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XVII Con. Ven. Bot. 2007

FQ-08

Determinación de metabolitos secundarios presentes en el extracto etanólico de Lippia origanoides

Determination and of secondary metabolites present in the ethanolic extract of Lippia origanoides

J.L. Rodríguez, M.E. Sanabria, D. Rodríguez y M.I. Rangel

Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado; Postgrado de Fitopatología. Apartado de Correos 400 Barquisimeto, estado Lara.

Resumen

Con el objetivo de determinar los metabolitos secundarios (MS) presentes en el extracto etanólico (EE) de Lippia origanoides, se colectaron muestras de campo. Se secaron y maceraron 250 g de hojas y flores en 2500 mL de alcohol etílico al 98% y se rotaevaporaron para obtener el extracto puro, al cual se le determinó los alcaloides, aceites esenciales y saponinas, empleando la metodología de Marcano y Hasegawa (2002) y aplicando el método de Tswett (1906), se determinaron flavonoides, polifenoles-taninos y antraquinonas, cuantificándose estos últimos mas los alcaloides, con el método propuesto por Sanabria et al. (2006). Todos los MS mencionados estuvieron presentes; se obtuvo una mayor cantidad de antraquinonas y polifenoles-taninos; con respecto a flavonoides y alcaloides lo que indicó las diferencias cualitativas y cuantitativas de los MS en los EE de L. origanoides.

Palabras clave: extracto, determinación, metabolitos secundarios, Lippia

Abstract

To determine the secondary metabolites present in an ethanol extract of L. origanoides, 250 g of field samples of leaves and flowers were collected, dried, and macerated in 2500 mL of ethylic alcohol at 98%; then processed in a rotaevaporater to obtain the crude extract. Alkaloids, essential oils and saponinas were determined using Marcano and Hasegawa (2002) method, while flavonoides, polifenoles-tannins and antraquinonas were determined with Tswett (1906) method. Quantitation of the last four metabolites plus alkaloids, was performed applying the method proposed by Sanabria et al. (2006). All the mentioned metabolites were present in the extract. A larger quantity of antraquinones and polyphenols-tannins was obtained in the samples which indicated qualitative and quantitative differences of the metabolites in the ethanol extract of L. origanoides.

Key words: extract, determination, metabolites seconds, Lippia.

Introducción

Los metabolitos secundarios son considerados compuestos no esenciales para el funcionamiento de la célula vegetal, por cuanto no participan en las transformaciones bioquímicas comunes; solo son imprescindibles a las plantas que los producen, por lo que su función no esta bien entendida. La variabilidad cualitativa entre especies y familias botánicas se mantiene, en muchos casos, dependiendo de factores climáticos, fenológicos, genéticos y edáficos, con sus diferentes interacciones (1). Muchos de los compuestos producidos por las plantas silvestres son aprovechados por estas para protegerse de condiciones ambientales adversas, como del ataque de plagas y patógenos en general, hallándose en mayor proporción cuando la

planta presenta algún estrés, producido por la alteración de alguno de estos factores. Algunos de estos compuestos como los beta carotenos son aprovechados por el hombre en la alimentación animal y como materias primas para

la elaboración de medicamentos (4). Se han realizado

estudios para determinar cualitativamente, los

metabolitos en plantas silvestres de diferentes especies

y familias, en áreas protegidas por su riqueza y

biodiversidad (3). Así mismo, se han determinado los compuestos metabólicos en plantas cultivadas, los cuales han sido comparados con los de especies iguales pero manipulados genéticamente a fin de atribuir algún nivel de diferencia a factores diversos y a distintas condiciones de manejo (2). El objetivo del presente

Autor para correspondencia correo electrónico: luisfhashion@gmail.com

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Rodríguez et al.

trabajo fue determinar los metabolitos secundarios presentes en el extracto etanólico sin desgrasar de Lippia origanoides, especie silvestre de la que se han

demostrado propiedades fungistáticas lo cual representa una alternativa promisoria ante el uso indiscriminado de agroquímicos en el control de enfermedades.

