos de todas
as fontes lipdicas, expressos como triacilgliceris,
entretanto necessita de um maior nmero de padres de
ster metlico de cido graxo para identicao dos picos
cromatogrcos.
O mtodo ocial para determinao de lipdios
totais para frmula infantil segundo a AOAC o de
Roese Gottlieb. Esse mtodo revelou valores prximos ao
descrito por Bligh e Dyer, o qual apresentou o menor teor
de lipdios. Pelo mtodo de Bligh e Dyer a relao metanol,
clorofrmio e gua crtica na etapa de extrao
12
. No
mtodo de Roese Gottlieb feito um tratamento prvio
com lcalis para solubilizar a protena e facilitar a quebra
da emulso, em seguida ocorre a extrao utilizando ter
etlico e ter de petrleo
12
. O teor de lipdio encontrado
pelo mtodo de Roese Gottielb pode estar relacionado
com o tempo de contato da amostra com os solventes, a
quantidade de amostra, e a capacidade destes solventes
extrarem mono, di e triacilglicerol e apenas alguns
lipdios polares
12,14
.
O mtodo mais apropriado para a determinao
de lipdios em frmula infantil o mtodo do Roese
Gottlieb, pois utiliza condies experimentias brandas
no comprometendo as insaturaes dos cidos graxos
polinsaturados, extrai apenas os componentes lipdicos
dos alimentos, no superestimando seus valores, alm
de ser o mtodo ocial da AOAC para este produto e
o recomendado pelo Codex Alimentarius. Entretanto,
os resultados indicaram uma menor recuperao
da gordura pelo mtodo ocial. Novas tecnologias
tm sido empregadas, como o microencapsulamento
dos cidos graxos polinsaturados de cadeia longa,
para suplementao das frmulas e so apresentadas
propostas de validao de mtodos para a determinao
Anlise estatstica
Todas as anlises foram realizadas em triplicata e os
resultados esto apresentados como mdia desvio
padro. Para a comparao dos procedimentos foi
aplicado teste de varincia (ANOVA) e teste de Tukey
(=0,05). Foram calculados os coecientes de variao.
RESULTADOS E DISCUSSO
Os ensaios obtidos para a comparao das variveis para
a quanticao dos cidos graxos foram realizados em
etapas distintas e independentes. No caso da extrao de
lipdios as anlises foram feitas quando a amostra chegou
ao laboratrio, nos anos de 2006 e 2007, e as demais
comparaes, durante o decorrer do estudo, sendo o
ltimo estudo da metodologia in situ e consequentemente
a comparao dos mtodos de metilao, nos anos de
2007 e 2008.
Determinao dos lipdios ou gordura total
A Tabela 1 apresenta os valores de lipdios para a amostra
da NIST 1849/2006 pelos diferentes mtodos de extrao,
entretanto esta amostra no apresentava valor indicativo
para lipdios.
Os mtodos de extrao de lipdios revelaram dife-
renas estatsticas entre eles. Pelo mtodo gravimtrico
por hidrlise cida obteve-se o maior teor de lipdios.
Os mtodos de Bligh e Dyer e o de Roese Gottlieb no
apresentaram diferena estatisticamente entre eles, bem
como os mtodos de Roese Gottlieb e AOAC 996.06.
O tratamento cido prvio pode extrair componentes
no lipdicos da amostra, como glicerol, carboidratos
de baixo peso molecular, aminocidos e sais de ureia,
superestimando assim os valores
12
. O mtodo por clculo,
de acordo com a AOAC 996.06, demonstrou resultados
Tabela 1. Valores de lipdios para amostra da NIST 1849/2006 pelos diferentes mtodos de extrao de lipdios
Mtodos
Lipdios (g/100g)
Mdia Desvio padro CV (%)
HA (AOAC 963.15) 31,53 0,29
a
0,92
HA (AOAC 996.06) 28,20 0,5
b
1,78
Roese Gottlieb 26,71 0,36
b,c
1,34
Bligh Dyer 25,15 0,24
c
0,95
Anlise realizada em triplicata; HA: hidrlise cida, CV(%): coeficiente de variao em porcentagem; mdias seguidas pela mesma letra no diferem
entre si de acordo com ANOVA e teste de Tukey (=0,05).
Kus MMM, Aued-Pimentel S, Mancini-Filho J. Comparao de mtodos analticos para determinao de lipdios e cidos graxos poli-insaturados
por cromatograa gasosa em frmula infantil. Rev Inst Adolfo Lutz, So Paulo, 68(1):12-20, 2009.
17
de lipdios e cidos graxos, que utilizam tanto hidrlise
cida como enzimtica para digerir as microcpsulas
e extrair adequadamente os lipdios e cidos graxos
polinsaturados de cadeia longa das frmulas infantis
3
.
