37

1. PROBLEMA
1.1 TITULO
PROTOCOLO DE PROPAGACIN IN VITRO DE Anguloa clowesii Lindl.
1.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Las orqudeas son plantas de crecimiento lento; los mecanismos de polinizacin no son
siempre efectivos y adems el pequeo tamao de las semillas y sus limitadas reservas
alimenticias hacen improbable su supervivencia in vivo, por lo que se hace necesario que
establezcan asociaciones simbiticas, principalmente con micorrizas para lograr su
germinacin. De sta forma se limita la propagacin sexual de la planta y la variacin
gentica que en ellas se puede presentar en condiciones naturales; adicionalmente algunas
especies de orqudeas (entre las que se incluye A. clowesii) estn siendo consideradas
como plantas nativas amenazadas debido a la recoleccin masiva a la destruccin o
degradacin de sus hbitats.
Es por ello que la Biotecnologa juega un papel importante en el desarrollo y adaptacin de
tcnicas de propagacin de cultivos in vitro que permitan la preservacin y propagacin de
especies de orqudeas nativas en vas de extincin, siendo necesaria la investigacin
permanente con el fin de generar protocolos de propagacin in vitro; labor que se ha
llevado a cabo en el laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del Jardn Botnico Jos
Celestino Mutis.
1.3 FORMULACIN DEL PROBLEMA
Cules son las condiciones ptimas in vitro para la propagacin in vitro de A. clowesii?
1.4 OBJETIVOS
1.4.1 Generales
Estructurar el protocolo de propagacin para la especie Anguloa clowesii, que incluya los
procedimientos de seleccin, desinfeccin, establecimiento, propagacin, enraizamiento in
vitro y adaptacin ex vitro.
1.4.2 Especficos
Determinar el medio de cultivo ptimo para las etapas de propagacin y enraizamiento in
vitro de Anguloa clowesii.


38

Realizar el proceso endurecimiento del material vegetal perteneciente a Anguloa clowesii,
teniendo en cuenta sustratos y condiciones ambientales necesarias.
1.5 JUSTIFICACIN
La importancia del presente trabajo de investigacin radica en la necesidad de implementar
una tcnica de propagacin in vitro que permita la regeneracin y / o multiplicacin masiva
de plntulas de A. clowesii a partir de la germinacin asimbitica de sus semillas, especie
que es considerada como prioritaria y que a su vez se constituye como un compromiso
establecido entre el Jardn Botnico Jos Celestino Mutis y la Red de Jardines de Botnicos,
metodologa de propagacin que contribuira a la recuperacin de sta especie vegetal.
1.6 ALCANCES Y LIMITACIONES
1.6.1 Alcances
Se pretende mediante el presente trabajo realizar estudios y ensayos aplicando tcnicas de
cultivo in vitro en tejidos vegetales que contribuyan al establecimiento de una tecnologa
adecuada para A. clowesii.
1.6.2 Limitaciones
Para el trabajo especfico de propagacin de A. clowesii no se cuenta con material
bibliogrfico e investigativo relacionado directamente con la especie, por tal razn se
tendrn como antecedentes trabajos de propagacin in vitro realizados para otras
especies de orqudeas.
1.7 HIPTESIS
La propagacin in vitro de A. clowesii es favorecida por la adicin de fitohormonas (BAP -
AIB) como sustancias reguladoras de su crecimiento y desarrollo.


39

2. MARCO TERICO
2.1 ANTECEDENTES
En nuestro pas la Biotecnologa es una ciencia reciente y aunque han sido muchos los
avances que se han hecho con algunas plantas como bananos, tubrculos, ornamentales,
etc., con orqudeas se ha trabajado poco en comparacin con otros cultivos y sigue siendo
el cultivo de semillas la principal va de regeneracin de plantas.
A continuacin se describirn los trabajos de investigacin que se han utilizados como
referencia para la elaboracin del presente trabajo de investigacin:

ALARCN, Carlos.1982. Estudios de medios de cultivo simbiticos y asimbiticos para la
propagacin sexual de orqudeas nativas de la sabana de Bogot. Bogot. Universidad
Nacional. Facultad de Agronoma.
Resumen. Se compar la germinacin asimbitica y simbitica de tres especies de
orqudeas nativas de la sabana de Bogot: Epidendrum ibaguense, Epidendrum Vespa y
Pleurotallis pulchella. Igualmente se estudiaron los mtodos de aislamiento de las micorrizas
especficas y las tcnicas de cultivo simbitico de las tres especies mencionadas
anteriormente. Cinco medios de cultivo fueron empleados en el cultivo asimbitico: de
banano, Burgeff Eg 1, Knudson C, M&S y N3F. E. ibaguense y E. Vespa germinaron y se
desarrollaron preferiblemente en el medio banano en condiciones asimbiticas. P. pulchella
por el contrario nicamente germin en el medio N3F. Se aislaron dos hongos micorrzicos
de las races que no haban sido reportados: Chaetomiun sp. que indujo germinacin
simbitica de E. Vespa y P. pulchella.
GONZALEZ, Claudia. 2000. Estudios preliminares sobre el efecto de las poliaminas,
putrescina y espermidina en la micro propagacin de Stanhopea wardii (ORCHIDACEAE).
Bogot. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Dpto. de Biologa.
Resumen. Stanhopea wardii es una de las muchas especies de orqudeas que se encuentra
en va de extincin y para la cual no se ha descrito un protocolo de micropropagacin. En
esta investigacin se evalo el efecto de las poliaminas putrescina y espermidina como
reguladores del crecimiento en el desarrollo de una tcnica de propagacin masiva.
Secciones foliares y pices radicales, de plantas mantenidas en invernadero, fueron
utilizados como fuente de explantes vegetativos. Igualmente se evalu el efecto de estas
poliaminas en la germinacin asimbitica de semillas obtenidas por auto polinizacin. Se
disearon tratamientos con diferentes concentraciones y combinaciones de poliaminas.
Con la aplicacin de (Put 500M) (Spd 1000M) y (Put 1000M - Spd 1000M) se
observaron respuestas de crecimiento, evidenciado por cambios en elongacin (longitud) y
dimetro de los pices radicales, fase preliminar para la induccin de embriones somticos a
partir de estos explantes, La germinacin asimbitica de las semillas de Stanhopea wardii se
vi favorecida con la adicin de poliaminas, aumentando el porcentaje de germinacin y
disminuyendo el tiempo de emergencia y posterior elongacin de las plntulas. Los
resultados obtenidos en esta investigacin constituyen un avance en el establecimiento de
un protocolo de micropropagacin.


