1

FISIOLOGA BACTERIANA
GUIA DE PROBLEMAS

1. El cloruro de sodio en concentracin mayor de 6 g/l inhibe la mayora de los
grmenes permitiendo el crecimiento de Estafilococos. Dado el siguiente medio
de cultivo:
Extracto de carne 1 g/l
Peptona 10 g/l
NaCl 75 g/l
D-Manitol 10 g/l
Agar 10 g/l
Rojo de fenol 25 mg/l
pH 7,4

A- Cmo clasificara este medio?
B- Si hubiera fermentacin de azcar, se producira algn cambio en el medio?

2. Dados los siguientes medios cuya composicin se detallan a continuacin:
Medio 1 Medio 2
Lactosa 5 g/l Triptona 5 g/l
Sacarosa 5 g/l Extracto de levadura 25 g/l
K
2
HPO
4
2 g/l Glucosa 10 g/l
Eosina 0,4 g/l Agar 15 g/l
Azul de metileno 0,065 g/l pH 7
Agar 15 g/l
pH 7,4

A- Cul medio usara para realizar un recuento de microorganismos totales de un
lote de pastillas?
B- Qu razones tiene para haber hecho esa eleccin?

3. Sabiendo que el citrato de sodio y el desoxicolato de sodio inhiben el crecimiento
de Gram(-) y algunos otros microorganismos y permite el crecimiento de
Salmonella y Shigellas. Dado el siguiente medio de cultivo:
Peptona 20 g/l
Glucosa 1 g/l
D-Manitol 2 g/l
Citrato de sodio 5 g/l
Desoxicolato de sodio 0,5 g/l
K
2
HPO
4
4 g/l
KH
2
PO
4
1,5 g/l
NaCl 5 g/l
pH 7,4

Cmo clasificara a este medio de cultivo? Fundamente su respuesta.

4. Confeccione un medio de cultivo e identifique las condiciones de crecimiento para
cada uno de los siguientes microorganismos:
a- Quimiolitohetertrofo
b- Quimiorganoauttrofo
2

c- Quimiorganohetertrofo
d- Quimiolitoauttrofo fijador libre de N2
e- Quimiorganohetertrofo anaerobio estricto

5. Se desean estudiar los microorganismos presentes en una muestra polimicrobiana.
Para ello se necesitan obtener cultivos puros de cada uno de ellos, para lo cual:
a- Aisla colonias en un medio slido complejo y a partir de stas siembra en un
medio lquido complejo.
b- Aisla colonias en un medio slido complejo y a partir de stas siembra por
depsito y posterior quemado en medio slido complejo.
c- Aisla colonias en medio slido sinttico y a partir de stas siembra por
agotamiento de ansa en medio slido complejo.
d- Aisla colonias en un medio slido complejo y a partir de stas siembra en un
medio lquido sinttico.
e- Todo lo anterior es cierto
f- Nada de lo anterior es cierto

6. Se toma un inculo de uno de los cultivos puros y se siembra por puncin en un
tubo que contiene medio SIM, cuya composicin es:
Peptona de casena 20,0 g/l
Peptona de carne 6,6 g/l
Citrato de amonio y Fe(III) 0,2 g/l
Tiosulfato de sodio 0,2 g/l
Agar 3,0 g/l

El medio SIM es:
a- Slido y complejo
b- Lquido y sinttico
c- Semislido y complejo
d- Semislido y sinttico
e- Todo lo anterior es cierto
f- Nada de lo anterior es cierto

Luego de incubar a 37C durante 12 horas se observa que el crecimiento se
extiende sobre toda la superficie del medio, pero no hay crecimiento en la
puncin.
De los resultados obtenidos usted puede deducir que se trata de un
microorganismo:
a- Anaerobio estricto (movilidad +)
b- Anaerobio facultativo (movilidad -)
c- Aerobio (movilidad +)
d- Todo lo anterior es cierto
e- Nada de lo anterior es cierto
f-
7. Ud recibe una mezcla polimicrobiana y le solicitan aislamiento e identificacin de
grmenes. Cmo procedera a partir de la muestra para obtener los
microorganismos aislados? Utilizara:
a. Un medio slido selectivo para Gram (+)
b. Un medio slido selectivo para Gram (-)
c. Un medio lquido diferencial
3

d. Un medio slido complejo
e. Un medio slido sinttico
f. Todo lo anterior es cierto
g. Nada de lo anterior es cierto

Posteriormente Ud. est interesado en identificar un determinado
microorganismo basndose en las caractersticas que presenta su colonia en la
tincin de Gram del mismo. Para ello Ud. debe obtener un cultivo puro de ese
organismo a fin de identificarlo mediante distintas pruebas metablicas.
Cmo procedera para lograrlo?:
a. A partir de una colonia aislada sembrara una placa con medio slido
complejo
b. A partir de una colonia aislada sembrara un medio lquido complejo
c. A partir de una colonia aislada sembrara una placa con medio slido
sinttico
d. Todo lo anterior es cierto
e. Nada de lo anterior es cierto

8. Seale con una cruz qu tipo de medio de cultivo, de acuerdo a su consistencia
utilizara para los siguientes ensayos:

Lquido Semislido Slido
a. Movilidad determinada macroscpicamente: ........... .............. ...........
b. Obtener cultivos puros: ............ ............... ...........
c. Movilidad determinada microscpicamente: ............ ................. ...........
d. Contaje de clulas viables: ............ ................. ...........
e. Realizar una curva de crecimiento por D.O: ............ ................. ...........

