T

cnicas experimentales en histolog

cnicas experimentales en histolog

a
a
1. 1. El microscopio El microscopio ptico convencional y sus variantes. ptico convencional y sus variantes.
2. 2. Procesamiento de muestras para microscop Procesamiento de muestras para microscop a a ptica. ptica.
Fijaci Fijaci n, inclusi n, inclusi n, seccionado y tinci n, seccionado y tinci n. n.
3. El microscopio electr 3. El microscopio electr nico de transmisi nico de transmisi n (MET) y de barrido (MEB). n (MET) y de barrido (MEB).
4. Procesamiento de muestras para 4. Procesamiento de muestras para para para microscop microscop a electr a electr nica. nica.
Fijaci Fijaci n, inclusi n, inclusi n y seccionado. n y seccionado.
T T cnicas de: contraste, desecado y metalizado de muestras. cnicas de: contraste, desecado y metalizado de muestras.
5. Histoqu 5. Histoqu mica: fundamentos y aplicaci mica: fundamentos y aplicaci n. n. Enzimohistoqu Enzimohistoqu mica mica. .
6. 6. Inmunohistoqu Inmunohistoqu mica mica e e inmunocitoqu inmunocitoqu mica mica. Principios b . Principios b sicos y sicos y
aplicaciones. aplicaciones.
Western Western blot blot. .
7. M 7. M todos de afinidad no inmunol todos de afinidad no inmunol gicos: Lectinas, Hibridaci gicos: Lectinas, Hibridaci n n in in
situ situ , , Southern Southern blot blot y Northern y Northern blot blot. .
8. Autorradiograf 8. Autorradiograf a: fundamentos y aplicaci a: fundamentos y aplicaci n. n.
9. 9. Neurohistolog Neurohistolog a a: tinciones histol : tinciones histol gicas, t gicas, t cnicas inmunol cnicas inmunol gicas y gicas y
trazadores neuronales trazadores neuronales
1.
1.
El microscopio
El microscopio

ptico convencional
ptico convencional
y sus variantes.
y sus variantes.
Microscopio
Microscopio

ptico de campo claro

ptico de campo claro

Emplea la luz visible

Consta de un sistema de lentes de vidrio
Condensador: capta los rayos emitidos por fuente de luz y los concentra sobre la
muestra.
Objetivo y ocular: aumentan la imagen.
Las imgenes (oscura sobre fondo claro) se forman por:
(A) diferencias de color (cambios de longitudes de onda), en el caso de muestras con
pigmentos naturales o teidas,
(B) variaciones de brillo (amplitud de onda), en preparaciones sin teir.
Microscopio de Microscopio de campo oscuro campo oscuro
La luz que entra en el objetivo es la que ha
interaccionado (reflejado o difractado) con el
objeto.
Imagen luminosa (contornos brillantes) sobre
fondo oscuro que mejora el contraste aunque la
resolucin pueda ser menor. .
Microscopio de Microscopio de contraste de fases contraste de fases
Transforma diferencias en el retardo del pasaje de la luz a
travs de la muestra (de fase, de ) en diferencias en
intensidad (amplitud)
Revela detalles estructurales
Variante: microscopio de interferencia o contraste
diferencial (DIC): efecto de relieve; til para cultivos
celulares.
Microscopio de Microscopio de fluorescencia fluorescencia
Los fluorocromos, al ser excitados,
absorben energa y emiten luz de mayor .
Las estructuras fluorescentes aparecen
brillantes y luminosas, sobre fondo oscuro.
Microscopio lser confocal
Elimina la luz reflejada/fluorescente procedente de
los planos fuera de foco; obtenindose una imagen
de un punto del plano focal
Realiza seccionamientos pticos
2. Procesamiento de muestras para
2. Procesamiento de muestras para
microscop
microscop

a
a

ptica.
ptica.
Fijaci
Fijaci

n, inclusi
n, inclusi

n, seccionado y
n, seccionado y
tinci
tinci

n.
n.
T
T

CNICA HISTOL
CNICA HISTOL

GICA
GICA

Preparaci
Preparaci

n
n

de una muestra para poder ser observada al

de una muestra para poder ser observada al
microscopio: c
microscopio: c

lulas vivas / muertas.

