Citometra de flujo

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Citometra de flujo
Anlisis de una muestra de agua marina conteniendo picoplancton fotosinttico por
medio de citometra de flujo mostrando tres poblaciones diferentes
(Prochlorococcus, Synechococcus, y picoeucariotas)
La citometra de flujo es una tecnologa
biofsica basada en la utilizacin de luz
lser, empleada en el recuento y
clasificacin de clulas segn sus
caractersticas morfolgicas, presencia de
biomarcadores, y en la ingeniera de
protenas. En los citmetros de flujo, las
clulas suspendidas en un fluido atraviesan
un finsimo tubo transparente sobre el que
incide un delgado rayo de luz lser, la luz
transmitida y dispersada por el pasaje de las
clulas a travs del tubo se recoge por medio
de unos dispositivos de deteccin,
permitiendo hacer inferencias en cuanto a
tamao y complejidad de las clulas.
Tambin permite el anlisis
multiparamtrico simultneo de otras
caractersticas fsicas y qumicas, evaluando en promedio ms de dos mil partculas por segundo.
La citometra de flujo es una tcnica utilizada en forma rutinaria en muchos centros de salud para el diagnstico y
seguimiento de muchas enfermedades tales como las leucemias, granulomatosis crnica, y SIDA; sin embargo tiene
muchsimas otras aplicaciones en investigacin bsica, prctica y ensayos clnicos. Una variante comn de esta
tcnica es la separacin fsica de partculas segn sus propiedades, emplendose por ejemplo para purificar
poblaciones de inters.
Historia
El primer citmetro de flujo basado en la medicin de impedancia, es decir utilizando el principio Coulter, fue
descrito en la patente de Estados Unidos N 2.656.508, expedida en 1953 a nombre de Wallace H. Coulter. Mack
Fulwyler fue el inventor del precursor de los citmetros de flujo actuales, en particular del tipo separador de clulas.
El primer dispositivo de citometra de flujo basado en fluorescencia (ICP 11) fue desarrollado en 1968 por Wolfgang
Ghde de la Universidad de Mnster, y declarado en la patente de Alemania N 1815352 el 18 de diciembre de 1968.
Y comercializado por primera vez en los aos 1968 y 1969 por la empresa alemana Partec encargada del desarrollo
y produccin a travs de Phywe AG en Gttingen. En aquel tiempo los mtodos de absorcin electromagntica
tenan el favor de la comunidad cientfica por sobre los mtodos fluorescentes. Poco tiempo despus comenz el
desarrollo comercial de los citmetros de flujo, incluyendo el citofluorgrafo (1971) de la empresa Bio/Physics
Systems Inc. (ms tarde Ortho Diagnostics), el PAS 8000 (1973) de la empresa Partec, y el primer dispositivo FACS
de Becton Dickinson (1974), el ICP 22 (1975) de Partec/Phywe y el Epics de la Coulter Corporation en 1977/78.
Origen del nombre de la tcnica
El nombre original de la citometra de flujo era "citofotometra de pulso" (en Alemn: Impulszytophotometrie), que
fue el nombre publicado en la primera patente de aplicacin prctica de la citometra de flujo fluorescente. Recin en
la 5ta Conferencia sobre Citometra Automatizada de la American Engineering Foundation realizada en Pensacola,
Florida en 1976 -ocho aos despus de la presentacin del primer citmetro de flujo fluorescente (1968)- se acord
utilizar el nombre de citometra de flujo, un trmino que rpidamente gan popularidad.
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Principio
Esquema de disposicin de elementos en un citmetro de flujo. Una fuente emisora
de luz monocromtica, usualmente un haz de luz lser (A) enva un rayo que es
colimado (L1) y enfocado (L2) por medio de lentes sobre la cmara de flujo
laminar (C), luego de atravesar la cmara el rayo de luz directa es detenido por una
pantalla (s), mientras que la luz dispersada es enfocada por otra lente (L3) sobre un
fotodiodo (D1), esto constituye el detector de dispersin frontal (FSC). La luz
dispersada lateralmente y la fluorescencia se enfocan por medio de una lente sobre
un espejo dicroico (M) que refleja la mayor parte de la luz de igual longitud de
onda a la producida por la fuente (A), atraviesa un filtro (F1) e incide sobre un
detector. Esto constituye el sistema de deteccin de dispersin lateral (SSC).La luz
que no es reflejada por el espejo dicroico, ya que tiene una longitud de onda
diferente a la emitida, lo atraviesa e incide sobre un filtro interferencial (F2) que
puede ser ajustado para una determinada longitud de onda, discriminando as entre
diferentes fluorforos, para finalmente incidir sobre un tubo fotomultiplicador
(D3), esto constituye el detector lateral de fluorescencia (SFL).