9. El agar TCBS (agar-tiosulfato-citrato-sales biliares-sacarosa) se utiliza para el
aislamiento de Vibrio cholerae. Las elevadas concentraciones de tiosulfato y
citrato inhiben el crecimiento de enterobacterias, mientras que la bilis y el colato
inhiben a enterococos.
a- Dada la composicin del medio, indique como lo clasificara de una manera
ms completa, y justifique.
Peptona de casena 5 g/l
Peptona de carne 5 g/l
Extracto de levadura 5 g/l
Citrato de sodio 10 g/l
Tiosulfato de sodio 10 g/l
Bilis desecada 5 g/l
Colato de sodio 3 g/l
Sacarosa 20 g/l
Cloruro de sodio 10 g/l
Hierro (III) citrato 1 g/l
Azul de bromotimol 0,04 g/l
Azul de timol 0,04 g/l
Agar-agar 14 g/l

4

b- De acuerdo a los requerimientos de fuente de carbono y energa, seale que
clase de microorganismos podran cultivarse en el medio TCBS.
1- Quimioorganohetertrofo
2- Quimiolitohetertrofo
3- Fotoauttrofo
4- Fotohetertrofo
5- Todo lo anterior es cierto
6- Nada de lo anterior es cierto

10. Si una cepa de Escherichia coli posee un genotipo met
-
trp
-
, dicha cepa:
a- Es auxtrofa para metionina y triptofano
b- Puede cultivarse en un medio de cultivo mnimo al cual se le adicion
metionina y triptofano.
c- Puede cultivarse en medio de cultivo complejo.
d- Es incapaz de sintetizar metionina y triptofano.
e- Todo lo anterior es cierto.
f- Nada de lo anterior es cierto.

11. Se desea obtener un cultivo puro de la bacteria Gram positiva Bacillus subtilis a
partir de una mezcla de microorganismos. Cul de los siguientes medios
utilizara?

Medio 1 Medio 2
Peptona 20 g/l extracto de levadura 5 g/l
NaCl 5 g/l triptona 10 g/l
Lactosa 10 g/l NaCl 5 g/l
Sales biliares 1,5 g/l agar 20 g/l
Rojo neutro 0,03 g/l
Violeta cristal 0,001 g/l
Agar 20 g/l
J ustifique su respuesta. Clasifique ambos medios de cultivo.

12. Lactoccocus lactis es una bacteria que posee una pared constituida por una gruesa
capa de murena y carece de membrana externa. Qu observara al microscopio
ptico, al realizar un extendido de un cultivo de dicha bacteria, en los siguientes
casos:
a- Luego de realizar una coloracin de Gram
b- Si en la tincin de Gram cambia el violeta de genciana por zafranina.
c- Si antes de la tincin de Gram resuspende el cultivo en sacarosa 50% y agrega
lisozima.
d- Si se olvida de agregar la mezcla alcohol-acetona de la coloracin de Gram.
e- Podr detectar la presencia de una cepa contaminante de Escherichia coli
usando una coloracin de Gram? Y si se olvida de agregar el decolorante?
J ustifique.

13. Dado el siguiente medio de cultivo:
Hidrocloruro de cistena 0.1 g/l
Citrato de sodio 0.3g/l
Dextrosa 0.2 g/l
Fosfato dicido de potasio 1 g/l
5

Extracto de levadura 0.5 g/l
Cloruro de sodio 5 g/l
Agar 15 g/l
Rojo fenol 0,012 g/l
NH
4
Cl 1 g/l
pH 6.9

a. Se trata de un medio sinttico, slido, que permite el crecimiento de
bacterias Gram (+) y Gram (-).
b. Se trata de un medio slido, complejo, que permite el crecimiento de
bacterias Gram (+).
c. Es un medio complejo, semislido, diferencial y selectivo para Gram (+).
d. Es un medio slido, diferencial, complejo, que impide el crecimiento de
bacterias Gram (+).

14. Ud. crece una bacteria en caldo peptonado en el cual la relacin con el oxgeno es
desconocida. Luego de 24 hs a 37
o
C, saca el cultivo de la estufa sin agitacin y
observa que el microorganismo creci a todo lo largo del tubo. Ud. concluye que
es:
a- un aerobio obligado
b- un microaerfilo
c- un aerobio facultativo
d- un anaerobio obligado.

15. Se estudia el mecanismo y lugar de accin de un antibitico activo contra
bacterias Gram (+), de estructura pptido cclico con un brazo de cido graso.
Para ello se realizan los siguientes ensayos:
A) ensayos de biosntesis de macromolculas: se cultiva a la bacteria ( en este
caso Staphylococcus aureus) en presencia de distintos precursores de
macromolculas marcadas radiactivamente, en presencia de distintos
antibiticos conocidos y del nuevo antibitico LY. Luego se preparan los
extractos celulares segn la macromolcula que se quiere estudiar y se
determina la cantidad de radiactividad en cada una segn la siguiente tabla:

% de inhibicin sobre la biosntesis
PROTENA DNA RNA MURENA
LY 2 2 0 90
ERITROMICINA 70 0 0 0
ACTINOMICINA 0 90 0 0
RIFAMPICINA 0 0 94 0
VANCOMICINA 0 0 0 78

Posteriormente se realizaron los siguientes ensayos para aclarar el mecanismo de
accin:
B) Incorporacin de radiactividad proveniente de precursores unidos a UDP en
presencia de distintos antibiticos: se realiza la incubacin del cultivo
bacteriano con los distintos precursores en presencia de distintos antibiticos.
Posteriormente se separa el pptido glicano cido insoluble y se determina su
radiactividad para cada condicin de cultivo segn se ve en la siguiente tabla:

6

Precursor radiactivo Antib. (g/ml) Radiactividad % inhibicin
UDP-GlcNAc
Sin agregado 22000 -
LY (100) 7000 68
Fosfomicina (300) 4000 82
Vancomicina (100) 3500 85
UDP-MurNAc-pentap.
Sin agregado 4000 -
LY (100) 1200 70
Fosfomicina (300) 4000 0
Vancomicina (100) 600 85

C) al incubar las bacterias con
14
C D-Alanina en presencia de 1000 g/ml de
Vancomicina, se produce la acumulacin in vivo de UDPMurNAc-
pentapptido, radiactivo, ya que la Vancomicina inhibe la transferencia del
precursor. Se agregan distintas cantidades de LY y a tiempos determinados de
determina la radiactividad en clulas (Fig. 1).

D) Por ltimo se ensay el efecto de la concentracin de LY sobre la liberacin de
K
+
intracelular en S. aureus. El K
+
liberado al medio extracelualr se midi en
un medio isoosmtico.

















En base a los datos suministrados :
1) interpretar cada uno de los resultados presentados.
2) Indicar los posibles lugares de accin del antibitico.




