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Ao 2013 - Qumica Biolgica I - TPN 2:

Estructura de protenas

Objetivos del prctico
Reforzar los conocimientos bsicos sobre estructura de protenas brindados en la clase terica.
Familiarizarse con el uso de programas de visualizacin molecular.
Luego de este prctico deber comprender:
La relacin de los ngulos (phi) y (psi) con la estructura de una cadena polipeptdica.
Los distintos tipos de estructura secundaria presentes en las protenas.
La distribucin diferencial de aminocidos hidrofbicos e hidroflicos en las protenas.
La relacin estructura-funcin para la hemoglobina humana.
Introduccin
Las estructuras atmicas de ms de 80.000 biomolculas han sido determinados y sus coordenadas depositadas
en una base de datos denominada Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Dada la fuerte relacin
que existe entre la estructura y la funcin, estas estructuras permiten entender la biologa celular a un nivel atmico y
dan herramientas para controlar tecnolgicamente su funcin. Por ejemplo, casi todas las enzimas involucradas en la
produccin de energa celular (gliclisis, ciclo del cido ctrico y transporte de electrones) han sido estudiadas y sus
estructuras determinadas. Tambin se conocen estructuras tridimensionales de diversas protenas involucradas en la
sealizacin celular, transporte, regulacin y defensa.
El conocimiento de las estructuras moleculares de las protenas permite numerosos desarrollos tecnolgicos,
principalmente en la industria farmacolgica como por ejemplo:
Descubrimiento y diseo de nuevas drogas: Una de las aplicaciones mas importantes de la estructura
biomolecular es el diseo de frmacos. El conocimiento de la estructura de una protena nos permite intentar disear
pequeas molculas que se unan a la misma, bloqueando o exacerbando su funcin. La potencialidad de esta
aproximacin qued demostrada en la lucha contra el VIH y el SIDA (Prevelige, 2011). Muchas de las drogas anti-VIH
actualmente en uso fueron obtenidas a travs de programas de desarrollo inteligente de frmacos.
Diseo de nuevas nano-mquinas o nano-herramientas: las estructuras biomoleculares han abierto una nueva
disciplina de la ingeniera biomolecular y la bionanotecnologa. De la mano de la comprensin viene el control, y los
investigadores se encuentran actualmente modificando biomolculas existentes para obtener nuevas funciones e incluso
diseando nuevas biomolculas. Por ejemplo, se estn construyendo estructuras a nanoescala con DNA.
Bioteraputica, enzimas industriales: muchos bioteraputicos han sido desarrollados con la ayuda de los
modelos 3-D de protenas. El diseo, construccin y humanizacin de anticuerpos ya es una rama desarrollada de la
biotecnologa, asimismo se pueden disear fragmentos pequeos de anticuerpos con actividad biolgica, aumentar su
especificidad, su afinidad o su vida media. Las enzimas son ampliamente usadas en la industria y en la biotecnologa,
son componentes de jabones, detergentes y empleadas para la elaboracin de pan, vino, jugo de frutas y para el
tratamiento de telas, papel y cuero. Su uso permite ahorrar agua, energa y evita el empleo de compuestos qumicos que
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pueden resultar nocivos para el medio ambiente y la salud humana. El modelado de las enzimas permite el entendimiento
de sus propiedades biofsicas para luego modificarlas y obtener molculas con propiedades biolgicas optimizadas para
el uso que se pretende darle o con alta estabilidad a la oxidacin, a las altas temperaturas, a la alta fuerza inica o con
mejor especificidad por un sustrato.
Determinacin de las estructuras moleculares
Entre las tcnicas utilizadas para determinar las estructuras de protenas se dispone actualmente de mtodos
experimentales y mtodos biocomputacionales (tericos pero que obtienen sus datos de la experimentacin). Entre los
mtodos experimentales podemos diferenciar los mtodos de alta y de baja resolucin. Los de alta resolucin son la
cristalografa de rayos X y la resonancia magntica nuclear. Proveen las coordenadas (x,y,z) de cada tomo, pero
presentan la desventaja de ser tcnicas de alto costo operativo y no dan informacin dinmica (es decir los cambios que
va sufriendo una biomolcula, por ejemplo durante una reaccin qumica o la unin a un ligando). Las tcnicas de baja
resolucin en cambio son de bajo costo operativo, dan informacin global del sistema y pueden ir midiendo los cambios
estructurales con el tiempo. La microscopa electrnica y la dispersin de Rayos-X a ngulo bajo (SAXS) dan
informacin de la forma de la molcula pero no coordenadas atmicas. El dicrosmo circular (DC) y la espectroscopa
infrarroja (IR) son muy tiles para determinar el contenido de cada tipo de estructura secundaria que hay en una protena.
Es importante destacar que las tcnicas de alta y baja resolucin son complementarias entre si, pues para comprender un
sistema es fundamental no slo conocer la distribucin espacial de sus tomos sino tambin seguir su movimiento. Las
tcnicas de DC, IR y espectroscopia de fluorescencia son muy tiles para determinar interacciones entre protenas,
subunidades proteicas, para monitorear cambios en funcin del tiempo y para estudiar el plegamiento de las protenas.
La Figura 1 muestra la complementariedad escalar, es decir a que escala podemos aplicar los diferentes mtodos.

