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Cinetica Enzimatica

OBIETTIVO PRINCIPALE:
costruire unequazione che potesse descrivere
in generale il comportamento cinetico degli
enzimi e quindi di determinare parametri
cinetici pi importanti (K
M
, V
max
, costante di
specificit, costante catalitica) che sono la
carta didentit di ogni enzima, misurando la
VELOCITA della reazione catalitica
Relazione tra Velocit e
concentrazione del substrato
Km
V
max
Relazione tra Velocit e
concentrazione del substrato
Km
V
max
A (S) basse la reazione lineare
Relazione tra Velocit e
concentrazione del substrato
Km
V
max
A (S) alte, SATURAZIONE
dellenzima
Relazione tra Velocit e
concentrazione del substrato
Km
V
max
A (S) alte, SATURAZIONE
dellenzima
La Formazione del complesso
ES la CHIAVE per la
comprensione della Cinetica
E
S E S P
k
1
k
-1
k
2
dove i termini indicati con k rappresentano le costanti specifiche di velocit di
reazione.
ES un intermedio di reazione il cui basso valore di energia di attivazione
permette di fare avvenire una specifica reazione catalizzata
Quando ES in seguito al raggiungimento di uno stato di equilibrio dinamico
assume un valore di concentrazione che si mantiene costante nel tempo, si dice
che stato raggiunto lo stato stazionario (steady state).
E
S E S P
k
1
k
-1
k
2
dove i termini indicati con k rappresentano le costanti specifiche di velocit di
reazione.
ES un intermedio di reazione il cui basso valore di energia di attivazione
permette di fare avvenire una specifica reazione catalizzata
Quando ES in seguito al raggiungimento di uno stato di equilibrio dinamico
assume un valore di concentrazione che si mantiene costante nel tempo, si dice
che stato raggiunto lo stato stazionario (steady state).
STEP 1
E
S E S P
k
1
k
-1
k
2
dove i termini indicati con k rappresentano le costanti specifiche di velocit di
reazione.
ES un intermedio di reazione il cui basso valore di energia di attivazione
permette di fare avvenire una specifica reazione catalizzata
Quando ES in seguito al raggiungimento di uno stato di equilibrio dinamico
assume un valore di concentrazione che si mantiene costante nel tempo, si dice
che stato raggiunto lo stato stazionario (steady state).
STEP 2
Perch importante questa reazione?
E GENERALE
DA DUE GRANDEZZE MISURABILI SI OTTENGONO
INFORMAZIONI
CHE RIGUARDANO LA CINETICA DELLENZIMA
Ragionando su questo modello di reazione ad un
substrato venne elaborata
LEQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN
0
Per ottenere lequazione di M. M. sono state considerate le
seguenti assunzioni teoriche:
VELOCITA INIZIALE (V
0
), VIENE VALUTATA SOLO LA
VELOCITA CATALITICA ALLINIZIO DELLA REAZIONE
Step limitante ES ! E + P
EQUILIBRIO RAPIDO DEL COMPLESSO ENZIMA-SUBSTRATO
e raggiungimento dello STATO STAZIONARIO DEL
COMPLESSO ENZIMA-SUBSTRATO
ASSUNZIONI UTILIZZATE PER COSTRUIRE
LEQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN
0
Michaelis-Menten Kinetics
Km
V
max
VELOCITA INIZIALE
Un problema costituito dalla variazione di (S) nel tempo.
Per questo viene considerata la velocit iniziale.
In condizioni di (S)>>(E), se si misura la velocit iniziale
(V
0
) la variazione di (S) trascurabile.
Inoltre la velocit iniziale viene misurata in in un periodo di
tempo durante il quale la reazione inversa fisicamente
trascurabile in quanto poco il prodotto formatosi:
la velocit iniziale che pu cos essere determinata sar la
massima velocit ottenibile. (c molto substrato e la velocit
contraria alla direzione della reazione bassissima)
In condizioni di velocit iniziale la reazione di fatto
irreversibile (k
-2
=0) e deve essere scritta nel seguente
modo:
Per ottenere lequazione di M. M. sono state considerate le
seguenti assunzioni teoriche:
VELOCITA INIZIALE (V
0
), VIENE VALUTATA SOLO LA
VELOCITA CATALITICA ALLINIZIO DELLA REAZIONE
Step limitante ES ! E + P
EQUILIBRIO RAPIDO DEL COMPLESSO ENZIMA-SUBSTRATO
e raggiungimento dello STATO STAZIONARIO DEL
COMPLESSO ENZIMA-SUBSTRATO
ASSUNZIONI UTILIZZATE PER COSTRUIRE
LEQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN
0
Limiting step, che determina la velocit
della reazione
Quindi la Vmax si raggiunge quando tutto lenzima complessato in ES
e la concentrazione di E libero diventa trascurabile.