16. Se quiere determinar el sitio de accin de un antibitico, para lo cual se utiliza la
bacteria Gram (+) Bacillus subtilis. Alcuotas de esta bacteria son incubadas con
el agregado de precursores radioactivos en presencia o en ausencia del antibitico.
Luego se van tomando muestras a distintos tiempos y se determina la
incorporacin de radioactividad en cada caso, obtenindose los siguientes
grficos:

Figura 1
0
5
10
15
20
25
30
0 20 40 60 80 100
concentracin de LY (ug/ml)
R
a
d
i
a
c
t
i
v
i
d
a
d

(
c
p
m

x

1
0
3
)
Figura 2
0.1 1 10 100
concentracin de LY (ug/ml)
K

l
i
b
e
r
a
d
o

(
u
g
/
D
O
5
9
0

n
m
)
7

a- Incubacin realizada en presencia de UDP (
14
C) Glc-Nac

b- Incubacin realizada en presencia de (
14
C) D-alanina.

c- Incubacin realizada en presencia de (
14
C) D-alanina.


Indique los posibles sitios de accin de este antibitico. Grafique D.O. en funcin
del tiempo para un cultivo al que se le agrega este antibitico. J ustifique sus
respuestas.

2 1 3
Tiempo (Hs.)
% de radioactividad
en la pared cel ular
Sin antibitico
Con antibitico
2 1 3
Tiempo (Hs.)
% de radioactividad
en la pared celul ar
Sin anti bitico
Con antibitico
4
2 1 3
Tiempo (Hs.)
% de radioactividad
en la fraccin de
membrana
Sin anti bitico
Con antibitico
4
8

17. Se realizaron investigaciones acerca del mecanismo de resistencia a Tetraciclina,
desarrollado por una cepa mutante de Staphylococcus faecalis. Se emplearon para
este fin tres cepas de este microorganismo: Una sensible al antibitico (A), una
cepa resistente ya conocida (B), y la mutante en estudio (C). Para detectar el
origen de la resistencia adquirida por esta cepa, se realizaron los siguientes
ensayos:

a- Efecto de la tetraciclina sobre el crecimiento de las cepas (A), (B) y (C). La
flecha indica el momento de agregado del antibitico (100 g/ml).

b- Actividad biolgica de la Tetraciclina recuperada del sobrenadante
(esterilizado por filtracin) donde se desarrollaron las cepas (B) y (C). El
sobrenadante de un cultivo de S. faecalis (B) y (C), de 15 Hs., al que se cultiv en
presencia de Tetraciclina (100 g/ml), fue recuperado y utilizado para ensayar su
capacidad inhibitoria remanente a distintas concentraciones, sobre una suspensin
de bacterias (A). El crecimiento fue observado y medido a las 15 Hs. De este
nuevo inculo adicionado con sobrenadante. El control se realiz incorporando en
un tubo cantidades variables de Tetraciclina fresca.

4 2 6
Tiempo (Hs.)
Log DO (590 nm)
S. faecalis
S. faecalis
S. faecalis
(A)
(B)
(C)
8
4 2 6 Tetraci cli na (g/ml)
Log DO (590 nm)
Cepa (A) + di stintas diluciones del sobrenadante de (B)
Cepa (A) + di stintas diluciones del sobrenadante de (C)
Cepa (A) + cantidades variabl es de Tetracicli na
8
Diluciones del
sobrenadante
1
/
8
1
/
16
1
/
4
1
/
2
1
9

c- Efecto de la Tetraciclina en la sntesis in vitro de protena, medida como
porcentaje de Actividad ( incorporacin de
14
C aminocidos)
Los extractos de las cepas (A), (B) y (C) fueron preparados y se enfrentaron con
distintas concentraciones de Tetraciclina.

d- Incorporacin de
3
H-Tetraciclina por la cepas (A), (B) y (C).
Se analiza la capacidad de acumularla intracelularmente en presencia o ausencia
de glucosa (fuente de energa).


Establezca qu tipo de mecanismo sera el que impide que estos mutantes no sean
afectados por la Tetraciclina.



10 5 15 Tetraciclina (g/ml)
% actividad
sntesis proteica
20
50
100
25
S. faecalis
S. faecalis
S. faecalis
(A)
(B)
(C)
10 5 15
Tiempo (mi n)
20
50
100
25
75
Cepa A
10 5 15 20
50
100
25
75
Cepa B
10 5 15 20
50
100
25
75
Cepa C
S. faecalis
S. faecalis
S. faecalis
S. faecalis
S. faecalis
S. faecalis
(A) en presencia de glucosa
(A) en ausencia de glucosa
(B) en presencia de glucosa
(B) en ausencia de glucosa
(C) en presencia de glucosa
(C) en ausencia de glucosa
10

18. Las tetraciclinas representan una familia de antibiticos introducidos a fines de la
dcada del 40, a partir de su aislamiento de diferentes cepas de Streptomyces.
Cuando una de estas cepas es cultivada en un medio de cultivo adecuado se
obtienen los resultados observados en la siguiente tabla.

TIEMPO (hs) PESO SECO (g/l) Ln PESO SECO
1 4.5 1.50
3 5.0 1.61
6 6.3 1.84
10 12.5 2.53
14 25.0 3.22
18 40 3.70

Por encima de las 20 hs. no se observa aumento apreciable del peso seco.
Paralelamente se determina la concentracin de tetraciclina (Tc) producida por
esta especie bacteriana en el sobrenadante del medio de cultivo.

Calcular la velocidad de crecimiento especfica mxima y el tiempo de
generacin.
a- Se podran utilizar los datos numricos de produccin de Tc (en caso de contar
con ellos) para calcular la velocidad pedida? J ustificar.

