Microbiologia de Conductos Radiculares PDF

MICROBIOLOGIA DE LAS LESIONES PULPARES
CAMILO ANDRES CORREDOR BUSTAMANTE

ALBEIRO FERNANDO TORRES ABRIL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCAS
MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
MICROBIOLOGIA AGRICOLA Y VETERINARIA
Bogot D.C. 16 de febrero de 2009



Trabajo de grado
Presentado como requisito parcial
Para optar al ttulo de

MICROBIOLOGO AGRICOLA Y VETERINARIO.
MICROBIOLOGO INDUSTRIAL.

NOTA DE ADVERTENCIA:
Artculo 23 de la resolucin No.13 julio de 1946.
la universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velar por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral catlica y por que las tesis no tengas ataques
personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellos el anhelo de
buscar la verdad y la justicia.



APROBADO

_

________________________
Dra. Margarita Chaves Clavijo
Bacteriloga MSc
Directora.

______________________ ______________________
Dr. Fredy Gamboa Dra. Mery Santaella
Bacterilogo Ph. D. Bacteriloga
Jurado. Jurado.



APROBADO

__________________________ ______________________
Ingrid Schuler. Janeth Arias
Biloga Ph. D. Bacteriloga M.Sc-M. Ed
Decana Acadmica. Directora de carrera

AGRADECIMIENTOS

Especialmente a nuestros padres, hermanas y amigos que apoyaron nuestro
trabajo a travs de nuestra carrera.

A la Dra. Margarita Chaves Clavijo por su paciencia, dedicacin y apoyo por
todo el largo proceso de finalizacin de nuestra carrera y por hacernos
excelentes personas y alcanzar la meta de ser excelentes profesionales.

TABLA DE CONTENIDO

1. INTRODUCCION.. 1

2. OBJETIVOS... 4

2.1 Objetivo General... 4

2.2 Objetivos especficos 4

3. MARCO TEORICO.. 5

3.1 MICROBIOLOGIA DE LA CAVIDAD ORAL 5

3.1.1 Adquisicin de la flora microbiolgica oral 6

3.2 LA PULPA DENTAL.. 7

3.2.1 Funciones de la pulpa...7

3.2.2 Exposicin de la pulpa.. 9

3.2.3 Filtraciones marginales de las restauraciones... 10

3.2.4 Contigidad... 10

3.3 VIAS DE ACCESO DE LOS MICROORGANISMOS A LA PULPA.11

3.3.1 Acceso mediante tbulos dentinarios. 11

3.3.2 Acceso Va Periodontal..14

3.3.3 Va Hematgena.15

3.3.4 Papel de los microorganismos en la patologa pulpar...16

3.4 EL MEDIO ENDODONTICO..18

3.4.1 Requerimientos para un patgeno endodntico19

3.4.2 Fisicoqumicos.. 20

3.4.3 Factores de Adhesin, Agregacin y Coagregacin..21

3.4.4 Nutricionales. 22

3.4.5 Protectores del husped..22

3.4.6 Antagnicos intermicrobianos.. 22

3.4.7 Modelos de relacin microbiana.. 22

3.4.8 Actividad enzimtica bacteriana... 25

3.5 MICROORGANISMOS MAS FRECUENTES ASOCIADOS A LAS
LESIONES PULPARES...26

3.5.1 Fusobacteriumnucleatum...26

3.5.2 Porphyromonas gingivalis..27

3.5.3 Prevotella spp.29

3.5.4 Peptostreptococcus spp..30

3.5.5 Streptococcus mutans.....31

3.5.6 Enterococcus spp33

3.5.7 Candida albicans.....34

3.5.8 Filifactor alocis35

3.6 MICROORGANISMOS POCO FRECUENTES EN LESIONES

PULPARES.37

3.7 MEDIOS DE CULTIVO..40

3.7.1 Anlisis Microbiolgico..42

3.8 TCNICAS MOLECULARES45

3.8.1 Reaccin de Hibridacin.48

3.8.2 Tipos de Hibridacin...50

3.8.3 Amplificacin de cidos Nuclecos....51

3.8.4 Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)52

3.8.4.1 Deteccin del Producto Amplificado 53

3.8.4.2 Modificaciones de la PCR..54

3.8.5 NASBA54

3.8.6 ADN Ramificado.55

3.8.7 Tcnicas Moleculares Aplicadas a Taxonomas Microbianas..56

3.8.7.1 Contenido G+C...56

3.8.7.2 Hibridacin ADN-ADN..56

3.8.7.3 Patrones de enzimas de Restriccin.57

3.8.7.3.1 Polimorfismos de la Longitud de lo Fragmentos
De Restriccin (RFLP)...57

3.8.7.3.2 Electroforesis en Gel del Campo Pulstil (PFGE).58

3.8.8 Secuenciacin de cidos Nuclecos.58

3.8.9 Tcnicas ARNr16S...59

4. ANALISIS BIBLIOGRAGICO DE ESTUDIOS REALIZADOS...63

5. CONCLUSIONES.82

6. BIBLIOGRAFIA...83

7. ANEXOS96

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Principales gneros y especies de microbiota oral37

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Microfotografa al Microscopio Electrnico de Barrido mostrando.
Candida spp..71

INDICES DE ANEXOS

ANEXO 1. Fusobacterium nucleatum... 96

ANEXO 2. Porphyromonas gingivalis.. 96

ANEXO 3. Prevotella intermedia.. 97

ANEXO 4. Peptostreptococcus spp.. 97

ANEXO 5. Streptococcus mutans.. 98

ANEXO 6. Enterococcus faecalis.. 98

ANEXO 7. Candida albicans.. 99

ANEXO 8. Microorganismos referentes en el estudio bibliogrfico 100

ANEXO 9. Tipos de Medios de Cultivo. 101

ANEXO 10. Tecnica Reaccion en Cadena de Polimerasa (PCR)..112

1. INTRODUCCION
La pulpa es un tejido blando de origen mesenquimatoso con clulas
especializadas, los odontoblastos, que se colocan perifricamente en
contacto directo con la matriz dentinal. La ntima relacin entre los
odontoblastos y la dentina es una de las razones por la que la dentina y la
pulpa deben considerarse como una entidad funcional, a veces denominada
complejo dentino pulpar. (Cohen, 2006).
La pulpa constituye un sistema microcirculatorio cuyos componentes
vasculares ms grandes son las arteriolas y las vnulas. Ninguna arteria o
vnula sale o entra de la pulpa. El tejido pulpar est protegido en su parte
externa por el esmalte y la dentina y la dentina a nivel coronal, a nivel
radicular por la dentina y cemento. Cuando algn agente externo genera una
lesin a estos tejidos puede comprometer la integridad de la pulpa y
ocasionar cambios inflamatorios o degenerativos a nivel de este tejido que
puede variar en magnitud y severidad (Rodrguez et al 2008)
Segn Bascones et al (1995) y Brau et al. (1995) la caries dental es la razn
fundamental por la que la pulpa se ve afectada por procesos infecciosos,
aunque tambin se pueden producir colonizaciones bacterianas a travs de
los mrgenes de obturacin o por fracturas dentarias, as mismo, los
procesos periodontales pueden ser el camino por el que lleguen bacterias a
la pulpa. Otras causas que motivan una afectacin pulpar pueden ser
iatrognicas, y en concreto la manipulacin dental con instrumental rotatorio
sin la adecuada refrigeracin o la aplicacin de frmacos cavitarios o
materiales de restauracin, que son procedimientos que, por la frecuencia de
su empleo, se encuentran entre las causas ms frecuentas de patologa
pulpar.

La pulpitis hace referencia a un estado inflamatorio de la pulpa que puede ser
agudo o crnico y en distintas formas evolutivas segn criterios clnicos o
histopatolgicos (Regezi et al, 2000)
La gran variedad anatmica y tisular existente en la cavidad oral, entre otros
factores, hace posible la convivencia de diferentes ecosistemas microbianos,
cada uno con caractersticas metablicas y nutricionales especficas y todos
ellos conviviendo dentro de un delicado equilibrio ecolgico (Gutirrez, et al
2004)
Ahora bien como comenta Rodrguez et al, (2008) ante el hallazgo de
muerte pulpar y posterior dao a tejidos del peripice se cuestiona el origen
de estos mismos a partir de factores iatrognicos bacterianos o qumicos, por
tanto ellos determinaron cuales son los microorganismos que se hallan en
estos dientes y pudiendo establecer su procedencia. Por esto mismo es de
vital importancia y de conocimiento, saber que son propios de la enfermedad
pulpar microorganismos que se ven vinculados en la etiologa tales como:
Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas, Treponema, Actinomyces,
Streptococcus, Peptostreptococcus y muchos otros.
La naturaleza polimicrobiana de las infecciones en la cavidad oral, permite
que se produzcan fenmenos de simbiosis y de sinergia bacteriana. Hasta el
inicio de la pulpitis, las bacterias implicadas sern principalmente aerobias;
sin embargo su proliferacin originar condiciones de anaerobiosis y la
necrosis vasculonerviosa pulpar, crendose as condiciones favorables para
el crecimiento de bacterias anaerobias facultativas y, posteriormente, de
anaerobias estrictas principales responsables de los procesos infecciosos
(Gutirrez, et al 2004).
El nmero de bacterias que colonizan la pulpa o el peripice es directamente
proporcional a la magnitud de la puerta de entrada de las mismas. Cuanto

ms importante sea la invasin bacteriana, en poco intervalo de tiempo,
mayor ser la respuesta inflamatoria reactiva. Sin embargo, ms que el
nmero, tiene mayor relevancia la capacidad que tengan las bacterias de
multiplicarse (Canalda-Brau, 2006); Por tanto las bacterias pueden utilizar
diversas puertas de entrada hacia la cavidad pulpar. En funcin de su
magnitud y proximidad, la patologa se instaura rpidamente o de forma
prolongada.

As desde que se demostr que la invasin microbiana de la pulpa casi
siempre cursaba con una respuesta inflamatoria pulpar, se han abierto
numerosas lneas de investigacin dirigidas a identificar los ecosistemas
bacterianos de la cavidad pulpar.

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo general:

Realizar una revisin bibliogrfica del tema: Microbiologa en lesiones
pulpares, y las metodologas aplicadas para la identificacin de estos
microorganismos relacionados en esta patologa.

2.2 Objetivos especficos:

Revisar las especies de microorganismos ms frecuentes en lesiones
pulpares.

Describir las caractersticas microbiolgicas y ecolgicas de los
microorganismos presentes en lesiones pulpares.

Analizar las tcnicas utilizadas en la determinacin de la flora
microbiolgica de las lesiones pulpares.

3. MARCO TEORICO

3.1 MICROBIOLOGIA DE LA CAVIDAD ORAL

La cavidad oral se compone de un conjunto de tejidos, asociados a
numerosos microorganismos constituyendo ecosistemas, con modificacin
constante. Segn la composicin de la microbiota y los tejidos se dividen en
saliva, superficie epitelial del surco crevicular, superficie dental del surco
crevicular, dorso de la lengua y epitelio bucal. Cuando este sistema ecolgico
esta en equilibrio se denomina eubiosis, y cuando se altera dicho equilibrio
se conoce como disbiosis, correspondiendo a una boca enferma a partir de la
cual puedan iniciarse procesos que desencadenen la destruccin del diente y
o sus tejidos de soporte. (Fraile, 2003).

En la cavidad oral se pueden aislar ms de 500 especies de
microorganismos; la mayora corresponde a la microbiota transitoria o de
paso, quedando como microbiota residente o habitual unas 20 especies y
predominado entre ellas la microbiota Gram positiva, principalmente los
estreptococos del grupo viridans componiendo el 90% de la microbiota oral.
El resto de microorganismos presentes se distribuyen entre cocos Gram
negativos como Neisseria; bacilos Gram positivos anaerobios ramificados
como Actinomyces, bacilos Gram positivos como Lactobacillus y
Bifidobacterium; bacilos Gram negativos anaerobios como Bacteroides,
Prevotella, Fusobacterium etc. Aunque en menor proporcin, podemos
encontrar en la cavidad oral normal espiroquetas, comensales y hongos
como Candida albicans. (Fraile, 2003). (Tabla 1)

3.1.1 Adquisicin de la flora microbiolgica oral.

La flora bacteriana se instala en la cavidad oral en forma progresiva desde el
nacimiento. El nio nace con una cavidad oral estril y la primera
contaminacin se produce en el parto por las bacterias de la flora vaginal.
Los siguientes microorganismos que colonizan son los que se encuentran en
el ambiente en estado libre o que se trasmiten al nio por personas ms
cercanas a l. A los tres meses de vida aun se pueden encontrar
Streptococcus en el 95% de la poblacin. Con la erupcin de los primeros
dientes aparecen tambin nuevos hbitats para la colonizacin, como el
esmalte dental y el surco gingival. Esto permite la aparicin de nuevas
bacterias como Fusobacterium, Actinomyces y Veillonella. En esta etapa los
anticuerpos maternos ya han desaparecido del suero del nio y este empieza
a crear sus propias defensas inmunolgicas, constituidas por
inmunoglobulinas sricas IgA secretadas en la saliva. Cuando se produce la
erupcin de dientes permanentes, el perodo de recambio se acompaa de
fenmenos inflamatorios, que permite que se favorezca la colonizacin de
bacterias potencialmente patgenas. La conformacin de la flora oral
definitiva se concreta desde la adolescencia, en donde los cambios
hormonales permiten el crecimiento de la mayora de Bacteroides. La
prevalencia de Prevotella intermedia y Treponema denticola es
especialmente elevada, pero la prevalencia de A. actinomycetemcomitans y
Porphyromonas gingivalis, se mantienen bajas. La totalidad de factores
habitacionales del ecosistema oral se establecen completamente en la edad
adulta y comprende una amplia diversidad de microorganismos. (Libana,
1997).

3.2 PULPA DENTAL

La pulpa dental es el tejido blando localizado en el centro del diente; forma,
soporta y est rodeado por dentina. En general, se considera a la pulpa como
un tejido blando laxo especializado. La pulpa dental alberga un gran nmero
de elementos titulares, incluido los nervios, el tejido vascular, fibras de tejido
conectivo, sustancia fundamental, lquido intersticial, los odontoblastos, los
fibroblastos y otros componentes celulares menores. (Walton, 1996).

La funcin primaria de la pulpa es formativa, debido a que de ah surgen los
odontoblastos que forman la dentina. En el desarrollo temprano del diente,
los odontoblastos tambin interactan con las clulas del epitelio dental para
formar esmalte. Despus de la formacin dental la pulpa proporciona varias
funciones secundarias relacionadas con la sensibilidad, hidratacin y defensa
del diente. (Walton, 1996).

3.2.1 Funciones de la pulpa
Durante toda su vida la pulpa lleva a cabo cinco funciones:

Induccin:
La pulpa participa en la induccin y el desarrollo de odontoblastos y dentina,
que cuando se forman inducen a la formacin de esmalte. Estos procesos
tienen actividades interdependientes, de tal manera que los ameloblastos
influyen en la diferenciacin de odontoblastos, y los odontoblastos y la
dentina en formacin de esmalte. Esta interaccin epitelial mesenquimatosa
es la esencia de la formacin dental. (Walton, 1996).

Formacin
Los odontoblastos forman dentina; estas clulas altamente especializadas
participan en la formacin de dentina de tres maneras: a) al sintetizar y
secretar matriz orgnica; 2) al transportar de manera inicial componentes
inorgnicos a la matriz de nueva formacin. 3) al crear un ambiente que
permita la mineralizacin de la matriz. Durante el desarrollo temprano del
diente, la dentognesis primaria por lo general es un proceso rpido despus
de completar la maduracin dental, la formacin de dentina contina de una
forma mucho ms lenta y en un patrn menos simtrico. (Walton, 1996).

Nutricin
Por medio de los tbulos dentinarios, la pulpa suministra nutrientes que son
esenciales para la formacin de dentina e hidratacin. (Walton, 1996).

Defensa
Los odontoblastos forman dentina en respuesta a la lesin, en particular
cuando el grosor original de la dentina est afectado por caries, desgaste,
traumatismo o procedimiento de restauracin. Los odontoblastos (o sus
clulas de reemplazo) tambin tienen la capacidad de formar dentina en
sitios donde se perdi la continuidad (exposicin pulpar), por medio de la
diferenciacin de nuevos odontoblastos o clulas parecidas a los
odontoblastos en el sitio de exposicin. Sin embargo, la cantidad de dentina
producida en respuesta a la lesin no es la misma que se produce de manera
fisiolgica ni proporciona el mismo grado de proteccin al tejido pulpar
subyacente. (Walton, 1996).

La pulpa tambin tiene la capacidad de producir una respuesta inflamatoria e
inmunolgica en un intento por neutralizar o eliminar la invasin de la dentina
por microorganismos causantes de caries y sus productos. (Walton, 1996).

Sensibilidad
A travs del sistema nervioso la pulpa trasmite las sensaciones mediadas por
el esmalte o dentina a los centros nerviosos ms altos, estos estmulos se
expresan a nivel clnico como dolor, aunque estudios fisiolgicos y
psicofisiolgicos indican que la pulpa tambin siente temperatura y tacto.
Tambin trasmite sensaciones de dolor profundo causado por enfermedad,
principalmente de tipo inflamatorio. (Walton, 1996)

3.2.2 Exposicin de la pulpa

La exposicin pulpar directa, sea de origen traumtico, como la fractura
coronaria o iatrognica causada por procedimientos operatorios, rompe la
barrera fsica impuesta por las estructuras dentarias, poniendo la pulpa en
contacto con el ambiente sptico de la cavidad oral (Estrela, 2005)

Debido a la exposicin de la pulpa a la flora oral, sta y su dentina
circundante
Pueden dar asilo a las bacterias y a sus productos derivados. Dependiendo
de la virulencia de las bacterias, la resistencia del husped, la cantidad de
flujo sanguneo y el grado de drenaje, el tejido pulpar puede permanecer
inflamado durante un largo periodo de tiempo o necrotizarse rpidamente.
Tras la necrosis pulpar, todo el sistema de canal radicular se infecta con
distintas especies de bacterias, las cuales pueden extenderse desde este
sistema hacia el ligamento periodontal a travs del foramen apical o de los
canales laterales. La presencia de bacterias en el sistema del canal radicular

suele dar a lugar al desarrollo de lesiones perirradiculares y, en ocasiones
laterales. (Cohen, 1999)

Si la pulpa queda expuesta, como ocurre por ejemplo en la caries esta queda
expuesta a toda flora oral. Los estreptococos alfa-hemolticos, los
Enterococos spp. Y Lactobacilos spp. Son los que se encuentran con ms
frecuencia. A medida que aumenta el espesor de la pulpa necrtica, se
establece un mayor nmero de especies anaerbicas obligadas, entre las
cuales se incluyen los cocos anaerbicos Gram positivos y los bacilos Gram
negativos, que son favorecidos por la baja concentracin de oxigeno
existente en las zonas necrticas de la pulpa (Cohen, 2002)

3.2.3 Filtraciones marginales de las restauraciones

Se producen a travs de la interface existente entre el material de
restauracin y el diente. Errores en la tcnica operatoria, como adaptaciones
inadecuada en los mrgenes de la corona a la lnea de terminacin del
tallado, errores en el manejo de los materiales de obturacin, o la fatiga o
alteraciones de los mismos que se produce con el paso del tiempo, pueden
dar lugar a discrepancias significativas en el material de restauracin y la
estructura dentaria restaurada. (Libana, 2002).