lulas vivas / muertas.
Es una serie secuencial de pasos a trav
Es una serie secuencial de pasos a trav

s de los cuales una

s de los cuales una
muestra de tejido llega a transformarse en delgados cortes
muestra de tejido llega a transformarse en delgados cortes
coloreados capaces de ser observados al microscopio
coloreados capaces de ser observados al microscopio
1.
1.
-
-
Obtenci
Obtenci

n de la muestra
n de la muestra
2.
2.
-
-
Fijaci
Fijaci

n
n
3.
3.
-
-
Inclusi
Inclusi

n
n
4.
4.
-
-
Corte
Corte
5.
5.
-
-
Coloraci
Coloraci

n / Contrastado
n / Contrastado
6.
6.
-
-
Montaje
Montaje
T
T

CNICA
CNICA
HISTOL
HISTOL

GICA
GICA
El tratamiento posterior del tejido
depende del objetivo de estudio
0. Anestesia do
animal
Procesamiento de muestras para microscopa ptica
Muestra
Fijacin
Inclusin
Impregnacin
Seccionado
Contraste/Tincin
Tejido vegetal / animal (biopsias, necropsias)
Organismos unicelulares
Material endurecido por congelacin
Material endurecido por sustancias infiltradas
Pigmentacin natural
Tinciones generales o especficas
Tcnica microscpica empleada
Observacin
1.
1.
-
-
Obtenci
Obtenci

n de la muestra
n de la muestra
Consiste en la toma de muestras del organismo o del tejido
Consiste en la toma de muestras del organismo o del tejido
vegetal /animal a observar
vegetal /animal a observar
1.
1.
-
-
Organismos unicelulares
Organismos unicelulares
2.
2.
-
-
Material vegetal
Material vegetal
3.
3.
-
-
Material animal
Material animal
4.
4.
-
-
Material humano
Material humano
a) biopsias
a) biopsias
b) necropsias
b) necropsias
c) piezas operadas
c) piezas operadas
2.
2.
-
-
Fijaci
Fijaci

n
n
Operacin que mata las clulas y las conserva, cuanto sea posible, en el estado en que
estn durante la vida. Para ello se utilizan los agentes fijadores.
Objetivos: Objetivos:
A) Matar e interrumpir la actividad celular evitando la autolisi A) Matar e interrumpir la actividad celular evitando la autolisis. s.
B) Preservar de la degradaci B) Preservar de la degradaci n bacteriana y putrefacci n bacteriana y putrefacci n. n.
C) Conservar inalterada la estructura y la actividad celular. C) Conservar inalterada la estructura y la actividad celular.
D) Insolubilizar los constituyentes celulares solubles que se pr D) Insolubilizar los constituyentes celulares solubles que se pretenden estudiar. etenden estudiar.
E) Endurecer y proteger el tejido frente a posteriores tratamien E) Endurecer y proteger el tejido frente a posteriores tratamientos sobre tos sobre l. l.
F) Impedir la generaci F) Impedir la generaci n de distorsiones significativas y artefactos. n de distorsiones significativas y artefactos.
Tipos: Tipos:
- - Agentes f Agentes f sicos: fr sicos: fr o, calor, microondas. o, calor, microondas.
- - Agentes qu Agentes qu micos: micos:
a) soluciones formadas por un solo compuesto qu a) soluciones formadas por un solo compuesto qu mico: mico:
Formol (10%), Formol (10%), cido cido ac ac tico,etanol tico,etanol, , paraformaldehido paraformaldehido, , glutaraldehido glutaraldehido, cloruro de , cloruro de
mercurio, bicromato pot mercurio, bicromato pot sico y sico y tetr tetr xido xido de osmio. de osmio.
b) soluciones formadas por una mezcla de varios compuestos qu b) soluciones formadas por una mezcla de varios compuestos qu micos: micos:
- - L L quido de quido de Bouin Bouin ( ( cido p cido p crico/formol/ crico/formol/ cido ac cido ac tico). tico).
- - Carnoy Carnoy (alcohol et (alcohol et lico/cloroformo/ lico/cloroformo/ cido ac cido ac tico glacial). tico glacial).
- - Paraformaldehido Paraformaldehido/ /glutaraldehido glutaraldehido (con o sin (con o sin cido p cido p crico). crico).
Cada uno de estos fijadores es adecuado para cada tipo de tejido y tambin
para una u otra tcnica a seguir.
Mtodos
a) Inmersin b) Perfusin vascular
3.
3.
-
-
Inclusi
Inclusi

n
n
A) Inclusi A) Inclusi n/Impregnaci n/Impregnaci n n en parafina (pl en parafina (pl sticos sticos ) )
Deshidrataci Deshidrataci n/aclaramiento n/aclaramiento Muestras fijadas Muestras fijadas
Moldes (barras de Moldes (barras de Leukart Leukart) )
Impregnaci Impregnaci n (parafina) n (parafina)
Confecci Confecci n del bloque n del bloque Bloque s Bloque s lido con muestra lido con muestra
B) Imbibici B) Imbibici n en medios de soporte (agarosa, gelatina, OCT) n en medios de soporte (agarosa, gelatina, OCT)
4.
4.
-
-
Corte
Corte
Obtener secciones delgadas de las muestras biolgicas que permitan pasar la luz
a su travs. Se utilizan diversos tipos de microtomos.
a) directamente en portaobjetos
Gelatinizados
b) bao a 40
Recogida/adherencia de los cortes:
Microtomo de rotacin (Minot)
Microtomo de deslizamiento Vibratomo (en fresco)
Criostato (requiere crioproteccin)
5.
5.
-
-
Coloraci
Coloraci