19. Se estudi el mecanismo y lugar de accin de un antibitico activo contra
bacterias Gram (+), para ello se realizaron los siguientes ensayos:

Ensayos de biosntesis de macromolculas: se cultiv la bacteria (Staphylococcus
aureus) en presencia de distintos precursores de macromolculas marcadas
radioactivamente, en presencia de distintos antibiticos conocidos y del nuevo
antibitico X. Luego se prepararon los extractos celulares segn la macromolcula
que se quera estudiar y se determin la cantidad de radioactividad de cada una
segn la siguiente tabla:

% de inhibicin sobre la biosntesis
Protena DNA RNA Murena
X 2 1 1 92
Cloranfenicol 85 0 2 2
Actinomicina 1 91 15 0
10 5 15
Tiempo (hs)
Cc de Tc
producida
20 25 30
11

Rifampicina 0 1 92 1
Vancomicina 1 0 0 84

Posteriormente se realiz el siguiente ensayo para aclarar el mecanismo de accin:

Precursor radioactivo Antibitico (/ml) Radiactivad
(incorporada en
murena)
% Inhibicin
UDP-GlcNac Sin agregado
X
D-cicloserina
Ristocetina
20000
200
250
400
-
99
98.5
98
UDP-MurNac-pentapptido Sin agregado
X
D-cicloserina
Ristocetina
5000
4500
4250
500
-
5
7.5
90

En base a los datos suministrados:
a. Interpretar cada uno de los resultados presentados.
b. Indicar los posibles lugares de accin del antibitico.

20. Indique cmo se comportar un cultivo de la bacteria Gram (-) E. coli K12, ante el
agregado de los siguientes antibiticos, por separado, en los momentos indicados
por las flechas, ya sea en un medio isotnico (caldo peptonado +sacarosa) o
hipotnico (caldo peptonado)-
1- Penicilina G
2- Estreptomicina
3- Polimixina
4- cido Nalidxico

21. Hasta el presente se han descripto distintos mecanismos de resistencia bacteriana a
tetraciclinas. Para estudiar uno de estos mecanismos de resistencia mediado por la
protena Tet (0) en una cepa de E. coli denominada J M107 productora de esta
protena, se realizaron los siguientes ensayos:

Tiempo
D.O. D.O.
1, 2, 3
1, 3, 4
3, 2
3, 4
Tiempo
MEDIO ISOTNICO MEDIO HIPOTNICO
12

a- Captacin de
3
H-tetraciclina: se crecieron las cepas J M107 y HB101 (cepa de
E. coli resistente a tetraciclina mediante un proceso de expulsin activo de la
droga) hasta la fase log, se lavaron y resuspendieron en medio de cultivo fresco
con el agregado de
3
H-tetraciclina. A distintos tiempos se tomaron alcuotas y se
determin la radioactividad presente en las bacterias.

b- Efecto de Tet(0) sobre la actividad de la tetraciclina: se utiliz un sistema de
traduccin in vitro a partir de ARNm sinttico (poliU) cuya traduccin da
polifenilalanina. Dicho sistema de traduccin utiliza fracciones ribosomales
provenientes de E. coli HB101 o J M107 Tc
r
en presencia de
14
C-fenilalanina y
distintas concentraciones de tetraciclina en un medio por lo dems completo. A
los 60 minutos se precipita la polifenilalanina con cido tricloroactico al 10% y
se mide la radioactividad incorporada en el precipitado. En la figura se grafica el
porcentaje de inhibicin alcanzado.

c- Por ltimo se midi la unin de 3H-tetraciclina a una fraccin de ribosomas
provenientes de la cepa HB101 o de la cepa J M107. Para ello se incub una
alcuota conteniendo ribosomas en un buffer adecuado en presencia de distintas
concentraciones de 3H-tetraciclina durante 15 minutos a 37C. Posteriormente se
colectaron los ribosomas, se lavaron, y se determin la radioactividad unida en
cada caso. Se obtuvieron los siguientes resultados:
30 15 45
Tiempo (min)
Captacin
de ( H)-Tc
3
60 75 90
2
4
6
8
HB101
JM107
50 25 75
[Tc] M
% de
Inhibici n
100 125 150
20
40
60
80
JM107
HB101 100
40 20 60
[Tc] M
( H)-Tc
unida
3
80 100 125
0.5
1.0
1.5
2.0
JM107
HB101
150
13

En base a los datos mostrados, indique el posible mecanismo de resistencia de la
cepa J M107. J ustifique su respuesta analizando en cada caso los datos mostrados.

22. Se desea estudiar el transporte de Cd
++
en dos cepas de la bacteria Gram (+)
Bacillus subtilis. B. subtilis 100 y B. subtilis 200. Para ello se realizaron los
siguientes experimentos:

a- Se crecen ambas cepas en presencia de distintas concentraciones de Cd
++
y se
determina la densidad ptica final alcanzada a las 12 horas de cultivo.

f. En la bacteria Gram (-) E. coli el transporte de Cd
++
es mediado por el mismo
transportados que introduzca Mn
++
. Con el objeto de determinar si sucede lo
mismo en bacterias Gram(+) se crecen ambas cepas de B. subtilis hasta la fase
exponencial tarda en presencia de distintas concentraciones de Cd++y en
presencia o ausencia de Mn
++
. Luego se determina la densidad ptica final
alcanzada.

g. Se analizan los transportes de Cd
++
y Mn
++
en ambas cepas de B. subtilis
crecindose las mismas hasta la fase exponencial tarda, centrifugando,
resuspendindolas en medio fresco con el agregado de 5 M de Cd
++
o 5 M
de Mn
++
radioactivos. Se determin a continuacin la radioactividad
transportada en cada cepa:
1
[Cd ] M
++
D.O.
10 100
B. subti lis 100
B. subti lis 200
1
[Cd ] M
++
D.O.
10 100
B. subti li s 100
B. subti li s
B. subti li s
B. subti li s
200
o 200 + 50M Mn
o 100 + 50M Mn
++
++
5 2.5
Tiempo (mi n)
1 1
Tiempo (mi n)
5 2.5
B. subti li s 100
B. subti li s 200
Cd
++

Mn
++

14

h. El DNP (dinitrofenol) es un compuesto que desacopla la fosforilacin
oxidativa. El agregado de este compuesto a cultivos crecidos en presencia de
Mn
++
radioactivos da los siguientes resultados sobre la cepa de B. subtilis 100:













En base a los resultados mostrados conteste justificando para cada caso:
a. Efecto del Cd
++
sobre cada cepa de B. subtilis
b. Relacin entre el transportador de Cd
++
y Mn
++
en B. subtilis
c. Tipo/s de mecanismo/s de resistencia al Cd
++
en la cepa de B. subtilis 200.
d. Clasificacin del mecanismo de transporte de Mn
++
.
e. Comente los distintos mecanismos de transporte de soluto indicando sus
caractersticas ms importantes.