Figura 1: Representacin esquemtica de la resolucin obtenida con las diferentes tcnicas para la obtencin de estructuras de
protenas.

Tcnicas de alta resolucin:
o Cristalografa de rayos-X: permite determinar la ubicacin de cada tomo en la molcula. La biomolcula de
inters es expresada (producida en altas cantidades), purificada y cristalizada. Luego el cristal es sometido a un
intenso haz de rayos-X (a menudo, provistos por un sincrotrn). Los rayos X son difractados en un arreglo
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caracterstico de manchas. Analizando el espaciado y la intensidad de estas manchas, se puede determinar como
se acomodan las molculas en el cristal y donde se ubica cada tomo.
o Espectroscopa RMN: revela las distancias entre los tomos en una biomolcula, as como tambin la
conformacin local de porciones de cadenas macromoleculares. Esta informacin es usada para inferir la
estructura de las biomolculas. Actualmente, la espectroscopa de RMN es efectiva para determinar la estructura
de molculas orgnicas pequeas y protenas u oligonucletidos de baja masa molecular, ya que las mediciones
experimentales son difciles o imposibles de llevar a cabo para molculas grandes.
Tcnicas de baja resolucin:
o Microscopia electrnica: es efectiva para estructuras muy grandes, tales como virus o ensambles proteicos como
el poro nuclear. Las pticas usadas para enfocar los electrones no son lo suficientemente precisas para resolver
los tomos individuales, pero la microscopa electrnica puede dar una buena aproximacin de la forma general
de las estructuras subcelulares. Es una herramienta poderosa usada en combinacin con las tcnicas de
resolucin a nivel atmico mencionadas antes (cristalografa de rayos-X y RMN).
o Dispersin de Rayos X a ngulo bajo (SAXS): La dispersin de rayos X a bajos ngulos, o SAXS (Small Angle
X-ray Scattering) es una tcnica basada en analizar la dispersin de rayos X producida por un material al paso de
un haz de rayos X a ngulos muy prximos a cero. Cualquier evento de dispersin est caracterizado por una ley
recproca entre tamao de partcula y ngulo de dispersin. La radiacin electromagntica incidente interacta
con los electrones en una muestra. Una parte de ellos emitir radiacin coherente. En el lugar donde las ondas
interfieran constructivamente tendremos un mximo, que es lo que detectamos. Del anlisis matemtico de las
interferencias constructivas podemos obtener el tamao y la forma global de una protena.
o Dicroismo Circular (DC): es una tcnica espectroscpica de absorcin que provee informacin acerca de la
estructura de macromolculas biolgicas. La seal medida en DC es la diferencia entre las Abs (A) de la luz
polarizada circularmente hacia la izquierda (i) y hacia la derecha (d): DC = A(d) - A(i)
Se utiliza como fuente luz polarizada (UV-VIS) y las muestras a analizar, adems de absorber, deben ser
pticamente activas. DC es una de las tcnicas ms sensibles para determinar las estructuras secundarias y
monitorear cambios en dicha estructura. El cromforo en el UV lejano (180 a 250nm) es el enlace peptdico; y
en el UV cercano (250 a 350nm) son los residuos aromticos, Tyr, Trp y Phe, y el puente S-S de Cys. El DC en
el UV lejano permite obtener medidas empricas de los elementos de estructura secundaria de la protena y en
muchos casos se puede obtener la proporcin de cada uno de ellos que se encuentra presente (es decir % de
hlices , hojas , giros y no ordenada). La intensidad en el cercano es mucho menor que en el lejano por lo
que se requiere mayor concentracin de protena. Esto es debido a que en una protena hay menos residuos
aromticos que enlaces peptdicos. El espectro de DC en el UV-cercano depende del plegamiento de la protena
(estructura terciaria) y es como una huella dactilar de la misma en condiciones nativas (plegada). Esto implica
que este mtodo es til para saber si la protena est correctamente plegada. Tambin se puede seguir el cambio
conformacional provocado por algn ligando que se una a un residuo aromtico.
o Espectroscopia infrarroja (IR): proporciona informacin sobre el contenido de estructura secundaria de
protenas y pptidos, ya que los mismos presentan un conjunto caracterstico de bandas de absorcin en su
espectro. Las bandas caractersticas encontradas en un espectro IR de una protena son las bandas amida I y
amida II. La absorcin asociada a la banda amida I depende de las vibraciones de estiramiento del enlace C = O
(figura 2), en cambio la banda amida II depende principalmente de las vibraciones de flexin del enlace N-H.
Debido a que tanto el C = O y los enlaces N-H estn implicados en el enlace de hidrgeno que tiene lugar entre
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los diferentes elementos de estructura secundaria, las ubicaciones en el espectro de ambas bandas depende del
tipo de la estructura secundaria presente en la protena. Estudios con protenas de estructura conocida se han
utilizado para correlacionar la forma de la banda amida I con el contenido de estructura secundaria.
Figura 2: vibraciones de los enlaces responsables de las bandas de
absorcin en el espectro IR de las protenas.


