UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA

Facultad de Medicina Humana

Prctica N 05: Accin de agentes fsicos, qumicos y
Antibiograma
Aislamiento de Staphylococcus Aureus










Alumno: Elvis Valdez meca
Curso: Mecanismos de Agresin y Defensa I
Ciclo: IV
Profesor Responsable:
Dr. Cesar Torres Daz
Piura-Per
2014
Mecanismos de Agresin y Defensa I
IVciclo-FMH-UNP

1



INFORME N05
AISLAMIENTO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS
1. OBJETIVOS:

Reconocer y aprender los pasos que se deben seguir para aislar staphylococcus aureus;
teniendo en cuenta las distintas tcnicas para aislarlos de las otras especies de staphylococcus
existentes.

Reconocer y aprender a realizar las pruebas bioqumicas que sean necesarias para determinar
qu clase de microorganismo es, interpretando los resultados.
Determinar si el organismo es patgeno o no.

2. INTRODUCCIN:

Los cocos grampositivos son un grupo heterogneo de bacterias, las caractersticas que tienen en
comn son su forma esfrica, su reaccin a la tincin de Gram y la ausencia de endoesporas.
La presencia o ausencia de actividad catalasa es una prueba sencilla que se utiliza para
subdividirlas en varios gneros.

Entre los gneros aerobios catalasa positivos cabe mencionar: Staphylococcus, Micrococcus.

Gneros aerobios catalasa negativos: Streptococcus, Enterococcus.

Los staphylococcus tienen un dimetro de 0.5 a 1 um y son anaerobios facultativos, inmviles
capaces de crecer en un medio con elevada concentracin de sal, y a temperaturas de 18-40C.

Las especies que se asocian con mayor frecuencia a enfermedad en el ser humano son S. aureus, S.
epidermidis, S. Haemolyticus, S. Aureus resistente a meticilina.

Las colonias de S. Aureus son doradas como consecuencia de los pigmentos carotenoides que se
forman durante su crecimiento y que dan el nombre a la especie. Es la nica especie presente en
las personas que produce la enzima coagulasa.

En esta prctica se busc aislar colonias de Staphylococcus aureus en Agar Manitol Sal, para luego
realizar todas las pruebas bioqumicas propuestas, y verificar todas sus caractersticas particulares.

Mecanismos de Agresin y Defensa I
IVciclo-FMH-UNP

2



3. MARCO TEORICO

El Staphylococcus aureus tiene un metabolismo de tipo fermentativo y anaerobio facultativo,
catalasa positivo y oxidasa negativo. Son capaces de fermentar la glucosa sin produccin de
gases y producen acetil metil carbinol. Fermentan tambin el manitol con formacin de cidos
y puede hacerlo en anaerobiosis. No hidrolizan el almidn y son capaces de crecer en
presencia de un 40% de bilis.
Su temperatura ptima de crecimiento va de 35 a 40 C y el pH ptimo oscila entre 7,0 y 7,5
aunque soportan pH mucho ms extremos. Soportan tasas elevadas de cloruro sdico, hasta
un 15%.
Poseen una enzima, la coagulasa, que los diferencia del resto de las especies del gnero; sta
tiene la facultad de reaccionar con el fibringeno dando lugar a un cogulo de fibrina. Poseen
igualmente una desoxirribonucleasa o DNasa, una nucleasa exocelular que despolimeriza el
ADN. A esta enzima se la denomina termonucleasa por ser termoresistente en las cepas de
S.aureus.
Tambin presentan la protena A, una protena de unin inespecfica a anticuerpos que est
relacionada con su virulencia.
Un medio diferencial para S.aureus es el medio manitol-salino o Chapman.

EPIDEMIOLOGIA
El Staphylococcus aureus es un agente patognico que acta como un microorganismo
saprfito, se encuentra en la piel del individuo sano pero en ocasiones en que las defensas de
la piel caen puede causar enfermedad. El principal grupo de riesgo son pacientes
hospitalizados o inmunocomprometidos. Cerca de 2 mil millones de personas han sido
colonizadas mundialmente por este microorganismo.