V
o
= K
2
(S)
Per ottenere lequazione di M. M. sono state considerate le
seguenti assunzioni teoriche:
VELOCITA INIZIALE (V
0
), VIENE VALUTATA SOLO LA
VELOCITA CATALITICA ALLINIZIO DELLA REAZIONE
Step limitante ES ! E + P
EQUILIBRIO RAPIDO DEL COMPLESSO ENZIMA-SUBSTRATO
e raggiungimento dello STATO STAZIONARIO DEL
COMPLESSO ENZIMA-SUBSTRATO
ASSUNZIONI UTILIZZATE PER COSTRUIRE
LEQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN
0
Il complesso ES si mantiene in uno stato
stazionario durante tutto il periodo di tempo
in cui si possono misurare delle velocit
iniziali:[ES] rimane costante perch la
velocit con cui il complesso ES si forma a
partire da E+S uguale alla somma delle
velocit con cui si scinde a dare E+P ed E+S.
STATO STAZIONARIO
Lapprossimazione dello stato
stazionario
G. E. Briggs and J. B. S.
Haldane (1925)
Allo stato stazionario le
velocit di formazione e
rottura di ES sono uguali
Lipotesi dello stato stazionario vale solo se:
Il sistema di reazione sia un sistema chiuso (reattore batch)
La concentrazione iniziale di substrato sia considerevolmente
superiore alla concentrazione totale di enzima
si considera la veloci iniziale della reazione
Michaelis-Menten Kinetics
Km
V
max
E adatta alle osservazioni sperimentali??
A basse (S) allora Km >> (S) e quindi
(S) Al denominatore trascurabile
A alte (S) allora (S) >> Km e quindi
Km al denominatore trascurabile
Modo pi pratico per descrivere la
cinetica: Grafico degli inversi
K
M
K
cat
K
cat
/K
M
SIGNIFICATO DELLE
COSTANTI CATALITICHE
Michaelis-Menten Kinetics
Km
V
max
La km caratteristica di un
enzima per un certo substrato
Glucosio] plasma: circa 5mM
Glucosio + ATP Glucosio-6-P +ADP
Km glucosio per GK epatica=15mM
Km glucosio per HK cervello=0,01 mM
Spesso la K
m
simile
alle concentrazioni
cellulari fisiologiche
dei substrati (in rosa)
Costante catalitica (k
cat
)
o Numero di turn-over
E rappresentata dalla k della reazione limitante
V
Max
= k
cat
[E
0
]
Massimo numero di molecole di
substrato convertite nella unit di tempo
da una molecola (sito) di enzima
correlata alla velocit di
decomposizione del complesso ES
Nel caso di reazioni complesse con molte tappe
catalitiche, la costante catalitica data dal contributo
di tutte le costanti di velocit nei singoli step. Se una
di queste velocit molto pi lenta delle altre:
k
cat
sar uguale alla K di quello step
Ogni enzima ha valori di k
m
e k
cat
che sono
ottimali per le condizioni bilogiche in cui si trova
ad operare.
Dipendono quindi dal substrato, dalla sua
concentrazione e dalla chimica della reazione
da catalizzare.
Il confronto di k
m
e k
cat
di

enzimi diversi potrebbe
non essere corretto
Rapporto k
cat
/K
m
(costante di specificit)
D una idea della efficienza relativa con cui
vengono trasformati substrati diversi
(specificit)
Tiene conto della velocit di catalisi (k
cat
) e
dellaffinit tra E e S (K
m
)
D una idea della efficienza catalitica
dellenzima (enzimi perfettamente evoluti
hanno costanti cinetiche che si
approssimano alla diffusione)
Acetlicolinesterasi 9 x 10
-5
1.4 x 10
4
1.6 x 10
8
Fumarasi 5 x 10
-6
8 x 10
2
1.6 x 10
8
MOLTI ENZIMI CATALIZZANO
REAZIONI A DUE O PIU
SUBSTRATI
Meccanismo a ping-pong
Meccanismo a ping-pong
GLI ENZIMI POSSONO ESSERE
INIBITI
Inibizione Reversibile
Gli inibitori reversibili
competitivi sono
molto simili al substrato
(eccedono entrambi al sito
attivo dellenzima)
substrato
inibitore
INIBIZIONE
COMPETITIVA
Stessa Vmax
Aumento Km
INIBIZIONE
INCOMPETITIVA
Calo Vmax
Cala Km
(ESI porta a un calo di ES
e quindi altro ES deve formarsi)
INIBIZIONE
MISTA
(sia Km che Vmax sono modificate)
INIBITORI IRREVERSIBILI
La Velocit di reazione
influenzata da numerose variabili:
concentrazione di
substrato
concentrazione di
enzima
Inibitori
Cofattori/coenzimi
attivatori
pH
temperatura
La Velocit di reazione
influenzata da numerose variabili:
concentrazione di
substrato
concentrazione di
enzima
Inibitori
Cofattori/coenzimi
attivatori
pH
temperatura
Effetti del pH sullattivit
enzimatica
Lattivit di molti enzimi varia con il pH nello stesso
modo in cui semplici acidi e basi si ionizzano.