Un rayo de luz monocromtico, usualmente
de luz lser, es dirigido hacia un finsimo
chorro de lquido hidrodinmicamente
enfocado. Y se coloca una serie de
detectores en el punto en el que el chorro de
lquido atraviesa el rayo de luz. Uno se
coloca en lnea con el rayo de luz (a este
detector se lo conoce como FSC, por
Forward Scatter o detector de Dispersin
Frontal), y varios angularmente a la
trayectoria del rayo (a estos se los conoce
como SSC, por Side Scatter, o detectores de
Dispersin Lateral); adems de uno o ms
detectores de fluorescencia. Cada una de las
partculas suspendidas con un tamao de
entre 0,2 a 150 micrmetros que atraviesan
el rayo de luz lo dispersan, y las sustancias
qumicas fluorescentes que se encuentran
dentro o adheridas a la partculas son
excitadas hasta emitir luz a una longitud de
onda mayor que la de la fuente de luz. Esta
combinacin de de luz dispersada y
fluorescencia es recogida por los detectores,
y por medio de un anlisis en la fluctuacin
de la intensidad luminosa recogida por cada
detector, es posible derivar varios tipos de informacin acerca de la estructura fsica y qumica de cada partcula
individual.
El detector frontal o FSC brinda informacin acerca del volumen de la partcula, mientras que los detectores laterales
o SSC brindan informacin acerca de la complejidad interna de la misma (por ejemplo la forma del ncleo celular, la
cantidad y tipo de grnulos citoplasmticos o la rugosidad de la membrana plasmtica). Esto es debido a que los
componentes internos de las clulas dispersan la luz. Algunos de los citmetros de flujo presentes en el mercado han
eliminado la necesidad de un detector de fluorescencia y utilizan tan slo la informacin de luz dispersada para las
mediciones. Otros citmetros de flujo son capaces de generar grficos de los datos obtenidos de la fluorescencia de
las clulas, luz dispersada y luz transmitida.
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Aspecto del frente de un citmetro de flujo - en
este caso se trata del Fluorescence activated cell
sorter (FACSCalibur) de Becton-Dickinson
Citmetros de flujo
Los citmetros de flujo modernos son capaces de analizar varios miles
de partculas por segundo, en tiempo real, y pueden separar y aislar
activamente partculas de acuerdo a propiedades especficas. Un
citmetro de flujo es en cierta forma similar a un microscopio, salvo
que, en vez de producir imgenes de las clulas, los citmetros de flujo
ofrecen una cuantificacin automtica de una serie de parmetros con
altsima calidad. Para analizar tejidos slidos es posible preparar en
primera instancia una suspensin de clulas.
Un citmetro de flujo tiene cinco componentes principales:
La celda de flujo laminar, donde el lquido circulando en rgimen de
flujo laminar acarrea y pone en lnea a las clulas de modo que pasen a travs del rayo de luz de a una y en fila.
Un sistema de medicin, los ms comnmente utilizados son la medicin de la impedancia o conductividad
(principio Coulter) y los sistemas pticos.
Un sistema de iluminacin formado ya sea por lmparas de alta luminosidad (de mercurio, xenn) lseres de alta
potencia refrigerados por agua (de argn, de criptn, de tinturas), lseres de baja potencia refrigerados por aire (de
argn 488 nm), lser rojo de helio-nen ( 633 nm), verde de helio-nen, ultravioleta de helio-cadmio; lseres
de diodo de baja potencia (azul, verde, rojo, violeta).
Un detector y un conversor de seales ADC (anlogo a digital), los cuales registran la seal producida (sea FSC,
SSC, SFL) y la convierten en una seal elctrica que puede ser procesada por un computador.