o Espectroscopia de Fluorescencia: es el mtodo espectroscpico ptico ms utilizado en determinaciones
analticas y para la investigacin cientfica. Se aplica, entre otras cosas, para estudiar los procesos fsicos
fundamentales de las molculas, la relacin entre la estructura y la funcin e interacciones entre biomolculas
(por ejemplo entre una protena y un cido nucleico, entre dos protenas o entre una protena y un ligando). El
estudio de la fluorescencia de los aminocidos aromticos, principalmente Trp y Tyr puede dar mucha
informacin del entorno en el que se encuentran los mismos y de la estructura terciaria y cuaternaria de las
protenas cuando se las somete a diferentes perturbaciones. Al tener un alto nivel de sensibilidad se pueden
estudiar las protenas en soluciones muy diluidas y su amplio rango dinmico (hay equipos que pueden hacer
determinaciones en tiempos extremadamente cortos) permite realizar estudios de plegamiento o de interaccin
con ligandos en funcin del tiempo. Otra gran ventaja es que se puede aprovechar la fluorescencia intrnseca de
las protenas (de los residuos Trp y Tyr) y realizar estudios dinmicos con la protena sin modificaciones.
Tcnicas Biocomputacionales:
o El dogma central que fundamenta la modelizacin terica de protenas a partir de su secuencia se basa en que la
estructura tridimensional de una protena est determinada slo por su secuencia y por las caractersticas del
entorno, sin la participacin obligatoria de factores externos. Existen numerosos mtodos que van desde el
modelado de novo de una protena hasta los que utilizan como molde una protena de la misma familia cuya
estructura est ya resuelta. Estos mtodos tuvieron un desarrollo exponencial en la ltima dcada y permiten
obtener mucha informacin til cuando esta es inaccesible para las tcnicas experimentales.

Acceso a la informacin sobre estructuras de protenas
Toda la informacin estructural derivada de las tcnicas de alta resolucin ha sido cuidadosamente almacenada
en una gran base de datos, el PDB (Protein Data Bank). Desde 1971 los investigadores depositan all sus resultados los
que son revisados antes de ser aceptados. Hoy en da, hay ms de 80.000 estructuras y para consultarlas se puede visitar
su sitio web: http://www.pdb.org/pdb/home/home.do
Visualizacin de las estructuras atmicas
La informacin que depositan los autores en PDB debe estar en el formato de la figura 3. Bsicamente consiste
en un archivo de texto plano donde se incluye informacin acerca de la metodologa experimental utilizada para resolver
la estructura de la protena, seguido por las coordenadas en el espacio de los tomos (uno por lnea).
Actualmente existen numerosos programas de visualizacin molecular los cuales permiten representa
espacialmente a cada tomo segn sus coordenadas. Entre los ms utilizados para la generacin de grficos
profesionales, como los que encontramos en publicaciones cientficas y libros de texto, podemos nombrar Rasmol,
PyMOL y VMD.
Vibracin
Amida I
Vibracin
Amida II
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Figura 3: Vista de un archivo pdb. En el rectngulo resaltado se pueden ver las coordenadas atmicas (x,y,z) de los tomos
de cada aminocido y tambin de tomos no pertenecientes a la protena (heterotomos).