n
n
HIDRATACIN:
A) Las muestras incluidas en parafina debern ser desparafinadas (xileno) e hidratadas en
baos de alcohol de concentraciones decrecientes: 100, 96, 80 y agua destilada.
B) Las dems se lavan en tampn fosfato para hidratar y eliminar el
medio con el que se hizo el bloque.
COLORACIN: proceso mediante el cual un cuerpo es teido por un colorante, sin perder el
color cuando es lavado con el disolvente usado para preparar la disolucin del colorante.
COLORANTES: Sustancias que confieren color a otros cuerpos e informan de su naturaleza
qumica.
Pueden ser de 2 tipos: ortocromticos / metacromticos.
Pueden ser: artificiales / naturales
MTODOS DE COLORACIN:
General o rutinaria / especfica
Coloracin directa: verdadera afinidad entre colorante y objeto.
Indirecta: intervencin de mordientes.
Progresiva: el colorante acta hasta que llegue a su punto ptimo.
Regresiva: sobrecoloracin y posterior diferenciacin.
Simple: un nico colorante tie solo algn componente del tejido.
Combinada: Se emplen 2/ms colorantes , que tien diversos componentes del tejido.
6.- Montaje
Consiste en sellar las secciones teidas en condiciones que permitan su observacin a
microscopio y su proteccin frente al deterioro del ambiente.
Medios de montaje:
a) Temporales: Medios hidrosolubles (glicerina).
b) Permanentes: Medios no hidrosolubles (Eukitt). Antes del montaje:
1.- Lavado de la muestra teida.
2.- Deshidratacin de los cortes teidos.
3.- Aclarado en xileno. .
Confeccin: Se depositan unas gotas de medio de montaje depositan unas gotas de medio de montaje
en un cubreobjetos, que se coloca sobre la muestra evitando en un cubreobjetos, que se coloca sobre la muestra evitando
la formaci la formaci n de burbujas. Secado en estufa a 40 n de burbujas. Secado en estufa a 40 antes de su antes de su
observaci observaci n microsc n microsc pica pica
VARIANTES
VARIANTES
Cortes flotantes: gruesos (40-100 m), se procesan sin adherirse al portaobjetos hasta su
montaje
Tinciones previas al corte: una vez procesada la muestra se realizan los cortes y el montaje
Procesado in toto : si el organismo a estudiar es de pequeo tamao, se procesa entero
3.El microscopio electr
3.El microscopio electr

nico de
nico de
transmisi
transmisi

n (MET).
n (MET).
El microscopio electr
El microscopio electr

nico de
nico de
barrido (MEB).
barrido (MEB).
MET
MET
Estructura Estructura electrondensa electrondensa: : aquella muy afn por las sales de metales pesados. El depsito metlico
sobre la estructura celular impide que el haz de atraviese esa zona de la muestra, por lo que, los
electrones salen rebotados o quedan retenidos en ella, y la estructura aparece de color negro o gris
oscuro en la placa fotogrfica.
Estructura Estructura electronl electronl cida cida: : aquellas que poseen poca afinidad por las sales de metales pesados: el
electrn atraviesa la muestra por esas zonas, que aparecern como reas de color gris/blanco
MEB
MEB
MICROSCOPIO PTICO VERSUS MICROSCOPIO ELECTRNICO (DIFERENCIAS)
M M s complejas, laboriosas s complejas, laboriosas
delicadas y lentas. delicadas y lentas.
Generalmente sencillas Generalmente sencillas T T cnicas preparatorias de la cnicas preparatorias de la
muestra muestra
Escasos. Producen im Escasos. Producen im genes genes
monocrom monocrom ticas (blanco y negro). ticas (blanco y negro).
Revelan estructuras Revelan estructuras
electr electr ndensas ndensas- - y y- - l l cidas cidas
Gran variedad de m Gran variedad de m todos de tinci todos de tinci n n
( (policrom policrom ticos ticos) )
M M todos de contraste todos de contraste
Las secciones han de ser muy Las secciones han de ser muy
finas (20 finas (20- -100 100 nm nm): cortes ): cortes
ultrafinos ultrafinos
Varias Varias m m Grosor de la muestra Grosor de la muestra
El El rea observable es menor rea observable es menor
inferior a 1mm inferior a 1mm
2 2
. .
Se observan Se observan reas mayores de la reas mayores de la
muestra ( muestra (cm cm) )
Campo de observaci Campo de observaci n n
100.000X (o 100.000X (o m m s s) ) => => Aporta Aporta
informaci informaci n n sobre sobre la la
ultraestructura ultraestructura de la de la muestra muestra
1000 X 1000 X Aumentos m Aumentos m ximos ximos
1 1 nm nm 0,2 0,2 m (MO campo m (MO campo claro claro): ): A A
distancias menores de 0,2 distancias menores de 0,2 m, dos m, dos
objetos que realmente est objetos que realmente est n n
separados entre si, aparecen como separados entre si, aparecen como
uno s uno s lo. lo.
L L mite de resoluci mite de resoluci n n
Un haz de electrones enfocados y Un haz de electrones enfocados y
acelerados acelerados
Luz visible Luz visible Fuente de iluminaci Fuente de iluminaci n n
Microscopio electr Microscopio electr nico nico Microscopio Microscopio ptico ptico
5 5- -10nm 10nm electrones secundarios electrones secundarios
Microscopio electr Microscopio electr nico nico
MEB MEB
0.5 0.5 nm nm (5 (5 ) )
Electrones transmitidos Electrones transmitidos
Microscopio electr Microscopio electr nico nico
MET MET
0,1 0,1- -0,2 0,2 m m
Luz visible Luz visible Microscopio Microscopio ptico ptico
0,1 0,1- -0,2 0,2 m mm m Luz visible Luz visible Ojo humano Ojo humano
Distancia de Distancia de
Resoluci Resoluci n n
Radiaci Radiaci n n Sistema Sistema ptico ptico
4. Procesamiento de muestras para
4. Procesamiento de muestras para
microscop
microscop

