Transcript of Reactivo TRIzol

Reactivo TRIzol
Tras la homogenizacin de la muestra con TRIzol:
Tras la homogenizacin de la muestra con TRIzol
El ADN es precipitado de la interfase con/capa orgnica con etanol
Las protenas son precipitadas del supernatante de fenol-etanol a travs de la precipitacin de isopropanol
precipitados de ARN, ADN o protenas son lavados para remover impurezas, y resuspendidos por aplicaciones de
corrientes
Precauciones
por tener fenol (txico y corrosivo) e isotiocianato (irritante), puede ser un riesgo de saluda si no es manejado
adecuadamente
Contenido y almacenamiento
surtido en volmenes de 100mL o 200 mL y distribuido a temperatura ambiente.

TRIzol es estable por doce (12) meses cuando es almacenado apropiadamente.
Uso
Para investigacin solamente. No destinado a diagnstico humano o animal ni uso teraputico
Materiales necesarios
El reactivo TRIzol es una solucin monofsica de fenol, guanidinaisotiocianida y otros componentes que facilitan el
aislamiento de ARN de una gran variedad de especies tanto de tamao molecular grande como pequeo
Es un reactivo de uso inmediato
Diseado para aislar altas cantidades totales de ARN, ADN y proteinas
Mantiene la integridad del ARN debido a su altamente efectiva inhibicin de la actividad de la A.Ribonucleasa
las moleculas aisladas pueden ser utilizadas en:
El RNA en RT-PCR
anlisis de Northern Blot, hibridacin DotBlot, seleccin de poly(A)+, translacin in vitro, ensayo de proteccin de
ARNasas, clonacin molecular
El ADN en PCR, restriccin de digestin de enzimas y Southern Blots
Las protenas aisladas pueden ser usadas para Western Blots, recuperacin de actividad enzimtica, y algunas
inmunoprecipitaciones
usar las reglas de bioseguridad rigurosamente
Evite contacto directo conTRizol
En caso del contacto con la piel lave inmediatamente el rea expuesta con grandes cantidades de agua
Si inhala vapores, movilcese a lugar con aire fresco y busque atencin mdica de ser necesario.
Aislamiento de ARN
Cloroformo
Alcoholo isopropil
Etanol 75% (en agua DEPC-tratado)
agua libre de ARNasa o SDS (docedil sulfato de sodio) 0.5%
Centrifuga y rotor capaz de alcanzar hasta 12,000 rpm
tubo de microcentrfuga de Polipropileno
Bao maria (55-60C)
Aislamiento de ADN
Cloroformo, Etanol 100%, citrato de sodio en etanol 10%, 8Mm de NaOH, centrfuga y rotor capaz de alcanzar hasta
12,000 rpm, tubos de micro centrfuga de polipropileno.
Aislamiento de Protenas
Cloroformo, alcohol isopropil, etanol 100%, 0,3 mMhidroclorido de guanidinaen etanol 95%, SDS 1%m, Centrfuga y
rotor capaza de alcanzar hasta 12,000 rpm, Tubos de microcentrfuga de polipropileno
Preparacin de muestras
Homogenizacin de muestras
1. Determinar tu tipo de tejido, y realizar la homogenizacin a temperatura ambiente de acuerdo con los siguientes datos. El
volumen de la muestra no debe exceder 10% del volumen del TRIzol usado para homogenizar. Asegrate de usar la
cantidad adecuado de TRIzol, puesto que un volumen insuficiente pude resultar en Contaminacin del ARN aislado con
ADN
tipo de muestra
Tejido
Aadir 1mL de TRIzol por cada 50-100 mg de muestra de tejido


Homogenizar muestra usando un homogeneizador o un Teflon de vidrio.


Nota: Procese o congele el tejido inmediatamente despus de este procedimiento
Clulas adherentes
Remover medio de cultivo de la placa de Petri.



