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SANTIAGO, 13 DE OCTUBRE 2014

Nombre: Francisca Cid J.
Profesor: Esteban Ordenes.


Experimento numero 4
Objetivos
Estandarizar la dilucin optima del anticuerpo anti receptor de estrgenos clon SP1
Modelo experimental propuesto
Se necesitaran 5 cortes histolgicos los cuales se obtendrn de una inclusin de tero
entregada por el docente.
Llevaremos 4 de los 5 cortes hasta la olla a presin para la recuperacin antignica.
A los 4 cortes que se les realizo recuperacin antignica cortes fueron divididos de la
siguiente manera
o Corte para la inmunoticin anti receptor de estrgenos clon SP1 dilucin 1:100
o Corte para la inmunoticin anti receptor de estrgenos clon SP1 dilucin 1:150
o Corte para la inmunoticin anti receptor de estrgenos clon SP1 dilucin 1:200
o Se utilizo control negativo sin anticuerpo primario
Se uso el sistema de deteccin polmero marcado con peroxidasa
Al 5 corte se le realizara la tincin topogrfica de rutina hematoxilina eosina.

Materiales y mtodos
Equipamiento:
Cmara Hmeda.
Soplador.
Olla a presin. .
Micropipetas (respectivas puntas)
Lpiz hidrfobo
Porta objetos silanizados
Reactivos:
Anticuerpo anti receptor de estrgenos clon SP1
DAB
Diluyente para DAB
Polmero marcado con perxidasa
EDTA
Buffer fosfato

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Protocolo Inmunohistoqumica
Recuperacin antignica
Se utiliz el mtodo de recuperacin antignica con olla a presin con EDTA a pH 8.0
preparado desde la solucin de EDTA marca Diagnostic System el cual se diluyo desde la
solucin madre al 10X en base al protocolo de laboratorio (la solucin de trabajo obtenida
tiene un pH 8.0)
Se lleno el recipiente de la olla a presin con 500 ml de agua destilada, y se lleno un recipiente
plstico con la solucin de EDTA.
Luego se procedi encender la olla con la funcin al mximo se midieron 26 minutos con un
temporizador externo, ya que al poner las funciones optimas en la olla para realizar la
recuperacin esta olla marca 44 y eso sobrepasara el tiempo de recuperacin optima.
14 minutos de precalentamiento
12 minutos de recuperacin
Luego se procedi a apagar la olla a presin
15 minutos para eliminacin del vapor, la eliminacin del vapor se hace de manera
precavida para evitar que hierva el tejido y destruirlo
Se realizaron 5 baos con agua bidestilada de 1 minuto cada 1

Tcnica inmunohistoqumica con el sistema de deteccin polmero marcado con peroxidasa
despus de la recuperacin antignica
Bloqueo de peroxidasa endgena durante 10 minutos en una solucin de perxido de
hidrgeno al 3% a temperatura ambiente (1:9) preparado en PBS
Lavado en agua destilada 3 minutos.
Lavado en PBS pH 7.3, 3 lavados por 2 minutos cada uno.
Incubacin con bloqueador de uniones inespecficas R.T.U. NORMAL HORSE SERUM 2,
5% marca Vector durante 10 minutos, eliminar el exceso y sin lavar continuar al paso
siguiente.
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Incubacin con anticuerpo primario (anti receptor de estrgenos clon SP1 con las diluciones
propuestas para cada corte, 1 corte con dilucin 1:100,otro corte con dilucin 1:150 y el otro
con dilucin 1:200) en estufa a 37C durante 30 minutos
Lavado en PBS pH 7.3, 3 lavados por 2 minutos cada uno.
Incubar con Polmero marcado con peroxidasa ImmPRESS REAGENT MARCA VECTOR durante
30 minutos a temperatura ambiente.
Lavado en PBS pH 7.3, 3 lavados por 2 minutos cada uno.
Incubar con solucin sustrato cromgeno de trabajo durante 3 minutos, evaluando los
resultados.
o A un ml de diluyente ImmPACT DAB colocar una gota de cromgeno ImmPACT DAB
ambos reactivos marca VECTOR
Lavar en agua destilada - 3 por 2 minutos cada lavado.
Teir con hematoxilina de Mayer durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Presentacin de los resultados obtenidos
Intensidad de la coloracin valorada en cruces segn sistema de deteccin
Intensa: +++
Moderada: ++
Leve:+
Sin tincin: 0
Dilucin Propuesta Intensidad tincin Background
1:100 +++ ++
1:150 +++ ++
1:200 +++ +