FACTORES DE VIRULENCIA
Los factores de virulencia que presenta S. aureus, pueden ser productos extracelulares o
propios de la clula bacteriana.

1.- Coagulasa. Es una enzima que le da la cualidad de coagular el plasma humano. Existe una
coagulasa libre, que es una protena secretada con mltiples formas antignicas, la cual se
puede evidenciar en un tubo de ensayo con plasma humano o de conejo, resultando un
cogulo de fibrina. Aparte, existe una coagulasa unida a la pared bacteriana que acta como
factor de la agregacin plaquetaria.

2.- Hemolisinas. Protenas, de las cuales alfa y delta son significativas para el hombre. Alfa es
termolbil, pero produce lisis de eritrocitos y toxicidad para otras lneas celulares; bloquea la
Mecanismos de Agresin y Defensa I
IVciclo-FMH-UNP

3

repolarizacin de la membrana plasmtica, por lo cual genera contraccin de la musculatura
lisa y vasoconstriccin. Lo anterior resulta en la reduccin del flujo sanguneo y en una acidosis
lctica. Por lo mismo, existe hipertensin.

3.- Leucocidina. Protena que ayuda al microorganismo a sobrevivir dentro de los fagosomas
leucocitarios.

4.- Hialuronidasa. Enzima que degrada el tejido conectivo, permitiendo el avance del
microorganismo hacia zonas ms profundas.

5.- Estafiloquinasa. Enzima que disuelve los cogulos de fibrina.

6.- Lipasas. Degradan los cidos grasos presentes en los tejidos cutneos sanos.

7.- Enterotoxinas. Protenas relativamente estables al calor y resistentes a enzimas
proteolticas. Suprimen la actividad de IgM aumentan la susceptibilidad del paciente a generar
shock. Enterotoxinas A y D son las ms comunes.

8.- Toxina exfoliativa. Genera la separacin del tejido intraepidrmico, produciendo el
sndrome de la piel escaldada.

9.- Protena A. En la superficie de la pared bacteriana. Se une a la regin Fc de la IgG,
inactivndola.

10.- Penicilinasa o b-lactamasa. Hidroliza el anillo b-lactmico presente en la estructura
molecular de las penicilinas.

11.- Catalasa. Transforma el perxido de hidrgeno en agua.

12.- Exotoxinas pirognicas.

13.- Toxina del Shock txico (TSST-1). Causante del sndrome del shock txico.









Mecanismos de Agresin y Defensa I
IVciclo-FMH-UNP

4



4. METODOS Y PROCEDIMIENTOS:
Mechero de Bunsen,
Agua oxigenada
Cristal violeta, Lugol, Alcohol cetona y safranina.
Fsforos,
Tubos de ensayo con medio BHI,
Placas de Petri con medio agar manitol sal.La sal es para evitar el crecimiento de otras
bacterias
Asa de siembra, hisopos de madera.

Para Antibiograma:
Placa de petric con medio Muller-Hilton,
Disco con antibiticos, los antibiticos en el disco son: Penicilina, Tetraciclina,
Oxacilina, Dicloxacilina, Cefazolina, Ceftriazona, Sultamicilina, Ampicilina, Amikacina,
Sulfatrimet.












Mecanismos de Agresin y Defensa I
IVciclo-FMH-UNP

5



Procedimiento:
a) Toma de muestra y aislamiento del microorganismo:
Despus de desinfectar el rea de trabajo, procedemos a tomar la muestra, dentro
del permetro de esterilidad brindado por la llama de un mechero, mediante un
hisopado farngeo y se siembra en la placa de Agar Manitol Sal por agotamiento,
se lleva a incubar por 24 horas.




