40

OROZCO, Gilma. 1990. Germinacin asimbitica in vitro en semillas de dos especies de
orqudeas (Epidendrum vespa Vell y Catleya trianae Recho). Bogot. Universidad Nacional.
Facultad de Ciencias. Dpto. de Biologa.
Resumen. En esta investigacin se evalo el efecto de las Auxinas (ANA y AIA) y Cito-
quininas (KIN y BAP) como reguladores del crecimiento en el desarrollo de una tcnica de
propagacin masiva a partir del cultivo in vitro de semillas de dos especies de Orqudeas
Epidendrum vespa Vell y Catleya trianae Recho. Las cpsulas fueron llevadas al laboratorio
y las semillas cultivadas bajo completa esterilidad usando el medio M&S (1962) con fuentes
de nitrgeno modificadas a la mitad y adicin de hormonas (Auxinas y Citoquininas) a
diferentes concentraciones para la etapa de establecimiento. Para la etapa de enraizamiento
se utiliz el medio M&S con adicin nicamente de Auxinas a diferentes concentraciones.
Las condiciones ambientales manejadas en las etapas de establecimiento y enraizamiento
fueron 21 C da, 18 C noche, con un fotoperiodo 16 horas luz. Los mejores tratamientos
para la germinacin de las semillas y posterior enraizamiento en el caso de Catleya trianae
Recho fueron ANA (3 ppm) KIN (1 ppm) y AIA (5 ppm), respectivamente. Las semillas de
Epidendrum vespa Vell tuvieron mejor resultado en su proceso de germinacin en el medio
suplementado slo con ANA (5 ppm) y el tratamiento para el enraizamiento con AIA (5
ppm) result ser tambin el de mejores resultados.
PACHECO, R. A. 2001. Cultivo de tejidos vegetales aplicable a la conservacin de
orqudeas. Bogot. Jardn botnico de Bogot Jos Celestino Mutis.
Resumen. La investigacin desarrollada en procesos de germinacin asimbitica y
propagacin de diferentes especies de orqudeas se basa en el empleo del medio Knudson
C para germinacin y el medio Knudson C para crecimiento, respectivamente. No se registra
el empleo de fitorreguladores en ninguno de los medios de cultivo. El material de partida ha
sido explantes sexuales (semillas) provenientes de cpsulas en diferente grado de madurez,
tanto dehiscentes como no dehiscentes. La siembra de semillas de cpsulas no dehiscentes
se realiza directamente en el medio de cultivo, con una previa desinfeccin superficial con
hipoclorito de sodio de las paredes de la cpsula. Las semillas provenientes de cpsulas
abiertas se someten a una desinfeccin directa mediante el proceso de centrifugado,
empleando tambin el hipoclorito de sodio como el agente desinfectante.
PELAEZ, Juan Manuel. 2002. Embriognesis somtica en Epidendrum ruizianum. Bogot.
Universidad Nacional. Facultad de Ciencias. Dpto. de Biologa.
Resumen. En ste trabajo se encontr una va de propagacin en masa a travs de la
Embriognesis Somtica. Se eligi la especie Epidendrum ruizianum por ser nica en la
zona andina. Las Cpsulas de sta orqudea fueron llevadas al laboratorio y sus semillas
cultivadas bajo completa esterilidad, usando el medio M&S para la germinacin y desarrollo
de las semillas. Las plntulas obtenidas despus de 9 meses de cultivo fueron subcultivadas
en el M&S suplementado con agar 8 g / lt, 2-4 D 0-1-2-3 mg / lt y thidiazuron (TDZ) 0-1-2-3
mg / lt solo y en combinaciones con un pH de 5.8 a 27 C en completa oscuridad durante
10 semanas. Una vez fueron observadas estructuras globulares los explantes se sembraron
en frascos con el medio M&S, con 8 gr / lt de agar agar y carente de reguladores de
crecimiento, ajustando a un pH de 5.8 a 27 C bajo fotoperiodo 16 horas luz durante 16
semanas, para la maduracin y germinacin de los embriones. En ste trabajo se encontr
que la Embriognesis Somtica es la principal va de regeneracin de plantas, obteniendo
150 a 200 plntulas por frasco.


41

PREZ, Belkys A. 2005. Germinacin in vitro de Masdevallia ignea Rchb.f
(ORCHIDACEAE) a partir del cultivo de semillas provenientes de diferentes tipos de
polinizacin. San Jos de Ccuta. Universidad Francisco de Paula Santander Jardn
Botnico Jos Celestino Mutis. Facultad de Ciencias Agrarias y del Ambiente.
Resumen. En sta investigacin se evalu el efecto de los medios M&S modificado y
Knudson C, y del GA3 como regulador del crecimiento en la germinacin asimbitica de las
semillas de Masdevallia gnea Rchb.f provenientes de tres tipos de polinizacin: auto
polinizacin, geitonogamia y polinizacin cruzada. Se observaron respuestas de crecimiento
evidenciado por la formacin de protocormos, con lo cual se determin que el tratamiento
conformado por semillas provenientes de autopolinizacin, sembradas en un medio
Knudson C suplementado con GA3 1 ppm fue el ms adecuado para la germinacin
asimbitica.
PREZ, Belkys A. 2005. Propagacin mediante la tcnica de cultivo de tejidos vegetales in
vitro de especies nativas pertenecientes a la familia Orchidaceae que viene propagando la
Subdireccin Cientfica. Informe tcnico indito. Jardn Botnico Jos Celestino Mutis -
Subdireccin Cientfica. Bogot.
Resumen. En la fase de propagacin se pudo determinar la influencia favorable de los
fitorreguladores BAP (2 ppm) y ANA (0.5 ppm) en la elongacin apical y formacin de
nuevas hojas y brotes en las especies evaluadas (Epidendrum chioneum, Cattleya trianae,
Epidendrum elongatum, Odontoglossum lindenii, Oncidium orgyale y Catasetum sp,). En
Anacheilium vespa, Lycaste fulvescens, Epidendrum nocturnum, Odontoglossum crispum y
Miltoniopsis sp. el medio de cultivo sin suplemento de fitorreguladores, provoc una mayor
proliferacin de callos y protocormos y la formacin de brotes (pequeas plntulas) en ellos
en comparacin con el medio suplementado con Citoquininas y Auxina (BAP: 2 ppm y ANA:
0.5 ppm). En el proceso de enraizamiento de Odontoglossum lindenii los mayores
porcentajes de enraizamiento se observaron en un medio M&S al 50%, sin la adicin de
fitorreguladores inductores de rizognesis. Para Comparettia macroplectron, se observ que
la formacin de races estuvo estimulada por la accin de los nutrientes presentes en el
medio Knudson C germinacin, sin fitorreguladores y fuente de Nitrgeno reducida en un
25%.
El sustrato ms apropiado para la adaptacin ex vitro de las especies en estudio
(Odontoglossum lindenii, Epidendrum elongatum y Epidendrum chioneum) fue el
conformado por Tierra abonada 50%, escoria fina 20%, corteza de pino ptula fina 20% e
icopor en pequeos pedazos 10%, En algunas especies (Odontoglossum Crispum,
Comparettia macroplectron y Cattleya trianae) el proceso de adaptacin fue favorable no
observndose diferencias en cuanto a la utilizacin del anterior sustrato y el siguiente
tambin evaluado conformado por Escoria gruesa 30%; corteza de pino ptula 50% e icopor
20%.

Para Anguloa clowesii se estableci un tratamiento de desinfeccin para puntas radiculares
y secciones foliares de empleando como agente desinfectante el cido hipocloroso a una
concentracin del 0.5% con inmersin del explante durante 10 minutos. La efectividad de
este tratamiento permiti establecer cultivos con bajos niveles de contaminacin.
PREZ, Belkys A. 2006. Propagacin masiva, a travs de la tcnica de cultivo in vitro de
tejidos vegetales, de especies de las colecciones especializadas, con nfasis en orqudeas y
desarrollo del protocolo de propagacin de la especie Anguloa clowesii. Informe tcnico
indito. Jardn Botnico Jos Celestino Mutis - Subdireccin Cientfica. Bogot.