23. Durante una serie de estudios se logr aislar una especie bacteriana desde el
sedimento del fondo de una laguna. Este microorganismo denominado GS-15 fue
cultivado anaerbicamente a 33 C en un medio de cultivo que contena en
gramos por litro:
CaCl
2
.5 H
2
O 0.1
KCl 0.1
NH
4
Cl 1.5
NaH
2
PO
4
0.6
NaAcO 6.8

El medio contena adems vitaminas en cantidades adecuadas, como as tambin 200
mM de Fe(III) amorfo (hidrxido frrico) (medio I). Como resultado de estos
experimentos se obtuvieron las grficas de la figura 1:
Nota: Fe (II) y Fe (III) se midieron en el sobrenadante.












FIGURA 1
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
das
Fe (II) Nvx 107 cel/ml acetato Fe (III)
FIGURA 2
0
3
6
9
12
15
18
21
0 5 10 15 20 25
horas
x

1
0
7

c
e
l
.

/

m
l
Fe (III) Fe (II) Nvx 107 cel/ml

5 2.5
Tiempo (min)
B. subtilis 100 + 50M
54
Mn
++

B. subtilis 100 + 50M
54
Mn
++
+ 0,5M DNP
Transporte
de (
54
Mn
++
)
0.4
0.8
1.5
15

a. Cmo interpreta cada una de estas curvas?
b. Calcular mx. y el Tg . Tener en cuenta que los datos numricos de las
grficas no son logartmicos.
c. Cmo clasificara el medio de cultivo?

Luego GS-15 fue cultivada anaerbicamente en una medio idntico al I salvo que en
lugar de adicionar Fe(III) amorfo se agreg citrato frrico (medio II). Fig.2.
d. Cmo interpreta las grficas? Que conclusin obtiene de la
comparacin de las velocidades de crecimiento entre las figuras 1 y 2?

24. Se desean estudiar las caractersticas de crecimiento de dos especies bacterianas
Q.O.T. aisladas a partir de una muestra de suelo. Las especies en cuestin,
denominadas cepa A y cepa B, fueron caracterizadas nutricionalmente hallndose
que la cepa A posee una auxotrofa para el aminocido (L)-leucina y que la cepa B
es prottrofa productora de al menos una sustancia con actividad antibitica,
sintetizada desde el comienzo de la fase exponencial tarda de crecimiento.
Luego de crecerse, por separado, las cepas A y B en medio sinttico mnimo se
obtuvieron los resultados dados a continuacin.

Tiempo (h)
ln D.O.
Cepa A Cepa B
0 0.095 0.182
1 0.139 0.182
2 0.530 0.405
3 0.910 0.693
4 1.609 1.029
5 2.300 1.386
6 2.990 1.568
7 3.400 1.609
8 3.690 1.705
9 3.800 1.705
10 3.850 1.723
11 3.850 1.740
12 3.850 1.723

Pregunta 1: Calcule la mxima de crecimiento y el tiempo de generacin (tg)
para cada cepa bacteriana.
Pregunta 2: Confeccione un medio de cultivo sinttico mnimo apto para el
crecimiento de cada cepa bacteriana por separado.

A continuacin los microorganismos A y B son crecidos juntos en el mismo
medio de cultivo sinttico mnimo obtenindose los datos siguientes:

Tiempo (h) ln (N cl. viables / ml)
Cepa A Cepa B
0 11.51 11.61
1 11.61 11.61
16

2 12.07 11.95
3 12.30 12.30
4 12.90 12.64
5 13.59 13.00
6 14.28 13.33
7 14.40 14.15
8 14.00 15.42
9 13.59 16.70
10 13.22 17.97
11 12.21 19.24
12 9.21 20.51

Pregunta 3: Confeccione un medio de cultivo sinttico mnimo para el
crecimiento conjunto de las cepas A y B.
Pregunta 4: Calcule mxima de crecimiento de las cepas A y B as como
mxima de muerte (cuando corresponda). Cmo explica Ud. los resultados obtenidos
al comparar estos datos con los de la respuesta a la pregunta 1, anterior situacin en la
cual los microorganismos A y B fueron crecidos separadamente?

25. Para estudiar el efecto y mecanismo de accin de un antibitico se llevaron a cabo
los siguientes experimentos:
a. Recuento del nmero de clulas viables.
El ensayo del antibitico (ATB) se realiz sobre una cepa de Bacillus subtilis
sensible (S) y una resistente (R); el antibitico fue agregado en una
concentracin de 100g/ml, 150 minutos despus de iniciado el cultivo.
Cuando el experimento se realiz en un medio isosmtico los valores de las
cepas R y S no difirieron significativamente del control realizado sin
antibitico, no siendo as cuando el ensayo se realiz en un medio
hiposmtico. Los valores informados son unidades formadoras de colonias por
mililitro de cultivo.

TIEMPO (minutos) S y R con antibitico.
S sin antibitico
S sin antibitico S con antibitico
0 1.0 x 10
3
1.1 x 10
3
1.1 x 10
3

30 1.0 x 10
3
1.2 x 10
3
1.2 x 10
3

60 1.5 x 10
3
1.3 x 10
3
1.2 x 10
3

90 4.0 x 10
4
4.2 x 10
4
4.1 x 10
4

120 4.0 x 10
5
4.1 x 10
5
4.0 x 10
5

150 4.0 x 10
6
3.9 x 10
6
3.8 x 10
6

180 4.2 x 10
7
4.1 x 10
7
4.0 x 10
6

210 3.7 x 10
8
3.6 x 10
8
9.0 x 10
5

240 4.3 x 10
8
4.2 x 10
8
2.0 x 10
5

270 5.0 x 10
8
4.9 x 10
8
8.0 x 10
4

300 5.1 x 10
8
5.0 x 10
8
4.0 x 10
4

330 5.2 x 10
8
5.1 x 10
8
2.1 x 10
4

360 5.2 x 10
8
5.2 x 10
8
1.0 x 10
4

390 5.2 x 10
8
5.2 x 10
8
5.0 x 10
3

Osmolaridad del
medio
ISOSMOTICO HIPOSMOTICO HIPOSMOTICO
17

b. Se ensay tambin el efecto de distintas concentraciones del antibitico sobre
el crecimiento de una cepa sensible en condiciones hiposmticas, para lo cual
se adicion el mismo a distintas alcuotas de un cultivo de DO=0,6 y se midi
la DO final alcanzada luego de 1 hora de adicionado el antibitico.