Anlise dos cidos graxos por cromatograa
em fase gasosa
Os resultados da comparao entre os trs mtodos
de preparao de steres metlicos de cidos graxos
encontram-se na Tabela 2. Para a comparao das
metodologias de Hartman e Lago modicada por Maia e
Rodrigues-Amaya e IUPAC, a determinao da gordura
foi normalizada, isto , extrada de acordo com Roese
Gottlieb. O padro interno empregado para o clculo foi
o ster metlico de cido graxo 23:0. No caso do mtodo
in situ no h etapa de extrao de gordura.
Os trs mtodos revelaram resultados equi-
valentes, apenas houve diferenas estatsticas para o
cido -linolnico. No mtodo descrito pela IUPAC
observaram-se os maiores valores, incluindo os desvios
padro, mais altos que os obtidos pela metodologia de
Hartman e Lago modicada por Maia e Rodrigues-
Amaya
17,18
.
A metodologia da IUPAC que utiliza como
catalisador o KOH metanlico apesar de no ser
recomendada para produtos alimentcios devido
ocorrncia de hidrlise e formao de cido graxo livre
24
,
rpida e tem fornecidos resultados adequados para
alguns produtos alimentcios
25
. No presente trabalho, para
a frmula infantil, as limitaes acima descritas podem
ter gerado desvios-padro mais altos do que o observado
pelo mtodo de Hartman e Lago modicado. Quanto ao
mtodo in situ este apresentou resultados comparveis
com o mtodo de Hartman e Lago modicado por Maia
e Rodrigues-Amaya. Entretanto mais estudos devem ser
realizados, para otimizar esta metodologia, pois, h a
inuncia de variveis experimentais como a quantidade
de gua da amostra, acidez, tomada de amostra, entre
outros, no desempenho do mtodo
20
.
Determinao dos cidos graxos polinsaturados
Na Tabela 3 esto presentes os valores de cidos graxos
para os diferentes mtodos de extrao de lipdios, bem
como para os diferentes padres internos (PI) utilizados.
O mtodo AOAC 963.15 foi o que apresentou os teores
mais prximos dos valores indicativos, principalmente
quando se utiliza os PIs 21:0 e 23:0, fato este explicado
pelo maior teor de lipdios. Entretanto, os valores de
desvios padro foram os maiores quando comparado
aos outros mtodos. Este procedimento utiliza
tratamento cido e a quente, podendo afetar as duplas
ligaes das molculas de cido graxo polinsaturado de
cadeia longa e consequentemente resultar em maiores
disperses nos resultados
12
. Entretanto, pode auxiliar na
extrao dos lipdios e cidos graxos no caso de produtos
microencapsulados
3
.
Os mtodos de Bligh e Dyer e Roese Gottlieb
so os que mais preservam as ligaes caractersticas
dos cidos graxos polinsaturados de cadeia longa, pois
utilizam tratamentos brandos. O mtodo por clculo
mostrou resultados satisfatrios quando comparado aos
valores indicativos e/ou outros mtodos para o cido
linoleico e cido -linolnico, quando o clculo foi com
PI 13:0, porm houve uma perda do cido araquidnico
e do cido docosahexaenoico. O tempo de aquecimento
do mtodo (40 min) pode ter desencadeado reaes
Tabela 2. Comparao dos teores de AG obtidos por diferentes mtodos de preparao para steres metlicos de
cidos graxos na amostra de referncia de frmula infantil da NIST
Roese Gottlieb
PI EMAG 23:0
Mtodo in situ
Hartman e Lago IUPAC Golay et al.
LA (g/100g) 5,98 0,03
a
6,1 0,1
a
5,8 0,2
a
ALA (g/100g) 0,53 0,01
a,b
0,540 0,008
b
0,51 0,01
a
ARA (g/100g) 0,096 0,001
a
0,100 0,005
a
0,097 0,003
a
DHA (g/100g) 0,0224 0,0003
a
0,0240,004
a
0,021 0,002
a
Mdiadesvio padro (triplicata); LA: cido linolico; ALA: cido -linolnico; ARA: cido araquidnico; DHA: cido docosahexaenico; PI: padro
interno; EMAG: ster metlico de cido graxo; mdias seguidas pela mesma letra, na mesma linha, no diferem entre si de acordo com ANOVA e
teste de Tukey (=0,05).
Kus MMM, Aued-Pimentel S, Mancini-Filho J. Comparao de mtodos analticos para determinao de lipdios e cidos graxos poli-insaturados
por cromatograa gasosa em frmula infantil. Rev Inst Adolfo Lutz, So Paulo, 68(1):12-20, 2009.
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por cromatograa gasosa em frmula infantil. Rev Inst Adolfo Lutz, So Paulo, 68(1):12-20, 2009.
19
de degradao e/ou isomerizao desses cidos graxos,
diminuindo sua quanticao.
