E.A.P. FARMACIA Y BIOQUMICA Quinto Ao Semestre 2013-I Prctica N9: Determinacin de Txicos Orgnicos Fijos- Identificacin de Residuos 1 y 4 Departamento Acadmico de Farmacologa, Bromatologa y Toxicologa Asignatura de Toxicologa y Qumica Legal Departamento Acadmico de Farmacologa, Bromatologa y Toxicologa
Profesor Responsable: Q.F. Jos Llahuilla Quea Integrantes: Cano Mori, Csar Eduardo 08040003 Chvez Carbajal, Lucero 08040103 Gamarra Domnguez, Eliane 08040007 Prez Guerrero, Fiorella 08040106 Quispe Ibarra Anthony 08040024 Horario de Laboratorio: Martes10:00 am 2:00 pm
Prctica N9: Determinacin de Txicos Orgnicos Fijos-Identificacin de Residuos 1 y 4
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Introduccin La toxicologa forense ayuda al establecimiento de la relacin causa-efecto entre la exposicin de un medicamento o sustancia qumica y los efectos txicos o mortales que puedan causar esa exposicin, las primeras investigaciones en toxicologa forense datan del ao 1850 en donde el Conde Hiplito de Bocarm, asesina a su cuado administrndole nicotina; para demostrar la causa de esta muerte Stass crea un mtodo de aislamiento y extraccin de txicos orgnicos fijos. 1 A raz de estos avances qumicos y muchos otros, la Toxicologa Forense adquiere un gran desarrollo que se va consolidando a medida que sus resultados analticos pueden ser confirmados mediante la variada tecnologa instrumental, cada vez ms especfica y sensible. Hoy en da las drogas de abuso han pasado a ser de un problema global que afecta a muchos pases, obligando a las naciones a intensificar sus esfuerzos por el control y regulacin de algunas drogas 3 , es por ello que como futuros investigadores en el presente informe vamos a identificar los principales metaboltos producto de la biotransformacin de sustancias txicas presentes en los fluidos y tejidos corporal. Para la identificacin de estas sustancias previamente es necesario realizar una extraccin en un disolvente orgnico ya sea en medio cido o alcalino de modo que nos permita extraer la mayor cantidad y pureza 2 de estos txicos. Dentro de estos compuestos vamos a poder encontrar sustancias como las benzodiacepinas, carbamacepina, fenotiazinas, anfetaminas, antidepresivos tricclicos, alcaloides, plaguicidas organofosforados, barbitricos, salicilatos y otros analgsicos antipirticos que hayan sido empleados como sustancias de abuso por el paciente.
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Objetivos Identificar los compuestos orgnicos fijos presentes en una muestra biolgica de orina mediante reacciones especficas.
Determinar la presencia de salicilatos, fenotiazidicos y benzodiacepinas presentes en una muestra biolgica de orina.
Conocer las propiedades, mecanismos de accin y las consecuencias de sus efectos lesivos.
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Determinacin de Txicos orgnicos fijos Identificacin de Residuo 1 y 4 1. Marco terico 1.1. Salicilatos
Son sustancias hoy en da ampliamente empleadas por sus propiedades antiinflamatoria y analgsica, por ello se expenden de forma libre en muchos establecimientos farmacuticos en sus presentaciones de salicilatos, acido acetil saliclico, salicilato de sodio o salicilato de dietilamina. 5
Los salicilatos poseen como ncleo fundamental el cido saliclico (cido ortohidroxibenzoico) un potente irritante que solo puede usarse por va tpica; sin embargo para su utilizacin y mejor absorcin se han sustituido grupos carboxilos e hidroxilos dando como resultado la conocida aspirina, paracetamol, salicilato de metilo, entre otros. 4
Mecanismo de accin y toxicidad Absorcin: GI, Drmica. Metabolismo: Heptico (depuracin 3.9L/h) Unin a Protena : 50-80% Volumen de distribucin: 0.15L/kg Excreta: Orina depende ph alcalino Efectos txicos SNC: hiperventilacin, alcalosis respiratoria, deshidratacin. S.RESPIRAT: edema pulmonar. S.HEMATO: alteracin factor de coagulacin, hemorragia. GI:nauseas, emesis, dolor abdominal, Prctica N9: Determinacin de Txicos Orgnicos Fijos-Identificacin de Residuos 1 y 4
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1.2. Fenotiazinas Las fenotiazinas son un grupo de frmacos que se emplean principalmente en el tratamiento de la psicosis, se caracterizan por presentar un anillo tricclico en el cual estn ligados dos anillos de benceno por un tomo de nitrgeno y azufre. 6 A partir de esta base se han podido sintetizar ms de 30 fenotiazinas con diferentes acciones farmacolgicas; uno de los primeros frmacos sintetizados fue la Clorpromazina indicado para estados de ansiedad, psicosis y agitaciones.