CONCENTRACIN (g/ml) DO final alcanzada
10 1.2
50 0.9
100 0.2
200 0.2

c. Para analizar cual era el metabolismo afectado se ensay el antibitico en
cuestin y otros de actividad conocida sobre una cepa sensible en presencia de
precursores marcados radiactivamente, y se midi su incorporacin a distintas
biomolculas. Los valores informados (en cuentas por minuto totales) fueron:

ANTIBIOTICO [
35
S] metionina [
3
H] timidina [
3
H] uracilo [
14
C] UDP
NAcGluc
ATB 14900 14000 14900 17000
Cloranfenicol 3100 16300 16100 111000
Actinomicina 14000 2500 15500 120000
Rifampicina 13900 16000 170 115000
Vancomicina 14800 16500 16000 20000
Sin antibitico 15000 17000 16500 120000

d. Con el fin de localizar el sitio de accin del antibitico se realiz un
experimento en el cual se utilizaron precursores radioactivos de la sntesis de
murena, midindose la incorporacin de los mismos a la pared celular en un
medio isosmtico, luego de 2 horas de cultivo, en presencia de 200 g/ml del
antibitico.

PRECURSOR S sin antibitico S con antibitico R con antibitico
N-AcGlucosamina 20000 1500 18000
D-Alanina 23000 1300 17900
UDP NAc Mur pentapptido 19000 1600 19000

e. Para estudiar el mecanismo de resistencia de la cepa R se realiz el siguiente
experimento:
Se cultiv la cepa R en presencia del antibitico (200 g/ml) hasta una DO de 0,5,
se separaron las clulas por centrifugacin, y los sobrenadantes se usaron para
crecer la cepa sensible S partiendo de una DO inicial de 0,15 en 3ml volumen
final. Los resultados se informan como DO alcanzada luego de 3 horas.

MEDIO FRESCO : SOBRENADANTE DO FINAL ALCANZADA
4 ml: 0 ml 0.80
3 ml : 1 ml 0.81
2 ml : 2 ml 0.72
1 ml : 3 ml 0.74
0 ml : 4 ml 0.71
18

i. Grafique ln(Nv) versus tiempo para las cepas en estudio.
ii. Represente los resultados esperados en el caso de medir Abs. en
lugar de Nv.
iii. Calcule la
mx
. para la cepa control sin antibitico en medio
isosmtico.
iv. Indique el posible sitio de accin del antibitico y mecanismo de
resistencia para la cepa R.

26. Para analizar el efecto de diferentes concentraciones de un antibitico sobre el
crecimiento de una cepa de Streptococcus se determin tanto la D.O. del cultivo,
como el recuento de clulas viables a diferentes tiempos. Los datos indicados en
la columna (cultivo I) fueron obtenidos en ausencia del antibitico. Los cultivos 2
y 3 muestran los mismos datos, a los cuales se les adicion a los 150 minutos el
antibitico en estudio a una concentracin final de 1 y 100 g/ml respectivamente.

Cultivo 1: ausencia de antibitico
Cultivo 2: a los 150 minutos se agreg el antibitico a una concentracin final de 1
g/ml y se continu midiendo la D.O. del cultivo.
Cultivo 3: se realiz el mismo procedimiento que para el cultivo 2 excepto que el
antibitico se agreg a una concentracin final de 100 g/ml.

Tabla 1. Medida de D.O.
Tiempo
(min)
Cultivo 1 Cultivo 2 Cultivo 3
D.O. ln D.O D.O. ln D.O D.O. ln D.O
0 148 5 148 5 148 5
60 149 5 149 5 149 5
90 181 5.2 181 5.2 181 5.2
120 330 5.8 330 5.8 330 5.8
150 600 6.4 600 6.4 600 6.4
180 1097 7 600 6.4 600 6.4
210 2000 7.6 600 6.4 600 6.4
240 3640 8.2 600 6.4 600 6.4
300 5400 8.6 600 6.4 600 6.4
360 5430 8.6 600 6.4 600 6.4

Tabla 2. Recuento de clulas viables (x 10
8
).
Tiempo
(min)
Cultivo 2 Cultivo 3
N cl.
viables (Nv)
ln Nv N cl.
viables (Nv)
ln Nv
0 2.7 19.4 2.7 19.4
60 2.7 19.4 2.7 19.4
90 3.3 19.6 3.3 19.6
120 6.0 20.2 6.0 20.2
150 11 20.8 11 20.8
180 11 20.8 11 20.8
210 11 20.8 11 20.8
240 11 20.8 11 20.8
300 11 20.8 11 20.8
360 11 20.8 11 20.8
19

A. Calcule
mx
. y tg e indique durante que lapso el cultivo se encontraba en la fase
exponencial.
B. Fundamente cual es el efecto del antibitico para cada concentracin
(bacteriosttico, bactericida o bacterioltico).
C. Calcule, si corresponde, la velocidad especfica de muerte (), sabiendo que la
muerte celular sigue una cintica exponencial similar a la de crecimiento celular.

27. Con el fin de analizar el efecto de los antibiticos X e Y sobre el crecimiento de
E. coli se determin el nmero de clulas viables por mililitro (Nv/ml) a diferentes
tiempos, en ausencia (Tabla 1) y en presencia de dichos antibiticos (Tabla
2:antibitico x; Tabla 3: antibitico Y). Se indican las diluciones realizadas a cada
tiempo para el contaje de clulas viables, el volumen sembrado para cada dilucin
y el nmero de unidades formadoras de colonias (UFC) contadas en cada dilucin.
Tabla 1. Valores obtenidos en ausencia de antibiticos.
Tiempo (hs) Dilucin Vol. de siembra (ml) UFC
0 10
-2
0.1 30
10
-3
0.1 1
1 10
-2
0.2 61
10
-3
0.2 3
2 10
-2
0.1 60
10
-3
0.1 8
4 10
-3
0.1 410
10
-4
0.1 38
6 10
-6
0.2 49
10
-7
0.2 4
7 10
-5
0.1 922
10
-6
0.1 145
8 10
-6
0.1 290
10
-7
0.1 25
9 10
-7
0.2 58
10
-8
0.2 1