Un sistema de amplificacin, lineal o logartmico.
Un ordenador para el anlisis de las seales.
El proceso de recoleccin de datos a partir de las muestras utilizando un citmetro de flujo es conocido como
adquisicin. La adquisicin es mediada por un software presente en un ordenador fsicamente conectado al citmetro
de flujo. Este software es capaz de ajustar varios parmetros de la medicin, tales como voltaje, compensacin, etc.
para cada una de las muestras analizadas, y adems se encarga de asistir a la presentacin inicial de la informacin
de la muestra mientras se realiza la adquisicin de los datos para asegurar que los parmetros han sido correctamente
ajustados. Los primeros citmetros de flujo eran en su mayora, dispositivos experimentales, sin embargo los
avances tcnicos desde su origen han permitido que ahora tengan una gran cantidad de aplicaciones tanto clnicas
como de investigacin. Debido a estos desarrollos, se ha producido un considerable mercado de instrumentos,
software de anlisis, y reactivos utilizados tanto en la adquisicin como en el marcado fluorescente con anticuerpos.
Los instrumentos modernos en general poseen mltiples lseres y detectores. El rcord actual para un instrumento
comercial es de cuatro lseres y 18 detectores de fluorescencia. Al aumentar el nmero de lseres y detectores, es
posible aumentar la cantidad de anticuerpos fluorescentes utilizados para el marcado, y se hace posible identificar
con mayor precisin la poblacin de inters a travs de sus marcadores fenotpicos. Algunos instrumentos pueden
incluso tomar fotografas digitales de cada clula, permitiendo analizar si la seal fluorescente se produce dentro o
en la superficie de la clula.
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Anlisis de datos
Gating
Scatterplot de fluorescencia versus dispersin
lateral, de una muestra de sangre entera, el
programa ha separado automticamente las
poblaciones basndose en un algoritmo de
proximidad a centroides. En color cian se observa
la poblacin de neutrfilos + basfilos, en
magenta la de linfocitos, en verde monocitos, en
rojo la de eosinfilos y por debajo las plaquetas y
eritrocitos fantasma
Los datos generados por los citmetros de flujo pueden ser dibujados
en relacin a una variable, en forma de histograma, o en grficos de
puntos (dot-plot) de dos dimensiones y dos o ms variables, o incluso
en grficos tridimensionales. Las regiones delimitadas en estos grficos
pueden ser separadas secuencialmente, de acuerdo con la intensidad de
la fluorescencia, para crear una serie de subgrupos llamados "gates"
(portales). Existen protocolos especficos para hacer la separacin en
gates, proceso conocido como gating, tanto para propsitos clnicos
como diagnsticos, especialmente en relacin con la hematologa.
Los grficos de citometra con frecuencia se hacen en funcin de
escalas logartmicas. Ya que los diferentes compuestos fluorescentes
utilizados para hacer el marcado poseen espectros de emisin que con
frecuencia se solapan, las seales recogidas por los detectores deben
ser compensadas tanto electrnica como computacionalmente. Los
datos acumulados por los citmetros pueden ser analizados utilizando
diferentes softwares, tales como por ejemplo WinMDI (el nico que es
freeware), Flowjo, FCS Express, VenturiOne, CellQuest Pro, o
Cytospec. Una vez que se han recogido los datos, no se hace necesario
que la computadora siga conectada al citmetro, razn por la cual la
mayor parte de las veces el anlisis de datos se hace en otro ordenador.
Esto se hace especialmente necesario en instalaciones centrales donde la utilizacin de estas mquinas se encuentra
bajo alta demanda.
Anlisis computacional
Los progresos recientes en la identificacin atomtica de poblaciones utilizando mtodos computacionales ha
ofrecido una alternativa a las estrategias tradicionales del gating. Los sistemas automatizados de identificacin
podran, potencialmente, ayudar a encontrar poblaciones extremadamente pequeas, raras, y ocultas. Los mtodos
automatizados ms representativos incluyen al FLOCK en Immunology Database and Analysis Portal (ImmPort),
FLAME GenePattern y flowClust, en Bioconductor. Los esfuerzos colaborativos han desembocado en un proyecto
abierto llamado FlowCap (Flow Cytometry: Critical Assessment of Population Identification Methods,) de manera
de proveer una va alternativa para comparar y evaluar los datos obtenidos por los mtodos de agrupamiento en
citometra de flujo, adems de servir para establecer una gua para el uso y aplicacin ms apropiados para estos
mtodos.