nel sito catalitico vi sono spesso
residui acidi e basici
Variazioni di pH modificano le
interazioni intra- ed inter-catena
Tutti gli amminoacidi liberi possiedono almeno due pK perch possiedono
almeno il gruppo carbossilico (ACIDO) e il gruppo amminico (BASICO). Per
esempio lalanina che ha una catena laterale alifatica possiede solo questi
due gruppi ionizzabili:
pK il pH in cui la forma protonata e
la deprotonata dellamminoacido si
trovano alla stessa concentrazione:
Henderson- Hasselbach:
Per acido:
AH A
-
+ H
+
pH = pK
a
+ log A- / AH
Per base:
BH
+
B + H
+
pH = pK
b
+ log B/ BH
+
D
i
m
i
n
u
i
s
c
e

c
o
n
c
e
n
t
r
a
z
i
o
n
e

H
+
Enzima proteolitico digestivo che agisce nello
stomaco ad un pH tra 1 e 2
La Velocit di reazione
influenzata da numerose variabili:
concentrazione di
substrato
concentrazione di
enzima
Inibitori
Cofattori/coenzimi
attivatori
pH
temperatura
Sperimentalmente, in vitro, si rilevato che la
velocit di gran parte delle reazioni enzimatiche
in media raddoppia per ogni aumento di 10 C
di temperatura:
Temperatura ottimale:
varia da un enzima all'altro;
dipende dal particolare sistema cellulare;
Laumento della temperatura porta ad un aumento dellenergia cinetica del sistema
ed ha un effetto importante sulla velocit di reazione
Quando le molecole collidono lenergia cinetica pu essere convertita in energia chimica potenziale. Se questa
forma di energia diventa grande abbastanza, pu venire raggiunta la soglia dellenergia di attivazione di una
reazione. Se tale reazione esoergonica, pu avvenire la trasformazione dei reagenti in prodotti.
Cos se la temperatura di un sistema aumenta, pi molecole per unit di tempo possono raggiungere lenergia di
attivazione, e la velocit di una reazione pu aumentare.
Per convertire il substrato in prodotti, gli enzimi devono collidere e legare il substrato nel sito attivo. Aumentando
la T aumenter questo numero di collisioni.
Laumento della temperatura del sistema pu anche rompere i legami deboli dellenzima e denaturare cos la
sua struttura tridimensionale. QUINDI:
Il calore fino ad una certo punto aumenta lattivit enzimatica, poi, superata una certa
soglia, pu indurre la denaturazione dellenzima e quindi la sua completa inattivazione.
Enzimi
Andamento dell'attivit enzimatica in funzione della temperatura.
(tratto AB), crescente, corrisponde
all'aumento dell'attivit dell'enzima
fino a un massimo per effetto di
una contemporanea diminuzione
dell'energia di attivazione della
reazione
(tratto BC), decrescente fino a un valore asintotico
della temperatura, l'effetto combinato
dell'aumento di attivit enzimatica proporzionale
all'aumento di temperatura e della diminuzione
brusca di tale attivit per sottrazione di enzima
denaturato
(tratto CD) asintotica
a un valore limite di
temperatura,
corrisponde alla
totale e irreversibile
inattivazione
dell'enzima per
denaturazione.
EFFETTO DELL TEMPERATURA
SULLATTIVITA ENZIMATICA
Gambero da ALASKA
Chimotripsina da maiale
Enzima di batterio che vive
in acque calde
La Velocit di reazione
influenzata da numerose variabili:
concentrazione di
substrato
concentrazione di
enzima
Inibitori
Cofattori/coenzimi
attivatori
pH
temperatura
Struttura generale degli enzimi
Struttura generale degli enzimi
APOENZIMA
(Parte proteica)
OLOENZIMA
coenzima (vitamina)
ione metallico
gruppo prostetico
(legato covalentemente)
MECCANISMI DI AZIONE