EXPERIMENTO #1: Medicin de la absorbancia

Una solucin produce Absorbancia (luz absorbida) y Transmitancia (luz que

transmite). El espectrofotmetro es un instrumento que mide la Absorbancia
(medida indirecta de la concentracin de una sustancia; por la Ley de Beer-
Lambert ambos son directamente proporcionales).

Spectronic 20

Componentes de un espectrofotmetro:
1- Fuente de luz: ilumina la muestra.
2- Monocromador: permite que salga el haz de luz deseado segn la longitud
de onda.
3- Celda: compartimiento de la muestra. Puede estar hecha de cuarzo por lo
que no se deben lavar con escobillas, ni rayar con el fin de garantizar el
paso eficiente de la luz.
4- Detector: detecta la radiacin, puede responder a fotones o a calor.


Dependiendo de la solucin, la fuente de luz puede ser:
- Ultravioleta si se trata de soluciones NO coloreadas.
- Visible (intervalo 390-780 nm) si se trata de soluciones coloreadas.

Regin visible
400 nm AZUL 500 nm VERDE 600 nm AMARILLO 700 nm ROJO

Si una solucin es azul, al colocarla en el espectrofotmetro a 600 nm (amarillo) su
absorbancia ser significativamente mayor que a 400 o 500 nm. Lo mismo ocurre
con una solucin amarilla, su absorbancia ser mayor a su complementario
(azul), o sea, en 400 nm.

(nm)
Absorbancia
Azul
(soln. CoSO4)
Amarillo
(soln. K2CrO4)
Rojo
(soln. NiSO4)
420 0,02 2,00 0,02
500 0,02 0,11 0,05
590 0,11 0,02 0,03

Pregunta: Qu relacin debe haber entre el color de la luz y el color de la
solucin para que haya una absorcin mxima?
Respuesta: Ambos colores deben ser complementarios.
Laboratorio n2
Tcnica para la extraccin de sangre en el humano
ANLISIS DE SANGRE
La determinacin cuantitativa de los constituyentes sanguneos representa uno de los datos ms valiosos
con que cuenta el mdico para realizar diagnsticos, conocer la evolucin de los cuadros patolgicos y
controlar drogas utilizadas en teraputica.
Los mtodos analticos ms utilizados son de tres tipos principalmente:
Fotomtricos
Volumtricos
Gasomtricos
Las determinaciones en sangre pueden realizarse utilizando sangre total, plasma o suero. Deben seguirse
una serie de procedimientos de acuerdo a la sustancia a determinar:
1. Extraccin de la sangre
2. Preparacin
3. Uso de anticoagulantes
4. Desproteinizacin

1. EXTRACCIN: la mayor parte de los estudio se realizan en sangre venosa o en sangre capilar;
muy raras veces se emplea sangre arterial para los anlisis ordinarios de laboratorio.

A. OBTENCIN DE SANGRE CAPILAR
Se utiliza para realizar microanlisis
Se acerca en su composicin a la sangre arterial.
Se puede obtener de la parte lateral de la yema de los dedos y en el lbulo de la oreja (nios y
adultos) y en la parte lateral del taln (nios)

B. OBTENCIN DE SANGRE VENOSA
La sangre se obtiene en general de las venas de la flexura del codo, preferentemente de la mediana del
codo, ceflica y baslica. Cuando se tiene poca experiencia es mejor no elegir la baslica ni la ceflica,
porque estn muy prximas a inervaciones.
Concluyendo, si no se ve o no se palpa ninguna vena, la preferente para la extraccin, es la vena mediana
del codo.
Factores que impiden una extraccin exitosa
Hemos traspasado la vena
No estamos en la vena
El bisel est obstruido por la piel
Estamos en la vlvula de la vena

Razones por las cuales obtenemos poca sangre
Se forma un vaco en la jeringuilla por halar el mbolo antes de tiempo o se sale el bisel.
Luego de una extraccin, es comn que el paciente tenga un edema en el rea donde se realiz la misma;
un edema es la acumulacin de lquido en el espacio intersticial.
En caso tal de que no se pueda efectuar una puncin en el brazo para extraer sangre, se recurre a punzar
la vena femoral; esta puncin solamente es realizada por un mdico. Para esta extraccin es preciso
localizar la arteria femoral en el tringulo femoral. Posteriormente se le solicita al paciente que coloque
uno de sus malolos externos sobre la rodilla y as se aflora mejor esta zona. Finalmente se introduce el
bisel con un ngulo de 90.
Cmo saber si nos hallamos en una arteria o en una vena?
Presin: las arterias son vasos de presin, mientras que las venas son vasos de capacitancia.
Color de la sangre: en las arterias la sangre es brillante pero este no es un criterio muy
confiable.
La vena yugular externa es otro sitio para extraer sangre, principalmente en nios. A estos se les recuesta
en el borde de una mesa y su reaccin ser llorar por lo que se sopla ms la vena y la sangre se acumula
en la cabeza.
C. OBTENCIN DE SANGRE ARTERIAL
Se emplea para realizar estudios de gasometra (pCO2, pO2), conocer el porcentaje de saturacin
de Hemoglobina, conocer las concentraciones de los iones, pH de la sangre, conocer la
oxigenacin. En la sangre arterial la oxigenacin es de aproximadamente 95%. En la sangre
venosa es de aproximadamente 70%.
Sitios para extraer sangre arterial: arteria radial (se puede localizar en la tabaquera anatmica,
en el dorso de la mano), arteria braquial y arteria femoral. De estas la preferente es la arteria
radial. Luego de la extraccin se debe ejercer presin sobre la arteria hasta que la sangre se
coagule.