42

Resumen. El presente trabajo de investigacin consisti en la ejecucin de dos etapas de
trabajo: 1)La accesin de diferentes especies de orqudeas a travs de la recoleccin de
cpsulas en las instalaciones del Jardn Botnico y en las salidas de campo realizadas, con
el objeto de llevar a cabo un estudio preliminar de germinacin asimbitica in vitro de
semillas y 2) La seleccin de grupos de especies de acuerdo a la cantidad y al estado de
crecimiento del material vegetal de la familia Orchidaceae para poder llevar a cabo labores
de rescate, propagacin, enraizamiento in vitro y adaptacin ex vitro.
Adems se realiz la etapa de establecimiento de semillas de Anguloa clowesii Lindl en la
que se determin para cpsulas dehiscentes y no dehiscentes un tratamiento de
desinfeccin que permiti disponer de cultivos con bajos niveles de contaminacin y el
medio de cultivo ptimo (medio P748, BAP: 2 ppm y AIB: 1 ppm) con el que se alcanz
altos porcentajes de germinacin. La aplicacin de Citoquininas y de auxinas (en menor
proporcin), como reguladores del crecimiento, influy de manera positiva en la formacin
de los protocormos, ya que se aument el porcentaje de semillas germinadas,
disminuyendo considerablemente el tiempo de germinacin, siempre y cuando se tuviera
como base el medio P748.
2.2 BASES TERICAS
2.2.1 GNERO ANGULOA
ste gnero fue nombrado por los botnicos espaoles Hiplito Ruiz y Jos Antonio Pavn
en honor de Don Francisco de Angulo, estudioso de la flora del Per y Director General de
Minas a finales del siglo XVII. Es un gnero con unas 11 especies de orqudeas epfitas
simpodiales, de la subfamilia Epidendrodeae, de la tribu Maxillariae. Se encuentra distribuido
en la regin Andina de Colombia, Venezuela, Ecuador, Per y Bolivia, con el centro de
dispersin en Colombia en donde se presentan el mayor nmero de especies en clima
medio o moderadamente fro. La flor se parece al tulipn, de ah su nombre comn de
Orqudea tulipn. El nombre de Cuna de Venus es por el labelo articulado que se "mece" en
el centro de la flor, como un beb en su cuna. (Escobar, 1990).
Descripcin. Son plantas de hbitos terrestres, y a veces epfitas con pseudobulbos
grandes mayores de 20 cm. ovoideos hasta ovoideos cnicos, cubiertos de vainas
alternas. Los pseudobulbos pierden sus hojas cada ao (siendo estas hojas delgadas y
alcanzando hasta un metro de longitud), entrando as la planta en un estado de reposo.
Cuando renuevan su crecimiento, tambin aparecen las flores (brotando de los
pseudobulbos), as como los nuevos brotes (Escobar, 1990).
Las hojas son grandes, lanceoladas y picudas y en una planta de desarrollo pleno pueden
alcanzar ms de 1 m de longitud. Las flores son nicas y nacen de las base de los
seudobulbos. Las flores son globosas, grandes y vistosas. La floracin dura un mes.
De la base de cada pseudobulbo se desarrollan de 2 a 4 hojas. Las hojas son caducas y se
mudan al inicio de cada nuevo desarrollo. Los spalos tienen forma bulbosa (asemejando
un tulipn), son cncavos y los ptalos son semejantes a los spalos, aunque un poco ms
pequeos. El labelo es trilobulado con el lbulo central ms pequeo que los laterales,
articulado al pie de la columna y muy mvil. La columna es gruesa con un pie prominente en
la base. (Escobar, 1990). Se presentan 4 polinios, aplanados, con un estpite linear. Las


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flores tienen una fuerte fragancia a cinamomo. El polinizador natural de este gnero es una
gran abeja macho (euglossine) que al salir de la flor entre el labio y la columna arrastra
consigo el polen.
2.2.2 Anguloa Clowesii Lindl.
Posee flores bastante grandes, de color amarillo intenso, muy fragantes. Fue descubierta
por J. Linden cerca del nevado del Tolima, pero para despistar a otros colectores la registr
como de la Sierra Nevada de Santa Marta (Figura 14). Se encuentra en Colombia y
Venezuela (Escobar, 1990). La clasificacin taxonmica se encuentra en la tabla 12.
Figura 14. Planta de A. clowesii Lindl
Tabla 12. Clasificacin cientfica de A. clowesii Lindl
Gnero Anguloa
Ruiz y Pavn 1794
Reino: Plantae
Divisin: Magnoliophyta
Clase: Liliopsida
Orden: Asparagales
Familia: Orchidaceae
Subfamilia: Epidendroideae
Tribu: Maxillarieae
Subtribu: Lycastinae
Gnero: Anguloa
Ruiz y Pavn 1794.
Especie: Anguloa clowesii
Fuente. http://es.wikipedia.org/wiki/Orchidaceae


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3. METODOLOGA
El presente trabajo de investigacin, se llev a cabo en el laboratorio de Cultivo de Tejidos
Vegetales de la Subdireccin Cientfica del Jardn Botnico Jos Celestino Mutis.

3.1 VARIABLES
Variables Independientes:
Medios de Cultivo: Knuson C, P723 y P748
Regulador de crecimiento: BAP y AIB a 0, 1 y 2 ppm
Sustratos: Corteza de pino ptula, icopor, tierra abonada, carbn vegetal
Variables dependientes:
Contaminacin: Definida por el porcentaje de contaminacin (presencia de hongos
y/o bacterias) obtenido en cada tratamiento evaluado.
Oxidacin: Determinada por el porcentaje de explantes que presentaron
oscurecimiento total.
Tiempo de germinacin: Definido como la duracin en das a partir del momento de
siembra que tardan en germinar las semillas.
Germinacin: Determinada por el porcentaje de semillas que formaron protocormos.
Longitud apical: Definida por el crecimiento en longitud (cm) de las plantas formadas.
Nmero de hojas: Determinado por la formacin de nuevas hojas en la fase de
propagacin.
Incremento del desarrollo y crecimiento: Definido por el porcentaje de incremento del
desarrollo y crecimiento relacionado con la diferencia de la longitud apical (mm) y nmero de
hojas durante el tiempo de evaluacin.
Formacin radicular: referida al nmero y longitud (cm) de races desarrolladas en
plantas que superaron la fase de propagacin.
Longitud apical ex vitro: Definida por el crecimiento en longitud (cm) de las plantas en
proceso de adaptacin.

La evaluacin de las variables se realiz cada ocho das despus de la siembra llenando
adecuadamente los formatos diseados para tal fin. Los tiempos de evaluacin dependen de
la fase desarrollada. La evaluacin estadstica de los resultados obtenidos se llev a cabo
mediante un anlisis de varianza (ANOVA) con el programa estadstico denominado Statistix
7.0. Posteriormente, se aplicaron las pruebas de amplitud de medias por el procedimiento
de LSD.