Materiales y métodos

La investigación se desarrolló en el laboratorio de Microtécnia e Histopatología Vegetal de los Postgrados de Agronomía de la Universidad Centroccidental "Lisandro Alvarado". Para cumplir con el objetivo planteado en el presente trabajo, se procedió, bajo la metodología de Marcano y Hasegawa (2002), a colectar muestras de tallo, hojas y flores de Lippia origanoides para su posterior sometimiento a secado bajo cobertizo y a temperatura ambiente de 23ºC a 29ºC, durante 15 días. Luego, se pulverizaron 250g de la muestra en una licuadora convencional Osterizer MR y se pusieron a macerar en 2500 mL de alcohol etílico al 98%, por 48 horas en un envase cubierto con plástico negro para protegerlo de la luz directa. Posteriormente se paso el filtrado del macerado por un Rotaevaporador Brinkmann MR , el extracto crudo obtenido se guardó en un frasco ámbar bajo refrigeración (8ºC) hasta la realización del análisis. La prueba cualitativa para los alcaloides débilmente básicos, básicos, sales cuaternarias de amonio, aceites esenciales y saponinas, se realizó siguiendo la metodología de Marcano y Hasegawa (2002). Para la extracción de los alcaloides se empleo extracción liquido-liquido, para ello el extracto se evaporó hasta casi la sequedad, se redisolvió con HCl (10%). Los alcaloides débilmente básicos se extrajeron con cloroformo. En el caso de los alcaloides básicos la fase acuosa remanente se alcalinizó con NH 4 OH, antes de la extracción con cloroformo. La tercera fase se analizó para sales cuaternarias de amonio. Se colocaron tres gotas de las tres fases en una porción de cromatofolio de silica/gel y se rociaron con reactivo de Meyer; la presencia de una coloración marrón rojiza era indicativa de los tres tipos de alcaloides. Los aceites esenciales se determinaron por el olor característico que le confieren al extracto. Para las saponinas, el extracto etanólico se agitó fuertemente con agua y se dejó reposar por más de 20 min, la presencia y persistencia de una espuma indicaba lo

positivo de la prueba. Para la determinación de los flavonoides, polifenoles y taninos y las antraquinonas, se empleó la metodología de Tswett (1906), haciendo para ello una corrida cromatográfica de 10 láminas de silica/gel y 20 gotas del extracto por cada solvente especifico para cada prueba. Así, par los flavonoides se usaron 10 mL de hexano, luego de desarrollada la cromatografía, las laminas se observaron bajo luz ultravioleta donde una coloración fluorescente blanca revelaba la presencia de estos metabolitos. Para los polifenoles, el solvente del cromatograma fue una mezcla de agua destilada-ácido acético (9:1) de agua destilada - ácido acético, el revelado se logró rociando el cromatograma con cloruro férrico al 1%, una coloración parda nos indicaba lo positivo de la prueba. En las saponinas, el solvente usado fue ácido acético y el revelado mediante una mancha rojiza al rociar la silica/ gel con NH 4 OH. La cuantificación de los alcaloides, flavonoides, polifenoles-taninos y antraquinonas presentes en 1mL del extracto se hizo mediante la metodología de Sanabria et al. (2006), para ello se emplearon cromatogramas de silica/gel con dimensiones de 6,5 x 2,5 cm y marcados a 0,7 cm de la base donde se agregó cada gota del extracto. Luego del revelado, se marcó un área de 0,05 (para alcaloides y polifenoles- taninos), 0,025 (para antraquinonas) y 0,02 cm 2 (para flavonoides), donde se observara la presencia de cada uno de los metabolitos. Se marcó, además, un área igual con solvente, como testigo. Las áreas se rasparon y pesaron, calculando la cantidad de cada metabolito por diferencia de peso. También se determinó para esta prueba, el valor, en porcentaje, del factor de recorrido (Rf) de cada metabolito en el cromatograma, dividiendo la distancia del recorrido del metabolito por la distancia del recorrido del solvente (en centímetros). Los valores de Rf fueron sometidos a un análisis estadístico por la prueba de Tukey, con el programa Statistix MR , Versión 8, previa transformación de los valores por la función log(x).