3.2.4 Contigidad

La infeccin de la pulpa dental puede acontecer a consecuencia de procesos
infecciosos adyacentes, las alteraciones seas como la ostetis y la
osteomielitis y la presencia de quistes en reas apicales en el propio diente
conducen con frecuencia a la necrosis pulpar. (Libana, 2002).

Independientemente de las vas de entrada, una vez que han penetrado en el
tejido pulpar, las bacterias colonizan, se multiplican y contaminan todo el
sistema radicular. Dependiendo del nivel de la concentracin de oxigeno y de
la presencia o ausencia de los nutrientes esenciales en el sistema radicular,
existen grupos especficos de bacterias que sobreviven y forman la flora de
los canales radiculares infectados. (Adriaens, 1988)

Las bacterias anaerobias producen cidos grasos de cadena corta, como el
cido propinico, butrico e isobutrico. Estos son factores de virulencia que
afectan la quimiotaxis de los neutrfilos y la fagocitosis. Estas bacterias
estn en un estado dinmico influido por la interaccin entre las bacterias y el
hospedero. Aunque esta microbiota es menos compleja que la microbiota
subgingival, se produce una serie de relaciones ecolgicas interbacterianas.
(Walton, 1996).

3.3 VAS DE ACCESO DE LOS MICROORGANISMOS A LA PULPA
DENTAL

El acceso de microorganismos a la estructura pulpar se puede dar
bsicamente por el acceso va tbulos dentinarios y a travs de vas
periodontal y hematgenas.

3.3.1 Acceso mediante tbulos dentinarios

Como consecuencia de la prdida del esmalte o del cemento, los tbulos
dentinales estn expuestos a las bacterias presentes en la cavidad oral. Los
tbulos dentinales se extienden desde la pulpa hasta las uniones esmalte
dentina y cemento dentina. Debido al tamao y el nmero de tbulos en la
dentina, los microorganismos pueden penetrar, multiplicarse e invadir los

numerosos tbulos expuestos. La lentitud de la invasin de la dentina viable
por las bacterias pueden deberse a la presencia de factores de resistencia
naturales en la dentina y tejido pulpar. (Libana, 2002).

Hoshino et.al (1992) utilizaron procedimientos anaerbicos para comprobar la
rpida invasin bacteriana de las pulpas dentales no expuestas, las cuales se
cubran con dentina clnicamente sana por debajo de las lesiones producidas
por caries. Seis de cada nueve dientes sufran invasin bacteriana, siendo
los organismos predominantes los anaerobios obligados.

La presencia de bacterias, de sus productos derivados y de otros irritantes en
los tbulos dentinales suelen generar respuestas inflamatorias en el tejido
pulpar. La inflamacin de la pulpa tambin puede producirse cuando los
tbulos dentinales transportan sustancias irritantes desde las caries
incipientes a la pulpa o cuando los tbulos contienen y permiten el paso de
los microorganismos existentes bajo los materiales dentales de restauracin
o cerca de las bolsas periodontales. (Cohen, 2006).

La eliminacin del cemento durante el tratamiento periodontal puede exponer
numerosos tbulos dentinales a la flora oral, lo que en ocasiones permite que
los microorganismos penetren el tejido pulpar. La produccin de un barrillo
dentinario durante la manipulacin de la raz, as como los iones de calcio y
fsforo de la saliva, pueden retardar la invasin de los tbulos dentinales por
los microorganismos orales. (Cohen, 2006).

Sen et al. (1995) definen el barrillo dentinario como una capa de material
amorfo, irregular y granular, compuesta por dentina, restos de tejido pulpar y
procesos odontoblsticos y, en ocasiones, por bacterias. Cuando los canales

radiculares se instrumentan durante el tratamiento endodntico, siempre se
forma esa capa en las paredes del canal.

La mayora de autores opinan que las bacterias productoras de cido
invaden los tbulos y desmineralizan las paredes. Las especies proteolticas,
que actan sobre la matriz orgnica, la cual es denudada en los tbulos
dentinales ensanchados, los cidos, metabolitos y productos txicos se
difunden ms rpidamente que las bacterias, con lo cual los odontoblastos
resultan afectados y, posiblemente, destruidos. Si las bacterias pueden ser
eliminadas en su avance, es posible conseguir la curacin. La caries dental
es la causa ms comn de las lesiones pulpares, y muchas reacciones de la
pulpa pueden ser infecciones prolongadas de los tbulos dentinales, que se
originan desde el fondo de la cavidad y las paredes como consecuencia de la
filtracin de materiales de relleno. Si no se tratan, las bacterias acaban por
afectar el tejido pulpar y dan lugar a la inflamacin. El nmero de bacterias
aumenta, los leucocitos neutrfilos polimorfonucleares se infiltran y se forma
un absceso, provocando la muerte del tejido pulpar. (Cohen, 2006)

A partir de la expansin de la lesin cariosa en sentido centrpeto o durante
intervenciones odontolgicas, los microorganismos pueden utilizar esta va
para llegar a la pulpa; es la va ms comnmente utilizada, siendo la lesin
de caries la fuente ms frecuente de infeccin (Estrela, 2005) adems
Dahlen-Moller (1991) y Siqueira (1997) a partir de sus estudios llegaron a la
conclusin que esa invasin solamente ocurre cuando el grosor de la
dentina alcance como mximo 0.2 mm entre los limites cariosos y pulpar, y
que es garantizada gradualmente por el proceso de divisin celular,
favorecida, a veces, por el efecto mecnico de la masticacin.

3.3.2 Acceso Va Periodontal

Muchas veces tenemos una injuria y/o compromiso pulpar en dientes con
ausencia de caries (coronas ntegras) y con presencia de restauraciones. Las
piezas dentarias comprometidas periodontalmente, suelen sufrir una invasin
microbiana proveniente de microorganismos presentes en las bolsas
periodontales y que tiene acceso a la pulpa mediante los conductos laterales,
conductos accesorios y a travs del delta apical, (De Lorenzo 2004., Libana,
1997).

Existen mltiples anastomosis entre vasos sanguneos y linfticos de la pulpa
y del periodonto, lo que facilita el pasaje de los microorganismos. (Libana
1997).

Adriaens et al. (1988) examinaron la presencia de bacterias en la dentina de
dientes con complicaciones periodontales y las compar con la dentina de
dientes sanos, encontrando ms microorganismos en la dentina y pulpa de
los dientes con compromiso periodontal. La eliminacin del cemento durante
un tratamiento periodontal puede exponer numerosos tmulos dentinarios a
la flora oral, permitiendo que los microorganismos penetren hasta la pulpa.

Estrela et al. (2005) y a partir de estudios realizados por Dahlen-Moller
(1991) comentan que esa va puede ser facilitada a los microorganismos,
por ejemplo, durante la realizacin de una profilaxis dentaria, y a
consecuencia de una luxacin y, ms significativamente, a partir de la
migracin de la insercin epitelial durante el establecimiento de una bolsa
periodontal. En relacin con esa va, es pertinente considerar que la
capacidad de locomocin de ciertos microorganismos periodontopatgenos,

como Wolinella y Selenomonas, les garantiza las condiciones ecolgicas
para llegar hasta la pulpa y eventualmente colonizarlas.

Existe una relacin causa-efecto entre la infeccin del canal radicular,
lesiones perirradiculares o laterales y la penetracin de las bacterias en la
direccin opuesta (hacia la pulpa). Tericamente, los canales laterales
limpios y el foramen apical adyacente a las bolsas periodontales deberan
proporcionar el acceso a los microorganismos orales al sistema del canal
radicular. Cuando se infecta la pulpa a travs del foramen apical, un requisito
previo parece ser siempre la existencia de un mal estado de la pulpa para
que se produzca la infeccin. Grossman (1967) aplico Serratia marcescens
sobre la enca labial de dientes de perros y monos, y los traumatizo con una
pesa metlica. Al encontrar este microorganismo en el tejido pulpar, llego a la
conclusin de que el ligamento periodontal proporcionaba una va para el
paso de estos organismos hacia el tejido pulpar. (Cohen, 1999)

3.3.3 Va Hematgena

La infeccin va hematgena es rara. Esta va de infeccin est dada por el
fenmeno de la anacoresis, que se define como la atraccin positiva de los
microorganismos presentes en la circulacin sangunea hacia los tejidos
inflamados o necrticos durante una bacteremia. Se considera as pues, que
para que se d una instalacin de bacterias circulantes en el torrente
sanguneo, generalmente se requiere una inflamacin o necrosis previa de la
pulpa. La deteccin de microorganismos que no pertenecen a la microbiota
normal de la cavidad oral, nos sugiere una infeccin por esta va. Otra
manera de que la pulpa se infecte es la presencia de un foco infeccioso
adyacente. (Adriaens, 1988)

Cuando la pulpa se infecta a travs de cualquiera de los mecanismos
explicados, el mal estado de sta es prerrequisito para que se produzca
dicha infeccin. Cuando tienen lugar infecciones retrgradas, generalmente
estn involucradas pocas especies bacterianas. (Libana, 2002).

En los casos de necrosis aspticas (que se puede producir por la supresin
de la irrigacin sangunea) motivada por un traumatismo, el tejido necrtico
se mantendr libre de bacterias hasta su posterior infeccin, la cual se puede
dar por cualquiera de las vas antes ya expuestas. (Adriaens, 1988)

3.3.4 Papel de los microorganismos en la patologa pulpar
Ha sido reconocido ampliamente que los microorganismos juegan un papel
fundamental en el desarrollo y mantenimiento de las patologas pulpares y
periapicales. Normalmente la pulpa dental es un tejido estril y est
principalmente involucrada en la produccin de dentina y en la sensibilidad
del diente. (Kettering J, 1999).
Cualquier lesin de la pulpa puede desencadenar una respuesta inflamatoria
de la misma. Si bien los irritantes pueden ser de naturaleza fsica, trmica o
qumica, los microorganismos son considerados el principal agente
etiolgico. Las patologas pulpares y periapicales suelen ser un resultado
directo o indirecto de la presencia de bacterias y otros microorganismos en el
medio bucal. (Dahlen et al. 2000).
Dado que los microorganismos desempean un papel primordial en la
patognesis de las lesiones pulpares y perirradiculares es preciso manejar
los fundamentos de la microbiologa endodntica para entender el papel que
desempean en estas afecciones, las vas de difusin de la infeccin pulpar y

periapical, las respuestas de los tejidos ante estos agresores y los mtodos
utilizados para controlar y erradicar las infecciones del sistema de conductos
radiculares. (Love et al. 2002).
La pulpa y la dentina forman un complejo funcional el cual es protegido tanto
por sustancias exgenas de la cavidad bucal como por estructuras dentarias
(el esmalte y el cemento). Cuando el complejo dentino-pulpar es infectado,
los tejidos reaccionan en contra de los microorganismos invasores a fin de
erradicarlos. La capacidad de este complejo de realizar esta funcin no ha
sido subestimada, ya que los tejidos estn dotados con procesos
inmunocompetentes. Sin embargo, en trminos clnicos, si la infeccin no es
erradicada a travs de esos procesos naturales o procedimientos
operatorios, los microorganismos invaden el complejo dentino-pulpar
venciendo las defensas y causando la enfermedad pulpar, e infectando la
cmara pulpar y el sistema de conductos radiculares. (Love et al. 2002).
El sistema de conductos radiculares est en abierta comunicacin con los
tejidos periapicales (ligamento periodontal, cemento y hueso alveolar) por las
vas del foramen apical, conductos laterales y accesorios. Los metabolitos y
productos txicos son producidos principalmente por las bacterias presentes
dentro del sistema de conductos radiculares y se difunden a los tejidos
periapicales desencadenando la respuesta inflamatoria (periodontitis apical),
la cual se caracteriza por resorcin del hueso alveolar. La enfermedad
periapical inducida por microorganismos por lo general comienza como una
inflamacin de tipo crnico y se manifiesta histopatolgicamente como un
granuloma. (Love et al. 2002).
La invasin de los tbulos dentinarios por microorganismos ocurre cuando la
dentina est expuesta al medio bucal. Esto puede ocasionarse por lesiones

de caries, procedimientos restauradores o periodontales, fisuras de esmalte o
dentina, o traumatismo dental. (Peters et al. 1995). El avance de las
bacterias del proceso carioso traer como consecuencia la infeccin de la
pulpa dental y del sistema de conductos radiculares y el consecuente
desarrollo de lesin perirradicular. Sin embargo, las bacterias asociadas a la
caries dental difieren de las asociadas a la infeccin pulpar. (Love et al. 2002)
3.4 EL MEDIO ENDODNTICO

El medio endodntico es un sistema complejo y dinmico. Complejo, pes
tenemos el conducto radicular, con sus caractersticas particulares en cuanto
a forma y a distribucin (conductos amplios, atrsicos, curvos, rectos,
bifurcados, conductos accesorios, conductos laterales, deltas apicales)
conforman una red amplia de microambientes de difcil acceso y que
favorecen (por contener tejido necrtico como fuente de nutrientes) el
crecimiento de microorganismos. Dinmico, pues los microorganismos
implicados en una lesin inicial de la pulpa no sern los mismos que se
encuentren en una necrosis pulpar, en la que se forma un ecosistema
radicalmente diferente. En este medio ambiente particular, que es el
endodntico, cobra importancia el concepto de sucesin microbiana
(Libana, 1997).

La sucesin microbiana es el proceso mediante el cual se produce una
variacin o un cambio de microorganismos condicionado por alteraciones en
el hbitat. Es lgico, por tanto, esperar un cambio en cuanto a la composicin
de la flora bacteriana, pues se produce una alteracin radical del medio
ambiente endodntico. De pulpas recientemente infectadas, son aisladas
mayores proporciones de bacterias Gram positivas, anaerobias facultativas y
sacarolticas, tales como Lactobacillus y Actinomyces spp. (Libana, 1997).

Con la evolucin del proceso infeccioso, estas bacterias van consumiendo
gradualmente el oxgeno presente en el medio y las condiciones en el interior
del conducto se van paulatinamente alterando, favoreciendo el desarrollo de
bacterias anaerobios estrictos, siendo la mayora de stas Gram negativas y
proteolticas. (De Lorenzo 2004, Kawashima, 1996).

La particularidad de estas bacterias, tales como: Prevotella, Porphyromonas
y Fusobacterium, es su ubicacin inicial en el peripice, regin de la cual
pueden obtener fcilmente el exudado rico en contenido proteico y en donde
las condiciones de anaerobiosis son las ms propicias. Con el desarrollo de
la necrosis, ste exudado pasa a todo el canal, aportando el contenido
proteico y permitiendo el predominio de estas bacterias a lo largo de todo el
sistema endodntico. (De Lorenzo 2004, Kawashima, 1996). Toda infeccin
endodntica es de carcter polimicrobiana. (Brook et al. 1996).

Los anaerobios no son encontrados en cultivos puros porque su naturaleza
sinrgica requiere de nutrientes especficos para su crecimiento, los mismos
que son aportados por otro tipo de microorganismos. (Sundqvist, 1992).

3.4.1 REQUERIMIENTOS PARA UN PATGENO ENDODONTICO
Para que un microorganismo logre su objetivo deben darse ciertos
requerimientos:
Los microorganismos deben estar presentes en cantidades
suficientes para iniciar y mantener una lesin periapical
Poseer factores de patogenicidad, que puedan expresarse durante el
proceso infeccioso

Deben localizarse espacialmente en el canal radicular para que sus
factores de patogenicidad alcancen los tejidos periapicales
El canal radicular debe permitir la supervivencia y crecimiento de los
microorganismos.
Las relaciones antagnicas entre los microorganismos no deben
darse o presentarse en baja proporcin.
El husped debe defenderse, inhibiendo la diseminacin de la
infeccin, ste proceso puede resultar en dao del tejido periapical.
(Siqueira et al. 2002).
Los microorganismos que componen la microflora oral, coexisten en
ecosistemas primarios que estn regulados por una serie de factores
conocidos como determinantes ecolgicos que son de cinco tipos: (Libana,
1997).
Fisicoqumicos
De adhesin, agregacin y coagregacin
Nutricionales
Protectores del husped
Antagnicos interbacterianos
3.4.2 Fisicoqumicos:
a) Humedad
Las bacterias dependen de ella para el intercambio de nutrientes, para las
reacciones metablicas y para la eliminacin de productos inhibidores de
desecho. (Libana, 1997).

b) pH
En la cavidad oral en condiciones normales oscila entre 6.7 y 7.5, pero
constantemente esta sometido a variaciones que afectan el metabolismo
bacteriano. (Libana, 1997).
c) Temperatura
La temperatura oral est prxima a los 37 C pero tiende a variar
transitoriamente por la ingesta de alimentos calientes o fros por lo que se
eliminan microorganismos de forma transitoria. (Libana 1997).

d) Potencial de xido-reduccin
El hbitat de los grmenes anaerobios tiene una baja tensin de oxgeno y
un potencial de xido reduccin disminuido, resultado de la actividad
metablica de los microorganismos que consumen oxgeno mediante su
respiracin. (Libana 1997).
3.4.3 Factores de Adhesin, Agregacin y Coagregacin
a) Adhesin
Es la interrelacin que se da entre los microorganismos y el husped,
lo que permite la colonizacin de los tejidos.
b) Agregacin y Coagregacin
Unin entre bacterias de la misma o diferente especie
respectivamente que les permite acumularse y formar colonias.
(Libana 1997).
Entre las especies mas comunes en los canales radiculares necrticos, se
encuentra, Fusobacterium nucleatum, el cual muestra una alta habilidad para

coagregarse in vitro con la mayora de las bacterias orales (Sundqvist G.
1992).
3.4.4 Nutricionales
La microbiota oral obtiene sus nutrientes de tres fuentes distintas: de los
tejidos o secreciones del husped (fuentes endgenas), de otros
microorganismos (fuentes interbacterianas) y de la dieta alimentara (fuentes
exgenas). (Libana, 1997)
3.4.5 Protectores del husped
Son todos aquellos factores que limitan por parte del husped el ingreso
penetracin y colonizacin bacteriana tales como: Integridad de mucosas y
del tejido dental, masticacin, deglucin, tejidos linfoides, y la saliva por su
accin mecnica, qumica e inmunitaria. (Libana, 1997).
3.4.6 Antagnicos intermicrobianos
A nivel microbiano se dan relaciones entre especies bacterianas que
determinan la supervivencia de unas y la eliminacin de otras lo cual llega a
establecer un tipo de microflora determinado. (Libana, 1997).
3.4.7 Modelos de relacin microbiana
Un ecosistema oral, constituye una comunidad microbiana que habita en la
cavidad oral, y como comunidad existen relaciones entre las diferentes
especies all presentes. Las relaciones que se dan entre las bacterias,
tienden a dividirse en relaciones positivas, neutras y negativas. (Libana,
1997).

a) Relaciones positivas

Son relaciones en que dos microorganismos obtienen ventaja de la
asociacin. Entre las relaciones positivas destaca el mutualismo o simbiosis.
(Libana, 1997).
b) Relaciones neutras

En esta relacin, ninguna de las especies se ve afectada, se puede obtener
ventaja de una de ellas pero sin perjudicar a la otra. Entre ellas el
comensalismo, en la que se destaca la presencia de anfibiontes, los cuales
son microorganismos que mantienen una relacin comensal con otro, pero
que en determinadas condiciones , como por ejemplo una disminucin en la
capacidad de defensa del hospedador, pueden llegar a establecer una
relacin de parasitismo.(Libana,1997).
c) Relaciones negativas

Se dan cuando uno de los microorganismos se ve perjudicado por la relacin
con otro microorganismo. La principal relacin negativa es la antibiosis o
antagonismo que se da cuando un microorganismo impide el crecimiento de
otro, obtenindose de esta forma una ventaja ecolgica ya que se disminuye
la competencia. Esto se da por la produccin de bacteriocinas que son
sustancias inhibitorias del crecimiento de otras bacterias, entre las que se
pueden citar las mutacinas que son bacteriocinas producidas por algunas
cepas de Streptococcus mutans orales. (Libana, 1997).
La depredacin es otro tipo de relacin negativa en que uno de los
microorganismos mata al otro y se alimenta de l. Otra relacin negativa es

el parasitismo en que una de las especies vive en o sobre la otra obteniendo
beneficio del hospedador a costa del perjuicio de ste. Un ejemplo de
relacin negativa es la que se da cuando determinadas especies de
estreptococos orales que producen perxido de hidrgeno, ejercen una
accin txica sobre otras bacterias que carecen de sistemas detoxicantes.
(Libana,1997).