45

3.2 ETAPAS DE PROPAGACIN
La presente investigacin est basada en un diseo experimental completamente al azar,
ya que se cont con material vegetal homogneo de la especie en estudio.
El esquema general de trabajo realizado se resume a continuacin, teniendo en cuenta que
la fase de establecimiento (desinfeccin y germinacin) de semillas fue desarrollada y
evaluada por Prez-M, 2006 (contrato 267):
Revisin bibliogrfica.
Planteamiento de la investigacin.
Preparar soluciones stock y medios de cultivo para las etapas de propagacin y
enraizamiento in vitro.
Realizar el subcultivo del material vegetal disponible (plantas).
Llevar a cabo el endurecimiento de las plantas con previa formacin de races.
Registrar datos segn diseo experimental.
Interpretacin estadstica de cada uno de los tratamientos.
Disear el protocolo de propagacin especificando los procedimientos de
establecimiento, propagacin, enraizamiento in vitro y adaptacin ex vitro.
3.2.1 Etapa 1. Establecimiento in vitro del material vegetal (semillas) ). . Para sta fase
cabe destacar nuevamente que fue desarrollada por Prez-M, 2006 (contrato 267), por lo
que lo presentado a continuacin (en metodologa, resultados y conclusiones) constituye un
resumen de lo reportado en el informe tcnico de dicho contrato.
Para la desinfeccin se emple hipoclorito de sodio como principal agente desinfectante.
Las cpsulas no dehiscentes fueron sometidas al tratamiento de desinfeccin superficial
descrito en la figura 15.
Figura 15. Esquema de desinfeccin de cpsulas no dehiscentes (superficial)














C C P PS SU UL LA A D DE E O OR RQ QU UI ID DE EA A
2 2 m mi in n. .
1 1. . L LA AV VA AD DO O C CO ON N A AG GU UA A
D DE ES ST TI IL LA AD DA A
2 2. . I IN NM ME ER RS SI I N N E EN N S SL LN N
J JA AB BO ON NO OS SA A

3 3. . L LA AV VA AD DO O C CO ON N A AG GU UA A
D DE ES ST TI IL LA AD DA A


46

EN CABINA




















Para la siembra en cabina se realizaron cortes en los extremos de la cpsula (parte distal),
y en la seccin central o basal. Estos cortes permitieron abrir la cpsula y tomar las semillas
para luego ser sembradas directamente en los medios de cultivo a ensayar que fueron en
total once tratamientos descritos a continuacin:
T0: Medio Knudson C
T1: Medio Knudson C, BAP (1 ppm) y AIB (1 ppm)
T2: Medio Knudson C, BAP (2 ppm) y AIB (1 ppm)
T3: Medio Knudson C, BAP (1 ppm) y AIB (2 ppm)
T4: Medio Knudson C, BAP (2 ppm) y AIB (2 ppm)
T5:P748
T6:P723
T7: Medio P748, BAP (1 ppm) y AIB (1 ppm)
T8: Medio P748, BAP (2 ppm) y AIB (1 ppm)
T9: Medio P748, BAP (1 ppm) y AIB (2 ppm)
T10: Medio P748, BAP (2 ppm) y AIB (2 ppm)
Se sembraron tres repeticiones por tratamiento, para un total de 33 frascos evaluados
durante tres meses, los cuales fueron trasladados a la sala de incubacin donde se manejan
las siguientes condiciones ambientales: Luz, intensidad lumnica entre 1500 y 5000 lux,
picos que se logran manejar dependiendo de la ubicacin dentro de la estantera en sentido
vertical; temperatura, ntre 19 y 27 C como picos mnimos y mximos; humedad, entre el
60 y 80 % y fotoperiodo natural 12 horas luz y 12 horas oscuridad. Se tuvo en cuenta
manejar una intensidad lumnica homognea, ubicando los frascos sembrados con semillas
en las secciones de intermedia intensidad lumnica.
La composicin de los medios Knudson C (germinacin), P723 y P748 se encuentra descrita
en las tablas 13, 14 y 15, respectivamente.
Repetir ste paso hasta que la
superficie de la cpsula se
encuentre totalmente limpia.
7 7. . E EX XT TR RA AC CC CI I N N Y Y S SI IE EM MB BR RA A D DE E
S SE EM MI IL LL LA AS S
5. SUMERGIR LA CPSULA EN
AGUA ESTRIL, DURANTE 50
SEGUNDOS, EN CONSTANTE
AGITACIN
4. LIMPIEZA LA SUPERFICIE DE
LA CPSULA CON UN ALGODN
ESTRIL HUMEDECIDO CON
HIPOCLORITO DE SODIO (13 %)

6 6. . F FL LA AM ME EO O D DE E L LA A C C P PS SU UL LA A C CO ON N
A AL LC CO OH HO OL L A AL L 7 70 0% %


47

Tabla 13. Medio bsico Knudson C (1946)
FRMULA
NOMBRE
CONCENTRACION
en mg/l
(NH4) 2 SO4 Sulfato de Amonio 500
Ca(NO3)2.4H2O Nitrato de Calcio 500
FeSO4.7H2O Sulfato Ferroso 25
MgSO4.7H2O Sulfato de Magnesio
250
MnSO4.H2O
Sulfato de Manganeso 5.682
KH2PO4 Fosfato de Potasio 250
ZnSO4.7H2O Sulfato de Zinc
3.31
H3BO3
cido Brico 0.56
CuSO4. Sulfato de Cobre
0.4
MoO3 xido de Molibdato 0.16
C6H12O6 Inositol 100
Fuente. PACHECO, R. A. 2001. Cultivo de tejidos vegetales aplicable a la conservacin de
orqudeas. Jardn botnico de Bogot Jos Celestino Mutis.
Tabla 14. Composicin del medio de cultivo P748 (modificado)
CONCENTRACIN
COMPUESTO
Medio mg/Lt Formula Nombre
825 NH4NO3 Nitrato de amonio
950 KNO3 Nitrato de potasio
90.35 MgSO4.7H2O Sulfato de magnesio
8.45 MnSO4. H2O Sulfato de manganeso
5.3 ZnSO4.4H2O Sulfato de zinc
166 CaCl2.H2O Cloruro de calcio
0.415 KI Yoduro de potasio
0.0125 CoCl2.6H2O Cloruro de cobalto
85 KH2PO4 Fosfato monobasico de
potasio
3.1 H3BO3 Acido brico
0.135 Na2MoO4.2H2O Molibdato de sodio
27.81 FeSO4.7H2O Sulfato ferroso
37.81 Na2 EDTA. 2H2O Acido
etilendiaminotetractico
100 C6H12C6 Inositol
10 C12H17ClN4OS.HCl Tiamina
1 C6H5NO2 Acido Nicotinico
1 C8H11NO3HCl Piridoxina
2000 Carbn activado
5000 Agar
30000 Banano
20000 Sacarosa


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Tabla 15. Composicin del medio de cultivo P723 (modificado)

