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clasificacin de clulas activadas por fluorescencia
La tcnica de clasificacin de clulas
activadas por fluorescencia FACS por
sus siglas en ingls
(Fluorescence-Activated Cell Sorting)
es un tipo especializado de citometra
de flujo. Esta tcnica provee un
mtodo para la clasificacin y
seleccin de clulas provenientes de
una mezcla de varias poblaciones en
dos o ms contenedores de a una clula
por vez, segn las caractersticas
particulares de dispersin y
fluorescencia de cada clula. Es un
instrumento cientfico de gran utilidad
ya que provee un mtodo de grabacin
de datos provenientes de las seales de
fluorescencia de cada clula que es a la
vez rpido, objetivo y cuantitativo; adems permite la separacin fsica de aquellas clulas pertenecientes a una
poblacin de inters. El acrnimo FACS es una marca registrada perteneciente a Becton, Dickinson and Company.
Entre la gran mayora de los investigadores que utilizan esta tecnologa ya sea para la clasificacin o el anlisis, este
trmino ha pasado a ser genrico en el uso comn, al igual que xerox o kleenex. El clasificador de clulas fue
inventado por Mack Fulwyler en 1965, utilizando originalmente el principio Coulter como mtodo de recoleccin de
datos, una tcnica relativamente difcil y que ya casi no se utiliza en los instrumentos modernos. La tcnica fue
ampliada luego por Len Herzenberg, quien fue el responsable de acuar el trmino FACS. Herzenberg gan el
Premio Kyoto en 2006 por su trabajo pionero en citometra de flujo.
La suspensin de clulas es arrastrada hacia el centro de una corriente de lquido estrecha, que fluye rpidamente. El
flujo est dispuesto de manera que existe una gran separacin entre clulas en relacin con su dimetro. Un
mecanismo de vibracin ultrasnico provoca que la corriente de lquido conteniendo las clulas se rompa en
pequeas gotitas. El sistema se ajusta de modo que haya una baja probabilidad de que ms de una clula quede
contenida en cada gota. Justo antes de que la corriente se rompa en gotitas, el flujo pasa a travs de una estacin de
medicin de fluorescencia, donde se mide el carcter fluorescente de inters de cada clula. Un anillo capaz de
adquirir una carga elctrica se coloca justo en el punto donde la corriente se rompe en gotitas. Segn la medicin de
la intensidad de fluorescencia recogida para cada clula, el sistema entrega una determinada carga elctrica al anillo,
como consecuencia las gotitas se cargan elctricamente con un signo contrario al del anillo mientras se desprenden
de la corriente de lquido. Las gotitas cargadas luego caen a travs de un sistema de deflexin electrosttica que
desva las gotas en los contenedores dependiendo de su carga. En algunos sistemas, la carga se aplica directamente a
la corriente de lquido, y como resultado la gotita que se desprende retiene carga del mismo signo que la aplicada.
Luego de que la gotita se desprende, el anillo recupera una carga neutra.
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Marcadores
Marcadores fluorescentes
Se pueden utilizar un amplio rango de fluorforos como etiquetas para el marcado fluorescente en citometra de
flujo. Los fluorforos se encuentran por lo general qumicamente unidos a anticuerpos especficos capaces de
reconocer una determinada molcula diana en la superficie o en el interior de la clula. Estas etiquetas fluorescentes
tambin pueden adosarse qumicamente a casi cualquier compuesto qumico que presente una cierta afinidad por la
membrana o alguna otra estructura celular. Cada fluorforo posee un pico de excitacin caracterstico, y un longitud
de onda de emisin tambin caracterstica. Sin embargo los espectros de emisin de diferentes etiquetas con
frecuencia se superponen, por consiguiente, la combinacin de marcadores que pueden ser usados depende de la
longitud de onda de la lmpara(s) o del lser(es) usados para excitar los fluorocromos y en los tipos de detectores
que se encuentren disponibles. El nmero mximo de marcadores fluorescentes distinguibles se cree que se
encuentra entre 17 o 18, y este nivel de complejidad requiere un laborioso proceso de optimizacinpara limitar los
artefactos, as como complejos algoritmos de deconvolucin para separar los espectros solapados.