Los lactobacilos y los estreptococos son importantes productores de
bacteriocinas, que juegan un papel muy importante en la ecologa de la
microflora de la mucosa oral. Esta produccin de bacteriocinas puede inhibir
el acceso de bacterias exgenas a la cavidad oral y al tracto respiratorio.
(Sundqvist G. 1992).
De esta forma se ha observado que, las interacciones microbianas tanto
positivas como negativas, pueden regular significativamente la presencia de
diferentes especies microbianas en un mismo nicho (Sundqvist G. 1992).
Se han reportado varias asociaciones bacterianas en conductos radiculares
de dientes necrticos, entre ellos: Fusobacterium nucleatum con
Peptostreptococcus micros, Selenomonas sputigena, Campylobacter rectus y
Porphyromonas endodontalis. Prevotella intermedia es afn a
Peptostreptococcus micros, Peptostreptococcus anaerobius y Eubacterium
spp; mientras que se ha observado que Porphyromonas endodontalis inhibe
el crecimiento de Prevotella intermedia. (Sundqvist G. 1992).
Algunas combinaciones de bacterias resultan ms potentes que otras, por
ejemplo, la unin entre Prevotella, Porphyromonas, Fusobacterium y
Peptostreptococcus, incrementan el grado de destruccin periapical.
Experimentalmente la induccin de infecciones radiculares en monos

utilizando nicamente Enterococcus faecalis, indujo una modesta destruccin
periapical en comparacin con la combinacin entre Enterococcu faecalis,
Streptococcus milleri y ctinomyces bovis, que demostr ser mas agresiva.
(Libana, 1997).

3.4.8 Actividad Enzimtica Bacteriana.

Hoy en da se asume que la microbiota endodntica est representada,
principalmente, por microorganismos Gram negativos, los cuales viven, se
multiplican y eventualmente mueren en el conducto radicular infectado,
liberando en este proceso endotoxinas. La actividad endotxica est
fuertemente relacionada con la presencia y el nmero de bacterias Gram
negativas en el canal radicular (Pajari et al. 1993) stas en un determinado
momento, pueden superar el foramen apical e iniciar una lesin a ese nivel.
(Dalby, 2000).

Las endotoxinas contenidas en la pared celular de las bacterias Gram
negativas son las sustancias responsables de los mecanismos inflamatorios
que se desencadenan a nivel pulpar. Son liberadas al medio despus de la
desintegracin de la bacteria, lo que produce diversos efectos biolgicos,
como fiebre o estimulacin de la actividad linfoctica. (Dalby, 2000).

Las endotoxinas estn presentes en altas concentraciones en conductos
radiculares de dientes con necrosis pulpar sintomtica y son antgenos no
especficos que pueden desencadenar reacciones inflamatorias especficas e
inespecficas, donde intervendrn clulas fagocitarias de defensa (linfocitos,
macrfagos y neutrfilos), las cuales liberarn diferentes sustancias qumicas
que actuarn como potenciadores, mediadores o inhibidores de la patologa
pulpar y periapical. (Jawetz et al.1999).

Algunos microorganismos anaerobios producen enzimas extracelulares como
colagenasas y proteasas que al parecer estimulan la invasin bacteriana de
los tejidos. (Dalby, 2000).

3.5 MICROORGANISMOS MS FRECUENTES ASOCIADOS A LAS
LESIONES PULPARES.

3.5.1 Fusobacterium nucleatum:
Son bacterias pleomorfas que aparecen con formas muy variables: en huso,
globulosas, redondeadas, finas, etc. Son moderadamente sacarolticas,
aunque sintetizan material de reserva intracelular a expensas de polmeros
de glucosa. Sus fuentes nutricionales y energticas mas importantes
provienen del catabolismo de pptidos y aminocidos, elaborando como
producto metablico final especialmente acido butrico. A diferencia de otros
bacilos Gram negativos anaerobios estrictos son resistentes al verde
brillante. Puede aislarse como hbitat primario en la cavidad oral y adems
aislarse del intestino, vas respiratorias aunque se encuentra por lo general
en el surco gingival. (ANEXO 1) (Libana 2002).

Aun as, in vivo, los factores de virulencia de F. nucleatum no estn
claramente definidos, su poder patgeno se relaciona con la endotoxina,
leucotoxina, compuestos solubles que inhiben la quimiotaxis de los
neutrfilos, fosfatasas, etc. Si parece importante su capacidad de
coagregarse con otras bacterias favoreciendo los procesos de colonizacin y
formacin de placas. Tambin se sabe que los cidos grasos de cadena
corta (especialmente el cido butrico) y el amoniaco obtenido a partir de
aminocidos (p. ej. cistena o metionina) pueden comportarse como txicos
tisulares, igualmente, producen dos compuestos malolientes que estn
implicados en la halitosis (SH, metilmercaptano). (Libana, 2002)

3.5.2 Porphyromonas gingivalis:
Comprende bacterias asacarolticas, es decir que no metabolizan los hidratos
de carbono ni por la va de Embden-Meyerhof-Parnas (gluclisis) ni por la
ruta pentosa de fosfatos, debido a que carecen de enzimas como la glucosa-
6-fosfato deshidrogenasa y gluconato-6-fosfato-deshidrogenasa. Emplean
compuestos nitrogenados como fuentes energticas, no se desarrollan en
presencia de bilis al 20%. Este microorganismo se encuentra en el surco
gingival, de forma especial cuando hay lesiones periodontales avanzadas;
mas raramente puede detectarse, quizs a modo de reservorio, en el dorso
de la lengua, amgdalas y saliva. No se le considera como parte integrante de
la microbiota oral normal sino como un patgeno exgeno ausente en
individuos sanos. Se le relaciona con multitud de procesos patolgicos:
gingivitis, pulpitis, abscesos periodontales y periapicales. Para su
aislamiento, los medios de cultivo deben incluir vitamina K y de forma
especial, por su dependencia del hierro, hemina o sangre, habitualmente a
de carnero lacada, esto es, congelada y descongelada para que, al romperse
la membrana de los hemates, se liberen mejor los nutrientes. Para hacer los
medios selectivos se aaden antibiticos no activos sobre P. gingivalis; es el
caso de kanamicina, tobramicina, acido nalidxico, colistina o bacitracina
(medio preconizado por Hunt). Las colonias, claramente diferenciadas,
aparecen tras una incubacin de al menos 48 horas a 36 +/- 1 C; muestran
la tpica pigmentacin marrn oscura o negra y no fluorescente bajo una luz
ultravioleta. Las caractersticas in vitro para su identificacin, son aparte de
las del gnero, la produccin de indol a partir del triptfano y el hecho de
poseer una enzima proteoltica semejante a la tripsina que hidroliza un
sustrato incoloro, la Benzoil.D-L- arginina-B naftilamida (BANA) dando
origen a un compuesto coloreado (B-naftilamida). (Libana, 2002).
Sus factores de virulencia:

Capsula: es de naturaleza polisacrida que aparte de permitir la subdivisin
de la especie en seis serotipos, tiene una accin antifagocitaria por su efecto
antiopsnico.
Membrana externa: tiene gran inters fisiopatolgico por poseer protenas
que se comportan como adhesinas que participan en fenmenos de adhesin
y coagregacion bacteriana y, por tanto, en la colonizacin de clulas
epiteliales y fibroblastos y en la formacin y mantenimiento de la placa
subgingival. Con respecto a esto ultimo cabe destacar los procesos
coagregativos de P. gingivalis con Fusobacterium nucleatum y Actinomyces
naeslundii. (Libana, 2002).

La endotoxina asociada al lipopolisacrido (LPS) cuya actividad endotxica,
con respecto a otras bacterias Gram negativas, no parece muy importante.
Formar vesculas superficiales que se liberan con facilidad del resto del soma
celular; dichas vesculas atraviesan barreras impermeables a la clula
completa y transportan, de esta forma, factores de virulencia que serian
trasladados a distancia. (Libana, 2002).

Fimbrias: como las protenas de la membrana externa y con sus mismas
consecuencias, se comportan como adhesinas e intervienen en fenmenos
de coagregacion y adhesin a superficies epiteliales y dentales, en este caso
con la mediacin de la saliva. (Libana, 2002).

Proteasas: P. gingivalis produce una amplia gama de enzimas proteolticas;
algunas se asocian a la membrana externa y otras se liberan al exterior o son
transportadas a distancia por las vesculas superficiales. El efecto destructivo
de estas enzimas se extiende tambin a elementos del sistema inmunitario,
permitiendo la evasin bacteriana de la respuesta del hospedador. Se
comprende que estas proteasas, al comportarse como agresinas e

impedinas, desempean un papel importante en el surco gingival para
producir periodontitis. (Libana, 2002).

Otros compuestos proteicos: es el caso de la superxido dismutasa, que
permite a P. gingivalis resistir la accin oxidante de los radicales superoxido
generados en el interior de los leucocitos polimorfonucleares. Otras
exoenzimas que tambin contribuyen al dao tisular como hialuronidasa,
fosfatasa alcalina; y una exotoxina del tipo epiteliotoxina de gran importancia
en el proceso penetrante de los tejidos. (Libana, 2002).

Metabolitos txicos tisulares: son cidos grasos de cadena corta, amoniaco,
compuestos azufrados voltiles, metilmercaptano, que aumenta la
permeabilidad de la mucosa oral. (Libana, 2002).

Molculas antibacterianas: muchos de los metabolitos citados ejercen un
efecto competitivo con otras bacterias; a ellos hay que aadir la produccin
de bacteriocinas por parte de algunas cepas de P. gingivalis. Todas estas
molculas estn implicadas en las amplias interrelaciones que las bacterias
establecen en la cavidad oral. (ANEXO 2) (Libana, 2002).

3.5.3 Prevotella spp.
Comprende bacterias moderadamente sacarolticas por la va Embdem
Meyerhof Parnas pero no metabolizan los glcidos por la va de las pentosas
fosfato ya que carecen de las enzimas glucosa-6 fosfato deshidrogenasa y
gluconato-6 fosfato- deshidrogenasa. No se desarrolla en presencia de bilis
al 20%. Son resistentes a la vancomicina.
Especies pigmentadas:
P. melaninogenica, P. intermedia, P. nigrescens, P. corporis, P. loescheii, P.
pallens, P. denticola (algunas de cuyas cepas no son pigmentadas). Se les

relaciona con mayor o menor grado con multitud de procesos, como
infecciones pulpares, absceso periapical, alveolitis, etc. En la mayora de los
casos su patogenicidad no es muy bien conocida, de forma que participaran
en estos procesos unidas a otras bacterias de carcter sinrgico. Con
respecto a las enfermedades periodontales la mas implicada son P.
intermedia y P. nigrescens cuyas colonias al contrario de P. gingivalis, emiten
fluorescencia; la primera especie esta presente en el surco gingival en una
de cada dos personas con buena salud periodontal y su prevalencia pasa a
tres de cada cuatro sujetos con problemas de gingivitis o periodontitis; por
ello resulta difcil atribuirle un papel claro como periodontopatogena; con
respecto a P. nigrescens se asla aun con mayor frecuencia en individuos
sanos. P. intermedia, P. melaninogenica, P. loescheii se han descrito fimbrias
como adhesinas y residuos proteicos y glucoproteicos superficiales, pueden
actuar como receptores de otras adhesinas. Tambin se ha comprobado la
capacidad para degradar inmunoglobulinas, su accin toxica sobre los
fibroblastos y su actividad fibronoltica. La boca es un reservorio habitual para
estas bacterias. Especies no pigmentadas (Koneman. 1999).

Son P. buccae, P. buccalis, P. oris, P. oulorum, P. veroralis y P.
zoogleoformas, P tanerae y P. enoeca. La mayora de ellas tienen como
hbitat primario el surco gingival, algunas especies son ms abundantes en
las enfermedades periodontales aunque su grado patgeno real se
desconoce. (ANEXO 3) (Libana, 2002).

3.5.4 Peptostreptococcus spp:
Son cocos de cadenas cortas o emparejados Gram positivos, no
formadores de esporas, anaerobios su factor de virulencia est en la enzima
de la colagenasa y betalactamasa. Se aslan frecuentemente en procesos
infecciosos supurados que tienen carcter mixto y polimicrobiano: en el

cerebro y los senos, pleuropulmonares, peritoneales, etc. Tambin se
detectan con el mismo carcter con lesiones de caries de dentina, formas
avanzadas de periodontitis, abscesos de origen dental, conductos radiculares
infectados, etc. Ante una identificacin preliminar de cocos Gram positivos
anaerobios, la sensibilidad mediante la tcnica de disco-placa a polianetol
sulfonato sdico (SPS) indica la identificacin de Peptostreptococcus
anaerobius y as la fcil diferenciacin de este ltimo por su morfologa
microscpica (tamao) y porque se identifica muy bien con los micromtodos
que detectan enzimas preformados, un cromatograma abigarrado, incluyendo
hasta cido isocaproico en los productos finales del metabolismo.
nicamente en el caso de P. anaerobius la cromatografa separa un gnero y
una especie concreta, en el resto, y segn los ltimos cambios taxonmicos,
los productos finales del metabolismo son los mismos para los distintos
gneros. Aqu se da la paradoja de que con los caracteres fenotpicos
usualmente estudiados, hay que llegar al diagnstico de especie para poder
llegar al gnero adecuado. Cuando esto no sea posible, quizs sea bueno
conocer en que grupo se est. (ANEXO 4) (Alcal et al, 2004).

3.5.5 Streptococcus mutans
Se asla en el 70.90% de la poblacin no desdentada y resistente a la caries
(portadores). En individuos con caries activa o especialmente predispuestos
su cantidad aumenta significativamente. Se considera el microorganismo
cariogeno por excelencia. Por su especial capacidad de colonizar superficies
duras se asla en la cavidad oral, sobre todo a partir de placa
supragingivales, radiculares y saliva, en cuyo caso su origen es secundario a
la localizacin en las placas. Igualmente su papel es importante en las
endocarditis subagudas, representando entre el 7.14% de todas las
originadas por los estreptococos. (ANEXO 5) (Libana, 2002).

Sus colonias en agar sangre son y hemolticas y excepcionalmente -
hemolticas. En su estructura antignica hay que destacar que poseen los
polisacridos parietales c, e y f, y, protenas asociadas a la mureina
conocidas como antgenos I y II estas protenas u otras similares participan
en procesos adhesivos: a) como adhesinas interactuando con receptores de
la pelcula adquirida, tales como protenas ricas en prolina. b) como
glucosiltransferasas y receptoras de glucano en fenmenos agregativos y
coagregativos entre bacterias que colonizan los dientes. (Libana, 2002).

Los factores de virulencia a destacar son:
a) Sntesis de polisacridos intracelulares.
b) Sntesis de polisacridos extracelulares de tipo glucano insolubles y
solubles y fructanos
c) Movilizacin de polisacridos intracelulares por glucgeno fosforilasa y
extracelulares solubles por dextranasas y fructanasas.
d) Poder acidogeno, acidofilo y acidurico, inicio de crecimiento a pH 5 y
corto efecto post-pH.
e) Importante capacidad adhesiva por las protenas parietales, que
facilitan su adhesin en superficies duras en ausencia de glucanos,
agregativa y coagregativa, a travs de glucanos y protenas receptoras
de glucanos.
f) Produccin de bacteriocinas con actividad sobre otras bacterias Gram
positivas que podran tener una significacin ecolgica, aunque no
esta demostrada in vivo su importancia como factor selectivo de la
microbiota. (Libana, 2002).

3.5.6 Enterococcus spp
Pertenecen a este genero numerosas especies, la mas frecuente en
patologa humana es Enterococcus faecalis, seguida de Enterococcus
faecium. Se asocian en parejas y cadenas cortas; en cultivo son muy
parecidas a los estreptococos. Pertenecen al serogrupo D pero fueron
separadas de los estreptococos por carcter quimiognico. Sus factores de
virulencia no son muy bien conocidos. Su hbitat es el intestino. Producen
una gran variedad de procesos infecciones extraorales que plantean un
problema particular de tratamiento antibitico. Por su metabolismo anaerobio
son intrnsecamente resistentes a los aminoglucsidos que, sin embargo
pueden penetrar si se unen a otros compuestos que inhiben la sntesis del
peptidoglucano al ingresar en el interior de las bacterias, pero aun as no
sern tiles si las cepas muestran altos niveles de resistencia por la
produccin de enzimas inactivantes; por otra parte, las cefalosporinas no son
eficaces por la baja afinidad de sus PBP a las misma. (Koneman, 1999).