Fuente.
http://www.orchidculture.com/PODS/index.html
http://www.cals.cornell.edu/dpt/flori/hort400/orchid/orchid1.html
http://www.orchidsource.com/GBSeedManual.htm
http://www.rbg.kew.org.uk/ksheets/orchid-prop.html
3.2.2 Etapa 2. Propagacin in vitro del material vegetal. Una vez obtenida la
germinacin, las plntulas fueron transferidas a cuatro medios de cultivo, en los que los
medios Knudson C y P748 se constituyen como los factores y las concentraciones de los
fitorreguladores BAP y AIB (0 1 y 2 ppm) como niveles de los factores evaluados:
T1: Knudson C sin fitorreguladores
T2: Knudson C, BAP 2 ppm, AIB 1 ppm
T3: P748 sin fitorreguladores
T4: P748, BAP 2 ppm, AIB 1 ppm
El material evaluado en cuanto a la longitud apical (cm) y nmero de hojas con sus
respectivos % de incremento, correspondi a seis plntulas de A. clowesii por tratamiento
(dos repeticiones por tto, cada una con 3 unidades experimentales), para un total de 24
plntulas evaluadas cada ocho das por un tiempo total de dos meses.
3.2.3 Etapa 3. Enraizamiento in vitro del material vegetal. Las plntulas fueron
transferidas a cuatro medios de cultivo con el fin de evaluar su influencia en la rizognesis.
En ellos los medios Knudson C y P748 se constituyen como los factores y las
concentraciones de los fitorreguladores BAP y AIB (0 0.5 y 2 ppm) como niveles de los
factores evaluados:
Concentracin
COMPUESTO
Medio mg/Lt Formula Nombre
412.5 NH4NO3 Nitrato de amonio
475 KNO3 Nitrato de potasio
75.8 MgSO4.7H2O Sulfato de magnesio
4.23 MnSO4. H2O Sulfato de manganeso
2.65 ZnSO4.4H2O Sulfato de zinc
83 CaCl2.H2O Cloruro de calcio
0.2075 KI Yoduro de potasio
0.0063 CoCl2.6H2O Cloruro de cobalto
42.5 KH2PO4 Fosfato monobasico de
potasio
1.65 H3BO3 Acido brico
0.0625 Na2MoO4.2H2O Molibdato de sodio
27.81 FeSO4.7H2O Sulfato ferroso
37.81 Na2 EDTA. 2H2O Acido
etilendiaminotetractico
100 C6H12C6 Inositol
10 C12H17ClN4OS.HCl Tiamina
1 C6H5NO2 Acido Nicotinico
1 C8H11NO3HCl Piridoxina
1000 Carbn activado
5000 Agar
20000 Sacarosa


49

T1: Knudson C sin fitorreguladores
T2: Knudson C, BAP 0.5 ppm, AIB 2 ppm
T3: P748 sin fitorreguladores
T4: P748, BAP 0.5 ppm, AIB 2 ppm
Se manejaron tres repeticiones por tto, cada una con 4 unidades experimentales, para un
total de 48 plantas. Los registros de las variables nmero y longitud de races (cm) se
realizaron cada ocho das por un tiempo total de dos meses.
Todos los tratamientos (medios de cultivo) fueron suplementados con sacarosa 15 g/l y
agar 5 g/l y sus componentes se pesaron en una balanza analtica de precisin y se
disolvieron en agua microfiltrada. El medio de cultivo fue dispensado en recipientes de vidrio
con una capacidad de 100 ml y a cada recipiente se le adicionaron 20 ml del medio. El pH
del medio fue ajustado a 5.8 antes de esterilizar en autoclave, a 15 libras de presin por
pulgada cuadrada (15lb/in
2
) con una temperatura de vapor aproximada de 121.5 C durante
15 minutos.
Las condiciones ambientales en la sala de incubacin fueron: Luz, intensidad lumnica entre
1500 y 5000 lux, picos que se logran manejar dependiendo de la ubicacin dentro de la
estantera en sentido vertical; temperatura, entre 19 y 27 C como picos mnimos y
mximos; humedad, entre el 60 y 80 % y fotoperiodo natural 12 horas luz y 12 horas
oscuridad (Figura 16).
Figura 16. Sala de incubacin
3.2.4 Etapa 4. Endurecimiento del material vegetal. La metodologa de endurecimiento
empleada en plantas con previa formacin de races se describe a continuacin:
Se removi con pinzas las plantas de los frascos y se lavaron sus races con agua
microfiltrada (teniendo la precaucin de no mojar las hojas) con el fin de eliminar cualquier
residuo de medio de cultivo adherido a ellas.
Las plantas fueron colocadas sobre papel absorbente y se sembraron en materas
previamente lavadas, en las cuales haba los siguientes sustratos previamente
esterilizados en horno a 140 C durante 2 horas:


50

S1: Tierra abonada 40%, carbn vegetal fino 20%, corteza de pino ptula fina 20% e icopor
en medianos pedazos 20%.
S2: Carbn vegetal fino 33,3%, corteza de pino ptula fina 33,3% e icopor en medianos
pedazos 33,3%.
S3: Carbn vegetal grueso 33,3%, corteza de pino ptula gruesa 33,3% e icopor en
medianos pedazos 33,3%.
Se dejaron bien distribuidas las races y un espacio libre de 5 cms entre en sustrato y la
parte superior de la matera con el fin de cubrir con papel plstico transparente
inmediatamente despus de realizar el transplante.
Las plantas fueron mantenidas en unos anaqueles que se han acondicionado en el
Laboratorio (Figura 17), manejando el riego por capilaridad una vez al da tres veces a la
semana.
Figura 17. Anaquel de endurecimiento de material vegetal
Se sembraron por sustrato un total de 16 plantas a la cuales se les realiz seguimiento
durante cinco semanas, evalundose el grado de adaptacin de las plantas relacionado
con la permanencia de la turgencia de la planta y por ende ausencia de marchitez,
necrosamiento de hojas y contaminacin.


51

4. RESULTADOS Y DISCUSIONES
4.1 ETAPA 1. ESTABLECIMIENTO IN VITRO DEL MATERIAL VEGETAL (SEMILLAS)
Para las cpsulas no dehiscentes se pudo establecer que el tratamiento de desinfeccin
superficial empleado fue altamente efectivo al permitir disponer de cultivos con nulos niveles
de contaminacin. Igualmente no se observaron signos de oxidacin en los explantes.
En cuanto a la germinacin se obtuvieron los siguientes resultados basados en la figura 18,
en la prueba de Anova y en la prueba Tukey: Las semillas sembradas en T9 (Medio P748,
BAP: 1 ppm y AIB: 2 ppm) iniciaron sus procesos germinativos con los mayores porcentajes
en el primer mes de evaluacin, sin embargo en el T8 (Medio P748, BAP: 2 ppm y AIB: 1
ppm) se alcanz una germinacin del 100% en el segundo mes despus de la siembra,
porcentaje tambin alcanzado por el T5 (P748 ) en el tercer mes de evaluacin. Por lo tanto
se consolidada el T8 como el mejor tratamiento, vindose reflejada la influencia positiva de
mayores concentraciones de BAP en relacin con AIB en los procesos germinativos de las
semillas teniendo como base el medio P748.
Figura 18. Germinacin de A. clowesii en tres meses de evaluacin
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3
Mes despus de siembra
%

d
e

g
e
r
m
i
n
a
c
i

n
T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6
T7 T8 T9 T10

T TT TO O R RE EP P % % d de e g ge er rm mi in na ac ci i n n
M Me es s 1 1 M Me es s 2 2 M Me es s 3 3
T T0 0 1 1 0 0 0 0 0 0
T T0 0 2 2 0 0 0 0 0 0
T T0 0 3 3 0 0 0 0 0 0
T T1 1 1 1 0 0 6 6 1 13 3
T T1 1 2 2 0 0 9 9 1 15 5
T T1 1 3 3 0 0 5 5 1 13 3
T T2 2 1 1 0 0 2 29 9 5 56 6
T T2 2 2 2 0 0 3 36 6 6 64 4
T T2 2 3 3 0 0 3 31 1 5 59 9
T T3 3 1 1 0 0 0 0 5 5
T T3 3 2 2 0 0 0 0 7 7
T T3 3 3 3 0 0 0 0 5 5