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Descripciones histolgicas
Hematoxilina eosina:




Se observa corte en corte histolgico de tero dos de su capaz, la primera capa observada es
el endometrio, en el cual podemos observar glndulas endometriales, las cuales poseen ms
bien un aspecto rectilneo, el estroma del rgano se logra distinguir la presencia de algunos
vasos sanguneos, luego se observa la capa correspondiente al miometrio, donde podemos
observar fibras musculares lisas que estas dispuestas en varias direcciones y la presencia de
algunos vasos sanguneos, debido a la disposicin de las glndulas que poseen ms un aspecto
rectilneo, el endometrio est en la fase proliferativa









Miometrio
Endometrio
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Imagen A Imagen B Imagen C














A) Dilucin 1:100: Se observa un corte histolgico de tero, al cual se le realizo la
inmunotincin con la dilucin del anticuerpo anti receptor de estrgenos 1:100, donde a
mayor podemos observar una glndula de la zona del endometrio en la cual la
inmunotincin, si bien tiene patrn nuclear logramos visualizar tincin inespecfica en el
citoplasma de las clulas epiteliales que componen esta glndula, por el contrario el tejido
conectivo circundante, no posee esta tincin inespecfica estando claramente el patrn
nuclear

B) Dilucin 1:150: Se observa un corte histolgico de tero, al cual se le realizo la
inmunotincin con la dilucin del anticuerpo anti receptor de estrgenos 1:150, donde a
mayor podemos observar una glndula de la zona del endometrio en la cual la
inmunotincin, si bien tiene patrn nuclear logramos visualizar tincin inespecfica en el
citoplasma de las clulas epiteliales que componen esta glndula la cual ha disminuido
versus la dilucin anterior, por el contrario el tejido conectivo circundante, no posee esta
tincin inespecfica estando claramente el patrn nuclear.

Glndula endometrial
Estroma
Clula epitelial
Estroma
Glndula endometrial
Clula epitelial
Glndula endometrial
Estroma
Clula epitelial
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C) Dilucin 1:200: Se observa un corte histolgico de tero, al cual se le realizo la
inmunotincin con la dilucin del anticuerpo anti receptor de estrgenos 1:200, donde a
mayor podemos observar una glndula de la zona del endometrio en la cual la
inmunotincin, si bien tiene patrn nuclear aun seguimos visualizar tincin inespecfica en
el citoplasma de las clulas epiteliales que componen esta glndula la cual ha disminuido
versus la dilucin anterior siendo ya casi imperceptible, y se sigue observando el estroma
que a estas glndula sin tincin inespecfica.



Conclusin
Luego de realizar la inmunotincin y analizar los resultados, vemos que la inmunotincin realizada
si dio el patrn que corresponda o sea el patrn celular nuclear, aunque observamos tincin
inespecfica en los citoplasmas en las clulas epiteliales que conforman estas glndulas
endometriales con las tres diluciones propuestas, siendo ms leve la tincin de fondo con la
dilucin 1:200
Debido a los resultados obtenidos al realizar este experimento, una conclusin que puedo extraer
es que el anticuerpo, aun se puede seguir utilizando de manera ms diluida por ejemplo la dilucin
1:250, lo cual finalmente ayudara a lograr la tincin especfica que es netamente el patrn nuclear
y eliminar la tincin de fondo obtenida en los citoplasmas de las clulas.