Enterococcus faecalis: Coco anaerobio facultativo Gram positivo que habita
el tracto gastrointestinal y genitourinario femenino. La mayora de sus cepas
son homofermentativas, no producen gas, no poseen enzimas citocrmicas y
se obtiene cido lctico por fermentacin de la glucosa. En su pared celular
poseen antgenos del grupo D y un acido lipoteicoico intracelular asociado a
la membrana citoplasmtica. Puede crecer en temperaturas entre 10
o
y 45
0
C.
Es un microorganismo oportunista, causa infecciones nosocomiales en
diferentes grados de compromiso. Crece con facilidad en medios difciles con
poca cantidad de oxigeno y nutrientes y forma biopeliculas entre si o con
microorganismos de otras especies. Otro factor que favorece su crecimiento,
es el potencial de oxido reduccin elevado. (ANEXO 6) (Libana, 2002).
Se asocia fuertemente a casos de fracaso de tratamientos de conductos,
aunque eventualmente, se ha visto en presencia de lesiones primarias de

origen pulpar. Enterococcus faecalis se puede encontrar asociado a
Streptococcus, Lactobacillus y otras bacterias facultativas as como bacterias
anaerobias lo que puede crear una flora mixta aun ms virulenta. (Liebana
2002).

3.5.7 Candida albicans:
Las especies Candida crecen como clulas de levaduras tpicas de 4-6 m
redondas u ovaladas con gemacin en la mayora de las condiciones y en
casi todas las temperaturas, crecen en condiciones de anaerobiosis en
medios de cultivo a pH con rango entre 2,5 y 7,5 y la temperatura oscila entre
20
o
y 38
o
, el crecimiento de colonias se puede detectar entre 48 y 72 horas
despus de la siembra. (Libana, 2002).

Los microorganismos del genero Candida son oportunistas se encuentran
como comensal en la cavidad bucal, intestino, vagina, secrecin bronquial y
piel del hombre. Las colonias de esta especie se observan
macroscpicamente: color crema cerosa, hmedas, redondas. Y
microscpicamente son blastosporas redondas u ovales. (Libana, 2002).

Candida albicans a lo largo de la historia ha sido causante de diferentes
enfermedades en humanos, las cuales generalmente se produce por tres
mecanismos: por invasin de cepas colonizantes del tracto gastrointestinal o
la piel; como consecuencia de transmisin vertical en el neonato o en raras
ocasiones por trasmisin horizontal adems esta especie puede llegar a
producir infeccin cuando el hospedero tiene algn factor predisponente y de
esta manera ocasionar un grupo de manifestaciones clnicas que pueden
presentarse en la zona cutnea, mucocutnea o de formas sistemticas
(Castrillon. et al. 2005). C. albicans tiene varios atributos de virulencia para

colonizar el hospedero y ocasionar daos de forma directa al activar, resistir
o desviar los mecanismos de defensa del mismo. Estos atributos que
contribuyen a la patognesis de C. albicans incluye la morfognesis
(transicin entre las clulas levaduras unicelulares y las formas de
crecimiento filamentosas), las enzimas secretadas aspartil proteasas (SAP) y
fosfolipasas y las biomolculas de reconocimiento del hospedero
(adhesinas), que le permiten iniciar el proceso de formacin de biopeliculas.
As mismo, el cambio de fenotipo se acompaa por alteraciones en la
expresin de antgenos, morfologa colonial afinidades de C. albicans a los
tejidos. (Castrillon et al 2005)

Candida albicans es un microorganismo muy verstil, por su capacidad para
sobrevivir como comensal en varios sitios anatmicamente distintos como la
piel, intestino, cavidad vaginal y oral. En el esputo expectorado y en la vejiga
urinaria de los pacientes con catteres a permanencia; ya que en promedio
del 25 al 30% de los individuos son portadores de C. albicans en estas
cavidades. Adems de el reservorio endgeno (cavidades naturales del
hombre), tambin se puede adquirir de fuentes exgenas y se aslan de
superficies ambientales. (ANEXO 7) (Bonardello et al. 1999).

3.5.8 Filifactor alocis:
Es un bacilo, no esporulado, anaerbico obligado, Gram negativo, las
clulas miden de 0.4-0.7 m de ancho por 1.5-7.0 m de largo. Tienen forma
cnica redondeada. Algunas cepas han demostrado algn tipo de movilidad
esto sin observar flagelo alguno. Las colonias en agar sangre son pequeas
puntiformes con 1.0 mm de dimetro. Son circulares, convexos, lisas,
translucidas a transparentes, brillantes y no hemolticos. (Siqueira-Rocas,
2003). Los principales productos metablicos en caldo de glucosa son
pequeos a moderadas cantidades de butirato y acetato. Con abundante H
2

que puede ser detectado como halos alrededor, estos es, cuando hay
suficiente crecimiento. Las cepas de estas especies muestran un mnimo
crecimiento y no reaccionan a pruebas bioqumicas y es muy utilizado para
la diferenciacin de otras especies de Fusobacterium a partir de determinar
las protenas celular solubles por electroforesis y por el contenido de G+C de
ADN. El principal hbitat de F. alocis aparecen en el surco gingival y estudios
ha demostrado que est envuelta en la patognesis de la periodontitis.
Debido al escaso crecimiento que tiene este microorganismo y los mtodos
de identificacin bioqumica no son suficientes y lo hace ms difcil detectar y
relacionar con enfermedades endodnticas. Su deteccin se hace ms
eficiente con mtodos moleculares como el PCR. (Tabla 1) (Siqueira-Rocas,
2003).

Principales Gneros y Especies de la Microbiota Oral.

Tabla 1. Principales gneros y especies de microbiota oral. (Aguilar 2004)

3.6 MICROORGANISMOS POCO FRECUENTES EN LESIONES
PULPARES

Se han realizado estudios que revelan la presencia de otros microorganismos
poco comunes entre ellos se encuentra Coxiella burnetii y segn
Abuodharam et al (2002), adems de su deteccin pudo corroborar la teora

de la colonizacin de la pulpa dental a partir de la invasin del torrente
sanguneo en ausencia de inflamacin (anacoresis) Bajo este reporte se
pudo sustentar con resultados que por primera vez la colonizacin por C.
burnetii en la pulpa dental por va sangunea es un hecho. Su trabajo fue
desarrollado en inicio con la inoculacin intraperitoneal en conejillos de indias
y posteriormente con la tcnica de amplificacin PCR y secuenciacin
directa, C. burnetii fue recuperada hasta en un 50 % de los animales.

Dialister pneumosintes es un bacilo no fermentativo, anaerbico, Gram
negativo, que crece en agar sangre formando colonias pequeas, circulares,
transparentes, lisas, y brillantes. Se ha recuperado de la profundidad de la
cavidad periodontal y se ha relacionado la enfermedad periodontal con el
microorganismo, Doan, et al (2000), hace referencia a la identificacin por la
tcnica de PCR a partir de la muestra periodontal. Cabe destacar que
previamente al realizar pruebas bioqumicas no hay consistencia para la
identificacin de Dialister Pneumosintes adems que no es frecuente
encontrar tal microorganismo en la placa subgingival ya que es muy poco lo
reportado. Por esto Doan y colaboradores dieron a conocer una
identificacin definitiva de D. pneumosintes como un organismo que se
encuentra en muestras de placa subgingival, as como desarrollar un mtodo
de deteccin PCR para D. pneumonsintes y comparar la eficacia entre los
mtodos de deteccin entre medios de cultivo y PCR.

Otro tipo de microorganismo rara vez encontrado en lesiones pulpares es
Yersinia pestis en un plano histrico Drancourt et al (1998) identificaron
ADN de Yersinia pestis en pulpa dental de hace 400 aos lo que evidencia su
presencia y esto gracias a la durabilidad de la pulpa dental as como tambin
mantenerse una esterilidad natural en ella. Cabe mencionar que fueron
recolectadas las muestras de dos esqueletos del siglo 16 que se suponen

que murieron por la plaga dental de la poca. El uso de PCR para la
extraccin de ADN antiguo e incorporacin de primers especficos para el
gen humano beta-globina demostr la ausencia de inhibidores. La
incorporacin de primers especficos para Y. pestis rpoB (el gen codificante
de la subunidad-beta para la ARN polimerasa) y asociado a la virulencia (gen
codificante para la activacin del plasmingeno) con esto se logro obtener
una indistinguible secuencia de nucletidos para su identificacin de la
bacteria. Tambin dedujeron los autores que a partir de la pulpa dental
promete ser un blanco atractivo para determinar la etiologa de
enfermedades septicmicas ancestrales. (Drancourt et al.1998).

Otros microorganismos son: Bifidobacterium spp, Lactobacillus spp,
Mogibacterium ssp, Lachospiraceae ssp, Aggregatibacter
actinomycetemcomitans, Megasphaera spp, Leptotricia buccalis, Selemonas
sputigena, Serratia mercescens, Gemella spp, Tannerella forsythensis.
(ANEXO 8)

3.7 Medios de cultivo

Son preparados que intentan reproducir artificialmente las condiciones del
hbitat natural de los agentes bacterianos. Sus componentes deben cubrir
todas las necesidades nutricionales de las bacterias que se van a estudiar y
deben incorporarse en una mezcla justa y equilibrada. (Libana, 2002)
Clasificacin de los medios de cultivo se hace en funcin de su contenido, de
su estado y de su utilidad, segn Libana (2002)

1. Segn su contenido.

a.) Definidos o sintticos: Se conoce perfectamente la composicin
qumica, ya que se elaboran aadiendo productos puros e
individualizados.

b.) No sintticos o empricos: No se conoce la composicin exacta; se
prepara con extractos de carne, de levadura, peptonas etc. su empleo
se basa en la experiencia y son los medios ms utilizados (ej., agar
cerebro corazn o agar Mueller Hilton)

2. Segn su estado.

a.) Lquidos: Son llamados caldos (ej., caldo tioglicolato, caldo cerebro
corazn) los constituyentes estn disueltos en el agua sin sustancias
solidificantes. Se utilizan sobre todo para inocular muestras o cuando
se cultiva un nico microorganismo, para obtener una masa
microbiana u observar las caractersticas de crecimiento.

b.) Semislidos: Contienen agar en escasa proporcin (menos del 1%) se
utilizan como medios para analizar alguna caracterstica especial de
las bacteria, como por ejemplo la movilidad o la capacidad oxidativa
fermentativa. Tambin se emplean como medios de transporte de
muestras clnicas (ej., medio Stuart)

c.) Slidos: Se obtienen agregando agar al medio liquido en una cantidad
suficiente para que solidifiquen, segn su utilizacin, se distribuyen en
tubos o platos de petri, se utilizan principalmente para pruebas de
identificacin bioqumica (ej., bilis esculina agar)

3. Segn su utilizacin:

a.) Bsicos o comunes: Son aptos para las bacterias no exigentes y
contienen los nutrientes mnimos para el desarrollo.

b.) Enriquecidos: Son medios bsicos que se suplementan con sustancias
muy nutritivas para bacterias exigentes, como la sangre, el suero, etc.

c.) Selectivos: Estos medios permiten el crecimiento de algunas bacterias
e inhiben el de otras se utilizan en casos que interese recuperar
ciertos tipos de microorganismos y se desee impedir el crecimiento de
otros.

d.) Diferenciales: Estos medios llevan incorporados determinadas
sustancias que pondrn de manifiesto visualmente la presencia de
alguna caracterstica bioqumica de la bacteria.

Cada microorganismo requiere una variedad de condiciones especiales para
su crecimiento. Para conseguir su desarrollo, es fundamental otorgarle tanto
condiciones fsico-qumicas ptimas como un medio de cultivo que contenga
los nutrientes necesarios para su multiplicacin. (ANEXO 9) (Libana 2002).

3.7.1 Anlisis Microbiolgico

Reconociendo la evidencia de la participacin de los microorganismos en el
establecimiento y manutencin de los procesos en el conducto radicular y en
la regin periapical, el anlisis microbiolgico como recurso de la
determinacin del efecto teraputico no se constituye en tcnica de rutina en
las clnicas de endodoncia y en instituciones acadmicas (Siqueira, 1997).
Los procedimientos microbiolgicos, relativos a la recoleccin, transporte,
siembra e incubacin, con el objeto de preservar y propagar los
microorganismos anaerobios presenta poca practicidad, son costosos y
consumidores de tiempo; las tcnicas genticas presentan restricciones a
nivel de la practica y evaluaciones clnicas; el resultado negativo puede
expresar falta de sensibilidad de la tcnica; el uso de eficientes sustancias
antimicrobianas durante el tratamiento qumico-mecnico y en la medicacin
intracanal optimizan el control microbiano. Aun con aquellas limitaciones,
actualmente el anlisis microbiolgico con base en el cultivo de
microorganismos oriundos del conducto radicular parece constituirse en
recursos de laboratorio valioso en el contexto de la tcnica endodntica.
(Estrela 2005).

En la investigacin, su importancia es significativa una vez que permite el
estudio de la etiopatogenia del proceso; soporta la evaluacin de la
efectividad antimicrobiana de sustancias usadas en el tratamiento; y por
consiguiente, contribuye para el perfeccionamiento de la tcnica endodntica.

Finalmente el anlisis microbiolgico de los conductos radiculares es til en
la evaluacin y acompaamiento de los casos recidivantes, porque permite,
por ejemplo, el aislamiento de microorganismos de los gneros
Enterococcus, Actinomyces y Propionibacterium (originalmente Arachnia)
(Molander et al. 1998), facilitando su identificacin y posteriormente
permitiendo la determinacin de su perfil de sensibilidad a antibiticos y/o
quimioterpicos (Molander et al. 1998).

El protocolo para el ensayo microbiolgico de naturaleza cultivable, concluido
el tratamiento qumico-mecnico, consisten lo siguiente:
a. Adicin de la solucin de muestreo, haciendo movimientos de
introduccin y retirada con la ayuda de una lima.
b. Repeticin del procedimiento
c. Retirada del material adherido a las paredes del conducto con
lima endodntica y, en la secuencia, su corte en el segmento
activo, con subsiguiente inmersin del mismo en medio de
transporte
d. Homogenizacin de la mezcla y transferencia del segmento de
la lima para el medio de cultivo correspondiente y/o repique de
la suspensin microbiana
e. Incubacin
f. Lectura e interpretacin de los resultados.

Es importante destacar que lo referido anteriormente debe ser realizado
integralmente en condiciones aspticas, evitando que microorganismos
contaminantes interfieran en el resultado. De la misma manera, el uso de
sustancias neutralizantes del agente antimicrobiano utilizado durante el
tratamiento provoque resultados falsos negativos. (Estrela 2005).

Los medios de transporte tienen por finalidad la preservacin de los
microorganismos, eventualmente generados en el material clnico, desde su
recoleccin hasta el adecuado procesamiento en laboratorio. Por su
composicin y caractersticas esos medios tienen accin sttica, impidiendo,
de ese modo, que ocurran alteraciones en la proporcin original de los
microorganismos, as como condiciones capaces de proteger la microbiota
endodntica de los efectos txicos del oxigeno molecular; el uso de esos
medios actualmente constituyen un recurso universal a medida que los
microorganismos conservan su viabilidad en los mismos. Entre los medios de
transporte comnmente recomendados, se encuentran: Medio de Transporte
Reducido (RTF), Medio III Microbiostatico de Viabilidad y Mantenimiento
(VMGA III) y el Caldo Tioglicolato (THM). (Siqueira, 1997).

La etapa correspondiente al cultivo exige la utilizacin de medios de cultivos
lquidos, semislidos y/o slidos, dependiendo del propsito del estudio. Esos
medios deben ser ricos en sustancias nutritivas, de modo que soporten el
crecimiento y multiplicacin de la gama variada de microorganismos
endodnticos, abarcando aquellos con gran capacidad de sntesis y tambin
aquellos exigentes de sustancias nutritivas ms complejas. Las sustancias
enriquecedoras son hemina y vitamina K, complementariamente, en medio
slido, debe ser adicionada sangre desfibrinada de carnero. (Siqueira, 1997).

Entre los medios lquidos, se destacan el Caldo Tripticasa Soya (TSB) y
Caldo Infusin Cerebro Corazn (BHI). En el caso de utilizarse medios
semislidos, la seleccin recae en el Caldo Tioglicolato (THM), ya que
presenta excelente desempeo como medio de transporte y como medio de
cultivo para los microorganismos oriundos de conductos radiculares
infectados (Carlsson et al, 1980). El medio slido mas utilizado parece ser el
Agar Brucella que, enriquecido con algunas sustancias, soporta el

aislamiento de los principales microorganismos de las lesiones pulpares.
(Estrela, 2005).

La incubacin del material debe priorizar los microorganismos anaerobios,
considerando que la presencia de microorganismos aerobios estrictos es
fugaz o inexistente. La incubacin debe ser realizada en anaerobiosis,
alcanzada por medio fsico (vacuo e insuflacin con una mezcla con el 80%
de N
2
el 10% H
2
y el 10% de CO
2
) o medio qumico (sistema Gazpak o
Anaerobac). El tiempo de incubacin vara entre 3, 6 y 14 das. (Molander et
al, 1998).

En el medio lquido o semislido, la lectura tiene como referencia la
presencia o ausencia de turbidez del mismo, indicativa, o no, del crecimiento
y multiplicacin de microorganismos. El medio slido va a permitir el
aislamiento de microorganismos, la determinacin de su capacidad
hemoltica, la obtencin de cultivo puro y subsecuentemente, su
caracterizacin morfolgica, fisiolgica y/o gentica y, cuando es necesario,
el anlisis de sensibilidad a antimicrobianos. (Siqueira, 1997).

3.8 TCNICAS MOLECULARES

La introduccin de tcnicas para la manipulacin del ADN in vitro ha tenido
un enorme impacto en el progreso de cada una de las reas de la
investigacin biolgica. El primer reporte de la aplicacin de la gentica
molecular en estreptococos se obtuvo alrededor de 1980, y en la actualidad
se cuenta con ms de 40 genes del Streptococcus mutans que han sido
clonados y secuenciados. (Libana, 1997 )

Recientemente, la metodologa molecular de identificacin microbiana
(reaccin de la cadena de polimerasa (PCR), sondas genmicas de ADN y
tcnicas de hibridacin molecular ADN-ADN) han permitido, por un lado,
obtener muestras positivas casi en un 100 % de los casos de identificacin
de especies bacterianas que, hasta el momento, no haban sido
relacionadas con la patologa periapical. (Canalda-Brau, 2006)

En los ltimos aos se han implementado nuevas tcnicas de identificacin
microbiana de base molecular, como por ejemplo, la reaccin de cadena
polimerasa (PCR). Estos mtodos han demostrado una ventaja considerable
para la identificacin de microorganismos y ya han sido aplicados para
analizar la flora endodntica (Chaves, 2005) sin embargo, uno de los
problemas mas resaltantes que acarrea la aplicacin de dichas tcnicas
moleculares en la microbiologa endodntica es que muchos de los
microorganismos que son identificados por medio de estos mtodos no
pueden ser cultivados en condiciones normales de laboratorio. Esta
condicin puede ser explicada debido a que luego de la extraccin del ADN
cromosmico y del ADN no cromosmico, los microorganismos sujetos a
dichas extracciones ya no pueden ser reproducidos. Chaves seala adems
que con tal carencia de reproducibilidad en medios de cultivos, las
caractersticas patgenas de dichos microorganismos "no cultivables" no
podran ser analizadas in vitro; y as no poder validar la implicancia de dichas
tcnicas de identificacin como, por ejemplo, en infecciones resistentes en el
tratamiento de conductos donde es mas importante poder reproducir los
microorganismos que crecen y sobreviven en el conducto radicular a que
solamente identificarlos molecularmente partiendo de un extracto de
ADN. Otro factor negativo para la aplicacin de tcnicas moleculares es la
falta de protocolo cuidadoso para la recoleccin de muestra de ADN.
(Chaves, 2005).