52

T T4 4 1 1 0 0 0 0 0 0
T T4 4 2 2 0 0 0 0 0 0
T T4 4 3 3 0 0 0 0 0 0
T T5 5 1 1 3 32 2 6 65 5 1 10 00 0
T T5 5 2 2 3 37 7 7 79 9 1 10 00 0
T T5 5 3 3 3 31 1 6 60 0 1 10 00 0
T T6 6 1 1 2 21 1 4 46 6 7 79 9
T T6 6 2 2 2 26 6 5 55 5 8 85 5
T T6 6 3 3 1 19 9 4 40 0 7 73 3
T T7 7 1 1 5 50 0 9 95 5 1 10 00 0
T T7 7 2 2 5 50 0 9 90 0 9 92 2
T T7 7 3 3 4 49 9 9 92 2 9 96 6
T T8 8 1 1 5 52 2 1 10 00 0 1 10 00 0
T T8 8 2 2 5 57 7 1 10 00 0 1 10 00 0
T T8 8 3 3 5 55 5 1 10 00 0 1 10 00 0
T T9 9 1 1 5 59 9 9 90 0 9 92 2
T T9 9 2 2 6 61 1 8 87 7 9 94 4
T T9 9 3 3 6 60 0 9 90 0 9 93 3
T T1 10 0 1 1 4 47 7 9 95 5 1 10 00 0
T T1 10 0 2 2 5 59 9 9 93 3 9 95 5
T T1 10 0 3 3 5 56 6 9 92 2 9 98 8
TTO: Medios de cultivo evaluados
T0: Medio Knudson C
T1: Medio Knudson C, BAP (1 ppm) y AIB (1 ppm)
T2: Medio Knudson C, BAP (2 ppm) y AIB (1 ppm)
T3: Medio Knudson C, BAP (1 ppm) y AIB (2 ppm)
T4: Medio Knudson C, BAP (2 ppm) y AIB (2 ppm)
T5:P748
T6:P723
T7: Medio P748, BAP (1 ppm) y AIB (1 ppm)
T8: Medio P748, BAP (2 ppm) y AIB (1 ppm)
T9: Medio P748, BAP (1 ppm) y AIB (2 ppm)
T10: Medio P748, BAP (2 ppm) y AIB (2 ppm)
REP: Repeticiones evaluadas por tratamiento
El empleo del medio Knudson C es ampliamente generalizado, sin embargo debido a los
especficos requerimientos nutricionales para los diferentes gneros se han desarrollado
otros medios diferentes con efectos satisfactorios como son el P748 y el P723 que fueron
ensayados en la presente investigacin.
Se determin que la germinacin de semillas de A.clowesii se ve favorecida principalmente
por la adicin al medio de cultivo de algunas sales minerales en mayores cantidades (de
MnSO4. H2O, ZnSO4.4H2O, H3BO3, Na2MoO4.2H2O, FeSO4.7H2O por ejemplo) y de otros
compuestos como el MgSO4.7H2O y el KH2PO4 en menores concentraciones que las
suministradas por el medio Knudson C de germinacin, y de compuestos orgnicos como el
banano junto con agentes antioxidantes como el carbn activado, por lo que el medio P748
result ser el ms adecuado para lograr completos procesos germinativos en un menor
tiempo de evaluacin. Adems se observ una interaccin positiva de mayores
concentraciones de BAP ( 2ppm) que de AIB (1 ppm) teniendo como base el medio P748
(Tratamiento T8) en la germinacin de las semillas, ya que los tiempos de germinacin
pasaron a ser de 2 meses, en comparacin con los 3 meses requeridos con el medio P748,
sin la adicin de fitroreguladores (T5).


53

stos resultados estn apoyados en diferentes estudios que han demostrado que las
hormonas cumplen un importante papel en el proceso de germinacin de las semillas.
Desde el punto de vista fisiolgico, la germinacin comienza con la imbibicin de la semilla,
por lo cual esta se hincha, con la imbibicin se activan enzimas hidrolticas que empiezan a
reparar la maquinaria bioqumica, con lo cual entran en actividad las clulas del embrin y
empiezan a sintetizar giberelinas, cuya accin hormonal induce la formacin de la -amilasa
de modo que el almidn del endospermo se convierte en glucosa, la cual se difunde hacia el
embrin y activa el ciclo de krebs. A continuacin las clulas embrionarias empiezan a
sintetizar citoquininas lo cual produce una rpida divisin de las clulas embrionarias pero
con poco alargamiento. A travs de la degradacin de las reservas nutritivas de la semilla
se activa el ciclo de krebs se produce energa, y se empiezan a sintetizar diferentes
aminocidos, especialmente triptfano, a partir del cual se sintetiza cido indolactico, cuya
accin especfica estimula el alargamiento de las clulas y el crecimiento del embrin.
Posteriormente, por procesos de diferenciacin celular y con la accin de auxinas y
citoquininas se observa la formacin de meristemos caulinar y radicular, con lo cual finaliza
el proceso de germinacin (Kigel & Galili, 1995). As, la aplicacin de auxinas, citoquininas y
giberelinas, como reguladores del crecimiento, ha favorecido la germinacin asimbitica de
diferentes especies de orqudeas, aumentando el porcentaje de semillas germinadas,
disminuyendo el tiempo de germinacin y obteniendo de este modo plntulas en un tiempo
ms corto (Arditti, 1992).
3.2.2 ETAPA 2. PROPAGACIN IN VITRO DEL MATERIAL VEGETAL
Los registros de las variables longitud apical (cm) y nmero de hojas que se llevaron a
cabo semanalmente durante dos meses se encuentran en el anexo C.
Longitud apical (cm). Durante las cinco primeras semanas de evaluacin, de acuerdo con
la prueba ANOVA, no se presentaron diferencias significativas entre los diferentes
tratamientos (P > 0.05). En la sexta, sptima y octava semana se encuentran diferencias
entre T1, T2 T3 y T4 (P = 0.0191, P = 0.0045 y P = 0.0057, respectivamente), y una vez
realizada la prueba de LSD (Tabla 16), se pudo determinar que el tratamiento T3 (P748 sin
fitorreguladores) fue el que brind una mayor longitud apical en la plntulas de A. clowesii
(Figura 19), seguido del T1 (Knudson C sin fitorreguladores), con el que form un grupo
homogneo en la sexta semana de evaluacin. Igualmente, aplicando la prueba ANOVA en
los porcentajes de incremento de longitud apical, se determin que existen diferencias
significativas (P= 0.0006) entre los tratamientos ensayados y al aplicar la prueba de
diferencias mnimas significativas (LSD) se cataloga nuevamente al T3 como el tratamiento
ms adecuado (Tabla 17).
Figura 19. Plantas de A.clowesii en T3 siete semanas despus de la siembra


54

Tabla 16. Prueba diferencias mnimas significativas (LSD) en A. clowesii
Tabla 17. Prueba LSD en % de incremento de longitud apical en plantas de A. clowesii