Durante este prctico se utilizara el programa Mage, el cual se encuentra especialmente adaptado para su uso en
docencia). Alternativamente se puede utilizar el programa King que es una versin Java (multiplataforma) del mismo.
Los mismos pueden ser descargados de
http://kinemage.biochem.duke.edu/software/index.php.
Este programa nos permitir navegar a travs de tutoriales personalizados para repasar los conceptos bsicos de
estructura de protenas y estudiar la relacin entre estructura y funcin de la hemoglobina humana. Los archivos de
tutoriales pueden descargarse de la pgina de la ctedra en el Campus Virtual (http://www.campusvirtual.unt.edu.ar/).
Para una mejor comprensin, recomendamos acompaar el estudio de esta gua con el uso de los tutoriales.

PARTE PRCTICA:
Conceptos bsicos de estructura de protenas (tutorial: practico_A.kin)
Fragmento polipeptdico: ngulos de rotacin (phi), (psi) y (omega)
El esqueleto de la cadena polipeptdica de las protenas est formado por los enlaces entre los tomos de
nitrgeno (N), el carbono (C

) y el carbono del carbonilo (C) pertenecientes a un residuo de aminocido y continua

unindose mediante enlace peptdico el C con el N del siguiente residuo de aminocido. La figura 4-A muestra un
fragmento de la cadena polipeptdica, para ilustrar su geometra, los nombres de los tomos y los ngulos diedros o
ngulos de torsin de la cadena principal (, y ).
El ngulo diedro se encuentra alrededor del enlace N
i
-C
i
, y esta definido como el ngulo entre el plano que
contiene los tomos C
i-1
-N
i
-C
i
y el plano que contiene los tomos N
i
-C
i
-C
i

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El ngulo diedro se encuentra alrededor del enlace C
i
-C
i
y esta definido como el ngulo entre el plano que
contiene los tomos N
i
-C
i
-C
i
y el plano que contiene los tomos C
i
-C
i
-N
i+1

El ngulo diedro corresponde al enlace peptdico y adquiere en la mayora de los casos un valor de 180.
Los ngulos , y son los encargados de moldear la estructura tridimensional de la protena. En la figura 4-B
se muestran las proyecciones de Newman (Ni, Jirt, Koata, Jenkins, & McNaught, 2012) de los atomos alrededor del
enlace N
i
-C
i
, correspondiente al ngulo . Por convencin, el ngulo de torsin adquiere valores entre -180 (medido en
sentido antihorario) a +180 (medido en sentido horario).
C
i
C
i+1
C'
i
C'
i+1
N
i+1
N
i
R
i
R
i+1
O
H
H
H
O


C'
i-1
O
H






Figura 4: A) ngulos diedros , y de la cadena principal. B) Proyecciones de Newman para mostrar como se miden los ngulos
diedros.
Al abrir el archivo practico_A.kin con el programa Mage se puede observar como se ajusta la conformacin de
un pptido al cambiar los valores de , . Se puede observar que algunos pares de valores de y generan un alto
impedimento estrico. De esto resulta que algunos pares de valores tienen mayor preferencia que otros. Esto queda
expuesto en un Grfico de Ramachandran (figura 5) donde se representa los pares de ngulos - para todos los
A
B
N
i
C
C C
i-1

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residuos de aminocidos de una protena.

Figura 5: grfico de Ramachandran mostrando la distribucin de los pares , observados en las estructuras de protenas de alta
resolucin depositadas en el PDB. Las regiones ms importantes corresponden a elementos de estructura secundaria conocidos tales
como hlice- (), hoja- (), espiral-P
II
(P
II
), giro- tipo II (P
II
seguido de ), giro- reverso ()

Dentro de este grafico se observa que los pares , no se distribuyen uniformemente sino que se encuentran concentrados en
regiones especficas. Tal como se vera mas adelante, cada zona esta asociada a distintos elementos de estructura secundaria.
dextrgira
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Funcin de los aminocidos en la estructura proteica
La distribucin de los aminocidos dentro de la estructura de una protena no es azarosa sino que responde a las
caractersticas fsico-qumicas de los mismos. As al analizar la estructura de una protena, podemos encontrar que los
residuos fuertemente hidrofbicos Cys, Phe, Ile, Leu, Met, Val, Trp se empaquetan predominantemente unos contra
otros para formar el ncleo interior de las protenas. La funcin principal de los residuos hidrofbicos grandes es la de
formar los ncleos hidrfobos. De las cadenas laterales alifticas, las que tienen C