Aunque para demostrar el potencial y el futuro que aun mantiene una tcnica
molecular se puede sealar a Fouad et al (2000), quienes a partir de un
estudio de PCR en los canales radiculares de una pulpa necrtica, revelaron
la presencia de un microorganismo relacionado al genero Olsenella el cual no
ha sido previamente descrito dentro de las infecciones endodnticas. (Fouad
et al. 2002).

Rolph et al. (2001), utilizaron la tcnica de reaccin de hibridacin
fundamentada en el apareamiento de dos cadenas sencillas de cidos
nucleicos que sean complementarias entre si para formar un hibrido, para
realizar un estudio de identificacin de microorganismos situados en canales
radiculares y demostrar que las tcnicas moleculares pueden detectar la
presencia de bacterias vinculadas a las infecciones endodnticas cuando las
tcnicas de cultivo dan un resultado negativo, y adems puede ser usado en
la identificacin de un amplio rango de bacterias relacionadas a la infeccin
endodntica as estas no sean cultivables.

A partir de estos mtodos de laboratorio, se han detectado, en orden de
frecuencia las bacterias mas prevalentes en la periodontitis apicales tales
como Treponema denticola (68%) Porphyromonas endodontalis (61%)
Tannerella forsythia (58%). (Canalda-Brau, 2006)
Tambin las tcnicas moleculares aplicadas a la taxonoma son de
indiscutible importancia dado que por estos mtodos se puede basar en
caractersticas fenotpicas y genotpicas de los organismos, un ejemplo claro
de ello hace Saito et al (2006) al lograr la identificacin de nuevos filotipos
asociados con infecciones endodnticas y sugerir que aun esta por revelar
una porcin de taxas sin caracterizar.

Las tcnicas de biologa molecular han revolucionado el campo del
diagnostico microbiolgico, ya que constituyen la alternativa de mayor utilidad
para la caracterizacin de ciertos microorganismos que presentan
dificultades para su deteccin mediante los mtodos convencionales. Gracias
a su relativa sencillez y gran sensibilidad, son de especial ayuda en mltiples
situaciones que requieran su identificacin.

Extraccin de cidos nucleicos: Existen diversos mtodos de extraccin y
el procedimiento elegido depende del tipo de muestra, la cantidad de
microorganismos presente y la naturaleza del cido nucleico. Por ejemplo, si
se trata de una colonia microbiana puede ser suficiente una extraccin con
calor o con detergentes; la proteasa K es til en diversas muestras que
contengan clulas o detritos celulares: la extraccin mediante fenol-
cloroformo es la tcnica de referencia, pero requiere muchos pasos y entraa
el riesgo de contaminacin de la muestra. Actualmente, existen equipos
comerciales de extraccin que combinan la accin de agentes qumicos
(p.ej., tiocianato de guanidina), enzimticos (p.ej., proteasa K) solventes
orgnicos (p.ej., alcohol o acetona) y medios fsicos (p. ej., partculas de
slice o filtracin por membranas); estos mtodos estn al alcance de la
mayora de los laboratorios y tienen las ventajas de su gran sensibilidad y
relativa sencillez. Una vez extrada la diana, se puede proceder a la
deteccin de los cidos nucleicos propiamente dicha. (Libana, 2002)

3.8.1 Reaccin de hibridacin

Descripcin: Consiste en el apareamiento de dos cadenas sencillas de
cidos nucleicos (ADN-ADN, ARN-ARN o ADN-ARN) que sean
complementarias entre s para formar un hibrido. En ella, se conoce la
composicin de una de las molculas de acido nucleico y se asocia con un

sistema que posteriormente ponga de manifiesto su presencia: enzimas,
antgenos, molculas fluorescentes o radioistopos. (Libana, 2002).

Fundamento y procedimiento: Se basa en la capacidad de
desnaturalizacin y renaturalizacin de los cidos nucleidos. Cuando una
molcula de ADN de doble cadena se somete a un choque trmico
(elevacin de la temperatura por encima de 90 C) o a un choque de pH
(soda concentrada), los puentes de hidrogeno que mantienen su estructura
se desnaturalizan (se rompen), separndose las dos cadenas
complementarias entre si; si se restablecen las condiciones inciales de
temperatura (temperatura ambiente) o de pH (neutro) las dos hebras de ADN
son capaces de volver a unirse para formar la doble cadena mediante el
proceso que se conoce como renaturalizacin. Estas dos propiedades son
inherentes a los cidos nucleicos y en ellas se basa la reaccin de
hibridacin. Para llevar a cabo esta reaccin lo primero que se hace es
desnaturalizar la diana, que previamente se habr extrado; tras la
desnaturalizacin, se introduce en el medio de reaccin la sonda (segmento
de ADN) y en vez de restablecer las condiciones inciales de temperatura,
tomando una temperatura de hibridacin superior al ambiente, entre 35 y 65
C. Esta depende directamente de la composicin de la cadena de ADN de la
sonda y es la necesaria para que el proceso de renaturalizacin tenga lugar
entre la sonda y su cadena complementaria, es decir, para que tenga lugar la
hibridacin. Y una vez formado, el hibrido se detecta siguiendo el formato de
revelado inmunolgico que determina el sistema de marcaje empleado en la
sonda (enzimas, radioistopos, fluorocromos o incluso antgenos). (Libana,
2002).

3.8.2 TIPOS DE HIBRIDACION

Los ms utilizados son: hibridacin en microplaca (formato de
enzimoinmunoanlisis) o en solucin (el acido nucleico y la sonda se
encuentra en solucin, lo que acelera el proceso de hibridacin). (Libana,
2002).

Enzimoinmunoanlisis: se basa en la capacidad en que tienen Ag y Ac de
adherirse a una superficie inerte como el poliestireno sin perder sus
propiedades y en la posibilidad de marcar una inmunoglobulina con una
enzima. (Libana, 2002).

Dot blot: consiste en desnaturalizar el acido nucleico diana y luego fijarlo por
calor o luz UV en una membrana de nylon; posteriormente se aade la
sonda, lo que permite la deteccin cualitativa de un agente infeccioso en una
muestra. (Libana, 2002).

Southern y Northern blot: el primero permite determinar el tamao del
fragmento de ADN que hibrida con la sonda; el ADN se digiere previamente
con enzimas de restriccin y se separan por tamao los fragmentos
resultantes mediante electroforesis; estos se transfieren por la accin de un
tampn de gran fuerza inica a una membrana de soporte como nylon o
nitrocelulosa y posteriormente se sigue como en el Dot blot. La tcnica es
compleja y larga y requiere gran cantidad de muestra, lo cual limita su
aplicacin. El Northern blot es una variacin de Southern blot utilizando ARN
en lugar de ADN. (Libana, 2002).

Hibridacin in situ: se utiliza para la deteccin directa en tejidos, ya que se
realiza en el contexto morfolgico del tejido infectado, confirmando, en su

caso, que el microorganismo est implicado en el proceso infeccioso.
(Libana, 2002).

3.8.3 Amplificacin de cidos nucleicos
Las tcnicas de hibridacin pueden carecer de la suficiente sensibilidad
cuando el microorganismo buscado se encuentra en escasa cantidad en la
muestra. Para esto se recurre a mtodos qumicos o enzimticos para
aumentar especficamente la cantidad de una secuencia de cido nucleico
del microorganismo. (Libana, 2002).

Se puede describir dos grandes grupos de tcnicas en funcin de lo que se
amplifica:

Amplifica la diana: el primero que comprende la mayora de los mtodos
existentes, entre estos estn la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
que es la ms extendida y la Amplificacin basada en la secuencia de cidos
nucleicos (NASBA) aunque adems existen otras como la reaccin en
cadena de ligasa (LCR)
Amplifica la seal: obtenida tras producirse el hibrido, entre los que hay que
destacar el mtodo conocido como ADN ramificado. (Libana, 2002).

3.8.4 Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).

Componentes:

ADN diana: es el ADN que se desea amplificar; tambin se llama ADN
molde. Su cantidad y calidad son factores determinantes de la eficacia de la
reaccin.
Desoxinucletidos trifosfatos (dNTP): aportan las bases que componen el
ADN (dATP, dTTP, dGTP) y debe encontrarse en cantidades iguales.
Cebadores: tambin se conocen como primers o iniciadores; son
oligonucletidos (secuencia de ADN de 15-20 bases de longitud
complementarias de los extremos 3 de cada una de las cadenas de ADN
diana). (Libana, 2002).

Taq polimerasa: ADN polimerasa obtenida de la bacteria termfila Thermus
aquaticus, que tiene una temperatura mxima de actuacin de 72-90C y es
estable a las temperaturas de la reaccin. Su funcin consiste en alargar la
cadena de ADN hibridada con el cebador mediante la incorporacin de los
dNTP. (Libana, 2002).
Cloruro de magnesio: Influye en la hibridacin de los cebadores con el ADN
diana y en la actividad de la Taq polimerasa. (Libana, 2002).

Tapn de hibridacin: asegura la fuerza inica y el pH ptimos de la
reaccin enzimtica.

Reaccin:
Consta de 3 etapas que se repiten cclicamente, entre 25 y 40 veces,
dependiendo del protocolo:

- Desnaturalizacin del ADN: Temperatura de 90-95C, se separan las dos
hebras de ADN, quedando disponibles para hibridar con los cebadores.
- Hibridacin del ADN con los cebadores: se produce a una temperatura que
oscila entre 35-65C, dependiendo de la composicin de los cebadores.
(Libana, 2002).
- Extensin o polimerizacin de la cadena de ADN: La Taq acta alargando el
nuevo hibrido formado a una temperatura de 72C a partir del extremo 3 del
cebador, incorporando los dNTP complementarios del molde de ADN diana.
El producto de este primer ciclo sirve como diana para el siguiente ya que se
somete a unA nueva desnaturalizacin y a las etapas sucesivas. (ANEXO 10)
(Libana, 2002).

3.8.4.1 Deteccin del producto amplificado:

Una vez finalizada la PCR, se recurre a detectar la presencia del producto
amplificado (amplicon), para ello se realiza la electroforesis y si se requiere
mayor sensibilidad. Como se conoce el tamao del fragmento amplificado,
delimitado por la zona en la que se hibridan los cebadores, la electroforesis
es un mtodo sencillo y til en la deteccin, sobre todo en aquellos casos
donde la cantidad es elevada. Se realiza en gel de agarosa o poliacrilamida
y posteriormente se aplica una tincin con bromuro de etidio, que flurese
con mayor intensidad en presencia de ADN de doble cadena. Para confirmar
que se trata del fragmento de ADN buscado, es conveniente realizar la
electroforesis usando como control un marcador de peso molecular para
verificar el tamao correcto del amplificado. (Libana, 2002).

3.8.4.2 Modificaciones de la PCR

- RT PCR: si el acido nucleico diana es ARN, tras la extraccin este se debe
convertir en ADN complementario (ADNc) ya que la Taq polimerasa es
especifica de ADN. Se utiliza la enzima retrotranscriptasa, para transcribir
el ARN a ADN monocatenario y luego la Taq polimerasa lo convierte en ADN
bicatenario. (Libana, 2002).
- Nested-PCR: se trata de dos reacciones de PCR consecutivas y se utiliza
para aumentar la sensibilidad de la amplificacin; en una primera reaccin se
emplean cebadores externos y en la segunda cebadores internos que
amplifican un fragmento interno al amplificado en la primera PCR. As se
logra aumentar la sensibilidad de la reaccin. (Libana, 2002).
- Mltiple PCR: Permite la identificacin de mltiples fragmentos
pertenecientes a un mismo gen o a distintos genes. Para ello, se utilizan
tantas parejas de cebadores como productos se desee amplificar. (Libana,
2002).

- PCR in situ: el tejido se pone en contacto con la mezcla de reaccin en
termocicladores adaptados, los cebadores estn marcados con algn
sistema indicador y luego se revela directamente el producto amplificado.
(Libana, 2002).

3.8.5 NASBA

Se trata de un mtodo de amplificacin de la diana, aunque a diferencia de
la PCR es una reaccin que tiene lugar a una sola temperatura (isotrmica)
por lo que no es necesario emplear un termociclador, adems la diana para
este mtodo es ARN. (Libana, 2002).

Para conseguir la amplificacin del ARN se utiliza una estrategia enzimtica y
no es necesaria la desnaturalizacin, ya que la diana se encuentra en forma
de cadena sencilla. Se utiliza una cascada de reacciones a travs de tres
enzimas, una retrotranscriptasa (que es una ADN polimerasa que puede
utilizar como molde una molcula de ARN, aunque tambin es capaz de
copiar a partir de ADN. Una ARNasa H (degradadora de ARN, pero solo
cuando ste est hibridado con ADN). Y una T7 ARN polimerasa (que
sintetiza entre 10 y 100 copias de ARN a partir de una doble cadena de
ADN). (Libana, 2002).

3.8.6 ADN ramificado

Esta tcnica amplifica la seal y no la diana. La seal que se amplifica es la
obtenida tras la hibridacin de tres tipos de sondas: de captura, de anclaje,
de marcaje.

Una vez liberada, la diana se inmoviliza gracias a su hibridacin con las
sondas de captura que se hallan fijadas sobre la superficie de una
microplaca. Posterior a esta primera reaccin de hibridacin, se recurre a la
incorporacin a este hibrido de una segunda sonda de anclaje producindose
una segunda reaccin de hibridacin. Las sondas de anclaje son molculas
de ADN capaces de hibridarse con la diana y tienen la peculiaridad de
disponer de un verdadero esqueleto que soporta a su vez mltiples brazos o
ramificaciones de ADN. Y por ltimo se da la tercera reaccin de hibridacin
con la inclusin de una sonda de marcaje, y esta tercera reaccin consiste en
la unin de numerosas sondas de marcaje a los mltiples lugares de unin.
Despus de aadir el sustrato despus de esta tercera hibridacin, la seal
obtenida se habr amplificado y esto se debe a que utilizando esta cascada
de reacciones de hibridacin se consigue incorporar mayor cantidad de

molculas marcadoras que es, en esencia, de lo que depende la intensidad
de la seal producida. (Libana, 2002).

3.8.7 TECNICAS MOLECULARES APLICADAS A TAXONOMIA
MICROBIANA

3.8.7.1 CONTENIDO G+C:

Corresponde al nmero de bases de guanina + citosina en relacin con el
nmero total: adenina (A) timina (T). guanina (G) y citosina (C). El
porcentaje de G+C es constante dentro de una especie y dentro de un mismo
gnero las variaciones de dicho contenido son generalmente menores del
10%. Sin embargo aunque dos microorganismos tengan un contenido G+C
similar no se puede suponer que las secuencias sean iguales; por ello, esta
caracterstica debe ser analizada con otros datos complementarios. (Libana,
2002).

3.8.7.2 HIBRIDACION ADN-ADN:

Se utiliza hibridacin como trmino que indica una comparacin de
similitudes existentes entre el ADN de dos microorganismos. El ADN de
ambos microorganismos se desnaturaliza por calor y se ponen en contacto
en presencia de un tampn de hibridacin. Si las cadenas son
complementarias, si poseen el mismo ADN, se formarn hbridos estables de
ADN bicatenario a una temperatura 25C inferior a la que se disoci el ADN.
Si las cadenas no son complementarias, seguirn entonces como ADN de
simple cadena. (Libana, 2002).

Adems se utiliza esta tcnica para estudiar el grado de homologa entre dos
bacterias. Prcticamente se desnaturaliza el ADN de una de las dos
bacterias a estudiar y las cadenas sencillas de ADN se fijan en una cadena
de nitrocelulosa; se aade entonces el ADN de otro microorganismo marcado
con radioistopos y se incuba a temperatura de hibridacin. Despus se lava
la membrana para eliminar el ADN marcado y no unido, se determina la
radiactividad ligada a la membrana, que es proporcional a la cantidad de
ADN hibridado, y por tanto, a la semejanza entre ambos microorganismos. La
homologa se utiliza para le definicin de especie. (Libana, 2002).

3.8.7.3 PATRONES DE ENZIMAS DE RESTRICCION

Su fundamento radica en la utilizacin de una enzima de restriccin (ER),
endonucleasa que corta el ADN en un sitio de reconocimiento especfico,
generalmente compuesto de cuatro a seis pares de bases. Estas enzimas
van leyendo la cadena de ADN hasta encontrar la secuencia que reconocen
y, si est presente lo rompen originando lo que se conoce como fragmentos
de restriccin. Basndose en los patrones de dichos fragmentos se establece
la homologa o diferencia entre las cepas de los microorganismos que se
quieran comparar. (Libana, 2002).

3.8.7.3.1 POLIMORFISMO DE LA LONGITUD DE LOS FRAGMENTOS DE
RESTRICCION (RFLP)

El anlisis de los sitios de restriccin del ADN compara el nmero y el
tamao de fragmentos producidos por la accin sobre este con una (ER).
Debido a la gran especificidad de estas enzimas, la digestin completa del
ADN proporciona un orden reproducible de fragmentos, que pueden

separarse por medio de electroforesis y es conocido como fingerprinting. En
esencia se trata de la huella dactilar de cada microorganismo. El anlisis de
RFLP puede realizarse sobre ADN genmico. Tambin se puede efectuar
sobre el producto amplificado de ADN por PCR, mtodo denominado PCR-
RFLP; en este caso aumenta considerablemente la sensibilidad del mtodo.
(Libana, 2002).

Cuando el anlisis de los RLFP se hace sobre RNA ribosmico (ARNr)
entonces la tcnica recibe el nombre de ribotipificacin. El ARNr bacteriano
contiene regiones conservadas en todas las procariotas y otras regiones
variables, lo que permite comparar el grado de diferenciacin entre dos o
ms cepas bacterianas. (Libana, 2002).

3.8.7.3.2 ELECTROFORESIS EN GEL DEL CAMPO PULSATIL (PFGE)

En ocasiones, las ER cortan un gran porcentaje del genoma microbiano en
fragmentos tan grandes de ADN que la electroforesis convencional es
incapaz de separarlos. En este caso se utiliza la PFGE, que consigue
separar estos fragmentos utilizando cambios en el sentido de la
electroforesis por accin de una corriente que regularmente invierte su
polaridad. De esta forma se obtiene un electroferograma y para identificar un
microorganismo, este se compara con el de otros conocidos. (Libana,
2002).

3.8.8 SECUENCIACION DE ACIDOS NUCLEICOS:

Es la mejor manera de comparar las secuencias de ADN o ARN de dos
microorganismos. Es el mtodo de referencia, ya que proporciona la
composicin exacta del acido nucleico. Para la identificacin bacteriana se

elige secuenciar ARNr de las subunidades ribosmicos 30s y 50s y para el
estudio del ARNr, se debe realizar un RT-PCR para transformarlo en ADN.
(Libana, 2002).

