PRCTICA 5

DETERMINACIN DE PROTENAS


Objetivo general. El alumno identificar la presencia de protenas en algunos alimentos y
determinara el efecto de algunas sustancias sobre stas.

Objetivo especifico. El alumno realizar en equipo, tres experimentos relacionados con las
protenas, estableciendo una hiptesis para explicar lo que sucede en cada uno de estos.


INTRODUCCIN

Las protenas son molculas relativamente frgiles, que conservan su actividad biolgica
solamente en un intervalo relativamente limitado de pH y de temperatura. Las protenas son
polmeros de alto peso molecular, compuestos por aminocidos unidos entre s por enlaces
peptdicos, que cuando se solubilizan son de dimensiones coloidales. Presentan propiedades
fsicas y qumicas que dependen directamente de factores intrnsecos del propio polmero,
como son su estructura y composicin de aminocidos, o bien por factores extrnsecos
como el pH, temperatura, sales, etc. Existen varios mtodos para la identificacin,
caracterizacin y cuantificacin de las protenas, pero la mayora tiene como principio
alguna reaccin qumica caracterstica de los grupos R de los diferentes aminocidos. Entre
las tcnicas de identificacin se encuentran las basadas en reacciones de color, cuyo
principio se explica de la siguiente manera: de los aminocidos presentes en todas las
protenas, algunos reaccionarn con cierto reactivo para dar productos con colores
caractersticos. Tales reacciones de color son usadas convenientemente para determinar la
presencia de protenas o bien para determinar la presencia o ausencia de grupos qumicos
especficos en la molcula proteica. Puede decirse que las protenas reflejan las propiedades
qumicas de los residuos de aminocidos que contienen, por lo que la mayora de las
reacciones coloridas de identificacin dependen de la existencia de un aminocido
especfico en ellas.
La reaccin xantoproteica es un mtodo que se puede utilizar para determinar la cantidad
de protena en una solucin, empleando cido ntrico concentrado. La prueba da resultado
positivo en aquellas protenas con aminocidos portadores de grupos aromticos,
especialmente en presencia de tirosina. Una vez realizada la prueba se neutraliza con un
lcali virando a un color amarillo oscuro.
Desnaturalizacin de las protenas. Cuando las protenas se exponen a valores extremos
de temperatura o pH, o a algunas sustancias que afectan sus propiedades de plegamiento, se
dice que sufren desnaturalizacin. En general, las propiedades biolgicas de una protena se
pierden cuando se desnaturaliza. Los enlaces peptdicos no suelen resultar afectados cuando
las protenas se desnaturalizan y la secuencia de aminocidos en el polipptido (estructura
primaria) permanece por tanto inalterada. Sin embargo, la desnaturalizacin ocasiona un
desplegamiento en la cadena polipeptdica al destruirse la estructura de orden superior de la
molcula, en particular los enlaces de hidrgeno. El polipptido desnaturalizado retiene su
estructura primaria porque aquella est mantenida por enlaces covalentes. Dependiendo de
las condiciones de desnaturalizacin, el polipptido puede volver a plegarse una vez
suprimido el agente desnaturalizante. Sin embargo, el hecho de que la desnaturalizacin
conlleve generalmente a la prdida de la actividad biolgica de la protena, demuestra
claramente que la actividad biolgica no puede asociarse a la estructura primaria de las
protenas, sino que es el resultado del plegamiento preciso de la molcula, eventualmente
condicionado por la estructura primaria. El plegamiento de un polipptido origina, por
tanto, dos cosas: (1) el polipptido logra una forma nica que es compatible con una
funcin biolgica especfica, y (2) el proceso de plegamiento confiere a la molcula su
forma qumica ms estable.

MATERIAL:

1 Gradilla.
1 Mechero.
1 Soporte universal con anillo.
1 Tela de asbesto.
2 Vasos de precipitados de 600 ml.
1 Pinza para tubo de ensayo.
11 Tubos de ensayo de 22 x 175 mm.
7 Pipetas de 1 ml.

REACTIVOS

1 Huevo de gallina por cada 3 equipos.
Solucin de grenetina al 10%.
Solucin de almidn al 10%.
Solucin de sacarosa al 10%.
Leche entera de vaca.
Solucin de cido ntrico al 20%
Hidrxido de amonio.
Solucin de cido Clorhdrico 1M.
Solucin de hidrxido de sodio 1M.
Solucin de sulfato de cobre 0.1M.
Solucin de acetato de plomo 0.1M.
Agua destilada.
Hielo en cubos.