a electr
a electr

nica.
nica.
Fijaci
Fijaci

n, inclusi
n, inclusi

n y seccionado.
n y seccionado.
T
T

cnicas de contraste, desecado y

cnicas de contraste, desecado y
metalizado de muestras.
metalizado de muestras.
Para
Para
MET
MET
Para
Para
MEB
MEB
Muestra Muestra
Fijaci Fijaci n n
Inclusi Inclusi n n
Seccionado Seccionado
Contraste/Tinci Contraste/Tinci n n
Observaci Observaci n n
Muestra
Fijaci Fijaci n n
metalizado metalizado
Observaci Observaci n n
Secado Secado
Preparaci
Preparaci

n de muestras para microscop

n de muestras para microscop

a de transmisi
a de transmisi

n (MET)
n (MET)
Contraste Contraste positvo positvo: :
- - acetato de acetato de uranilo uranilo
- - citrato de plomo citrato de plomo
Bacterifagos
Tincin / contraste negativo
Adenomavirus
Material biolgico en suspensin acuosa se
le aade una gota del colorante (c.
fosfotngstico). Observamos el colorante
muy oscuro rodeando el material biolgico
(queda sin teir), dando el aspecto de un
negativo fotogrfico
Sombreado metlico
Sombreado unidireccional con un metal
evaporado (platino), que se deposita sobre
la superficie de las partculas y forma una
capa finsima (efecto de sombra)
Pseudomonas
Sombreado rotacional
Varios focos de evaporacin.
Contorno muy bien delimitado
Filamentos Filamentos ADN ADN Filamentos Filamentos actina actina
Procesamiento de muestras para Procesamiento de muestras para microscop microscop a a electr electr nica de barrido (MEB) nica de barrido (MEB)
Muestra: Los objetos met Los objetos met licos pueden ser observados directamente, pero licos pueden ser observados directamente, pero
las muestras biol las muestras biol gicas han de ser desecadas gicas han de ser desecadas
Fijaci Fijaci n: n: En muestras biol En muestras biol gicas puede hacerse gicas puede hacerse
una fijaci una fijaci n con aldeh n con aldeh dos ( dos (glutaraldeh glutaraldeh do do) y tetrxido
de osmio, seguida por una deshidrataci , seguida por una deshidrataci n con acetona n con acetona
Metalizado Metalizado: : revestimiento met revestimiento met lico por lico por
sombreado sombreado
Observaci Observaci n n
Secado: Secado: desecado por punto cr desecado por punto cr tico de CO tico de CO
2 2
1 1. Secado de la muestra (por punto crtico de CO
2
)
La deshidratacin (secado) que deben sufrir las muestras
biolgicas para su observacin con el MEB comprende
varias fases:
1. El H
2
O de la muestra se sustituye por acetona
2 La acetona se sustituye por CO
2
lquido
3 La muestra se lleva a unas condiciones de P y T, punto
crtico
4 El CO
2
lquido se evapora => la estructura de la muestra
no se deforma y queda seca internamente.
2. Metalizado
Una vez seca, la muestra biolgica se recubre con una capa
delgada de metal (Au), con el fin de hacerla conductora.