3.8.9 TECNICA ARNr16S

La comparacin de las secuencias del ARNr16S ha facilitado enormemente
la identificacin de bacterias, incluyendo microorganismos no cultivables, y la
elucidacin de sus relaciones naturales. Consecuentemente, estas pueden
ser utilizadas para determinar relaciones taxonmicas entre especies que
presentan poca interrelacin en su ADN. (Herrera, 2001)

Inicialmente realizaron estudios de secuenciacin del ARNr16S.
Posteriormente, los estudios se extendieron al ARNr23S. Las secuencias
nucleotdicas constantes del ARNr16S presentan la ventaja de proporcionar
un sitio de iniciacin adecuada para la elongacin de los cebadores y as
aplicar de forma ms fcil la tcnica de secuenciacin (Herrera, 2001).

El anlisis del ARNr16S parece ser el ms adecuado con los
microorganismos, ya que contiene aproximadamente a 1550 pb frente a los
75-120 del ARNr5S, por lo que pequeas diferencias en los nucletidos del
ARNr5S afectan mucho mas al resultado final que en el caso del ARNr16S
(Herrera, 2001).

Adems de su utilidad en los estudios taxonmicos, la secuenciacin del
ARNr se ha aplicado en identificacin bacteriana. Mediante el anlisis de las
secuencias parciales del ARNr16S es posible encontrar patrones de
secuencias especficos para grupos, especies o incluso serotipos
bacterianos. Para la identificacin de los microorganismos a ese nivel, se han

desarrollado pequeas sondas especficas de la regin variable del
ARNr16S. Las diferencias en las regiones conservativas proporcionan as
mismo secuencias para el diagnostico de grupos de organismos relacionados
y pueden ser usados como dianas para sondas especificas de
oligonucletidos. Sondas especficas de ARNr16S y 23S han sido aplicadas
para establecer diferentes grupos y especies, as como la identificacin de
bacterias (Herrera, 2001).

La hibridacin con sondas especficas permite la identificacin rpida de un
gran nmero de aislados, al mismo tiempo que posibilita la deteccin directa
de microorganismos concretos en las muestras, usando un extracto de
cidos nucleicos como diana. La sensibilidad de las pruebas puede ser
aumentada in vitro aplicando a la tcnica de la reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR). A partir de un pequeo fragmento de ADN, es posible
amplificar una secuencia diana hasta unos cuantos microgramos, los cuales
pueden ser secuenciados directamente o pueden ser utilizados como diana
de una sonda especifica. El uso combinado de sondas universales y
especficas permite tambin estimar la fraccin de determinados
microorganismos dentro de un conjunto. Por ltimo se puede realizar
estimaciones de unidades formadoras de colonias utilizando mtodos de
hibridacin de colonias in situ (FISH) (Herrera, 2001).

En cuanto a la metodologa de este anlisis, el ARNr16S es secuenciado
utilizando una modificacin de la tcnica de Sanger (1977) de
dideoxinucletidos, en la que conocidos primers complementarios a las
regiones conservadas del ARNR16S, son elongados utilizando una
transcriptasa inversa. Las pequeas cadenas de ADN producidas pueden ser
amplificadas mediante la PCR o por clonacin, y despus secuenciadas

mediante un proceso automatizado por electroforesis en geles de
poliacrilamida (Herrera, 2001).

Anteriormente, la metodologa utilizada para estudiar estas secuencias,
recaan en el aislamiento exitoso del ARNr, seguido de la secuencia directa
utilizando transcriptasa inversa. Actualmente, estas secuencias pueden ser
clonadas y detectadas por hibridacin, con genes que codifican para sondas
de ARNr (ADNr) de un organismo diferente. La utilizacin del PCR, permite
amplificar especficamente la regin a secuenciar, utilizando una corta
seleccin de primers. Estas secuencias amplificadas especficamente,
pueden ser clonadas para secuenciarse por mtodos convencionales
(Herrera, 2001).

Se usan dos estrategias a la hora de aislar genes de ARNr del total de los
cidos nucleicos. Una aproximacin es clonar fragmentos al azar de ADN
del medio ambiente y analizar aquellos que contienen genes de ARNr. Como
la cantidad de ADN clonado que contiene genes de ARNr es pequea, el
segundo paso, casi obligado, es la utilizacin de la PCR para amplificar este
ARNr. Como el ARNr est altamente conservado en la naturaleza los
investigadores usan primers universales para los tres dominios de
organismos (eucariota, bacterias, arqueobacterias), desde todos los puntos
parece aconsejable el uso de la PCR pues se necesita amplificar el ARNr
que antes solo formaba una pequea parte del total (Herrera, 2001).

La manera ms rpida de obtener los constituyentes de los ecosistemas
microbianos es pues mediante el uso de la PCR. En principio la PCR
realizada con estos primers amplifica los genes de ARN de todos los tipos de
organismos presentes en un ambiente. Los tipos individuales de genes en la

mezcla son separados en principio por clonacin y posteriormente son
secuenciados (Herrera, 2001).
Existen bases de datos como el Ribosomal Database Project, el GenbanK y
el laboratorio europeo de biologa molecular (EMBL), las cuales contienen
miles de secuencias de ARNr, perteneciente a una gran cantidad de
microorganismos. Estas bases de datos pueden consultarse libremente, para
realizar una comparacin estadstica de las secuencias obtenidas de un
aislamiento, contra las que ya estn publicadas, y as poder elaborar
dendrogramas, en los que se indique la posicin del nuevo microorganismo
recin identificado (Herrera, 2001).

Aplicacin
La secuencia del ARNr es el mtodo de eleccin para determinar relaciones
taxonmicas altas (arriba del nivel de gnero) debido a que la molcula de
ARNr16S contiene regiones altamente variables es usualmente posible el
encontrar regiones de 20 a 30 bases que son completamente exclusivas de
una solo especie de bacterias (Herrera, 2001).
La caracterizacin filogentica de los organismos es ms que un ejercicio de
taxonoma, puesto que las relaciones evolutivas estn establecidas en una
forma creble y cuantitativa. Se espera que los organismos cercanamente
relacionados sean similares en sus propiedades bioqumicas generales; por
el contrario, la diversidad en las secuencias de ARNr indica diferencias
bioqumicas potenciales (Herrera, 2001).

4. ANALISIS BIBLIOGRAFICO DE ESTUDIOS REALIZADOS

En 1894, Miller (Miller W, 1894) fu el primero en demostrar la invasin
bacteriana de los tbulos dentinarios tanto de dentina cariada como no
cariada as como en tejido pulpar necrtico, reportando que esta microflora
tubular consista en cocos y bacilos.

Luego de este argumento se desarrollaron mltiples investigaciones sobre la
microbiota de los conductos radiculares las cuales reportaron la presencia de
numerosas especies bacterianas. Dependiendo del medio de cultivo y las
tcnicas utilizadas para la identificacin bacteriana, los tipos y el nmero de
organismos aislados variaban significativamente.

Cuando Kakehashi et al. (1965), proporcionaron evidencia experimental y
establecieron claramente el papel fundamental de las bacterias en la
enfermedad pulpar y periapical. Seal el efecto de los microorganismos
sobre el tejido pulpar y demostr la aparicin de enfermedad pulpar y
periapical en pulpas dentales de molares de ratas quirrgicamente expuestas
slo cuando existan bacterias en la cavidad bucal. En ratas gnotobioticas
(libres de microorganismos) las pulpas expuestas permanecieron sanas e
iniciaron la reparacin formando un puente dentinario a nivel de la exposicin
pulpar.
En las primeras investigaciones se report una pequea incidencia de
bacterias anaerobias en infecciones primarias, (Hedman et al.1951, Melville
et al.1967, Nair et al. 1990, Winkler et al.1972) mientras que en estudios
posteriores se inform de una prevalencia del 90% de estas bacterias en

conductos radiculares infectados. (Baumgartner et al.1999, Fabricius et al.
1982 Hancock et al. 2001).
Estos resultados son confirmados posteriormente por Korzen et al (1974)
quienes analizaron los efectos de la microbiota bucal normal y de la infeccin
por Streptococcus mutans en la pulpa y los tejidos periapicales de ratas
comunes y gnotobioticas. En dicho trabajo, los autores concluyen que la
severidad de la inflamacin pulpar y periapical estaba directamente
relacionada con la cantidad de microorganismos existentes en el sistema de
conductos radiculares y con el tiempo de permanencia de los mismos dentro
del sistema, as como comprobaron que el grado de inflamacin es de mayor
intensidad en infecciones mixtas que en infecciones producidas por
microorganismos pertenecientes a una sola especie.
Hasta principios de 1970, la mayora de los estudios microbiolgicos
sealaban fundamentalmente la presencia de bacterias anaerobias
facultativas en el sistema de conductos radiculares infectados. Sin embargo,
con el advenimiento de las nuevas tecnologas en el aislamiento de bacterias
anaerobias y el progreso en el conocimiento del papel fundamental de estos
microorganismos en diversas patologas humanas, han cambiado
sustancialmente la bacteriologa mdica y bucal.
Los estudios de Sundqvist, et al (1976), cambian diametralmente los
conceptos hasta los momentos establecidos en la microbiologa endodntica.
La presencia de un alto porcentaje de anaerobios estrictos reportados en su
investigacin, demostraron la necesidad de emplear medios de cultivo
adecuado y tcnico para la identificacin de microorganismos anaerobios en
beneficio del avance en el conocimiento de la microbiologa del sistema de
conductos radiculares.

Las pulpas necrticas presentan una flora polimicrobiana caracterizada por
una amplia variedad de combinaciones de bacterias, un promedio de 4-7
especies por conducto, predominantemente anaerobias y en igual proporcin
de bacterias Gram positivas y Gram negativas. (Baumgartner et al.1999,
Hancock et al. 2001, Peters et al. 2002, Sundqvist et al. 1989). Demostr
que slo podan ser detectados signos de reaccin inflamatoria en los tejidos
periapicales de dientes que presentaran infeccin bacteriana dentro del
sistema de conductos radiculares. Este autor realiz un estudio en 32 dientes
unirradiculares con historia previa de traumatismo, los cuales presentaban
pulpas necrticas y su corona clnica intacta. Diecinueve de estos dientes
presentaban imagen radiolcida; en 18 de estos dientes se encontr la
presencia de microorganismos. Por otra parte, no se encontraron
microorganismos en aquellos dientes traumatizados sin rea periapical.
Sumado a estos hallazgos, sus resultados sugieren tambin, una asociacin
entre la sintomatologa y combinaciones especficas de bacterias.
Un 90% de las especies aisladas por Sundqvist (Sundqvist 1976) fueron
anaerobias; stas comprenden un grupo de especies restringido, si se
compara con la totalidad de la microbiota de la cavidad bucal.
Como se mencion anteriormente, los estudios de Sundqvist, en 1976,
marcan pauta en la tipificacin de microorganismos anaerobios estrictos y
anaerobios facultativos involucrados en las lesiones pulpares y periapicales,
con la introduccin de las tcnicas de anaerobiosis
Fabricius, et al (1982) desvitalizaron mecnicamente pulpas de monos, las
expusieron al medio bucal durante una semana y posteriormente las sellaron
durante 3, 6 y 35 meses. Los anlisis bacteriolgicos de estos perodos de
observacin mostraron que el 85-98% 24 observaron que los

microorganismos hallados con mayor frecuencia fueron Bacteroides
(Prevotella y Porphyromonas) y bacilos anaerobios Gram positivos, tambin
se aislaron pequeas cantidades de bacterias anaerobias facultativas.
Sundqvist et al (1989) evaluaron la microbiota de conductos radiculares
infectados y ms especficamente la prevalencia de Bacteroides pigmentados
de negro, actualmente tipificados como Porphyromonas y Prevotella. En una
muestra de 72 conductos se identificaron 173 cepas microbianas. Se
identificaron estos microorganismos en un 30% de los conductos radiculares.
Las especies ms frecuentemente encontradas fueron Fusobacterium
nucleatum, Bacteroides intermedius, Peptostreptococcus anaerobius,
Eubacterium lentum y E. alactolyticum.
Los bacilos anaerobios pigmentados de negro (Porphyromonas spp. y
Prevotella spp.) han sido implicados con mucha frecuencia en la etiologa de
las patologas pulpares y perirradiculares. Es probable que la actividad
proteoltica de estas bacterias sea un factor de virulencia altamente
significativo debido a que las proteinasas producidas por estos
microorganismos tienen efectos sobre las protenas plasmticas envueltas en
los procesos de defensa. (Sundqvist et al. 1989).
Siqueira et al (2003), estudiaron el gnero Porphyromonas que incluye doce
especies pigmentadas y una no pigmentada. De las cuatro especies aisladas
en seres humanos, slo P. endodontalis y P. gingivalis han sido aisladas
consistentemente en infecciones endodnticas, y se ha determinado que
juegan un papel importante en la etiologa de las diferentes formas de
lesiones perirradiculares incluyendo los abscesos perirradiculares agudos.
Las bacterias pigmentadas de negro estn siempre asociadas con otras
bacterias, confirmando las relaciones sinrgicas entre las bacterias

encontradas en infecciones polimicrobianas, especialmente con
microorganismos Gram positivos. Estas bacterias poseen requerimientos
nutricionales muy especficos los cuales son aportados por bacterias
especficas tales como Peptostreptococcus micros, Eubacterium spp. y
Campylobacter rectus. (Sundqvist, 1994).
Sundqvist, et al (1992), investig las relaciones comensales o antagnicas
entre los microorganismos en los conductos radiculares de dientes con
periodontitis apical. Se tomaron muestras de 65 conductos radiculares
humanos infectados y se analizaron segn especies, frecuencia de aparicin
y proporcin de la flora aislada total. Las especies ms frecuentes fueron
Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Peptostreptococcus micros,
Peptostreptococcus anaerobius, Eubacterium alactolyticum, Eubacterium
lentum y Wolinella recta. Las asociaciones positivas ms evidentes fueron
encontradas entre F. nucleatum y P. micros, Porphyromonas endodontalis,
Selenomona sputigena y Wolinella recta. Tambin se evidenci una
asociacin positiva entre Prevotella intermedia y Peptostreptococcus micros,
Peptostreptococcus anaerobius y Eubacterium. Los resultados de este
estudio son consistentes con el concepto de que existe un ambiente especial
y selectivo dentro del sistema de conductos radiculares, esto se debe, en
parte, a la naturaleza de cooperacin y antagonismo de las relaciones entre
las bacterias.
Gomes et al (1994), realizaron un estudio con el propsito de determinar si
algn grupo de bacterias estaba relacionada con dolor, inflamacin o con
cualquier otro sntoma endodntico. De 30 canales radiculares examinados
se aislaron un total de 57 especies bacterianas, de las cuales, el 60% fueron
anaerobios estrictos. Fusobacterium nucleatum fue aislado y relacionado a

todos los casos clnicos examinados pero no se determin una asociacin
significativa con otros gneros bacterianos.

Debelian et al. (1995), realizaron un estudio para determinar la presencia de
bacterias en los conductos radiculares posterior a la instrumentacin de
piezas dentarias con diagnstico de necrosis pulpar asociada a lesin
periapical aguda. De un total de 26 piezas dentarias evaluadas, se determin
que todos los canales contenan microorganismos, en su mayor parte
anaerobios estrictos, hallndose a Fusobacterium nucleatum en el 53% de
los casos.
Pocos estudios han reportado la presencia de hongos en infecciones
primarias endodnticas. Sen et al. (1995) evidenciaron hongos en las
paredes de los conductos radiculares en dientes infectados. En cuatro de las
muestras se presentaron en forma de levaduras y en una se presentaron en
forma de hifas. El estudio realizado con Microscopa Electrnica (SEM) para
investigar la topografa de la flora microbiana de los canales radiculares y
observar el grado de penetracin bacteriana en los tbulos dentinales de las
races infectadas Sin embargo, Pardi et al (2001). Han sealado que la
presencia de hongos en conductos radiculares es bsicamente poco
frecuente (10%) y podra estar asociado a la presencia de estos
microorganismos en saliva.

Brook (1996) confirm la hiptesis en la cual las infecciones del sistema
endodntico eran causadas principalmente por anaerobios estrictos. Para el
desarrollo de este estudio se analiz el contenido de secrecin purulenta de
cinco abscesos periapicales en el maxilar superior, todos ellos asociados a
cuadros de sinusitis. En todos los casos, los autores encontraron anaerobios
de los gneros Prevotella, Porphyromonas, Fusobacterium y
Peptostreptococcus.

En 1996, (Gomes et al.1996) investigaron la sensibilidad de la microflora
endodntica a los procedimientos biomecnicos del tratamiento de
conductos. Para ello, fueron evaluados 42 conductos radiculares tomndose
muestras en todos los casos antes de la limpieza y conformacin y, entre
siete y diez das posteriores a dicho procedimiento. En las primeras
muestras, fueron aisladas 51 especies bacterianas diferentes. Posterior a la
terapia endodntica el micro-ambiente cambia de diversas formas. El
principal efecto puede ser el cambio en la anaerobiosis. En este estudio se
determin un significativo descenso entre las especies anaerobias de la
primera y segunda evaluacin. En la segunda evaluacin, se detectaron
microorganismos tales como Enterococcus faecalis, Propionibacterium
acnes, Veillonella parvula, Streptococcus parasanguis, Streptococcus
gordonii, Streptococcus intermedius, entre otros. Se observaron especies
individuales de un mismo grupo presentndose en un mismo caso entre la
muestra 1 y 2, por ejemplo, Streptococcus intermedius, as como especies
que disminuyen y otras que aumentan entre la primera y segunda muestra.
Molander et al (1998) evaluaron el estado de la microbiota intrarradicular de
100 casos de periodontitis apical crnica persistente. Todos los dientes
presentaron tratamiento de conducto con no menos de cuatro aos
postoperatorios. El tamao de las lesiones fue establecido radiogrficamente
y fue de 2 mm en 14 casos, entre 3 y 5 mm en 56 casos y 5 mm en 30 casos.
Los conductos fueron desobturados con instrumental rotatorio y manual,
mientras en 21 casos se incluy el uso de cloroformo como solvente. Las
muestras fueron sembradas en agar Brucella para la incubacin aerobia y en
medio semi-lquido (HCMG-Sula) con el mtodo de combustin de Hidrgeno
para la incubacin anaerobia. Molander et al (1998) Los resultados
demostraron la presencia de microbiota dentro del conducto en 68 de los 100
casos estudiados, detectando 117 especies microbianas. En la mayora de

los conductos, fueron aisladas de 1-2 especies (85%) con predominio de
anaerobios facultativos Gram positivos (69%). El microorganismo detectada
con mayor frecuencia fue Enterococcus spp., en 32 dientes. En 20 de los
casos el crecimiento fue muy abundante. Tambin fueron aisladas en
cantidades importantes Lactobacillus spp., Escherichia coli, Streptococcus
spp., Staphylococcus spp. Fusobacterium spp., Prevotella spp. y Candida
albicans. En conclusin aseguran que las bacterias anaerobias facultativas
son menos sensibles a la actividad antimicrobiana que los anaerobios
estrictos y, por lo tanto, es de esperarse que persistan ms frecuentemente
en conductos radiculares despus de un tratamiento endodntico
inadecuado. Cuando los microorganismos anaerobios facultativos han estado
en una fase latente con baja actividad metablica por un perodo de tiempo,
los cambios en las condiciones nutricionales desencadenan su crecimiento.
(Molander et al.1998)
Siqueira et al. (1998) estudiaron la patogenicidad de bacterias anaerobias
estrictas y facultativas comnmente encontradas en infecciones
endodnticas usando ratones como modelo. La capacidad de inducir
abscesos fue evaluado siete das despus de inyectarles de manera
subcutnea la bacteria en cultivo puro y en combinacin con Prevotella
intermedia o Prevotella nigrescens; como resultado se obtuvo que ninguna
de las 50 muestras bacterianas estudiadas fueron patgenas en cultivo puro.
Una diferencia, aunque no estadsticamente significativa, fue detectada entre
muestras de cultivo puro y muestras en combinacin. Se detect un aparente
sinergismo cuando se asoci Porphyromonas gingivalis con Prevotella
intermedia o Prevotella nigrescens.