DESARROLLO:

EXPERIMENTO No. 1 IDENTIFICACIN DE PROTENAS

1. Marcar 5 tubos de ensayo, del nmero 1 al 5 respectivamente, agregar a cada tubo lo
siguiente: 1ml de clara de huevo (albmina) al primero, 1ml de leche al segundo, 1ml de
solucin de almidn al tercero, 1ml de solucin de sacarosa al cuarto y 1ml de solucin de
grenetina al quinto.
2. Agregar a cada tubo ocho gotas de cido ntrico al 20%, agitar con cuidado.
3. Colocar los tubos en un vaso de precipitados con agua hirviendo durante 10 minutos.
4. Sacar los tubos del bao mara y colocarlos en un vaso de precipitados que contenga
agua con hielo durante 5 minutos.
5. Sacar los tubos del agua con hielo y agregar a cada uno cinco gotas de hidrxido de
amonio, hacer observaciones.

EXPERIMENTO No. 2 EFECTO DE LOS CIDOS Y LAS BASES EN LAS
PROTENAS

1. Marcar tres tubos del uno al tres respectivamente.
2. Agregar 1ml de albmina a cada uno.
3. Aadir al tubo nmero uno 1ml de agua destilada, al tubo nmero dos 20 gotas de
solucin de cido clorhdrico 1M y, al tubo nmero tres 20 gotas de solucin de hidrxido
de sodio 1M.
4. Agitar cada tubo y hacer observaciones.

EXPERIMENTO No. 3 EFECTO DE LOS METALES SOBRE LAS
PROTENAS

1. Marcar tres tubos del uno al tres respectivamente.
2. Agregar 1ml de albmina a cada uno.
3. El tubo nmero uno es el testigo.
4. Aadir al tubo nmero dos, 4 gotas de solucin de sulfato de cobre 0.1M, al tubo nmero
tres, 4 gotas de solucin de acetato de plomo 0.1M.
5. Agitar los tubos y hacer observaciones comparando con el tubo testigo.

CUESTIONARIO

1. Describe 2 reacciones coloridas para la identificacin de protenas diferentes a la
realizada en la prctica.

2. Cul es la accin del cido clorhdrico sobre las protenas de la dieta en el estomago?

3. Qu efectos tienen los metales pesados en nuestro organismo?

BIBLIOGRAFIA

Mathews Christopher. Bioqumica. 3
a
Edicin. Editorial Pearson 2005
McKee Trudy. Bioqumica. La base molecular de la vida.1 Edicin. Editorial McGraw-
Hill Interamericana
http://www.angelfire.com/scifi/anarkimia/proteinas
PRCTICA 7

ANHIDRASA CARBNICA

Objetivo general. El alumno conocer que la presencia de una enzima modifica la
velocidad de la reaccin.

Objetivo especfico. El alumno observar y verificar la diferencia de la velocidad de una
reaccin con la presencia de una enzima y sin ella.


INTRODUCCIN

El CO
2
es un material de desecho proveniente del metabolismo de los tejidos, este gas es
mucho mas soluble que el O
2
, por esta razn difunde con facilidad en los medios acuosos y
a travs de las membranas , en consecuencia, basta una pequea diferencia de presin
parcial ( P
CO2
) para producir un flujo neto de CO
2
en cualquier sentido, por eso solo el 6 %
del CO
2
presente en la sangre se encuentra disuelto como tal, ya que la enzima anhidrasa
carbnica contenida en los eritrocitos, cataliza en ambos sentidos la reaccin:

CO
2
+ H
2
O H
2
CO
3


El CO
2
se une a la sangre en los tejidos porque la hemoglobina desoxigenada acta como
un cido muy dbil y adems tiene gran afinidad por el CO
2
, capta hidrogeniones del medio
y de este modo favorece la disociacin del H
2
CO
3
:

H
2
CO
3
HCO
3
-
+ H
+


El in bicarbonato formado (HCO
3
-
) en el interior del eritrocito difunde al plasma, de
modo que se transporta por ambos medios: 2/3 por el plasma y 1/3 por los eritrocitos, as la
sangre transporta CO
2
en forma de carbaminohemoglobina y en forma de bicarbonato, lo
contrario ocurre en el pulmn. La abundancia de O
2
favorece la formacin de
oxihemoglobina y al actuar esta como un cido fuerte, cede H
+
al HCO
3
-
, que se convierte
en H
2
CO
3
y se elimina en forma de CO
2
por accin de la anhidrasa carbnica, las
reacciones acopladas son:

TEJIDOS
HbO
2
-
+ CO
2
+ H
2
O

HbH + O
2
+ HCO
3
-

oxihemoglobinato PULMN hemoglobina
desoxigenada
(protonada)
MATERIAL:

1 Vaso de precipitados de 600 ml.
3 Tubos de ensayo de 25 x 200 mm.
3 Pipetas de 5 ml.
1 Probeta de 20 ml.
1 Cronmetro.
1 Tubo de Vacutainer (tapn lila)
1 Aguja para Vacutainer
1 Soporte para aguja de Vacutainer
1 Ligadura
1 Matraz Erlenmeyer de 50 ml
2 Pipetas de 1 ml

REACTIVOS:

Azul de bromotimol al 0.01% en agua de la llave o agua destilada a pH neutro.
Solucin salina al 0.9 %.
Torundas en alcohol.
Agua destilada.
Hielo.

MATERIAL BIOLGICO:

Sangre humana.

DESARROLLO:

1. Preparar en el matrz Erlenmeyer una mezcla a partes iguales de sangre y solucin salina
suficiente para todos los equipos.
2. Marcar cada equipo sus tubos con las letras A, B y C respectivamente.
3. Agregar a los tubos, 15 ml de agua destilada a pH neutro (medidos con la probeta) y 1 ml
de azul de bromotimol (indicador).
4. A los tubos A y B agregar 0.1 ml de mezcla de sangre-solucin salina, agitar los tubos
hasta tener una mezcla de color uniforme.
5. Introducir todos los tubos en un vaso con hielo y agua durante 10 min.
6. Introduciendo una pipeta de 5 ml en cada tubo, soplar en forma lenta y constante hasta
que vire el color, hacer esto al mismo tiempo que se pone a trabajar el cronmetro para
medir el tiempo en que ocurra el cambio de color.
7. Obtener el tiempo promedio de los tubos A y B.
8. Comparar este tiempo promedio, con el tiempo obtenido en el tubo C.
9. Hacer las conclusiones con respecto a la actividad enzimtica del experimento.

CUESTIONARIO:

1. Cual es la funcin de las enzimas?
2. Cuales son las partes del sistema enzimtico?
3. Qu determina el sitio activo de una enzima?
4. Cual es la funcin de las coenzimas?
5. Si la anhidrasa carbnica es una de las enzimas mas activas del organismo, Como debe
de ser su valor de constante de Michaellis (Km)?
PRCTICA 8

INHIBIDORES ENZIMTICOS

Objetivo general. El alumno identificar a los inhibidores enzimticos por su accin y
establecer la importancia de stos en los procesos metablicos.

Objetivo especfico. A travs de reacciones catalizadas por enzimas obtenidas de tejido
animal, se observar el efecto de los inhibidores y determinar de stos cul es competitivo
y cul no competitivo.


INTRODUCCIN

La inhibicin de la actividad enzimtica por molculas especficas es importante porque
constituye el principal mecanismo de control de los sistemas biolgicos.

A todos aquellos agentes que son capaces de interrumpir o retardar la actividad enzimtica
se les llama inhibidores. La inhibicin puede ser:

Reversible. Puede ser de tres tipos: competitiva, no competitiva y acompetitiva.
Irreversible.
Inhibicin competitiva. El inhibidor compite con el sustrato por el sitio activo, cuando se
aumenta la concentracin de sustrato el inhibidor puede ser desplazado ya que la unin
entre enzima e inhibidor es reversible. El inhibidor competitivo presenta cierto parecido
estructural con el sustrato, de modo que se puede unir a la enzima en el sitio activo, un
ejemplo de inhibidor competitivo es el acido malnico, el cual tiene un parecido estructural
con el acido succnico que es el sustrato de la enzima succinato deshidrogenasa.
La succinato deshidrogenasa es una enzima que se encuentra asociada a la membrana
interna de la mitocondria, esta remueve 2 protones y 2 electrones del succinato para dar
origen al fumarato, oxidacin asociada a la coenzima FAD.