Tabla 2. El antibitico X fue agregado a T=4 hs.
Tiempo (hs) Dilucin Vol. de siembra (ml) UFC
5 10
-4
0.1 54
10
-5
0.1 5
7 10
-3
0.1 630
10
-4
0.1 55
9 10
-3
0.2 1200
10
-4
0.2 108

Tabla 3. El antibitico Y fue agregado a T=4 hs.
Tiempo (hs) Dilucin Vol. de siembra (ml) UFC
5 10
-4
0.2 108
10
-5
0.2 9
7 10
-3
0.1 120
10
-4
0.1 24
9 10
-3
0.2 54
10
-4
0.2 2
20

A. Calcule UFC/ml del cultivo para cada tiempo, en ausencia y presencia
de los antibiticos X e Y.
B. Grafique ln Nv/ml vs tiempo en ausencia y presencia de los
antibiticos.
C. Calcule
mx
. y tg.
D. Puede, en base a los datos de Nv, indicar el efecto de los antibiticos
X e y sobre E. coli? (bacteriosttico, bactericida propiamente dicho o
bacterioltico). En caso negativo, indique qu otros datos necesitara
para determinarlo.

28. Se desea conocer el nmero de unidades formadoras de colonia por mililitro
(UFC/ml), de un cultivo de Escherichia coli LE392. A partir de dicho cultivo se
realizaron tres diluciones consecutivas de 1:100, y una cuarta dilucin de 1:10. se
sembraron con esptula de Drigalski 0,1 ml de la tercera y cuarta dilucin. En la
tercera se contaron 50 colonias y en la cuarta 3 colonias.
a- Cul de las dos diluciones se usa para calcular el nmero de UFC/ml?
J ustifique.
b- Calcule en nmero de UFC/ml del cultivo original.
c- Qu significado tiene el trmino UFC/ml?
d- Este mtodo de cuantificacin de microorganismos determina:
I. nmero total de microorganismos.
II. nmero de microorganismos viables.
III. nmero de microorganismos muertos.
IV. todo lo anterior es cierto.
V. nada de lo anterior es cierto.

29. El Fe(III) es un importante agente oxidante de compuestos orgnicos naturales
ubicados en las superficies y sedimentos acuticos. En estas transformaciones
participan microorganismos. Uno de ellos es Alteromonas putrefaciens y fue
sometido a los siguientes experimentos:

a- A. putrefaciens fue cultivada en el siguiente medio de cultivo (en g/l):
NaHCO
3
2,5 L-glutamina 0,02
KCl 0,1 DL-serina 0,04
NH
4
Cl 0,1 L-arginina 0,02
NaH
2
PO
4
.H
2
O 0,6

El Fe(III) fue provisto bajo la forma de citrato frrico 50 mM o bien como xido
frrico amorfo 200mM. Los distintos compuestos orgnicos fueron adicionados segn
se indica en cada caso. Condiciones de crecimiento: anaerobiosis.
El crecimiento de A. putrefaciens en el medio indicado suplementado con lactato
y citrato frrico muestra el comportamiento de la Figura 1 siguiente:








FIGURA 1
40
60
80
100
I
I
)

/

L
a
c
t
a
t
o

o

A
c
e
t
a
t
o

(
m
M
)
8
12
16
20
u
l
a
s

v
i
a
b
l
e
s

(
x
1
0
7
/
m
l
)
21












La estequiometra del proceso es:

Lactato + 2 H
2
O + 4 Fe
3+
------------ Acetato + HCO
3
-
+ 5 H
+
+ 4 Fe
2+


Si en lugar de suplementar con lactato y citrato frrico se suplementa con lactato
y MnO
2
se obtiene el siguiente comportamiento: (Figura 2)

Lactato + H
+
+ HCO
3
-
+ 2 MnO
2
-------- Acetato + 2 H
2
O + 2 MnCO
3
















Si el medio es suplementado con glucosa y citrato frrico (o MnO
2
) se obtienen
los siguientes resultados: (Figura 3)












En base a estos resultados descriptos conteste justificando en cada caso:
FIGURA 3
0
1
2
3
4
5
0 3 6 9
Tiempo (das)
G
l
u
c
o
s
a

(
m
M
)
0
5
10
15
20
25
F
e
(
I
I
I
)

o

M
n
O
2

(
m
M
)
Glucosa D.O. (600 nm) Fe(III) o MnO2
FIGURA 2
0
1
2
3
4
5
0 3 6 9 12 15 18
Tiempo (das)
F
e
(
I
I
)

/

L
a
c
t
a
t
o

o

A
c
e
t
a
t
o

(
m
M
)
0
5
10
15
20
25
M
n
(
I
I
)

(
m
M
)
Lactato Acetato Mn(II)
22

1- Cmo clasifica el medio de cultivo utilizado en base a su composicin
qumica?
2- Cul es la funcin del lactato en estos experimentos? Qu representa el
acetato?
3- Cmo clasifica a este microorganismo en base a su fuente de energa?:
i. Quimioauttrofo
ii. Quimioorgantrofo
iii. Quimiohetertrofo
iv. Quimiolittrofo
v. Fottrofo
vi. Alguna combinacin
vii. Ninguna combinacin
J ustificar
4- Por qu se obtiene an desarrollo al reemplazar el citrato frrico por MnO
2
?
Cul es la funcin de los mismos?
5- Cmo explica la falta de crecimiento en presencia de glucosa y citrato frrico?
6- Desde el punto de vista energtico A. putrefaciens desarrolla un proceso de:
i. Fermentacin
ii. Respiracin aerobia
iii. Respiracin anaerobia
iv. Fotosntesis
v. Fotosntesis anaerobia
vi. Alguna combinacin, cul?
J ustificar

30. En los ltimos aos se ha tomado conciencia de la importancia de los compuestos
orgnicos sulfurados voltiles en el reciclaje de azufre en la atmsfera. Uno de
tales compuestos es el dimetildisulfuro (DMDS) que es producido en grandes
cantidades en ambientes acuticos.
Estos sulfuros metilados son, en parte, absorbidos por el suelo y metabolizados
por ciertos grupos bacterianos como Thiobacillus. En una de tales investigaciones
se trabaj con una cepa de Thiobacillus thioparus que fue cultivada en el siguiente
medio (Medio A, en g/l):

KH
2
PO
4
2
K
2
HPO
4
2
NH
4
Cl 0,4
MgCl
2
.6H
2
O 0,2

El Medio A fue suplementado con 3 ml de solucin de vitaminas y 1 ml de
solucin de trazas metlicas, pH=7. Condiciones de crecimiento: 30C en
aerobiosis. El DMDS fue adicionado en todos los casos al medio en las
concentraciones que se indican en cada oportunidad.

a- Cmo clasificara al medio de cultivo en base a su composicin? J ustificar.