Dosis txica D.TERAPUTICA:40- 60mg/Kg/da D. AGUDA: 150- 200mg/Kg/da D.SEVERA:300-500mg/Kg Manifestaciones Clnicas Nauseas Deshidratacin Hipertemia Letarco Convulsiones Mecanismo de accin y toxicidad Absorcin: GI, Parenteral. Metabolismo: Heptico . Efecto anticolinrgico produce taquicardia, y el bloqueo alfa-adrenrgico causa hipotensin ortosttica. Concentracin plasmtica mxima: 2- 4h Unin a Protena : 80% Volumen de distribucin: 20 L/kg Excreta: Orina y bilis Vida media: 20-40h Efectos txicos
SNC: depresin. S.CARDIO: alteracin en la repolarizacin, conduccin auriculo- ventricular, S.DRMICO: hipersensisbilidad, reacciones cutneas. S.METABLICO: hipercolesterolemia. Prctica N9: Determinacin de Txicos Orgnicos Fijos-Identificacin de Residuos 1 y 4
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1.3. Benzodiacepinas Estn compuestas por un anillo de benceno unido a un anillo de diazepina de siete miembros, sin embargo presentan una sustitucin a nivel del carbono 5. Son tranquilizantes menores empleados con fines teraputicos en el tratamiento psiquitrico; sin embargo hoy en da tambin se emplean con fines delictivos junto con otros depresores del sistema nerviosos como el alcohol llevando al paciente a un estado de coma. Sus efectos ms relevantes son la sedacin, hipnosis, disminucin de la ansiedad, relajacin muscular, amnesia y actividad anticonvulsiva. 7
Dosis txica
D.LETAL: 150mg/Kg Manifestaciones Clnicas Miosis Hipotensin Arritmia Depresin respiratoria Agitaciones Hiper- Hiportemia Letarco Convulsiones Prctica N9: Determinacin de Txicos Orgnicos Fijos-Identificacin de Residuos 1 y 4
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Mecanismo de accin y toxicidad Absorcin: GI Metabolismo: Heptico . Mecanismo de accin: potencian la accin inhibitoria del neurotransmisor (GABA), favoreciendo el ingreso de iones de cloro a la clula, lo cual genera hiperpolarizacin celular y disminuye la excitabilidad neuronal. Concentracin plasmtica mxima: 2- 3h Unin a Protena : 80-90% Volumen de distribucin: 1-3.5 L/kg Excreta:Renal Vida media: 10h Efectos txicos
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2. Parte experimental
2.1. Reactivos, materiales y equipos
2.2. Tcnica operatoria 2.2.1. Identificacin de Salicilatos (R 1 ) A. Reacciones Generales
Se basa en la formacin de un complejo coloreado de tetrafenol- hierro, por la presencia de hierro (III) y el anillo fenlico de los salicilatos. La formacin de una coloracin roja, azul o prpura indica una reaccin positiva frente a la presencia de fenoles.
R E A C T I V O S
Tetracloruro de fierro Cl 3 Fe 5% cido clorhdrico HCl 10% Rvo de Trinder Rvo F.P.N. Rvo Dragendorf Nitrito de sodio NO 2 Na 0.1% Sulfamato de amonio 1% N- naftiletilendia mino clorhidrato 0.1%
M A T E R I A L E S
Capsula de porcelana Tubo de ensayo de vidrio Bao maria Placa cromatogrfic a de silicagel Cmara cromatogrfic a Capilar Pipeta de vidrio de 1, 5 y 10 ml Propiteta de plstico o bombilla
E Q U I P O S
Cmara extractora de gases de laboratorio Espectrofot metro Fundamento Prctica N9: Determinacin de Txicos Orgnicos Fijos-Identificacin de Residuos 1 y 4
Reaccin Qumica Mecanismo de accin Resultado FeCl 3 + 3 C 7 H 6 O 3 = Fe (C 7 H 6 O 3 ) 3 + Cl 3
Mtodo operatorio Gts R1 (Disuelto en etanol) Gts Cl 3 Fe 5% Coloracin azul, roja, prpura. Si la reaccin es positiva Agregar HCl 10% Desaparece el color. Prctica N9: Determinacin de Txicos Orgnicos Fijos-Identificacin de Residuos 1 y 4
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B. Cuantificacin
El reactivo de Trinder [HgCl 2 -Fe(NO 3 ) 3 ] produce un color prpura, aconsejable para la determinacin cuantitativa de salicilatos por espectrofotometra U.V. siendo caracterstico a una absorcin cuya longitud de onda es 540 nm
Fundamento Mtodo operatorio Reaccin Qumica MP ST 5ml Rvo Trinder 1ml HCl 1ml MP o St (5mg cido saliclico) Leer a 540nm por espectrofotometra FeCl 3 + 3 C 7 H 6 O 3 = Fe (C 7 H 6 O 3 ) 3 + Cl 3
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Absorbancia MP 0.549 ST 0.508
Mecanismo de accin Resultado 5mg AAS 100ml X = 0.05mg AAS 1ml
0.508 A ST 0.05mg AAS 0.549 A MP X= 0.0540mg AAS 0.0540mg AAS 2ml ORINA X 100 X=2.7mg% Prctica N9: Determinacin de Txicos Orgnicos Fijos-Identificacin de Residuos 1 y 4
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2.2.2. Identificacin de Fenotiaznicos (R 4 ) A. Reaccin de caracterizacin
Se basa en la formacin de un compuesto coloreado verde oscuro o azul-verde que indica la presencia de compuestos fenlico como el cido fenilpiruvico (metaboltos) o de cidos relacionados. El color puede aclararse lentamente pasando al amarillo.