Aladir 1mL de TRIzol directamente a las clulas en la placa por cada 10 cm de rea e superficie de la placa. Nota: Aadir
1mL de TRIzol a placas de 35mm, 3 mL a placas de 60 mm y 8mL a placas de 100mm.

Lisar las clulas directamente en la caja de Petri pipeteando las clulas arriba y abajo varias veces.
Clulas de suspensin
Recolectar las clulas a travs del centrifugando y remocin.



Aadir 0.75 mL de TRIzol por cada 0.25 mL de muestra . Nota: No lavar las clulas antes de la adicin de TRIzol para
evitar aumento deprobabilidad de degradacin de ARNm.


Lisar las clulas en la muestra pipetendola arriba y abajo varias veces. Disrupcin de algunas levaduras y clulas
bacteriales puede requerir uso de homogeneizador
Tejido o clulas con alto contenido de grasas, protenas, polisacridos, o material extracelular.
Seguido a la homogenizacin,
centrifugue su muestra a 12,000 rpm por 10 minutos a 4C. Nota: El resultado contiene ECM, Polisacridos y ADN de gran
peso molecular, mientras que el supernantante contiene ARN. In muestras con alto contenido de grasa, una capa de grasa se
colecta encima del supernantante.


Remover y descartar capa adiposa.


Transferir el supernantante limpio a un nuevo tubo.
Proceder a la fase de separacin, o almacenar la muestra homogenizada. Las muestras homogenizadas pueden ser
depositadas a temperatura ambiente por varias horas, o a -60 a -70C por al menos un mes.
Fase de separacin
1. Incube la muestra homogenizada por 5 minutos a temperatura ambiente para permitir la completa disociacin del
complejo nucleoproteico.
2. Aadir 0.2 mL de cloroformo por cada 1 mL de TRIzol usada en la homogenizacin. Tape el tubo
3. Agitar el tubo vigorosamente con su mano por 15 segundos
4. Incubar por 2-3 minutos a temperatura ambiente.
5. Centrifugar la muestra a 12,000 rpm por 15 minutos a 4C. Nota: La mezcla se separa en una fase menor color roja de
fenol cloroformo, una interfase, y una fase superior acuosa. El ARN permanece exclusivamente en la fase acuosa. La fase
acuosa superior es alrededor del 50% del volumen total.
6. Remover la capa acuosa de la muestra inclinando el tubo a 45% y pipeteando la solucin afuera. Evite tomar algo de la
interfase o la capa orgnica dentro de la pipeta cuando remueva la fase acuosa.
7. Coloque la fase acuosa en un nuevo tubo y proceda al Procedimiento de Aislamiento de ARN.
8. Guarde la interfase y la fase orgnica de fenol-cloroformo si se desea hacer aislamiento de protenas o ADN.

Lavado de ARN
1. Remover el supernantante del tubo, dejando solo el material granulado de ARN.
2. Lavar el material granulado, con 1 mL de etanol 75% por cada 1 mL de TRIzol Reactivo usado en la homogenizacin
inicial. Nota: El ARN puede ser almacenad en etanol 75% por al menos un ao a -20C, o al menos una semana a 4C.
3. Vaciar la muestra parcialmente, luego centrifugar el tubo 7500 rpm por 5 minutos a 4C. Descarte el lavado.
4. Seque al vaco el material granulado de ARN por 5-10 minutos. No seque el granulado con centrfuga al vaco.
5. Proceda a Resuspensin de ARN

Resuspensin de ARN
1. Resuspender el material granulado de ARN en agua libre de ARNasa o solucin SDS 0.5% (20-50 L) pasando la
solucin arriba y abajo barias veces a travs de la punta de la pipeta. Nota: No disuelva el ARN en SDS 0.5% si esta va a
ser usada en reacciones enzimticas subsecuentes.
2. Incubar in bao mara a 55-60C por 10-15 minutos
3. Proceda a hacer aplicacin de corriente (downstream) o almacene a -70C