2. PREPARACIN
A. Para obtener suero: se vierte la sangre extrada en un tubo de ensayo sin anticoagulante y se
deja coagular a temperatura ambiente. Luego se separa el cogulo de las paredes del tubo, se
centrifuga inmediatamente y se separa el suero que queda sobrenadante.
B. Para obtener plasma: la muestra obtenida debe tratarse con anticoagulante y se mezcla
haciendo girar el tubo suavemente. Luego de esto la muestra se centrifuga.







3. ANTICOAGULANTE: Es de gran importancia utilizar la cantidad apropiada de anticoagulante; un
exceso podra dar lugar a la hemlisis de los eritrocitos, dificultar algunas determinaciones o
alterar la distribucin de agua y ciertos electrolitos entre las clulas y el plasma.
En la electroforesis se utiliza el suero, debido a que este no posee las
protenas de la coagulacin de la sangre (fibringeno, que lleva a fibrina). En
un electroforetograma el fibringeno puede aparecer como una banda
adicional y podra pensarse que se trata de una patologa.
Los anticoagulantes ms utilizados son la heparina y el EDTA (cido etilendiaminotetracetico).
Heparina: Contiene sales de sodio y potasio que se deben evitar si en la muestra se van a realizar
anlisis de dichos iones. Suele utilizarse 0,2 mg por mL de sangre. Suele utilizarse como
tratamiento para pacientes con trombosis debido a que previene la formacin de cogulos de
sangre, evitando que la protrombina se convierta en trombina y por lo tanto se bloquee el paso
fibringeno a fibrina.
cido etilendiaminotetracetico (EDTA): Es un agente quelante y preservativo de los componentes
celulares sanguneos. Es efectivo en concentraciones de 1- 2 mg/mL de sangre.



Uso del EDTA:
o Determinacin de elementos formes de la sangre, por ser un agente quelante del calcio
(recordar que el Ca
2+
cuarto factor de la cascada de la coagulacin), formando un enlace
coordinado con el mismo para impedir que se complete la formacin del cogulo.
o Hematcrito
o Hemograma o biometra hemtica
Otros anticoagulantes utilizados son:
Oxalacetato de sodio
Oxalato de potasio
Fluoruro de sodio: es un anticoagulante conservativo. El flor inhibe las enzimas de la
gluclisis, lo que permite determinar bien los niveles de glucosa y de esta manera esta no
se metabolice y por lo tanto se preserve.
Citrato de sodio: para realizar estudios de la coagulacin.
Factores que pueden producir hemlisis
Demorar mucho para extraer la sangre
Dejar puesto el torniquete por ms de 2 minutos
Si se dobla la aguja y se contina con la extraccin
Un indicativo de que hay hemlisis es la coloracin rojiza /anaranjado rojiza del sobrenadante
(normalmente es amarillo).
Se altera la concentracin de potasio, un catin que se encuentra en todas las clulas y que mantiene el
potencial de reposo de las clulas, el potencial de umbral y el potencial de accin. Una concentracin
elevada de este catin puede ser indicativo de problemas cardiacos.**
** No estoy muy segura de por qu menciono eso.
Hematoma: cmulo de sangre en el tejido celular subcutneo


Un quelante, o antagonista de metales pesados, es una sustancia que
forma complejos con iones de metales pesados.


Precipitan el calcio


Laboratorio # 3
Electroforesis en protenas

La ELECTROFORESIS es la separacin de las molculas bioqumicas en suero o plasma de
acuerdo a su carga neta en el medio amortiguado utilizando un campo elctrico.

Las molculas pequeas que difunden con rapidez requieren de una gradiente ALTO
voltaje (20 V/cm) con el objeto de que la velocidad de la electroforesis sea mayor que
la velocidad de difusin del soporte.

Las protenas no difunden tan rpido como los aminocidos y se pueden separar en
gradientes de voltaje menores. As, si una solucin de una mezcla proteica (diferentes
puntos isoelctricos) se colocan entre dos electrodos: nodo (+) y ctodo (-), las
protenas se cargan negativamente debido al amortiguador (Tris-barbital, pH= 8.8)
y migran hacia el nodo a una velocidad que depende de:
su carga neta
medio de soporte usado
peso molecular
tamao de la protena







MATERIALES

Cmara electrofortica: lleva a cabo la electroforesis. Consta de dos electrodos
que se enchufan a una fuente de poder.
Fuente de poder: se le enchufan los 2 electrodos. Proporciona el voltaje (250V
300V) o el amperaje para llevar a cabo la separacin o corrida electrofortica.
Soporte slido: en l se siembran las muestras. Utilizaremos el acetato de
celulosa como soporte slido.