Bogen et al. (1999) estudiaron la frecuencia de P. endodontalis, P. gingivalis,
P. intermedia y P. nigrescens en 20 lesiones periapicales cerradas asociadas

a cuadros endodnticos sintomticos y asintomticos. La identificacin de las
especies bacterianas fue realizada por medio de la tcnica de la Reaccin en
Cadena de la Polimerasa (PCR). Los resultados obtenidos revelaron que P.
endodontalis no estuvo presente en ninguna lesin periapical. P. gingivalis
fue identificada en una lesin periapical y estuvo relacionada con un cuadro
de dolor moderado. P. endodontalis, P. intermedia o P. nigrescens no fueron
identificadas en ninguna de las lesiones estudiadas por lo que el autor
concluy que stos microorganismos al parecer eran infrecuentes en este
tipo de infecciones.
Waltimo et al. (1997) realizaron un importante estudio sobre la presencia de
hongos en 967 casos de periodontitis apical crnica persistente. De los
hongos aislados en este estudio el 80% fue representado por la especie
Candida albicans. As mismo, fueron identificadas Candida glabrata, Candida
guilliermondii, Candida incopiscua y Geotrichum candidum. Un total de 48
cepas de hongos fueron aisladas en 47 muestras (7%) de las cuales seis
fueron infecciones producidas por un solo microorganismo (Candida
albicans).

Figura 1. Microfotografa al Microscopio Electrnico de
Barrido mostrando Candida spp. En las fibras (Waltimo et
al 1999)

As mismo, evidenciaron crecimiento microbiano en 692 casos (72%). En los
casos de infecciones mixtas demostr la presencia de Streptococcus spp., P.
micros y F. nucleatum. Todas las especies de Candida evaluadas en este
estudio, presentaron alta resistencia a solucin saturada de hidrxido de
calcio. Se requiri de 16 horas de incubacin para eliminar el 99,9% de las
unidades de colonias formadas. (Waltimo et al 1999).
As tambin Waltimo et al (1999) realizaron un estudio enfocado a evaluar la
sensibilidad de Candida spp. Con hidrxido de calcio, medicacin de amplio
uso en endodoncia, dado su alto grado de alcalinidad. Tambin ha sido
probada, la sensibilidad de Candida spp, a ciertas soluciones desinfectantes,
tales como yoduro de potasio, acetato de clorhexidina, hipoclorito de sodio e
hidrxido de calcio. Los resultados sealan una mayor efectividad de los tres
primeros agentes antimicrobianos sobre Candida spp, en comparacin con el
hidrxido de calcio. Sin embargo, apuntan los autores, que el uso combinado
de estos desinfectantes, puede proveer una preparacin antimicrobiana de
amplio espectro con efectos a largo plazo.
Kuriyama-Karasawa, (2000) estudiaron la microflora bacteriana asociada a
infecciones orofaciales odontolgicas. Las muestras fueron tomadas de 163
pacientes que presentaban infecciones dentoalveolares, periodontitis y
pericoronaritis. Aisl un total de 664 especies bacterianas, 200 de las cuales
fueron aerobias. Los gneros bacterianos ms frecuentemente aislados
fueron: Peptostreptococcus, Gemella, Prevotella, Porphyromonas y
Fusobacterium.

Dalby (2000) evalu la sensibilidad antibitica de las bacterias ms
prevalentes en abscesos dentoalveolares agudos en 30 muestras de
secrecin purulenta, las cuales fueron cultivadas en condiciones aerobias y

anaerobias. Se identificaron 56 cepas bacterianas, de las cuales, el 62.5%
correspondi a anaerobios estrictos; siendo los microorganismos ms
prevalentes Streptococcus (35%), Peptostreptococcus (25%), Fusobacterium
(12.5%) y Porphyromonas (9%).

Arroyo (2000) evalu 30 muestras intraorales de pacientes atendidos en el
Centro Mdico Naval con el diagnstico de absceso dentoalveolar agudo,
realizando la identificacin microbiolgica mediante el sistema Microscan. De
un total de 56 especies bacterianas, el 62.5% estuvo representada por
bacterias anaerobias estrictas y el 35.7% por bacterias anaerobias
facultativas. Las especies bacterianas de mayor prevalencia fueron:
Peptostreptococcus saccharolyticus y Streptococcus mitis, con 18% y 14%
respectivamente. Asimismo, determin que la infeccin de tipo mixto fue la
ms frecuente (73%), pudiendo aislar de 1 a 4 microorganismos por muestra.

Lana et al. (2001) analizaron 31 canales radiculares con diagnstico de
necrosis pulpar, antes y despus de su manipulacin o preparacin
biomecnica. Los gneros aislados que presentaron mayor frecuencia
fueron: Prevotella, Fusobacterium, Lactobacillus, Streptococcus, Clostridium
y Peptostreptococcus en bacterias, y Candida y Saccharomyces en
levaduras. El total de microorganismos anaerobios estrictos aislados fue de
54 especies. El 82% de los canales evaluados mostraron infeccin
polimicrobiana. Las bacterias anaerobias estrictas fueron recuperadas en el
80% de los casos; las bacterias anaerobias facultativas en el 51% y las
especies microaerfilas en un 18.5% de los casos. Fueron determinadas
adems fuertes asociaciones positivas, particularmente entre Clostridium con
Prevotella y Peptostreptococcus con Fusobacterium.

Otro microorganismo ltimamente reportado, Bacteroides forsythus,
recientemente reclasificado como Tannerella forsythensis, es un bacilo
anaerobio estricto Gram negativo, pleomrfico, el cual fue identificado en un
52% del total de casos estudiados en pulpa necrtica. En los casos
asintomticos se present en un 59,1%, un 40% en periodontitis apical aguda
y un 50% en abscesos periapicales agudos. Estos resultados sugieren una
asociacin de este microorganismo con la patognesis de diferentes formas
de patologa perirradicular. (Rocas 2001).
Un importante estudio, realizado por Love et al. (2001) permiti comprobar
que la virulencia de E. faecalis se relaciona con su capacidad para invadir
los tbulos dentinarios y permanecer viable dentro de los mismos,
adhirindose al colgeno tipo I presente en el suero humano. Fue
comprobado igualmente por el autor, que para otros microorganismos, tales
como S. gordonii y S. mutans, el suero humano acta inhibiendo su
capacidad de invadir la dentina, no as sobre E. faecalis donde se mantuvo la
invasin an cuando fue reducida escasamente.
Lima et al. (2001) evaluaron in vitro la sensibilidad de biopelculas de
Enterococcus faecalis a ciertas medicaciones antimicrobianas tales como
clorhexidina (CHX) 2%, clindamicina y metronidazol. Concluyeron en esta
investigacin que la combinacin de metronidazol con clindamicina reduce
significativamente las biopelculas formadas de un da, mientras la
clorhexidina fue el nico medicamento capaz de eliminar las biopelculas de
1-3 das de formacin.
Portenier et al. (2001) evaluaron los efectos de elementos tales como
dentina, matriz de dentina tratada con cido etilendiamino tetraactico
(EDTA) o cido ctrico, colgeno tipo I y clulas muertas (E. faecalis) sobre la

inactivacin de la actividad antimicrobiana de yoduro de potasio y digluconato
de clorhexidina contra E. faecalis. La matriz de dentina y las clulas muertas
fueron los inhibidores ms potentes de la clorhexidina, mientras que la
dentina tratada mostr una muy leve inhibicin. El yoduro de potasio mostr
ser inhibido por todos los componentes evaluados excepto EDTA y cido
ctrico. Los autores concluyen que los diversos componentes de la dentina
son responsables de patrones divergentes de inhibicin de la actividad
antimicrobiana de estas dos sustancias, as como el tratamiento qumico de
la dentina, previos a la medicacin, puede alterar el efecto antimicrobiano de
las sustancias. En la bsqueda de alternativas de tratamiento para la
eliminacin efectiva de E. faecalis, ha sido evaluada la accin de diversas
soluciones antispticas, medicaciones e inclusive materiales de obturacin
sobre el microorganismo.
Siqueira et al. (2002) califican las infecciones endodnticas como mixtas y
semi-especficas con predominio de bacterias anaerobias estrictas. La
caracterstica de semi-especfica de estas infecciones es dada por la
correlacin entre algunos grupos bacterianos y algunas formas de
enfermedad periapical. Cuando se realizan cultivos de conductos radiculares
infectados, parece frecuente la aparicin de ciertas especies asociadas. Esto
indica que existen interrelaciones entre ciertas bacterias, comensales o
antagonistas.
Fouad et al. (2002) en un estudio bajo tcnicas de hibridacin de ADN
demostraron la alta frecuencia de Fusobacterium nucleatum, as como de
otros patgenos (Peptostreptococcus micros, Streptococcus spp. y Prevotella
nigrescens) sobre otros microorganismos involucrados en infecciones
primarias.

Por su parte, Peters et al. (2002) investigaron las combinaciones bacterianas
presentes en infecciones primarias con lesiones perirradiculares. Las
especies ms frecuentemente encontradas fueron Prevotella intermedia,
Peptostreptococcus micros y Actinomyces odontolyticus. Tambin se
reportaron asociaciones positivas entre P. intermedia y P. micros, entre P.
intermedia y Prevotella oralis, A. odontolyticus y P. micros, Bifidobacterium
spp. y Veillonella spp. Estos resultados indican que los patgenos
endodnticos no se presentan aleatoriamente y pueden estar asociados en
combinaciones especficas. Reportaron que las especies predominantes en
58 dientes con pulpas necrticas y periodontitis apical crnica fueron
Prevotella intermedia, Peptostreptococcus micros y Actinomyces
odontolyticus. Estos resultados son comparables con los obtenidos por otros
estudios realizados bajo condiciones similares.
Por su parte, Evans et al. (2002) estudiaron los mecanismos involucrados en
la resistencia de E. faecalis al hidrxido de calcio. Este estudio confirm la
supervivencia del microorganismo a dicho medicamento a un pH de 11,1.
Una respuesta adaptativa en un pH alcalino y una sntesis de protenas
inducidas por la tensin superficial parecen jugar un papel menor en la
persistencia de E. faecalis. Sin embargo, el hallazgo de una bomba de
protones con capacidad de acidificar el citoplasma fue un factor crtico en la
supervivencia de esta bacteria en altos niveles de pH. As mismo se
concluy, que el hipoclorito de sodio (NaOCl) es efectivo para la eliminacin
del microorganismo, segn los hallazgos de estos investigadores.
Jacinto et al. (2003), compararon hallazgos microbiolgicos de dientes con
necrosis pulpar asintomtico (29 casos) con dientes con el mismo
diagnstico y que presentaban sintomatologa clnica. Los canales
radiculares de dientes con sintomatologa presentaron mayor porcentaje de

anaerobios estrictos y mayor nmero de especies bacterianas por canal en
relacin a los dientes asintomticos. Los ms comnmente aislados fueron:
Fusobacterium necrophorum, Peptostreptococcus prevotti,
Peptostreptococcus micros, Fusobacterium nucleatum y Prevotella. El 39%
del total de especies aisladas estuvo constituida por bacterias Gram
negativas y fueron relacionadas con la sintomatologa. Hay una relacin
estadsticamente significativa al generarse inflamacin cuando esta presente
Fusobacterium nucleatum, mientras que el dolor a la percusin fue
relacionado a Bifidobacterium y Actinomyces.
En un estudio Siqueira (2003) demostr en conductos radiculares infectados,
la presencia de una especie no descrita anteriormente, Filifactor alocis. Este
microorganismo, detectado bajo tcnicas de identificacin PCR (Reaccin en
Cadena de la Polimerasa), fue aislado en el 46% de las muestras estudiadas.
Esta frecuencia relativamente alta de deteccin de Filifactor alocis asociada a
infecciones endodnticas, implica la posibilidad de estar involucrada en la
patognesis y mantenimiento de las lesiones perirradiculares. Debido a su
alta prevalencia y su relacin con otras patologas bucales, particularmente
con periodontitis marginal, es una especie potencial para formar parte del
restringido grupo de patgenos endodnticos.
Por su parte Tang et al (2003) realizaron la deteccin directa de
Actinomyces spp en canales radiculares infectados en una poblacin china.
Y explican que la poca sensibilidad dada por las tcnicas de identificacin
fenotpica ha obstaculizado la diferenciacin taxonmica de los Actinomyces;
ellos lograron desarrollar un mtodo de identificacin ms sensible y
especifico por medio de la tcnica de hibridacin DNA-oligonucletido
basada en PCR. Se sustent bajo el estudio de 32 muestras (dientes) de
pacientes chinos y con lo cual se logro amplificar el ADN ribosomal 16S de

las bacterias y posteriormente marcaje con dioxigenina para la posterior
hibridacin y deteccin. Concluyeron de manera asertiva con un 31.3% la
presencia de A. odontolyticus en los canales radiculares infectados y
confirmar de manera secundaria que A. naeslundii cobra presencia en
dientes traumatizados.

Gomes et al (2004) estudiaron la microbiota de conductos radiculares con
infeccin primaria. Sesenta conductos radiculares, 41 con infeccin primaria
y 19 con infeccin secundaria arrojaron 56 especies y un mximo de 10
especies por conducto. Un 70% lo constituyeron especies anaerobias
estrictas o microaeroflicas. Las especies ms frecuentemente aisladas
fueron: Peptostreptococcus micros (35%), Fusobacterium necrophorum
(23.3%), Fusobacterium nucleatum (11.7%), Prevotella intermedia (16.7%),
Porphyromonas gingivalis (6.7%) y Porphyromonas endodontalis (5%). La
microflora aislada de las infecciones primarias con periodontitis apical fue de
carcter mixto, comprendiendo bacterias Gram negativas y Gram positivas,
principalmente microorganismos anaerobios y conteniendo al menos tres
especies por conducto.

Fouad et al, (2004) hacen que la tcnica molecular tenga un papel
prominente o importante en el estudio clnico y mas en estudios crticos como
aquel expuesto en la deteccin molecular de especies de Enterococus en
canales radiculares con terapia de resistencia a infecciones endodnticas,
dado el estudio en pacientes diabticos, determino la presencia dominante
en estos pacientes de Enterococcus faecalis, con la tcnica de amplificacin
por PCR y posterior secuenciacin e identificacin filogentica.

Siquiera Jr. et al. (2005), realizaron un estudio en dientes con diagnstico de
necrosis pulpar asintomticos y con lesin periapical, comparando la

prevalencia de patgenos endodnticos en muestras de infecciones
primarias tomadas de pacientes en diferentes localizaciones geogrficas
(Brasil y Corea del Sur) para lo cual utiliz la tcnica de PCR. Como
resultado obtuvo que la especies prevalentes detectadas en Brasil fueron
Porphyromonas endodontalis (79%), Treponema denticola (79%) y Dialister
pneumosistes (76%), mientras que las especies encontradas en Corea
fueron Fusobacterium nucleatum (38%), Tannarella forsythia (26%) y
Treponema malthophilum (24%). Concluyendo que la prevalencia de algunas
especies en infecciones endodnticas pueden ser significativamente
diferentes de una localizacin geogrfica a otra.

Mientras Chu et al. (2005) compararon en su estudio los microorganismos
cultivables de canales radiculares que presentaban radiolucencia apical con
exposicin pulpar (grupo A) y sin exposicin pulpar (grupo B), tomando 45 y
43 muestras bacterianas respectivamente, las mismas que fueron cultivadas
en condiciones aerobias y anaerobias. Del grupo A se aislaron un total de
211 microorganismos, agrupados en 28 gneros y 55 especies y del grupo B
185 microorganismos, agrupados en 28 gneros y 54 especies. Concluyeron
que no hubo diferencias significativas entre la prevalencia de Actinomyces,
Peptostreptococcus y Campylobacter entre ambos grupos. El gnero
Prevotella fue ms comn en ambos grupos y Fusobacterium nucleatum fue
ms comn en el grupo B.
Sakamoto et al (2006) utilizaron la tcnica de anlisis de restriccin de
polimorfismos de ARNr 16s en bibliotecas de genes clonados, investigando la
diversidad de microbiota asociada con infecciones endodnticas sintomticas
y asintomticas y comparndola con la estructura de la comunidad
bacteriana de las dos condiciones clnicas. Las muestras fueron tomadas de
infecciones endodnticas asintomticas asociadas a lesiones crnicas

periradiculares. La infeccin sintomtica fue diagnosticada por abscesos
agudos. Los genes ARNr 16s aislados de muestras clnicas se utilizaron para
construir las bibliotecas y se realizaron anlisis de secuencias de 186
clones, los cuales revelaron 42 tipos de microorganismos; 23 (55%) fueron
filotipos, de los cuales siete son exclusivas de infecciones endodnticas. La
mayora de los microorganismos detectados fueron: Fusobacterium
nucleatum, Peptostreptococcus micros, Peptostreptococcus spp, Prevotella
spp, Dialister spp, Mogibacterium spp, Lachnospiraceae oral, Filifactor alocis,
Megasphaera spp, Veillonella spp, Veillonella prvula, Dialister spp. Algunos
microorganismos se detectaron solamente en muestras sintomticas como
Prevotella intermedia, Dialister Pneumosintes. En general, el nmero medio
de fragmentos de restriccin en muestras sintomticas fue significativamente
mayor que en muestras asintomticas.