Resultados y discusión

Todos los metabolitos, excepto los alcaloides básicos, se encontraron presentes en la planta de L. origanoides. Castillo et al. (2005) reportaron, en esta misma planta, la presencia de alcaloides, flavonoides, aceites esenciales, polifenoles y taninos; diferencias que posiblemente se deban a la época de colección, con diferentes características climáticas, y estados fenológicos de la planta distintos, lo que indica la

variabilidad cualitativa entre los metabolitos de una misma especie. Casanova et al. (2005) reportaron diferencias cualitativas para los extractos etanólicos en plantas cultivadas, sugiriendo que losI mismos varían tanto en plantas silvestres como en las cultivadas, debido a la interacción de los factores citados anteriormente. En la Figura 1 se muestra la similitud estadística

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de los factores de retención/recorrido (Rf) que existen entre los flavonoides y alcaloides, con 29 y 35%, respectivamente, con respecto a los obtenidos para las antraquinonas 46% y los polifenoles-taninos 60%, lo que nos indica que dentro de cada gran grupo de compuestos existen diferentes tipos de cada metabolito. En el Cuadro 1, se observan los valores de la cuantificación de los metabolitos, con un mayor nivel de polifenoles-

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taninos y antraquinonas, y menor en flavonoides. Al analizar el contenido en base al peso, se nota que los polifenoles son proporcionalmente mas altos y las antraquinonas las mas bajas, lo que indica que el peso de los metabolitos es igualmente diferente y su cantidad no está necesariamente relacionada con su peso. Esta variación cualitativa y cuantitativa puede también deberse a diversos factores genéticos y ambientales.

Polifenoles y Taninos Polifenoles y Taninos Antraquinonas Antraquinonas Flavonoides Flavonoides Alcaloides
Polifenoles y Taninos
Polifenoles y Taninos
Antraquinonas
Antraquinonas
Flavonoides
Flavonoides
Alcaloides Alcaloides
75
75
I I
60
60
II II
45
45
III
III
III
III
30
30
15
15
0
0
P P
y T
y T
Ant
Ant
F
F
Alc
Alc
Metabolitos
Metabolitos
Rf (%)
Rf (%)

Figura 1. Valores de factor de recorrido (Rf) de los metabolitos secundarios presentes en el extracto etanólico de Lippia origanoides. Los números romanos indican la significancia (p<0,05) de las diferencias.

Cuadro 1. Cuantificación de los metabolitos secundarios presentes en 1 mL del extracto etanólico de Lippia origanoides.

Metabolitos

Peso del metabolito(mg)

Porcentaje del metabolitos en la Muestra

Alcaloides Flavonoides Polifenoles y Taninos Antraquinonas

263,46

68

22,13

77

1410,00

92

1412,50

55

Conclusiones

La presencia de los metabolitos secundarios en las plantas silvestres, caso específico Lippia origanoides se debe a la interacción de una serie de factores que determinan en un momento especifico la variabilidad y estabilidad de dichos compuestos, es recomendable determinar la presencia de los mismos y luego cuantificarlos para evitar el gasto innecesario de reactivos. La diferencia existente entre alcaloides y

flavonoides con los polifenoles- taninos y antraquinonas, en relación a los valores de los factores de recorrido, porcentaje del metabolito en la muestra y peso del metabolito, puede indicar que sean estos últimos compuestos los que tienen efecto sobre los patógenos, tal como se ha sugerido en otros trabajos, pudiendo utilizarse como alternativas promisorias en el control de enfermedades en plantas de importancia agronómica.

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Rodríguez et al.

Literatura citada

1. Albornoz, A. 1980. Productos naturales, sustancias y drogas extraídas de las plantas. Caracas. 84p.

2. Casanova. R, J. Castillo, Y. De Freitez, M. Sanabria y D. Rodríguez. 2005. Metabolitos secundarios en dos tipos de Jengibre (Zingiber oficinale Rocoe). Proceeding of the interamerican society for tropical Horticulture. Vol. 49. Boca chica. Republica Dominicana. 48p

3. Castillo. J, M. Sanabria, D. Rodríguez y O. Crescente. 2005. Metabolitos secundarios en plantas silvestres del parque nacional Terepaima, Estado Lara. Memorias del XVI Congreso Venezolano de Botánica. Vol 17. Maturin. 280p.

4. Romero, A. 2004. Nuevas fuentes de antioxidantes naturales. Ministerio de Ciencia y Tecnología. Caracas, Venezuela.

191p.

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