*** El amortiguador debe estar ATEMPERADO para evitar el aumento de temperatura
provoque la desnaturalizacin de las protenas de la muestra en el tiempo de corrida.

** La corrida demora 40 minutos.

DESPUS DE LA CORRIDA

Una vez realizada la separacin electrofortica, se hace un relevado que consiste en
TEIR el soporte slido con un colorante: ROJO PONCEAU S que se une a las protenas,
lo que permite la deteccin de las bandas correspondientes a las protenas sricas
***Cuando el componente slido (acetato de celulosa) es teido cambia de nombre a
ELECTROFORETOGRAMA.



PLASMA: con protenas de la coagulacin
*CON fibringeno
SUERO: plasma sin las protenas de coagulacin
*SIN fibringeno
Las protenas son molculas anfteras: su carga neta depende del pH del medio, en este caso del
amortiguador alcalino dndole una carga NEGATIVA a las protenas
Se detectan 5 fracciones:
La albmina es la fraccin ms intensa del electroforetograma
Globulinas gamma, beta, alfa1, alfa 2


Desintmetro: convierte el electroforetograma en CURVAS es decir, en un
proteinograma que se define como la grfica de separacin electrofortica de las
proteinas del plasma o del suero.























Gamma Beta Alfa2 Alfa1 Albmina























** htp://www.uv.es/jcastell/Proteinas_plasmaticas.pdf

Cuestionario:
1. Cules son las principales protenas plasmticas?

Requisitos para ser considerada una protena plasmtica
Ser secretada activamente en la sangre
ejercer una funcin en el sistema vascular
Presentar mayor concentracin en plasma que otros tejidos
No derivar de lesiones.

Albmina
Globulinas (alfa, beta, gamma)

2. Si se usa suero en lugar de plasma, cul ser la diferencia en el
electroforetograma?

El plasma conserva el fibringeno, protena de la coagulacin. Al ser una
protena queda separada en la electroforesis y correr en
2,
esto quiere decir
que en una muestra de plasma la fraccin de
2
es ms intensa por la presencia
de fibringeno. En el suero el fibringeno es parte del cogulo, por lo tanto la
fraccin de
2
es tenue y prcticamente ni se ve.

3. Considerando que los pI de las protenas son:
Albmina (4,7) Alfa1 Glob (2,7) Alfa2 Glob (4,4) Beta Glob (2,7) Glob /6,2 7,3)
de fracciones de protenas sricas.
Explique por qu se utiliza el amortiguador Tris-Barbital pH 8,8 para realizar la
separacin

Es importante saber que las protenas son ANFOTERAS, es decir que cambian su
pH conforme al pH del medio. Utilizamos un amortiguador de pH alcalino para
cargar negativamente las protenas y darle una direccionalidad a la corrida,
de manera que esta se realice desde el ctodo (polo negativo) hacia el nodo
(polo negativo).


4. Los porcentajes de fracciones de protenas sricas determinados luego de la
desintometra son los siguientes

Alb 52,6%
Alfa1 Glob 3,2%
Alfa2 Glob 12,4%
Beta Glob 11,2%
Gamma Glob 17,1%

El suero tiene una concentracin de 7 g/dL. Calcule los g/dL correspondientes a cada
fraccin










Cuantificacin de protenas

Las sustancias que poseen enlaces peptdicos dan color azul violeta al reaccionar con
una solucin de cobre en medio alcalino (biuret). El color depende del medio de
coordinacin formado por el in cprico y los tomos del nitrgeno peptdico.






Utilizando el espectofotmetro se puede medir la concentracin del complejo de
coordinacin que es directamente proporcional a la concentracin de protenas totales
en el plasma o suero.

BIURET CUANTIFICAR PROTENAS
Componentes del reactivo de Biuret:
Protenas sricas % en sangre g /dL
Alb 52,6% 3,682
Alfa1 Glob 3,2% 0,224
Alfa2 Glob 12,4% 0,868
Beta Glob 11,2% 0,784
Gamma Glob 17,1% 1,197
Por qu azul violeta?
PROT + BIURET = AZUL VIOLETA
Esto es responsabilidad del COBRE quue forma un complejo de coordinacin con los
electrones desapareados del enlace peptdico)

CuSO
4
.5H
2
O: reacciona con los componentes del enlace peptdico para formar
el complejo de coordinacin.
NaOH: proporciona el medio alcalino para que se forme el complejo de
coordinacin.
Ioduro de potasio y sodio: evita la oxidacin del complejo de coordinacin.
Tartrato de sodio y potasio: estabiliza el complejo de coordinacin,
permitiendo que este se conserve en el tiempo de la lectura, para que se
mantenga el color de la solucin.