Mecanismos de Agresin y Defensa I
IVciclo-FMH-UNP

6

b) Al da al da siguiente despus de 24 horas, regresamos para observar si hubo o
no crecimiento. Al notar la presencia de colonias amarillas en la placa cultivada,
proseguimos con las pruebas bioqumicas.





El agar manitol cabio de color rojo a color amarillo
(seria manitol +).
A estas placas procedimos hacerles las pruebas
de GRAM Y CATALASA









c) Al notar la presencia de colonias amarillas, se selecciona una sepa, y se procede a
realizar las pruebas bioqumicas, comenzando con la coloracin Gram y llevamos
al microscopio, y proseguimos con todas las siguientes pruebas como :

Prueba de la catalasa.
Paso 1: Esterilizar el asa de siembra, calentndola hasta que el alambre de nikron se
observe de color rojo vivo.

Paso 2: Extraccin del microorganismo.y la ponemos en el pomo que contiene solucin
salina para su homogenizacin.


Mecanismos de Agresin y Defensa I
IVciclo-FMH-UNP

7



Paso 3: Fijacin del microorganismo sobre la lamina




Paso 4: Se vuelve a esterilizar el asa de siembra, para eliminar el microorganismo.

Paso 5: Se aplica una gota de agua oxigenada (perxido de hidrogeno), y se observa.





CATALASA +: Hay presencia de
burbujas.
Como vemos es catalasa positivo
podemos deducir que por esa
caractersticas que son estafilococos,
ahora tenemos que comprobar que
tipo de stafilococos es, lo que
queremos encontrar es el stafilococos
aureus para lo cual tenemos que tener
encuenta las pruebas de coagulasa.


Mecanismos de Agresin y Defensa I
IVciclo-FMH-UNP

8

Extraemos colonias de la placa que tiene estafilococos de para luego llevarlo a al caldo
BHI y hacer dentro de 24 horas la PRUEBA DE COAGULASA para pero ver si es que es
el estafilococos auereus


Sembrado en BHI. De 18 a 24 horas
Con el asa esterilizada se toma una muestra de la sepa que estamos utilizando en
el estudio y se coloca dentro del tubo de ensayo que contiene caldo BHI, desde
este BHI se sacar muestra para las dems pruebas: la coagulasa,y del
antibiograma.



Se lleva del caldo BHI 1mm al plasma citratado con 1mm, ver si este coagula.
Caldo nutritivo BHI
Plasma citratado 1mm
Mecanismos de Agresin y Defensa I
IVciclo-FMH-UNP

9



Prueba de la coagulasa: aqu ya han pasado ms de 24 horas despus de
ponerlo en plasma citratado.

Paso 1: se observ que en los tubos de ensayo que contenan la siembra de BHI con
estafilococos, cuatro son coagulasa positivo y uno es cuagulasa negativo, fue evidente
la observacin del coagulo.
El caldo BHI tiene un color amarillo dorado.



Se observan los dos primeros que son los que estn totalmente coagulado, y los otros dos
esta solo una parte coagulado.


Este es coagulasa
negativo








Mecanismos de Agresin y Defensa I
IVciclo-FMH-UNP

10

Sembrado en Muller Hinton, y prueba del
antibiograma
.


Se siembra una muestra desde el caldo BHI en la placa que contiene el medio
Muller Hinton, luego dejamos asentar al microorganismo.


Aqu se pasaron del de BHI a esta solucin




Mecanismos de Agresin y Defensa I
IVciclo-FMH-UNP

11

Se retira el disco con antibiticos de su envoltura.
















Se coloca en disco en el cultivo en medio muller-hilton, y se presiona en los puntos
exactos donde estn las distintas pastillas con los antibiticos, para que este
interaccione bien con el microorganismo.