Marcadores fluorescentes de unin covalente: Isoticianato de fluorescena, picoeritrina, rodamina, rojo texas,
cianinas.
[1]
Marcadores fluorescentes de unin no covalente: Hoechst, DAPI, Naranja de acridina, yoduro de propidio, rh12.
Los marcadores fluorescentes son sensibles al medio ambiente.
Puntos cunticos
A veces se utilizan puntos cunticos en lugar de los tradicionales fluorforos debido a que poseen un pico de emisin
mucho ms estrecho.
Marcado isotpico
Uno de los enfoques utilizados para soslayar el lmite de marcas fluorescentes utilizables, es utilizar en su lugar
istopos de lantnidos adosados a los anticuerpos. Este mtodo podra en teora, permitir el uso de entre 40 y 60
marcadores perfectamente distinguibles, y ha sido demostrado hasta para 30 etiquetas distintas. Las clulas son
ionizadas por medio de un chorro de plasma permitiendo de esta manera identificar los istopos asociados por medio
de espectrometra de masas de tiempo de vuelo. Aunque este mtodo permite el uso de un mayor nmero de
etiquetas, de hecho posee un menor rendimiento que la citometra de flujo tradicional. Y adems destruye las clulas
analizadas, impidiendo de esta forma su recuperacin para un proceso de seleccin.
Parmetros usualmente medidos
Esta lista es realmente larga y se encuentra en continua expansin, por citar slo algunos ejemplos:
Se utiliza para confirmar el diagnstico de leucemia linftica crnica
Volumen y complejidad morfolgica de clulas
Pigmentos biolgicos tales como la clorofila o ficoreritrina
Contenido total de ADN (anlisis del ciclo celular, cintica celular, proliferacin celular, ploida, aneuploida,
endoreduplicacin, etc.)
Contenido total de ARN
Variacin en el nmero de copias de ADN (por medio de la tecnologa Flow-FISH o BACs-on-Beads)
Anlisis cromosmico y separacin (construccin de libreras, tincin de cromosomas, etc)
Expresin y localizacin de protenas
Modificaciones proteicas, fosfoprotenas
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Presencia de productos transgenicos in vivo, particularmente demostracin de la presencia de la Protena verde
fluorescente o protenas fluorescentes relacionadas
Antgenos celulares de superficie (Marcadores de diferenciacin en clsteres - marcadores CD))
Varios antgenos intracelulares tales como citoquinas, mediadores secundarios, etc.)
Antgenos nucleares
Actividad enzimtica
pH, calcio inico intracelular, magnesio, potencial de membrana
fluidez de membrana
apoptosis (cuantificacin segn el grado de degradacin del ADN, potencial de membrana mitocondrial, cambios
en la permeabilidad, caspasas, etc
Viabilidad celular
Monitoreo de la electropermeabilizacin de clulas
Estallido respiratorio
Caracterizacin de la resistencia multidroga de clulas cancerosas
Glutatin
Varias combinaciones de ADN/antgenos de superficie
Adherencia celular (por ejemplo adherencia entre clulas hospedadoras y patgenas)
Aplicaciones
La tecnologa de la citometra de flujo tiene aplicaciones en numerosos campos, incluyendo la biologa molecular,
inmunologa, biologa vegetal y marina. Tiene una amplia aplicacin en medicina, (especialmente en trasplantes,
hematologa, inmunologa tumoral, y quimioterapia, diagnstico prenatal, gentica y seleccin de esperma para una
preseleccin de sexo). En biologa marina se ha explotado las propiedades autofluorescentes del plancton
fotosinttico para caracterizar abundancia y estructura comunitaria. En ingeniera de protenas, se utiliza la citometra
de flujo en conjuncin con tcnicas de expresin en levaduras y expresin en bacterias, para identificar aquellas
protenas expresadas en la superficie celular que posean las caractersticas deseadas.
Bibliografa
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Fuentes y contribuyentes del artculo
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Contribuyentes: User:J3D3
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Commons Attribution-Sharealike 3.0 Contribuyentes: User:SariSabban
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//creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/