TUBO BLANCO TUBO PATRN TUBO MUESTRA
5 mL Biuret 5 mL Biuret 5 mL Biuret
100 uL de muestra 100 uL de patrn 100 uL de muestra

Longitud de onda en el espectofotmetro = 500 nm

Solucin blanco: (Biuret + H
2
O) se utiliza para calibrar el espectrofotmetro.
Solucin Patrn: es de concentracin conocida. Se determina su absorbancia y
conociendo la misma se pude calcular las concentraciones de las muestras usando:

[Proteinas en plasma]= (Abs de la muestra / Abs del patrn) x [Patrn] g/dL
[Patrn]= 7g/dL

Resultados:
Patrn 0.271
Muestra 1 0.321 8.292
Muestra 2 0.319 8.240
Muestra 3 0.325 8.395
Muestra 4 0.312 8.059
Muestra 5 0.331 8.550
Muestra 6 0.291 7.517









EXPERIMENTO #4: Protenas plasmticas

Suero: Sangre sin elementos formes y protenas de la coagulacin (fibrina y
fibringeno). Es el lquido amarillento transparente que est en la sangre
coagulada.
Plasma: Es el lquido sobrenadante, ligeramente amarillo y transparente que est
en la sangre no coagulada. Para evitar la coagulacin se usan anticoagulantes
como heparina y EDTA.
Electroforetograma: Soporte slido de acetato de celulosa teido con un
colorante (rojo Ponceau S) en la cual aparecen las bandas proteicas.
Proteinograma: Representacin grfica de las protenas del plasma que se
obtiene luego de la densitometra del Electroforetograma.

Requisitos para ser una protena plasmtica:
1- Ser secretadas activamente hacia la sangre.
2- No derivar de lesiones, ni alteraciones de tejidos o clulas.
3- Ejercer una funcin en el sistema vascular.
4- Presentar mayor concentracin en el plasma que en otros tejidos.
Las protenas plasmticas se sintetizan en el hgado, excepto las inmunoglobulinas
que las producen las clulas plasmticas derivadas de los linfocitos B de la
mdula sea.

Concentraciones de las protenas sanguneas:
- Normal Normoproteinemia o Euproteinemia: 6-8 g/dL.
- Bajo Hipoproteinemia: < 3 g/dL (hipoalbuminemia).
- Alto Hiperproteinemia: > 10 g/dL (hiperglobulinemia).
Proteinuria: Presencia de protenas en la orina. La proteinuria normal es hasta 150
mg en orina de 24 hrs.
Sndrome: Conjunto de signos y sntomas que tienen un sustrato anatomo-
patolgico comn.

En CLNICA se observa tanto la hiper- como la hipoproteinemia pero sta es ms
frecuente. No existe ninguna patologa que produzca hiperalbuminemia. Pero s
hay un aumento relativo de las protenas totales debido a hemoconcentracin.
La hiperglobulinemia se presenta en enfermedades como el mieloma mltiple.
Mieloma: Tumor compuesto por clulas del tipo que se encuentran normalmente
en la mdula sea.

Mecanismos que producen hipoalbuminemia:
- Falta de aporte produce malnutricin proteico-calrica.
- Biosntesis defectuosa como en hepatopatas, cirrosis avanzada, hepatitis
severas, cncer, etc.
- Prdidas por:
o La piel (en quemaduras extensas y ciertas enfermedades de la piel)
o Los riones (en el sndrome nefrsico donde ocurre un dao renal en
la membrana basal que deja pasar las protenas)
o El intestino (en el sndrome de malabsorcin)
Los criterios para hacer el diagnstico de sndrome nefrsico son:
1- Albmina srica: 3 g/dL
2- Proteinuria: 3 g en orina de 24 hrs.

Protena Plasmtica Funcin
1) Prealbmina Transporte: Tiroxina, Retinol
2) Albmina Regula presin onctica.
Transporte: cidos grasos,
bilirrubina, frmacos, Ca
2+
y Cu
2+

3) 1 Globulinas
- Antitripsina
- Orosomucoide
(Glucoprotena cida)
- Fetoprotena

Inhibe enzimas proteolticas
Asociada con la inflamacin

Presente en el feto
4) 2 Globulinas
- Ceruloplasmina
- Haptoglobina
- Macroglobulina

Transporte de cobre
Enlaza la Hb
Inhibidor de endopeptidasas
5) 1 Globulinas
- Transferrina
- Hemopexina
- C4

Transporte de hierro
Fija grupo hemo libre
Complemento
6) 2 Globulinas
- Fibringeno
- C3

Factor de coagulacin
Complemento
7) Globulinas
- IgG
- IgA
- IgM
- IgD e IgE
- Protena C-reactiva


Defensa inmunitaria


Defensa no adaptativa




Estudio cintico de la catalasa
La catalasa es una protena oligomrica formada por cuatro subunidades proteicas y cuatro grupos
prostticos: ferriproto porfirina. Est presente en los eritrocitos. Su peso molecular es de 240 kDa.
Se trata de una enzima altamente especfica y cataliza la descomposicin del H2O2 en agua y oxgeno,
segn la siguiente reaccin:
2 H2O2 2 H2O + O2
El perxido (H2O2) es un producto txico del metabolismo celular; se le clasifica como una especie reactiva
de oxgeno (ROS).
La catalasa es una enzima anti-oxidante, ya que cataliza reacciones protectoras o de la desintoxicacin
del H2O2.