Se midi el crecimiento de T. Thioparus en el medio A con distintas
concentraciones de DMDS obtenindose las curvas de la Figura 1.

23

En otro experimento utilizando el medio A con DMDS 2 mM se midieron los
parmetros indicados en la Figura 2.

b- Cmo interpreta ambas figuras?


















Estudios ms complejos permitieron llegar a una ecuacin general de utilizacin
de DMDS por esta bacteria:

(CH
3
)
2
S
2
+ 6,5 O
2
------------ 2 CO
2
+ 2 H
2
SO
4
+ H
2
O

El metabolismo del DMDS es el siguiente:

FIGURA 1
0
0.2
0.4
0 20 40 60 80
Tiempo (hs)
A
b
s
DMDS (0,5 mM) DMDS (5 mM)
FIGURA 2
0
0.1
0.2
0 20 40 60 80
Tiempo (hs)
A
b
s
0
0.5
1
1.5
2
D
M
D
S

o

S
O
4
2
-

(
m
M
)
Abs DMDS (mM) SO42- (mM)
(CH ) S
3 2 2
2 CH SH
3
NADH +H
+
NAD
+
2 HCHO
2 O
2
2 H O
2
2 H S
2
2 H O
2 2
2 H O +O
2 2
(CATALASA)
2 HCOOH
2 H O
2
2 NAD
+
2 NADH +H
+
2 CO
2
2 NAD
+
2 NADH +H
+
[S O
2 3
=
]
[S O
4 6
=
]
H S
4 2
O
8 H O
2
16 H
+
24


c- De acuerdo a la fuente de energa utilizada por T. Thioparus, Ud. clasificara a
esta bacteria como:
i. Quimiolittrofa
ii. Quimioauttrofa
iii. Quimioorgantrofa
iv. Quimiohetertrofa
v. Todos los anteriores
vi. Ninguno de los anteriores
vii. Alguna combinacin, cul?
Tache las respuestas incorrectas y justifique su respuesta.

Si a un cultivo de T. Thioparus en crecimiento exponencial en presencia de
DMDS se le adiciona un inhibidor de la actividad de catalasa se observa una
disminucin abrupta del crecimiento de la bacteria. Esto no sucede si el DMDS es
reemplazado por tiosulfato de sodio.

d- Cmo explica estos resultados? (Utilice como ayuda el diagrama del
metabolismo general del DMDS)



31. En el curso de la bsqueda de nuevos antibiticos producidos por
microorganismos se detect que una cepa de Bacillus subtilis produce un
novedoso antibitico macrocclico llamado Dificidina. A los efectos de
caracterizar este compuesto se realizaron los siguientes experimentos:

a- Una cepa de E.coli fue cultivada en medio sinttico hasta D.O. 0,1. En ese
momento se fraccion el cultivo en 4 partes, y a los 60 minutos a cada fraccin
se le adicion un compuesto diferente (Fig. 1).

b- Clulas de E. coli fueron cultivadas en medio M9 hasta fase logartmica y en
ese momento se adicion Dificidina. Se tomaron alcuotas del cultivo desde el
agragado del antibitico, con el objeto de detectar la viabilidad celular (Fig. 2).

FIGURA 1 FIGURA 2

100 50 150 200
0,4
0,8
0,2
0,6
Abs (590nm)
Control sin droga
Cl oranfenicol
Di fici di na
Penicilina
Tiempo (min)
Agregado
de droga
100 50 150 200
10
20
5
15
ln N Clulas
Control sin droga
100g Difi cidi na
200g Difi cidi na
Tiempo (min)
Agregado
de droga
25



En base a estos dos experimentos, qu conclusiones extrae sobre el efecto de
Dificidina sobre el crecimiento de E. coli? Fundamente su respuesta.

A continuacin es realizada una serie de experimentos para determinar el proceso
metablico primario inhibido por Dificidina (ejemplo: sntesis de murena, de
protenas, de ARN, de ADN). En todos los casos E. coli se cultiv en medio M9
en presencia de algn precursor radioactivo como se indica en cada caso, y se
determin la radioactividad (cpm) incorporada por las clulas (Figuras 3-6).

Figura 3 Figura 4



Figura 5 Figura 6


1) sin agregado 5)Estreptomicina
2) Dificidina 6)Rifampicina
3) Ac. Nalidxico 7)Cloranfenicol
4) Cicloserina

CPM
Tiempo
Incorporaci n de
[ H] Timidi na
3
3
2
6
1
CPM
Tiempo
Incorporacin de
[ H] Aminocidos
3
2 y 5
1
4
CPM
Tiempo
Incorporacin de
[ H] Uracilo
3
6
1
7
2
CPM
Tiempo
Incorporacin de
[ H] DAP
3
4
2
3
1
5
26

Qu conclusin extrae de estos ltimos experimentos acerca del o de los posibles
blancos de accin de la Dificidina? Explique su respuesta.

32. Usted desea determinar el tipo de metabolismo fermentativo de una determinada
bacteria. Para ello procede a realizar un cultivo lquido en aerobiosis, y en un
momento determinado separa tres alcuotas iguales, a las que agrega por separado
glucosa marcada en el C1, C2, C3 o C4, respectivamente. En funcin del tiempo
mide la radiactividad remanente en el medio de cultivo, encontrando que al cabo
de 5 min se ha perdido casi la totalidad de la misma solamente en el tubo
conteniendo glucosa marcada en el C1. Qu tipo de fermentacin realiza la
bacteria? Fundamente su respuesta explicando cmo clasificara adems a la
misma en base a su relacin con el oxgeno.