Fundamento Mtodo operatorio Mecanismo de accin Reaccin Qumica Gts R 4 (diluido en etanol) Evaporar II gts Cl 3 Fe al 5% Agrega gt de HCl al 10% El color azul-verde no debe desaparecer. Prctica N9: Determinacin de Txicos Orgnicos Fijos-Identificacin de Residuos 1 y 4
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B. Reaccin especfica
Forrest F.M y Forrest F.L, en 1960, propusieron un mtodo de determinacin cualitativa basado en el uso de FeCl3, HClO3 y HNO3 (el reactivo FPN, de fierro, perclrico y ntrico), el cual produce un radical libre con coloracin variable (azul, azul violceo).
Reactivo Positivo/Negativo Coloracin Cl 3 Fe ++ Azul HCl 10% ++ No desaparece Resultado Fundamento Mtodo operatorio III Gts del Rvo FPN 5 mlCl 3 Fe 5% 45ml NO 3 H C
50ml Ac. Perclrico Gts R 4 (diluido en etanol) Evaporar
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2.2.3. Identificacin de Benzodiacepinas (R 4 ) A. Reaccin general ( Dragendorff)
Se basa en la identificacin de alcaloides, siendo especfico para compuestos nitrogenados presentes en la benzodiacepinas que por accin del Reactivo de Dragendorff (yoduro de potasio y bismuto) han de formar un compuesto rojo ladrillo caracterstico.
Reactivo Positivo/Negativo Coloracin FPN + Rojo violceo Mecanismo de accin Resultado Fundamento Mtodo operatorio III Gts R 4
Evaporar III Gts Rvo Dragendorff Formacin de precipitado rojo ladrillo Prctica N9: Determinacin de Txicos Orgnicos Fijos-Identificacin de Residuos 1 y 4
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B. Reaccin especfica
Se fundamenta en el empleo del reactivo de Bratton- Marshall (Nitrito de sodio, sulfamato de amonio y N- (1- Naftil) etilendiamina.) para la determinacin de benzodiacepinas por diazotizacin. Este reactivo fue propuesto originalmente por sus creadores para la determinacin de sulfonamidas en orina, en donde previamente la orina deba ser sometida a una hidrlisis cida con HCl para la produccin de una benzofenona, con el medio cido proporcionado previamente, el nitrito de sodio se convierte a cido nitroso y se lleva a cabo la reaccin de diazotizacin
5ml HCl 6N Bao en glicerina A temperatura de 124C Por 30min Enfriar 1ml NO 2 Na 0.1% 1ml Sulfamato de amonio 1% 1ml N- naftiletilendiam ino clorhidrato 0.1% Azul, rojo violceo Prctica N9: Determinacin de Txicos Orgnicos Fijos-Identificacin de Residuos 1 y 4
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Mecanismo de accin Reaccin Qumica Prctica N9: Determinacin de Txicos Orgnicos Fijos-Identificacin de Residuos 1 y 4
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2.2.4. Screenig en Cromatografa de capa fina
La cromatografa en capa fina es la separacin de dos o ms molculas presentes en una mezcla en base al principio de reparto entre dos fases. Sirve para hacer una determinacin en serie de los metaboltos que queremos evaluar, aunque tienen la ventaja de ser rpidos y de rutina, puede que en algunos casos no sean tan especficos como los mtodos anteriormente descritos.