En el estudio de la cintica de la catalasa, la determinacin del consumo de H2O2 se har por
manganimetra. Esta consiste en titular con permanganato la solucin E+ S+ H2SO4, para
determinar la cantidad de H2O2 que ha sido degradado por la catalasa. El permanganato
reacciona con el H2O2 remanente que no se logr descomponer. La reaccin redox que se lleva a
cabo es la siguiente:
5 H2O2 + 3H2SO4+ 2KMnO4 2MnSO4 + 5 O2+ K2SO4 + 8 H2O









CLCULOS:
Milimol de H2O2 inicial= (volumen de H2O2 en mL)(Molaridad de H2O2)
Milimol de H2O2 sin transformar= (volumen de KMnO4) (Molaridad de KMnO4) 5/2
Milimol H2O2 transformado= Milimol de H2O2 inicial - Milimol de H2O2 sin transformar
Milimol H2O2 transformado por minuto= Milimol de H2O2 transformado por minuto/5

Efecto de la concentracin de la enzima [E] sobre la velocidad de reaccin
Vara la cantidad de Enzima
Se mantienen constantes los siguientes factores: Concentracin del sustrato, T, pH, tiempo de
reaccin, presencia de un inhibidor.
PROCEDIMIENTO
1. Se agrega la solucin de enzima, luego el agua y por ltimo, el sustrato.
2. Detener la reaccin, transcurridos 5 minutos con 2,5 mL de H2SO4
REACTIVO 1 2 3 4 5 6 7
Solucin de enzima (mL) 0,1 0,2 0,4 0,8 1,6 3,2 6,4
Agua destilada (mL) 6,3 6,2 6,0 5,6 4,8 3,2 0
H2O2 (mL) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
KMnO4 usado 7,2 5,0 3,0 0,5 0,2 0,1 0,1
mmol de H2O2 inicial 0,2145 0,2145 0,2145 0,2145 0,2145 0,2145 0,2145
mmol de H2O2 sin transformar 0,198 0,1375 0,0825 0,01375 5,5x10
-3
2,75x10
-3
2,75x10
-3

mmol de H2O2 transformado 0,0165 0,077 0,132 0,20075 0,209 0,21175 0,21175
mmol de H2O2 transformado/min 3,3 x10
-3
0,0154 0,0264 0,04015 0,0418 0,04235 0,04235
Ejemplo
Concentracin de Perxido

Tubo 1
Milimol de H2O2 inicial
Milimol de H2O2 inicial= (volumen de H2O2 en mL) (Molaridad de H2O2)
Milimol de H2O2 inicial=(2,5 mL) (0,0858 M)
Milimol de H2O2 inicial= 0,2145 mmol
Milimol de H2O2 sin transformar
Milimol de H2O2 sin transformar= (volumen de KMnO4) (Molaridad de KMnO4) 5/2
Milimol de H2O2 sin transformar= (7,2 mL) (0,011 mmol/mL) 5/2
Milimol de H2O2 sin transformar=0,198 mmol
Milimol H2O2 transformado
Milimol H2O2 transformado= Milimol de H2O2 inicial - Milimol de H2O2 sin transformar
Milimol H2O2 transformado= 0,2145 mmol 0,198 mmol
Milimol H2O2 transformado= 0,0165 mmol
Milimol H2O2 transformado por minuto
Milimol H2O2 transformado por minuto= Milimol de H2O2 transformado /5 min
Milimol H2O2 transformado por minuto= 0,0165 mmol/5 min
Milimol H2O2 transformado por minuto= 3,3 x10
-3
mmol/min

Grfica de Velocidad vs Volumen de solucin enzimtica

Cuestionario
1. Cul es el orden de la reaccin en este experimento?
R/. En ese experimento, la reaccin es de orden 1. La velocidad aumenta en la misma proporcin
con la que aumenta la concentracin de la enzima.

2. Cul es la condicin experimental para mantener una lnea recta constante en la grfica
de velocidad versus volumen de solucin de enzima?
R/. La condicin experimental para mantener una lnea recta constante en la grfica de velocidad
vs volumen de solucin de enzima es mantener el suministro de sustrato constante para que la
enzima contine trabajando.

3. Si usted obtiene un cambio de inflexin en la curva de velocidad versus volumen de
solucin de enzima, Cmo lo explicara? Cmo es la velocidad de este segmento?
R/. En la curva se observa una inflexin, luego cambia para hacerse constante. Esto se debe a que
el sustrato se acaba en corto tiempo en presencia de una mayor cantidad de enzima, por lo que la
velocidad es igual a 0 (VRx= 0). La velocidad NO ES CONSTANTE, no se puede medir en ese tiempo
porque se agot el sustrato.




Volumen de enzima
Velocidad
de reaccin

EFECTO DE LA CONCENTRACIN DEL SUSTRATO

Se debe variar la concentracin del sustrato y mantener el volumen de la enzima
constante (0,2mL) y la temperatura constante tambin.