Nmero de hojas. Se encontraron diferencias significativas en la sexta, sptima y octava
semana de evaluacin (P= 0.0138, P = 0.0033 y P = 0.0033, respectivamente), periodos en
los cuales se aplic la prueba de LSD, y se determin al T3 (P748 sin fitorreguladores) como
el tratamiento ms apropiado para estimular la formacin de hojas en plantas de A.clowesii,
seguido del T1 (Knudson C sin fitorreguladores), el cual en las semanas 7 y 8 de evaluacin
presenta la formacin de grupos homogneos con el T3 y el T2 (Knudson C, BAP 2 ppm,
AIB 1 ppm) (Tabla 18).
LSD (T) COMPARISON OF MEANS OF INCREMENT BY
TTO
HOMOGENEOUS
TTO MEAN GROUPS
--------- ---------- -----------
3 15.136 I
1 13.326 I I
2 11.657 .. I I
4 10.374 .... I
LSD (T) COMPARISON OF MEANS OF SEM6 BY
TRATAMIEN
HOMOGENEOUS
TRATAMIEN MEAN GROUPS
--------- ---------- -----------
3 1.2301 I
1 1.1755 I I
4 1.1388 .. I
2 1.1164 .. I
LSD (T) COMPARISON OF MEANS OF SEM7 BY
TRATAMIEN
HOMOGENEOUS
TRATAMIEN MEAN GROUPS
--------- ---------- -----------
3 1.2894 I
1 1.2028 .. I
4 1.1753 .. I
2 1.1460 .. I
LSD (T) COMPARISON OF MEANS OF SEM8 BY
TRATAMIEN
HOMOGENEOUS
TRATAMIEN MEAN GROUPS
--------- ---------- -----------
3 1.3213 I
1 1.2299 .. I
4 1.1822 .. I
2 1.1813 .. I


55

Tabla 18. Prueba diferencias mnimas significativas (LSD) en A. clowesii


Estos resultados concuerdan con los obtenidos en la evaluacin del porcentaje de
incremento de nmero de hojas, al tener P= 0.0157 (existen diferencias significativas entre
los tratamientos) y al permitirnos la prueba LSD concluir como el mejor tratamiento al T3
(P748 sin fitorreguladores) (Tabla 19).
Tabla 19. Prueba LSD en el % de incremento en cuanto a nmero de hojas en plantas de
A. clowesii
El medio Knudson C contiene el balance orgnico y la nutricin inorgnica para el desarrollo
de las semillas de orqudeas, siendo ampliamente generalizado su empleo, sin embargo
para la especie en estudio el medio que brind los mejores resultados en cuanto a
elongacin plantular y nmero de hojas fue el P748 sin fitorreguladores, por lo que la
propagacin de A.clowesii se ve favorecida principalmente por la adicin al medio de cultivo
de algunas sales minerales como MnSO4. H2O, ZnSO4.4H2O, H3BO3, Na2MoO4.2H2O,
FeSO4.7H2O en mayores cantidades y de otros compuestos como el MgSO4.7H2O y el
KH2PO4 en menores concentraciones que las suministradas por el medio Knudson C de
germinacin, y de compuestos orgnicos como el banano junto con agentes antioxidantes
como el carbn activado. Adems se observ una interaccin poco favorable de los
fitorreguladores BAP (2ppm) y de AIB (1 ppm) con los medios Knudson C y P748, ya que
estos tratamientos (T2 y T4) siempre mostraron los menores promedios en la evaluacin.
LSD (T) COMPARISON OF MEANS OF SEM7 BY TRATAMIEN
HOMOGENEOUS
TRATAMIEN MEAN GROUPS
--------- ---------- -----------
3 2.4100 I
1 2.1959 I I
2 2.0642 .. I I
4 1.9060 .... I
LSD (T) COMPARISON OF MEANS OF SEM8 BY TRATAMIEN
HOMOGENEOUS
TRATAMIEN MEAN GROUPS
--------- ---------- -----------
3 2.4100 I
1 2.1959 I I
2 2.0642 .. I I
4 1.9060 .... I
LSD (T) COMPARISON OF MEANS OF INCREMENT BY
TRATAMIEN
HOMOGENEOUS
TRATAMIEN MEAN GROUPS
--------- ---------- -----------
3 12.840 I
1 10.773 I I
2 8.7332 .. I I
4 7.0127 .... I


56

4.3 ETAPA 3. ENRAIZAMIENTO IN VITRO DEL MATERIAL VEGETAL
Semanalmente durante dos meses se llevaron a cabo registros de las variables longitud
(cm) radicular y nmero de races formadas los cuales se encuentran en el Anexo D.
Longitud (cm) radicular. En cada semana de evaluacin, de acuerdo a la prueba ANOVA
se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos (SEM1 P=0.0302, SEM2
P=0.0041, SEM3 P=0.0038, SEM4 P=0.0062, SEM5 P=0.0044, SEM6 P=0.0025, SEM7
P=0.0036 y SEM8 P= 0.0020), por lo que se llev a cabo la prueba diferencias mnimas
significativas (LSD). Se determina que en el transcurso de las ocho semanas el T3 (P748 sin
fitorreguladores) se comporta como el medio de cultivo ms apropiado para lograr mayores
longitudes radiculares (Figura 20), seguido del T4 (P748, BAP 0.5 ppm, AIB 2 ppm) con el
que forma un grupo homogneo en el tiempo de evaluacin, exceptuando en la cuarta
semana (Tabla 20).
Figura 20. Planta de A. clowesii con raz sembrada en el T3

Tabla 20. Prueba diferencias mnimas significativas (LSD) en la longitud de races
Semana 1 Semana 2 Semana 3 Semana 4
TTO Media
Grupos
Homogneos Media
Grupos
Homogneo
s Media
Grupos
Homogneo
s Media
Grupos
Homogneo
s
T3 0.8388 I 0.9839 I 1.1295 I 1.2506 I
T4 0.8117 I I 0.8791 I I 0.9450 I I 0.9885 ..I
T2 0.7380 ..I I 0.7639 ..I I 0.8085 ..I 0.8607 ..I
T1 0.7071 ..I 0.7227 ..I 0.7718 ..I 0.8225 ..I
Semana 5 Semana 6 Semana 7 Semana 8
TTO Media
Grupos
Homogneos Media
Grupos
Homogneo
s Media
Grupos
Homogneo
s Media
Grupos
Homogneo
s
T3 1.3477 I 1.4350 I 1.4530 I 1.5238 I
T4 1.0631 I I 1.1281 I I 1.1985 I I 1.2621 I I
T2 0.8813 ..I 0.9159 ..I 0.9415 ..I 0.9617 ..I
T1 0.8591 ..I 0.8805 ..I 0.9009 ..I 0.9403 ..I
Nmero de races. Se presentan diferencias significativas entre los tratamientos en cada
una de las semanas evaluadas (SEM1 P=0.0279, SEM2 P=0.013, SEM3 P=0.0033, SEM4
P=0.034, SEM5 P=0.016, SEM6 P=0.0005, SEM7 P=0.0007 y SEM8 P= 0.0048) y de
acuerdo a la prueba de diferencias mnimas significativas (LSD) el medio P748 sin
fitoreguladores (T3) es nuevamente el mejor tratamiento al permitir que las plantas
desarrollaran una mayor cantidad de races en comparacin con los dems tratamientos
ensayados (Tabla 21).