Reactivo Positivo/Negat ivo Coloracin N- naftiletilendiamino +++ Rojo violceo Compuesto en estudio Sistema de solvente Proporcin Salicilatos Metanol 5ml Agua 5ml Fenotiazinicos Benzodiacepnico Metanol 5ml Agua 5ml Trietanolamina 0.03ml Resultado Fundamento Mtodo operatorio Soporte: Silicagel G Sistema de solvente Prctica N9: Determinacin de Txicos Orgnicos Fijos-Identificacin de Residuos 1 y 4
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Compuesto en estudio Revelador Salicilatos Reactivo de Trinder Fenotiazinicos Reactivo de FPN Benzodiacepnico Reactivo de Dragendorff
Reveladores Se realiza la siembra hasta 15 veces de las muestras problemas y los estndares con ayuda de un capilar pequeo. El punto de siembra debe estar por encima del nivel de la fase mvil.
Introducir las placas o soportes de silicagel G en la cmara cromatogrfica para realizada la corrida. Se procede a secar con cuidado las placas y se revela, tienen que colocarse en distintos roceadores para evitar mezclas.
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Sustancia Rf Rx Salicilatos 0.46 0.53 Fenotiazinicos 0.52 0.50 Benzodiacepinas 0.70 0.66 Resultado Rf: Mide la retencin de un componente. Rf= Distancia de la muestra desde el origen Distancia del eluyente desde el origen Rx: Mide la relacin entre el estndar Rx= Distancia recorrida por el compuesto de referencia Distancia recorrida por el eluyente Prctica N9: Determinacin de Txicos Orgnicos Fijos-Identificacin de Residuos 1 y 4
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3. Discusin de resultados
Para la identificacin de txicos orgnico fijos como los salicilatos, fenotiazinas y benzodiacepinas se emplearon mtodos qumicos de reacciones cualitativas y cuantitativas colorimtricas que fueron especficas para cada uno de estos compuestos, los resultados fueron positivos; sin embargo las cantidades encontradas en los residuos R 1 Y R 4 fueron mnimos segn los valores obtenidos al confirmar con los calores limites. Para una mejor identificacin de estos compuestos se realiz una determinacin por cromatografa en capa fina empleando slica gel-G que permiti comparar nuestras muestras problema frente a un compuesto estndar; para ello se emplearon diferentes reactivos como el Rvo de Trinder, Rvo FPN y Rvo de Dragendorff los cuales fueron potenciados al agregar nitrato de sodio en el proceso de revelado.
4. Conclusiones
Se determin la presencia de salicilatos, benzodiacepinas y fenotiazinas en los residuos R1 y2 de una muestra biolgica de orina mediante reacciones especficas colorimtricas.
Las concentraciones encontradas de salicilatos no sobrepasa el lmite tolerado, por lo tanto no podran causar grandes consecuencias de efectos lesivos a corto plazo.
La presencia de benzodiacepinas y fenotiazinas podra causar efectos lesivos si se encuentran a altas concentraciones en el organismo.
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5. Bibliografa 1. Drogas en pelo: sus alcances y limitaciones I" Perkins de Piacentino, A. M.; Locani, O. A.; Lorenzo, J. L. LABORATORIO DE TOXICOLOGA Y QUMICA LEGAL. Cuerpo Mdico Forense, Corte Suprema de Justicia de la Nacin Argentina. 2. Repetto, Manuel; Repetto, Guillermo. Toxicolgica fundamental. 4a ed. Sevilla: Editorial Diaz de Santos; 2009. Pg. 526 3. Osvaldo Romo Pizarro. Medicina legal: elementos de ciencias forenses. 1 edicin. Santiago de Chile. 2000. Pg. 5 4. Lorenzo F.P. Moreno G.I Hernndez J.C. Farmacologa: Bsica y Clnica. 18 edicin. Buenos Aires: Editorial Mdica Panamericana. 2008. Pg. 532 5. Secretaria de salud del Gobierno del estado de Veracruz. Gua de diagnostico y tratamiento intoxicacin por salicilato. 2012. Disponible en [www.ssaver.gob.mx./cilver] 6. Mencas R.E. Mayero F.L. Manual de toxicologa bsica. 1 edicin. Madrid: Editorial Daz de santos. 2000. Pg. 123- 124 7. Rozo U.R. Alvarado B.J. Gua de Prctica clnica Toxicologa. 1 edicin. Volumen II, Tomo IV. Bogot: Editorial Mdica Latinoamericana. 2004. Pg 76-78.