REACTIVO 2 3 4 5 6
H
2
O
2
(mL) 0.2 0.4 0.8 1.6 3.2
Agua (mL) 12.6 12.4 12.0 11.2 9.6
Enzima (mL) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
KMnO4 usado (mL) 0.62 1.2 2.4 4.8 8.5
mmol de H
2
O
2
inicial 0.0172 0.0343 0.0686 0.1373 0.2746
mmol de H
2
O
2
sin transformar 0.0171 0.0330 0.0660 0.1320 0.2338
mmol de H
2
O
2
transformados 0.0001 0.0013 0.0026 0.0053 0.0408
Velocidad 0.00002 0.000264 0.000528 0.001056 0.008162

Milimol de H
2
O
2
incial
Milimol de H
2
O
2
inicial= (volumen de H
2
O
2
) (Molaridad de H
2
O
2
)
Milimol de H
2
O
2
inicial= (0,2 mL) (0,0858 mmol/mL) 5/2
Milimol de H
2
O
2
inicial=0,0172 mmol

Milimol de H
2
O
2
sin transformar
Milimol de H
2
O
2
sin transformar= (volumen de KMnO
4
) (Molaridad de KMnO
4
) 5/2
Milimol de H
2
O
2
sin transformar= (0,62 mL) (0,011 mmol/mL) 5/2
Milimol de H
2
O
2
sin transformar=0,0171 mmol

Milimol H
2
O
2
transformado
Milimol H
2
O
2
transformado= Milimol de H
2
O
2
inicial - Milimol de H
2
O
2
sin transformar
Milimol H
2
O
2
transformado= 0,0172 mmol 0,0171 mmol
Milimol H
2
O
2
transformado= 0,0001 mmol

Milimol H
2
O
2
transformado por minuto
Milimol H
2
O
2
transformado por minuto= Milimol de H
2
O
2
transformado por minuto/5
Milimol H
2
O
2
transformado por minuto= 0,0001 mmol/5
Milimol H
2
O
2
transformado por minuto= 2,0 x10
-5
mmol/min




Clculos:
mmol de perxido inicial = (volumen de perxido en mL)(molaridad de perxido)
mmol de perxido sin transformar= (volumen de KMnO4)(molaridad de KMnO4) 5/2
mmol de perxido transformado= mmol de perxido inicial - mmol de perxido sin transformar
Velocidad= mmol de perxido transformado /5 min


Grfica de Velocidad vs Concentracin de sustrato


















Obtenga Vmax y Km experimentalmente

Cuestionario:

1. Interprete la forma de la curva experimental obtenida
Hiprbola rectangular

2. Cul es el orden de la Rx en los 3 segmentos obtenidos?
















3. Qu importancia tiene el momento en el cual la velocidad se hace constante e
independiente de la concentracin del sustrato?
Es el momento en que la enzima est saturada, es decir cuando alcanza su
velocidad mxima.


1
2
3
[S]<<Km orden 1
[S] aprox Km orden mixto
[S] >>Km orden cero (la velocidad
es independiente de [s]


4. Cuando V=Vmax/2, demuestre q Km= [S]
V= [S]= Km


Km + [S] = 2 [S]
Km= 2 [S] - [S]
Km= [S]


5. Cul es la utilidad de la determinacin de Km?
a. Defina conceptualmente Km
La constante de Michaelis-Menten (smbolo K
m
) corresponde a la
concentracin de sustrato que se alcanxa a la mitad de la velocidad mxima.
Es una medida de afinidad de la enzima. El valor de Km es inversamente
proporcional a la afinidad.
Es UTIL para conocer la afinidad de la enzima.

b. De qu depende Vmax?
Depende de la concentracin de la enzima.

c. Cules son los factores que afectan Km y Vmax?
[Enzima], temperatura.

6. Utilizando la ecuacin de Michaelis-Menten, interprete dos situaciones:
a. Cuando [S]<< Km. Cmo es la velocidad de la reaccin enzimtica?



Km se desprecia, ya que se acerca a 0


V= Vmax

velocidad es independiente a la concentracin del sustrato


b. Cuando [S]>> Km. Cmo es la velocidad de la reaccin enzimtica?





V es constante
EXPERIMENTO #7: Efecto de un inhibidor sobre la velocidad de reaccin

La Derivacin de Lineweaver-Burk es el inverso de la Ecuacin de Michaelis. Esta
grfica sirve para saber con qu tipo de inhibidor se est trabajando.




Un inhibidor es una sustancia que afecta la actividad enzimtica de forma
negativa. Importancia de los inhibidores: regulan las vas metablicas. Pueden ser:
a) Inhibidor competitivo: evita que se forme E-S. Parmetros: > Km, Vmax no
vara. Hay un aumento aparente de la Km porque se requiere una mayor
cantidad de [S] para alcanzar la Vmax. Ejemplos de estos inhibidores: CN
-
,
H2S, F
-
.
b) Inhibidor no competitivo: cuando se forma el complejo E-I, la enzima
cambia de forma, alterando el nmero de sitios catalticos disponibles para
el sustrato; por lo que Vmax disminuye. Parmetros: Km no vara, < Vmax.
Ejemplos de estos inhibidores: Hg, As, Pb.
c) Inhibidor anticompetitivo: el inhibidor se une una vez formado el complejo
E-S. Parmetros: < Km y Vmax.

Panel A: Enzima SIN inhibidor.
Panel B: Enzima con inhibidor competitivo MAYOR Km, IGUAL Vmax.
Panel C: Enzima con inhibidor no competitivo IGUAL Km, MENOR Vmax.
Panel D: Enzima con inhibidor acompetitivo MENOR Km y Vmax.
Vara la concentracin del inhibidor (KCN).
Se mantienen constantes los siguientes parmetros: Sustrato, Enzima,
Temperatura, Tiempo.