Inhibicin irreversible. Este tipo de inhibidores se unen por medio de enlaces covalentes a
los grupos funcionales de la enzima, modificando la estructura de la enzima de tal manera
que el sitio activo queda bloqueado impidiendo la unin del sustrato. Este tipo de inhibicin
es inespecfica, ya que un mismo inhibidor pude afectar a diversos sistemas enzimticos.
La citocromo oxidasa es sensible a la presencia de cianuro, azida y monxido de carbono,
los cuales inhiben irreversiblemente este complejo enzimtico y se interrumpe el transporte
de electrones producindose una cianosis celular.

MATERIAL Y REACTIVOS:

3 Tubos de 13 X 100 mm.
6 Tubos de 16 X 150 mm.
1 Gradilla.
1 Pipeta de 5 mL.
1 Pipeta Pasteur con bulbo.
1 Mortero completo.
2 Balanzas granatarias.
1 Bao mara a 37 C.
1 Centrfuga.
1 Termmetro.
Arena de cuarzo.
Petrolato lquido.
Corazones de pollo.
Solucin de malonato de sodio al 1%.
Solucin de parafenilendiamina al 1 %.
Solucin de fosfato disdico al 0.06 %.
Solucin de azul de metileno al 0.01 %.
Solucin de succinato de sodio al 1.5 %.
Solucin de cianuro de sodio al 0.01 %.

DESARROLLO:

I. OBTENCIN DE ENZIMAS.

a) Pesar aproximadamente 4 gramos de corazn de pollo
b) Moler lo anterior en un mortero con un poco de arena de cuarzo y 24 ml de fosfato
disdico.
c) Dejar reposar la mezcla durante 15 minutos a temperatura ambiente.
d) Centrifugar a 3000 r.p.m., durante 3 minutos.
e) Con la pipeta Pasteur, separar el sobrenadante y colocarlo en un tubo de 13 X 100 mm.

Nota: El lquido obtenido es la fuente de enzimas, contiene a la deshidrogenasa succnica
y a la citocromo oxidasa.

II. EFECTO DE LOS INHIBIDORES.

1. DESHIDROGENASA SUCCNICA.

a) Preparar 3 tubos como se indica en la siguiente tabla:

Tubo Enzima
( E ) ml
Succinato
( S ) ml
Malonato
( I ) ml
Agua
ml
Azul de metileno
(indicador) ml
1 2.0 0.5 1.0 1.0
2 2.0 0.5 1.0 1.0
3 0.5 3.0 1.0

b) Agitar los tubos, observar la coloracin y aadir a cada uno 1 ml de aceite mineral
(petrolato).
c) Incubar los tubos en el bao mara a 37 C durante 15 minutos.
d) Sacar los tubos del bao mara, observar la coloracin e interpretar.
e) Agitar el tubo nmero 1, observar la coloracin e interpretar.

2. CITOCROMO OXIDASA.

PRECAUCIN:
LA SOLUCIN DE CIANURO ES UN VENENO MUY
ACTIVO, SU INGESTIN PUEDE CAUSAR LA MUERTE.

a) Preparar tres tubos como se indica en la siguiente tabla:

Tubo Enzima
(ml)
Cianuro de sodio
(ml)
Agua
(ml)
Parafenilendiamina
(ml)
1 1.0 1.0 1.0
2 1.0 1.0 1.0
3 2.0 1.0

b) Observar la coloracin de los tubos, agitarlos e incubarlos en el bao mara a 37 C
durante 6 minutos.
c) Sacar los tubos del bao mara, observar la coloracin e interpretar sta.

CUESTIONARIO:

1. Qu es un inhibidor enzimtico?

2. Cuntos tipos de inhibicin enzimtica hay y en que consisten?

3. Cul es el papel que desempean los inhibidores enzimticos en nuestro organismo?

4. De los inhibidores empleados en esta prctica, cul es competitivo y cual irreversible?

5. Cul es la funcin del aceite mineral empleado en esta prctica?

6. Cul es la funcin del azul de metileno en la prctica?

BIBLIOGRAFIA.

Mathews Christopher. Bioqumica 3
a
Edicin Editorial Pearson. 2005
McKee Trudy. Bioqumica. La base molecular de la vida.1 Edicin Editorial McGraw-
Hill Interamericana.
Plummer D., Bioqumica prctica. Editorial McGraw Hill. 1981