57

Tabla 21. Prueba diferencias mnimas significativas (LSD) en el nmero de races
Semana 1 Semana 2 Semana 3 Semana 4
TTO Media
Grupos
Homogneos Media
Grupos
Homogneos Media
Grupos
Homogneos Media
Grupos
Homogneos
T3 0.9659 I 1.0953 I 1.1682 I 1.1979 I
T4 0.8797 I I 0.8797 ..I 0.8797 ..I 0.8797 ..I
T2 0.7934 I I 0.7934 ..I 0.8365 ..I 0.8797 ..I
T1 0.7071 ..I 0.7502 ..I 0.8365 ..I 0.8365 ..I
Semana 5 Semana 6 Semana 7 Semana 8
TTO Media
Grupos
Homogneos Media
Grupos
Homogneos Media
Grupos
Homogneos Media
Grupos
Homogneos
T3 1.2573 I 1.3245 I 1.3245 I 1.3245 I
T4 0.9659 ..I 1.0091 ..I 1.1250 I I 1.1250 I I
T2 0.8797 ..I 0.9094 ..I 0.9525 ..I I 0.9525 ..I
T1 0.8365 ..I 0.8365 ..I 0.8365 ....I 0.9228 ..I
4.4 ETAPA 4. ENDURECIMIENTO DEL MATERIAL VEGETAL
Los resultados que se presentan a continuacin estn de acuerdo al sustrato empleado:
Adaptacin en S1. ste sustrato (tierra abonada 40%, carbn vegetal fino 20%, corteza de
pino ptula fina 20% e icopor en pequeos pedazos 20%) permiti la conservacin de la
humedad en lmites normales y una aireacin aceptable ya que las plantas en las cinco
semanas de seguimiento no mostraron signos de contaminacin, marchitamiento ni
amarillamiento, por lo que se reporta una sobrevivencia del 100 %. Las plantas se
conservaron de color verde oscuro y vigorosas (Figura 21).
Figura 21. Adaptacin de A. clowesii en S1
Adaptacin en S2.La composicin del S2 (carbn vegetal fino 33,3%, corteza de pino
ptula fina 33,3% e icopor en pequeos pedazos 33,3%) brind al igual que el S1 las
condiciones ptimas para la adaptacin de las plantas, ya que se conservaron de color
verde oscuro, turgentes y sin presencia de agentes contaminantes (Figura 22). La
sobrevivencia fue del 100%.


58

Figura 22. Adaptacin de A. clowesii en S1
Adaptacin en S3. Con el pino ptula y el carbn vegetal gruesos junto con el icopor en
medianos pedazos se observ una escasa retencin de agua, por lo que un 37.5% de las
plantas presentaron deshidratacin, marchitamiento y amarillamiento de las hojas. Sin
embargo, las plantas sobrevivientes (62.5%) cinco semanas despus del transplante
permanecieron turgentes en ste sustrato (Figura 23).
Figura 23. Plantas de A. clowesii en S3 con signos de marchitamiento y en buenas
condiciones de adaptacin, respectivamente
Igualmente, se realiz como ensayo preliminar bajo el S1 (tierra abonada 40%, carbn
vegetal fino 20%, corteza de pino ptula fina 20% e icopor en pequeos pedazos 20%) y el
S2 (carbn vegetal fino 33,3%, corteza de pino ptula fina 33,3% e icopor en medianos
pedazos 33,3%) el endurecimiento de 36 plantas sin previa formacin de races, a las cuales
adems de la metodologa ya descrita se les realiz un choque hormonal con AIA (2 gr/L)
previo al transplante. Las plantas en las cinco semanas de seguimiento se conservaron
verdes y vigorosas, ausentes de marchitamiento y contaminacin (Figura 24), observndose
indicios de rizognesis en el 27.7% de las plantas.
Figura 24. Plantas de A. clowesii en S1 con previo choque hormonal


59

5. CONCLUSIONES
Teniendo en cuenta que A.clowesii Lindl es una de las especies de orqudeas que se
encuentran en va de extincin y para la cual no existe protocolo de micropropagacin se
considera que los resultados obtenidos en sta investigacin constituyen un gran aporte
para el establecimiento de una tcnica de propagacin masiva in vitro de sta especie de
orqudea.
Se estableci un tratamiento de desinfeccin altamente efectivo para las cpsulas no
dehiscentes. La germinacin de las semillas de A.clowesii Lindl se vio influenciada por el
medio de cultivo que se empleado, determinndose, de acuerdo a los porcentajes de
germinacin evaluados, al T8 (Medio P748, BAP: 2 ppm y AIB: 1 ppm) como el mejor
tratamiento. De sta forma la aplicacin de Citoquininas y de auxinas (en menor proporcin),
como reguladores del crecimiento junto al medio P748 influy de manera positiva en la
formacin de los protocormos, ya que se aument el porcentaje de semillas germinadas,
disminuyendo considerablemente el tiempo de germinacin.
En las etapas de propagacin y enraizamiento in vitro las plantas de A.clowesii se vieron
favorecidas en cuanto a elongacin apical, nmero de hojas y rizognesis por el medio P748
sin fitorreguladores.

Los tres sustratos ensayados brindaron buenas respuestas de adaptacin, sin embargo,
resultaron ms apropiados para ste proceso el S1 (tierra abonada 40%, carbn vegetal
fino 20%, corteza de pino ptula fina 20% e icopor en pequeos pedazos 20%) y el S2
(carbn vegetal fino 33,3%, corteza de pino ptula fina 33,3% e icopor en medianos pedazos
33,3%), ya que permitieron mantener la humedad en niveles adecuados y una buena
aireacin, factores importantes a tener en cuenta en la seleccin de sustratos para procesos
de endurecimiento. El S3 (carbn vegetal grueso 33,3%, corteza de pino ptula gruesa
33,3% e icopor en medianos pedazos 33,3%) result ser el menos favorable para las plantas
de A. clowesii al observarse en un 37.5% de ellas deshidratacin, marchitamiento y
amarillamiento de las hojas.


60

6. RECOMENDACIONES
El material vegetal obtenido en el desarrollo de la presente investigacin se encuentra en
diferentes etapas de propagacin, por lo cual es necesario dar continuidad al proceso
realizando los subcultivos y transferencia de plantas a los medios especficos segn
corresponda a crecimiento y desarrollo o enraizamiento .
Se hace necesario realizar subcultivos peridicos (cada cuatro semanas), con el objeto de
que se eviten procesos de fenolizacin, clorosis y necrosis de los explantes y de que las
plantas alcancen un adecuado desarrollo foliar y radicular para ser transplantadas a
condiciones ex vitro segn los parmetros establecidos en la presente investigacin.
Para la etapa de adaptacin ex vitro, se recomienda llevar a cabo el seguimiento de
crecimiento y desarrollo de las plantas que se encuentran en procesos de endurecimiento y
trasladarlas a condiciones de campo, al igual que ensayar otros sustratos en los que haya la
adicin de micorrizas.

Con el fin de incrementar el nmero de plantas se recomienda continuar el proceso de
propagacin masiva a partir de la metodologa desarrollada en la presente investigacin.



























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7. BIBLIOGRAFA
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