PROCEDIMIENTO:

1. Se mezclan sustrato e inhibidor, luego se agrega la enzima.
2. Se detiene la reaccin a los 5 minutos con 2,5 ml de H2SO4 1,5 M.

Reactivo
TUBOS
1 2 3 4
H2O2 2,5 mL 2,5 mL 2,5 mL 2,5 mL
Concentracin
De KCN
0 0,2 mL
1x10
-4
M
0,2 mL
1x10
-3
M
0,2 mL
1x10
-2
M
Solucin de enzima 0,2 mL 0,2 mL 0,2 mL 0,2 mL
mL de KMnO4 usado 3,9 4,2 4,9 6,0
mmol de H2O2 inicial 0,231 0,231 0,231 0,231
mmol de H2O2
sin transformar
0,107 0,116 0,135 0,165
mmol de H2O2
transformados
0,124 0,115 0,096 0,066
mmol de H2O2
transformados/min
0,0248 0,0230 0,0192 0,0132
% Inhibicin --- 7,26 22,58 46,77

Concentracin del Perxido
[H2O2] = 8,4 mL KMnO4 x 0,011 mol KMnO4 x 5 mmol H2O2 = 0,0924 M
2,5 mL H2O2 1 mL KMnO4 2 mmol KMnO4

TUBO 1
Milimol de H2O2 incial
Milimol de H2O2 inicial= (volumen de H2O2) (Molaridad de H2O2)
Milimol de H2O2 inicial= (2,5 mL) (0,0924 mmol/mL) 5/2
Milimol de H2O2 inicial=0,231 mmol

Milimol de H2O2 sin transformar
Milimol de H2O2 sin transformar= (volumen de KMnO4) (Molaridad de KMnO4) 5/2
Milimol de H2O2 sin transformar= (3,9 mL) (0,011 mmol/mL) 5/2
Milimol de H2O2 sin transformar=0,107 mmol

Milimol H2O2 transformado
Milimol H2O2 transformado= Milimol de H2O2 inicial - Milimol de H2O2 sin transformar
Milimol H2O2 transformado= 0,231 mmol 0,107 mmol
Milimol H2O2 transformado= 0,124 mmol

Milimol H2O2 transformado por minuto
Milimol H2O2 transformado por minuto= Milimol de H2O2 transformado por
minuto/5
Milimol H2O2 transformado por minuto= 0,124 mmol/5
Milimol H2O2 transformado por minuto= 0,0248 mmol/min

TUBO 2
% Inhibicin = velocidad sin [I] velocidad con [I] x 100
Velocidad sin [I]
% Inhibicin = 0,0248 0,0230 x 100
0,0248
%Inhibicin = 7,26

TUBO 3
% Inhibicin = velocidad sin [I] velocidad con [I] x 100
Velocidad sin [I]
% Inhibicin = 0,0248 0,0192 x 100
0,0248
%Inhibicin = 22,58

TUBO 4
% Inhibicin = velocidad sin [I] velocidad con [I] x 100
Velocidad sin [I]
% Inhibicin = 0,0248 0,0132 x 100
0,0248
%Inhibicin = 46,77

Cuestionario
1. Qu es un inhibidor?
Un inhibidor es una sustancia que afecta la actividad enzimtica de forma
negativa.
2. Interprete la grfica de velocidad versus concentracin del inhibidor.
Es una grfica de tipo exponencial, donde a mayor concentracin del
inhibidor, menor velocidad de reaccin, casi al punto de sta ser
constante.
3. Interprete la grfica de porcentaje de inhibicin versus concentracin del
inhibidor.
Es una grfica de tipo lineal, donde ambos parmetros son directamente
proporcionales. Es decir, a mayor [I], mayor % I.
4. Cmo har usted, experimentalmente, para demostrar si se trata de una
inhibicin competitiva o de una no competitiva?
Se realizaran dos experimentos: (1) Con [E] y [S], donde [E] es constante, y
[S] vara. (2) Con [E], [S] e [I], donde [E] es constante y [S] e [I] varan. Luego
de obtener los resultados se hace la linealizacin de Lineweaver-Burk.
5. Cmo varan los parmetros enzimticos en una inhibicin competitiva?
Aumenta Km, Vmax no vara.
6. Cmo varan los parmetros enzimticos en una inhibicin no
competitiva?
Km no vara, disminuye Vmax.