A escolha do padro interno de grande
importncia para a quanticao dos cidos graxos. O
padro interno deve eluir numa regio prxima dos
cidos graxos de interesse, ser estvel e no co-eluir com
outros cidos graxos
26
. No presente trabalho vericou-se
que o padro interno do ster metlico de cido graxo
13:0 eluiu muito antes dos cidos graxos polinsaturados
e tambm superestimou os valores de cido linoleico e
cido -linolnico; o padro interno do ster metlico de
cido graxo 21:0, nas condies cromatogrcas descritas,
pode co-eluir com o cido linoleico conjugado (CLA),
normalmente presente em gorduras lcteas. Portanto,
o padro interno do ster metlico de cido graxo 23:0
revelou ser o mais apropriado para a quanticao de
cidos graxos polinsaturados, pois possui os requisitos
citados, ou seja, elui numa regio prxima dos cidos
graxos de interesse, no co-elui com outros cidos graxos,
estvel, alm de apresentar resultados adequados quanto
preciso e exatido para quanticao de cidos graxos
polinsaturados de cadeia longa em alimentos
26,27
.
Os fatores de correo tericos do detector de
ionizao em chama foram estudados em relao ao 16:0,
18:0 e 23:0, e os resultados encontram-se na Tabela 4. Para
o estudo da inuncia desses fatores na quanticao
dos cidos graxos, normalizaram-se o mtodo de
extrao de gordura utilizando Roese Gottlieb, metilao
por Hartman e Lago modicado e clculo com padro
interno do ster metlico de cido graxo 23:0.
Houve apenas diferena estatisticamente
signi cativa no uso de diferentes fatores de correo
tericos para o detector de ionizao em chama para a
quanticao de cido linoleico e cido -linolnico. Os
valores em relao ao 16:0 e 18:0 foram menores que o da
referncia, sendo o fator de correo terico do detector
de ionizao em chama em relao 23:0 o mais prximo
dos valores da referncia. Shreiner (2005)
26
demonstrou
que a utilizao de fatores de correo tericos do
detector de ionizao em chama so mais apropriados
para quanticao de cidos graxos polinsaturados de
cadeia longa, e que podem ocorrer erros de quanticao
do cido docosahexaenoico de at 22,6% em relao
escolha de fatores experimentais.
CONCLUSO
O mtodo de extrao de lipdios revelou inuenciar de
maneira signicativa na quanticao nal dos lipdios
totais e cidos graxos polinsaturados nas frmulas
infantis. As menores disperses nos resultados dos cidos
graxos polinsaturados foram obtidas pela extrao de
gordura pelo mtodo ocial, ou seja, Roese Gottlieb,
entretanto, houve menor recuperao da gordura por este
mtodo. Com relao s metodologias de preparao de
steres metlicos de cidos graxos a de Hartman e Lago
e a in situ apresentaram desempenho satisfatrio. Quanto
quanticao dos cidos graxos polinsaturados em
frmula infantil recomenda-se o uso de padro interno
de ster metlico de cido graxo 23:0 e fatores de resposta
tericos do detector de ionizao em chama em relao a
esse padro interno. Futuros trabalhos devem ser realizados
para estabelecer mtodos adequados de extrao dos
lipdios e estericao direta (in situ) para quanticao
dos cidos graxos polinsaturados em frmulas infantis,
tendo em vista as tecnologias de suplementao das
frmulas infantis e objetivando a melhoria de desempenho
e diminuio do tempo de anlise.
Tabela 4. Comparao dos teores dos cidos graxos calculados com diferentes fatores tericos de correo de resposta
do DIC para amostra NIST 1849
Referncia 16:0 18:0 23:0
LA (g/100) 5,87 5,6 0,1
a
5,7 0,1
a
5,9 0,1
b
ALA (g/100) 0,601 0,56 0,01
a
0,57 0,01
a,b
0,59 0,01
b
ARA (g/100) 0,21 0,21 0,01
a
0,22 0,01
a
0,22 0,01
a
DHA (g/100) 0,07 0,068 0,007
a
0,070 0,007
a
0,072 0,007
a
Mdiadesvio padro (triplicata); LA: cido linolico; ALA: cido -linolnico; ARA: cido araquidnico; DHA: cido docosahexaenico; mdias
seguidas pela mesma letra, na mesma linha, no diferem entre si de acordo com ANOVA e teste de Tukey (=0,05). Lipdios totais por hidrlise cida
AOAC 963.15, extrao de lipdios por Roese Gottlieb, metilao por Hartman e Lago e quantificao por padro interno de ster metlico de cido
graxo 23:0.
Kus MMM, Aued-Pimentel S, Mancini-Filho J. Comparao de mtodos analticos para determinao de lipdios e cidos graxos poli-insaturados
por cromatograa gasosa em frmula infantil. Rev Inst Adolfo Lutz, So Paulo, 68(1):12-20, 2009.
20
AGRADECIMENTOS
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientco e
Tecnolgico (CNPq) e ao Instituto Adolfo Lutz pela colaborao
e parceria.
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