Sassone et al (2007) evaluaron la composicin de la microbiota de las
infecciones primarias endodnticas en 111 casos seleccionados de un solo
diente con pulpa necrtica. Se recogieron muestras de las canales de la raz
usando papel estril de dos puntos a 1 mm por debajo del foramen apical.
En cada muestra se aislaron 40 especies diferentes de bacterias. Se
determinaron utilizando tcnicas como sondas de ADN e hibridacin ADN-
ADN. El promedio de nmero de especies por muestra fue de 22. Las
especies mas frecuentes fueron: Enterococcus faecalis (89,3%),
Campylobacter gracilis (89,3%), Leptotrichia buccalis (89,3%), Neisseria
mucosa (87,5%), Prevotella melaninogenica (86,6%), Fusobacterium
nucleatum spp Vincentii (85,7%), Eubacterium saburreum (75,9%),
Streptococcus anginosus (75%), y Veillonella parvula (74,1%).

Rodrguez et al (2008) determinaron la presencia de microorganismos en el
tejido pulpar y as mismo clarifica las causas de su muerte y su posterior

dao a los tejidos periodontales. Selecciono 23 dientes y en 20 fue posible
encontrar crecimiento microbiano, se encontr bacterias anaerobias estrictas,
microorganismos entricos y levaduras. Fusobacterium spp fue el
microorganismo mas encontrado con 25%, seguido de Eubacterium spp en
15%, Peptostreptococcus spp., 10%; Campylobacter spp., 10%; bacilos
entricos Gram negativos, 10%; Porphyromonas gingivalis, 10%; Prevotella
intermedia, 5%; Eikenellia corrodens, 5%; Dialister pneumosintes, 5%; y
levaduras en 5%. No hubo evidencias de crecimiento de Actinobacillus
actinomycetemcomitans, Tannerella forsythensis ni estreptococo
hemoltico. Los resultados en el presente estudio concluyeron claramente la
presencia de microorganismos en lesiones apicales cerradas de origen
endodntico. De igual forma se evidenci que gran parte de los
microorganismos encontrados son considerados periodontopatgenos lo que
puede igualmente sugerir manejo compartido entre tratamiento endodntico,
periodontal y farmacolgico.

5 CONCLUSIONES

Desde que se demostr que la invasin microbiana de la pulpa, ocasiona
una respuesta inflamatoria se han abierto numerosas lneas de investigacin
dirigidas a identificar los ecosistemas bacterianos en la pulpa.

En el estudio bibliogrfico realizado, se encontr gran variedad de
microorganismos relacionados con esta patologa y los gneros mas
reportados fueron Fusobacterium spp, Peptostreptococcus spp, Prevotella
spp, Streptococcus spp, Porphyromonas spp.

Por otra parte se han encontrado otros microorganismos poco frecuentes
relacionados con lesiones pulpares como: Olsenella spp, Coxiella burnetii,
Dialister pneumosintes, Mogibacterium ssp, Megasphaera spp, Leptotrichia
buccalis, Selenomonas sputigena, Serratia marcescens, Gemella spp,
Tannerella forsythensis.

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79) Sundqvist G. 1976. Bacteriological studies of necrotic dental pulps.
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81) The Oxoid Manual. Novena Edicin. 2006.

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85) Walton R, Torabinejad M. 1996. Endodoncia. Principios y Prctica.
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BIBLIOGRAFIA ELECTRONICA

www.genomenewsnetwork.org/articles/03_02/fuso...

www.flickr.com/photos/ajc1/2425524326/

http://kato-dental.net

www.wikipedia.org/wiki/Peptostreptococcus

www.ronaldschulte.nl/Preparaten%20Tandplaque%...

http.commons.wikimedia.org/wiki/File:Enterococcus_...

www.doctorfungus.org

7. ANEXOS

ANEXO 1. Fusobacterium nucleatum

Fuente: www.genomenewsnetwork.org/articles/03_02/fuso...

ANEXO 2. Porphyromonas gingivalis

Fuente: www.flickr.com/photos/ajc1/2425524326/

ANEXO 3 Prevotella intermedia

Fuente: http://kato-dental.net

ANEXO 4. Peptostreptococcus spp

Fuente:www.wikipedia.org/wiki/Peptostreptococcus

ANEXO 5 Streptococcus mutans

Fuente:www.ronaldschulte.nl/Preparaten%20Tandplaque%...

ANEXO 6. Enterococcus faecalis

Fuente: http.commons.wikimedia.org/wiki/File:Enterococcus_...

ANEXO 7. Candida albicans en Agar Corn Meal

Fuente: www.doctorfungus.org

ANEXO 8.

MICROORAGNISMOS REFERENTES EN EL ESTUDIO BIBLIOGRAFICO

Figura 2. Microorganismos ms frecuentes en el presente estudio

ANEXO 9

MEDIOS DE CULTIVO

AGAR SANGRE

Para la preparacin de placas de agar sangre y de agar sangre cocida
destinadas al aislamiento y cultivo de diversos microorganismos, sobre todo
patgenos exigentes y su determinacin.
Sin adicin de sangre, es adecuado, por ejemplo, para la realizacin de
hemocultivos (UPDYKE 1970) y como base para la preparacin de diversos
medios de cultivo especiales.
El medio de cultivo corresponde a las recomendaciones de APHA para el
anlisis de alimentos (1984). (Oxoid 2006).

Forma de actuacin
Su abundante base nutritiva ofrece condiciones ptimas de crecimiento a
todos los microorganismos presentes. El valor del pH de 6.8, es
especialmente favorable para la conservacin de los eritrocitos y para La
formacin de los halos hemolticos claros (NORTON 1932). Para la
determinacin de las formas de hemolisis es adecuado aadir sangre de
oveja, recin obtenida, desfibrinada. Por calentamiento, despus de la
adicin de sangre, se obtiene el Agar sangre cocida (agar chocolate) que es
un medio nutritivo excelente. (Oxoid, 2006).

En realidad, cuando se utiliza como medio basal de cultivo, sin adicin de
sangre, se recomienda ajustar su pH entre 7.2 y 7.4, pues la mayora de las
bacterias forman colonias ms precozmente y crecen con mayor exuberancia
en un medio ligeramente bsico. (Oxoid 2006).

Segn TARSHIS y FRISH (1951), para el aislamiento de bacterias
tuberculosas a partir de esputos, es recomendable una adicin de 1% de
glicerina y 25% de sangre humana, lo que hace ms fcilmente reconocible
el crecimiento de colonias micobacterias, incluso en el caso de cantidades
mnimas de estos grmenes. Segn HOSTY y col. (1953), resulta ya
suficiente la adicin de 0.1% de glicerina y 2.5 de sangre humana, junto con
100 U.I /ml de penicilina. Segn SONDAG y col. (1977), BLACK y VAN
BUSKIRK (1973), la adicin de 5 mg/ml de gentamicina (por ejemplo, 0.1 ml
gentamicina en solucin), al agar sangre, posibilita el crecimiento selectivo
De Streptococcus pneumoniae y otros Streptococcus, as como Bacteroides,
Clostridium y levaduras. MISHRA y col. (1987) recomiendan un agar
Ampicilina Sangre de oveja (ASBA 30) para el cultivo selectivo de
Aeromonas. (Oxoid 2006).

Composicin (g/litro)
Sustrato nutritivo (extracto de corazn y peptonas) 20.0
Cloruro sdico 5.0
Agar agar
Aditivo: sangre 50-80 ml
Preparacin
Disolver 40 g/litro, esterilizar en autoclave (15 min a 121C), dejar enfriar a
45-50 C, incorporar 5 a 8 % de sangre desfibrinada y verter en placas
pH: 6.8 +/- 0.2
El medio de cultivo preparado es, antes de la adicin de la sangre, claro y
amarillo parduzco y posteriormente a la adicin de la sangre del color de la
misma y no hemolizado.

Empleo e interpretacin
Sembrar las placas en superficie. Incubacin: bajo condiciones casi siempre
de 24 a 48 horas a 37C. (Oxoid 2006).

AGAR SANGRE PARA ANAEROBIOS
Para el cultivo de microorganismos anaerobios, incluso muy exigentes y de
crecimiento lento, a partir de material clnico e investigacin. (Merck 1994).

Forma de actuacin.
Este medio de cultivo no selectivo, rico en nutrientes, garantiza tanto el
cultivo de microorganismos anaerobios exigentes como de aerobios y
microaerfilos. Favorece asimismo la formacin del pigmento tpico en el
caso de Bacteroides.

Composicin:
Peptona de casena 15.0
Peptona de harina de soja 5.0
Extracto de levadura 5.0
Cloruro sdico 5.0
L-cistena 0.5
Hemina 0.005
Agar-agar 13.5
Aditivos:
Vitamina K (phytomenadion) 0.01
Sangre de carnero desfibrinada 50 ml.

Preparacin:
Disolver 44g/litro, aadir 1 ml de solucin de vitamina K y esterilizar en
autoclave (15min a 121C ) tras enfriamiento a 45-50C, aadir mezclando,
50 ml de sangre de carnero estril y verter en placas. pH 7.4 +/- 0.1
El medio de cultivo preparado es, antes de la adicin de la sangre, claro y
ligeramente parduzco y posteriormente del color de la misma y no
hemolizada
Preparacin de la solucin de vitamina K: disolver 1g de vitamina k en 99 ml
de etanol absoluto. (Merck 1994).

Empleo e interpretacin:
Sembrar las placas en superficie. Incubacin: en condiciones optimas de 24
a 48 horas 37 C.
Determinacin de la formacin de pigmento y del tipo de colonias y de
hemolisis. (Merck 1994).

AGAR BILIS ESCULINA

Para la investigacin preliminar de Enterococos (grupo serolgico D), de
acuerdo con la formulacin propuesta por SWAN (1954), as como por
FACKLAM y MOODY (1970).

Forma de accin
La hidrlisis de la Esculina y la tolerancia a la bilis considerada como
caractersticas fidedignas y constantes de Enterococos (Oxoid, 2006).

En tanto que los Enterococos que toleran la presencia de bilis, pueden
multiplicarse sin impedimento, numerosas bacterias acompaantes resultan
notablemente inhibidas en su crecimiento por las sales biliares. Los
Enterococos hidrolizan al glucsido Esculina convirtindolo en glucosa y
esculetina. (Oxoid 2006).

Esta ultima sustancia, con iones hierro (III) forma un complejo de color verde
oliva hasta negro. Aadiendo suero de caballo al medio de cultivo puede
optimizarse el crecimiento de Enterococos. (Oxoid 2006).

Extracto de carne 3.0
Peptona de carne 5.0
Bilis de buey 40.0
Esculina 1.0
Citrato frrico 0.5
Agar agar.
Adicin de gentamicina

Preparacin
Disolver 64 g/ litro y esterilizar en autoclave. No recalentar! Tras enfriamiento
a 45-50C aadir eventualmente, 5% de suero y mezclar. Verter en placas.
pH:6.6+/- 0.2
Las placas preparadas son claras y de color pardo azulado.

Sembrar por sedimentacin sutil el material a investigar. Incubacin hasta 3
das a 37C.

En presencia de Enterococos, se produce por lo general ya al cabo de las
primeras 24 horas una coloracin oscura del medio alrededor de las colonias
en crecimiento. Cuando estas son numerosas y llegar a confluir, el
oscurecimiento producido puede llegar a afectar a la totalidad del medio de
cultivo de la placa. (Oxoid 2006).

Si al cabo de 3 das de incubacin no se ha producido oscurecimiento alguno
del medio de cultivo, se acepta que el material sembrado no tena
Enterococcus. (Oxoid 2006).

AGAR SABOURAUD

Para el cultivo de mohos y levaduras a partir, sobre todo, de materiales de
envasado y embalajes, as como para el ensayo de sustancias antimicticas.
Este medio de cultivo corresponde por su composicin a las
recomendaciones del Instituto d Tecnologa de Alimentos y de envasado de
la Universidad Tecnolgica de Mnich (1974).

Peptona de carne 5.0
D (+) glucosa 10.0
Maltosa 10.0
Agar agar.

Preparacin
Disolver 45 g/litro y esterilizar en autoclave (15 min a 121C). no
sobrecalentar
pH 5.4 +/- 0.1
Las placas con medio de cultivo son claras y de color amarillento
Sembrar el medio de cultivo. Incubacin hasta 5 das a 25C. (Oxoid 2006).

AGAR PAPA DEXTROSA

Es un medio utilizado para el cultivo de hongos y levaduras a partir de
muestras de alimentos, derivados de leche y productos cosmticos.
Puede ser suplementado con antibiticos o cidos para inhibir el crecimiento
bacteriano. Este medio es recomendado para realizar recuento colonial.
Tambin puede ser utilizado para promover el crecimiento de hongos y
levaduras de importancia clnica. La base del medio es altamente nutritiva y
permite la esporulacin y la produccin de pigmentos de algunos
dermatofitos. Alguno procedimientos sealan bajar el pH del medio a 3.5 +/-
0.1 con acido tartrico al 10% para inhibir el crecimiento bacteriano.
La infusin de papa promueve el crecimiento abundante de hongos y
levaduras y el agar es adicionado como agente solidificante. (Merck 1994).

Infusin de papa 200.0
Dextrosa 20.0
Agar agar

pH 5.6 +/- 0.2

Preparacin
Suspender 39 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con
agitacin suave hasta completa disolucin y hervir durante 1 minuto.
Esterilizar en autoclave por 15 min a 121C, enfriar a una temperatura entre
45-50C y vaciar en placas de petri. (Merck 1994).

Interpretacin
Las levaduras se observan como colonias de color crema o blanco. Los
hongos crecen como colonias difusas y de varios colores. (Merck 1994).

AGAR TSBV

Utilizado como medio selectivo apropiado pata el aislamiento de
A. actinomycetemcomitans en el laboratorio.

Agar tripticasa soya 40.0
Bacitracina 75 mg
Vancomicina 5 mg
Suero de caballo estril 0.1%
Se homogenizo la solucin hirvindola a 100C, se esteriliz en el autoclave
de vapor, se atempero a 50C y se le aadieron los antibiticos y el suero.
(Merck 1994).

CALDO Y MEDIO DE CULTIVO TIOGLICOLATO

Para el cultivo y aislamiento de Anaerobios estrictos y facultativos, de
grmenes microaerofilicos y para ensayos de esterilidad. (Oxoid 2006).
Por su composicin ambos medios de cultivo corresponden a las
recomendaciones de la United States Pharmacopoeia XXI (1980), a la
European Pharmacopoeia II (1985) y a la APHA (1984). Corresponden
adems a las prescripciones analticas apartado 35 de la LMBG para la
investigacin de alimentos. (Oxoid 2006).

Forma de accin
Las sustancias reductoras, tioglicolato y cistena, proporcionan una
anaerobiosis suficiente, incluso para Anaerobios exigentes. Debido a sus
grupos sulfhidrilos, se activan las compuestos de arsnico, mercurio y de
otros metales pesados. (Oxoid 2006).

Los medios con tioglicolato son adecuados, por lo tanto, para la investigacin
de materiales que contengan metales pesados o conservantes en cuya
composicin participen dichos metales pesados. La elevada viscosidad del
medio de cultivo tioglicolato impide la penetracin rpida de oxigeno. El
eventual aumento del contenido de oxigeno se pone en manifiesto por un
viraje a rojo del indicador redox Rezarsurina sdica. (Oxoid 2006).

Composicin
L (+) cistena 0.5

Cloruro sdico 2.5
Tioglicolato sdico 0.5
Rezarsurina sdica (ausente en caldo) 0.001
Agar agar (ausente en caldo)

Preparacin
Disolver 29 g/litro (para el caldo tioglicolato), o bien 30 g litro (para el medio
de cultivo tioglicolato), distribuir en tubos y esterilizar en autoclave (15 min a
121C)
pH 7.1 +/- 0.2

Los medios de cultivo preparados son claro de color amarillento.
A ser posible, estos medios de cultivo deben usarse recin preparados. En
medio de cultivo tioglicolato ya no puede utilizarse cuando los tubos
presenten coloracin rosa debida a la penetracin de oxigeno, en mas del
tercio superior de la altura del medio y cuando dicha coloracin no quede
eliminada por ebullicin (una sola vez). (Oxoid 2006).

El material objeto de ensayo se siembra en profundidad en el medio de
cultivo. A continuacin, puede superponerse una capa de aprox. 1 cm de
altura de parafina liquida estril o de agar agua.
Incubacin: varios das a temperatura optima.
Los grmenes anaerobios crecen en la parte inferior del tubo de cultivo.
(Oxoid 2006).

AGAR CEREBRO- CORAZON (BHI)
Para el cultivo de diversos microorganismos patgenos exigentes. Estos
medios de cultivo corresponden a las recomendaciones de los Standard
methods for the examination of wter and wastewater (1975). El caldo de
cerebro-corazn corresponde a la norma DIN 10163 para el anlisis de
carnes y a las prescripciones segn apartado 35 de la LMBG para el anlisis
de alimentos. (Merck 1994).
Substrato alimenticio (extracto cerebro, extracto de corazn y peptona) 27.5
D (+) glucosa 2.0
Cloruro sdico 5.0
Hidrogenofosfato disdico 2.5
Agar-agar 15

Preparacin.
Disolver 52g/litro (agar cerebro-corazn) y esterilizar en autoclave (15min a
121 C) pH: 7.4+/- 0.2. El medio es ligeramente parduzco, presenta
opalescencia. (Merck 1994).

Formas de actuacin
El agar cerebro corazn, aparte de su aplicacin en el terreno bacteriolgico,
es adecuado tambin para el cultivo de hongos patgenos. El crecimiento de
la flora bacteriana de acompaamiento puede inhibirse notablemente por
adicin de 20 UI de penicilina y 40 ug de estreptomicina por ml de medio de
cultivo. (Merck 1994).

Este medio de cultivo es menos adecuado para el estudio de formas
hemolticas (tras adicin de sangre) debido a su contenido de glucosa.
(Merck 1994).

ANEXO 10:

TECNICA DE REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

El proceso de PCR, puede resumirse en 4 etapas, que se repiten un n
nmero de veces:

1. Separacin de las cadenas de ADN, ello se realiza aumentando la
temperatura, la cual rompe los enlaces de hidrgeno que mantiene unidos a
las cadenas de ADN.

2. Adicin de cadenas cortas de polinucletidos, denominados cebadores,
que
Se unen por complementariedad de bases a cada una de las cadenas del
fragmento de ADN que se desee amplificar. Uno se une a la cadena 5 ---3 y
otro a la cadena 35.

3. Disminucin de la temperatura para permitir que los cebadores hibridasen
con las cadenas de ADN de la muestra problema, por complementariedad de
bases.

4. Adicin de la ADN polimerasa, los cuatro nucletidos (ATP, GTP, TTP,
CTP) y dems cofactores, para que tenga lugar la sntesis de la cadena
complementaria.

5. Repeticin de las etapas 1 a 4. Este proceso se caracteriza por ser
exponencial. En cada ciclo se duplica la regin de ADN ubicada entre los
cebadores. Este procedimiento se realiza en un equipo denominado
termociclador, que permite regular las diferentes temperaturas que se
requieren para cada uno de los pasos. A continuacin se enumeran ejemplos
de agentes microbianos subclasificados en bacterias, virus y protozoario, que
han sido identificados mediante PCR.

Grafico tegnica de PCR.

Fuente: http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/tema12.pdf

.

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