Efecto de la Temperatura sobre la velocidad de reaccin
El parmetro que variar ser la temperatura
Se mantienen constantes los siguientes factores: Concentracin del sustrato (2,5 mL), cantidad de
enzima (0,2 mL), pH, tiempo de reaccin, presencia de un inhibidor.
PROCEDIMIENTO
3. Se agrega la solucin de enzima, luego el agua y por ltimo, el sustrato.
4. Detener la reaccin, transcurridos 5 minutos con 2,5 mL de H2SO4
REACTIVO 1 2 3 4 5
H2O2 (mL) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
Temperatura (C) 0 24 37 60 100
Solucin de enzima (mL) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
KMnO4 usado 6,8 3,9 3,6 5,5 6,0
mmol de H2O2 inicial 0,2145 0,2145 0,2145 0,2145 0,2145
mmol de H2O2 sin transformar 0,187 0,1072 0,099 0,1512 0,165
mmol de H2O2 transformado 0,0275 0,1073 0,1155 0,0633 0.0495
mmol de H2O2 transformado/min 0,0055 0,02146 0,0231 0,01266 0,0099
*Tericamente el consumo de permanganato debe dar 7.8mL (el valor que da el prof. para
obtener la concentracin de perxido) y as las moles transformadas deben ser CERO.
Concentracin de Perxido

Tubo 3
Milimol de H2O2 inicial
Milimol de H2O2 inicial= (volumen de H2O2 en mL) (Molaridad de H2O2)
Milimol de H2O2 inicial=(2,5 mL) (0,0858 M)
Milimol de H2O2 inicial= 0,2145 mmol
Milimol de H2O2 sin transformar
Milimol de H2O2 sin transformar= (volumen de KMnO4) (Molaridad de KMnO4) 5/2
Milimol de H2O2 sin transformar= (3,6 mL) (0,011 M) 5/2
Milimol de H2O2 sin transformar= 0,099 mmol
Milimol H2O2 transformado
Milimol H2O2 transformado= Milimol de H2O2 inicial - Milimol de H2O2 sin transformar
Milimol H2O2 transformado= 0,2145 mmol - 0,099 mmol
Milimol H2O2 transformado= 0,1155 mmol
Milimol H2O2 transformado por minuto
Milimol H2O2 transformado por minuto= Milimol de H2O2 transformado /5 min
Milimol H2O2 transformado por minuto= 0,1155 mmol/ 5 min
Milimol H2O2 transformado por minuto=0,0231 mmol/min
Grfica de Velocidad vs Temperatura








Tericamente el tubo que est a 100C debi gastar ms permanganato porque se desnaturaliza
la enzima y no se descompone el sustrato. A 37 consumi menos permanganato.
Cuestionario
1. Interprete la forma de la curva experimental obtenida
R/. La temperatura ptima de la catalasa es 37 ya que se observa que a esta temperatura hay una mayor
velocidad, y por lo tanto mayor actividad y efectividad cataltica. Mientras que en los extremos (0 C y 100
C) la actividad enzimtica es bajsima.
2. Defina temperatura ptima
R/. La temperatura ptima es aquella en la cual se alcanza la mayor eficacia cataltica, se refleja en que
hay mayor velocidad puesto que la enzima tiene una conformacin ptima y degradar al sustrato a la
mayor velocidad posible.
3. Existen temperaturas sub-ptimas y sobre- ptima, Qu ocurre con la estructura de las
enzima en estas temperaturas?
a) Temperaturas sub- ptimas (0, 24):
Se mengua la actividad de la enzima
Su conformacin es diferente a la ptima
T ptima
V
T
T sobre- ptima
T sub- ptima
Falta energa cintica , no hay choques efectivos entre las molculas
b) Temperaturas sobre- ptimas (60, 100):
Se pierde la conformacin (se pierden las estructuras 2, 3 y 4; solo se conserva la 1)
Se desnaturaliza la enzima
4. Defina Q10. Calcule la Q10 de la catalasa utilizando sus datos experimentales.
R/. La Q10 es la cantidad de veces que cambia la velocidad cuando la T vara en 10 C.


Q10= 1,08 veces

















EFECTO DEL TIEMPO SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCION


Curva de progreso de la reaccin (mmol de H
2
O
2
descompuesto vs tiempo de
reaccin)








Grfica de velocidad vs tiempo






REACTIVO 1 2 3 4 5 6 7
H2O2 (mL) 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
Enzima (mL) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
Tiempo 30 15 10 5 3 1 0
KMnO4 usado (mL) 0.1 1.7 1.8 2 4.7 5.6 6.8*
mmol de H2O2 inicial 0.2145 0.2145 0.2145 0.2145 0.2145 0.2145 0.2145
mmol de H2O2 sin transformar 0.0028 0.0468 0.0495 0.0550 0.1293 0.1540 0.1870
mmol de H2O2 transformados 0.2118 0.1678 0.1650 0.1595 0.0853 0.0605 0.0275
Velocidad 7.06 x10
-3
1.68 x10
-2
1.10 x10
-2
3.19 x10
-2
2.84 x10
-2
6.05 x10
-2
0
0 15 30
Tiempo de Rx (min)
mmol de H
2
O
2
descompuesto
Tiempo de Rx (min)
Velocidad
CUESTIONARIO
1. Qu significado tiene la pendiente de la grfica 1?
R/. La pendiente representa la velocidad de reaccin




2. Calcule dos pendientes de la grfica 1

0,0124 mmol/ min

5, 6 x10
-4
mmol/ min

3. Cmo vara la pendiente con el avance de la reaccin?
R/. A medida que avanza la reaccin, la pendiente va disminuyendo al igual que
la velocidad.

4. Interprete la grfica 2 y relacione con su respuesta a la pregunta 3