Se lleva a la incubadora por 24 horas, luego de las cuales se tienen que observar los
resultados y tomar las medidas de los halos que se formen.
Mecanismos de Agresin y Defensa I
IVciclo-FMH-UNP

12



24 horas despus para la prueba de Antibiograma: en el antibiograma, pudimos apreciar
la siguiente figura:


OBSERVAMOS QUE:
El antibitico ms fuerte y efectivo es, en este caso, son SXT 25 Y EIT, con un
dimetro de 15mm. De alcance. Este fue el alo ms grande en consecuencia este
antibitico se califica como sensible.

El antibitico medianamente sensible fueron: AMC30(8mm) y TRD(9mm)
El antibitico ms resistente es DKB(3mm)

SXT 25 (15mm.)
EIT (15 mm)
AMC 30 (8mm)
TRD (9mm.)
DKB (3mm





Mecanismos de Agresin y Defensa I
IVciclo-FMH-UNP

13

5. OBSERVACIONES :


a) Tincin Gram:


Observamos cocos Gram positivos,











b) Catalasa: en la reaccin del microorganismo al contacto con agua oxigenada.
Observamos burbujas al colocar la muestra en la lmina con agua oxigenada, por
lo tanto, el microorganismo es: catalasa (+).como se puede observar en la
imagen.

c) Coagulasa: si hubo formacin de trombo, por lo que se concluye Coagulasa (+)

d) Antibiograma: en el antibiograma, pudimos apreciar la siguiente figura:
La formacin de alos y la sensibilidad del microorganismo con cada antibitico.














Mecanismos de Agresin y Defensa I
IVciclo-FMH-UNP

14

6. INTERPRETACION DE RESULTADOS:

En esta prctica logramos primero aislar un microorganismo patgeno como lo es el
Staphylococcus Aureus en un medio de cultivo Indicador selectivo, como lo es el Agar Manitol Sal,
este microorganismo tiene la capacidad de vivir en estas condiciones, ya que es capaz de resistir
grandes concentraciones de sal, adems de poderlo reconocer gracias al color amarillo que
presentan sus colonias, esto es debido a que oxidan azcares, como el manitol.
Al realizar las pruebas bioqumicas, al principio, constatamos que en nuestro cultivo exista una
sepa de bacterias Gram (+), cocos agrupados en forma de racimos, por lo que seguamos
sospechando de Staphylococcus Aureus, luego la prueba de Catalasa result positivo tambin, con
lo que reforz la idea de que se trataba de este tipo de microorganismo.

En lo que a la prueba de la coagulasa, esta es especfica para S. Aureus, y al arrojarnos positivo
podramos concluir que la muestra estudiada si perteneca a una colonia de este tipo de bacteria.

Con respecto a los resultados del antibiograma .El antibitico ms fuerte y efectivo es, en este
caso, son SXT 25 Y EIT, con un dimetro de 15mm. De alcance. Este fue el alo ms grande en
consecuencia este antibitico se califica como sensible.






















Mecanismos de Agresin y Defensa I
IVciclo-FMH-UNP

15


7. CONCLUSIONES:

El Staphylococcus Aureus, cocos Gram (+), puede ser aislado en un medio de Agar Manitol
Sal, tomando sus colonias un color amarillo o dorado dentro de este.

El Staphylococcus Aureus contiene las enzimas catalasa, coagulasa, por ello dichas pruebas
bioqumicas deben resultar positivas.

Staphylococcus Aureus es una bacteria resistente

los resultados del antibiograma .El antibitico ms fuerte y efectivo es, en este caso, son
SXT 25 Y EIT, con un dimetro de 15mm. De alcance. Este fue el alo ms grande en
consecuencia este antibitico se califica como sensible.









8. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS:

1. JAWETS, Melnick y Adelberg, MICROBIOLOGA MDICA 19
ava
edicin en Castellano.
Editorial Manual moderno.

2. MURRAY, MICROBIOLOGA MDICA 14
ava
edicin.

3. Staphylococcus Aureus
Disponible en:
http://www.bvsops.org.uy/pdf/aureus.pdf

4. Staphylococcus aureus:
Disponible en: http://es.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus_aureus