ramificados (Ile, Val) prefieren

ubicarse en hojas-, mientras que Leu y Met prefieren hlices-. Por el contrario, los aminocidos cargados Asp, Glu,
Lys, Arg se encuentran casi siempre en el exterior. Los grupos neutros y polares muestran una distribucin mas
uniforme, con una ligera preferencia hacia el exterior.
Muchos aminocidos juegan roles especficos en algunas posiciones particulares de estructuras secundarias.
Glicina tiene caractersticas especiales que le permiten servir para 3 diferentes propsitos: a) su capacidad de
adquirir valores de ngulos diedros poco comunes permite encontrarlo en los extremos de las piezas de estructura
secundaria, siendo por lejos el aminocido ms comn en el extremo C-terminal de las hlices; b) su reducido tamao le
posibilita actuar en contactos bien compactos en el interior de una protena, y c) la ausencia de una cadena lateral otorga
mayor libertad para rotar alrededor de los ngulos , , por lo cual es comn encontrarlo en lugares donde es requerida
una cierta flexibilidad en el movimiento.
Los residuos de prolina (Pro) se ubican por lo general expuestos al solvente, a pesar que su cadena lateral no
tiene tomos polares. Esto se debe a que es bueno para inducir la terminacin de las hlices- y para inducir la
formacin de giros, por lo cual se alojan preferentemente en los extremos de las piezas de estructura secundaria.
En el extremo N-terminal de las hlices- es comn encontrar Ser, Thr, Asn y Asp, ya que el oxgeno de la
cadena lateral puede establecer un puente-H con el grupo NH libre de la cadena principal en el primer giro de la hlice.
Curiosamente, glutamina es el residuo menos preferido para la posicin N-terminal ya que el grupo metileno extra en su
cadena lateral no permite que el oxigeno de la cadena lateral pueda ubicarse en una geometra correcta para formar el
puente-H. Esto demuestra que los residuos cuyas propiedades parecen superficialmente similares no siempre juegan un
papel equivalente en la estructura de una protena. En cambio, Gln es especialmente comn en las posiciones expuestas
en el centro de las hlices-.
Arginina y lisina son otro par de residuos similares con roles a menudo divergentes: la parte aliftica de su
cadena lateral establece contactos hidrofbicos, mientras que el grupo guanidinio de carga positiva en su extremo es
capaz de establecer interacciones electrostticas y puentes hidrogeno. El grupo guanidinio de la Arg puede establecer
hasta 5 puentes hidrogeno con tomos de oxigeno en un plano, y a menudo lo hace, por lo tanto tienden a poseer una
posicin bien definida. Lisina, en cambio, forma puentes hidrogeno a travs de su grupo NH
3
, de amplia libertad
rotatoria, que suele ser muy mvil en protenas e interacta bien con el solvente.

Motivos estructurales proteicos (tutorial: practico_B.kin)
El grafico de Ramachandran es un concepto fundacional que permite comprender como se definen los elementos
de estructura bsicos que pueden encontrarse en una protena. Tal como mencionamos anteriormente, los pares de
valores para los ngulos , se encuentran concentrados en 5 regiones principales (, , , , ) o sus imgenes
especulares (, , , , ) dentro del grfico, los cuales estn asociados a los distintos elementos de estructura
secundaria. Podemos clasificar la estructuras secundarias en dos grandes grupos: aquellos cuyos valores de , se
repiten en forma linear a lo largo de la cadena (es decir, aminocidos consecutivos adquieren un mismo valor para , )
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y regiones no repetitivas.
Entre las organizaciones repetitivas encontramos los clsicos elementos de estructura secundaria estudiados en la
clase terica: hlice-, hebra- (y su arreglo en hojas-) y espirales-P
II
(Figura 6). Las estructuras secundarias de hlice-
y hebra- estn mantenidas por puentes hidrgeno entre diferentes residuos de aminocidos, especficamente entre el
grupo N-H de un enlace peptdico y el grupo carbonilo (C=O) de otro enlace peptdico. Entre las organizaciones no
repetitivas encontramos los giros o bucles.


Figura6: elementos de estructura repetitiva, hlice- (A), hebra- (B) y espiral-P
II
(C)
Hlice- : el esqueleto peptdico esta enrollado, como una estructura en espiral, alrededor de un eje imaginario
(organizacin helicoidal de la cadena peptdica). Hay 3,6 aminocidos en cada vuelta de la hlice. Los grupos N-H de
todos los enlaces peptdicos apuntan en la misma direccin, la cual es aproximadamente paralela al eje de la hlice
mientras que los grupos C=O de todos los enlaces peptdicos apuntan en la direccin opuesta. El grupo C=O de cada
enlace peptdico esta unido por un puente hidrgeno al grupo N-H del enlace peptdico que se encuentra separado de l
por cuatro aminocidos. En la figura 7 se pueden ver dos representaciones esquemticas de hlice-.








Figura 7: estructura esquemtica de la hlice. Imagen tomada y modificada de (Koolman & Rhm, 2004).
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Hebras : el esqueleto de la cadena peptdica se extiende en un arreglo en zig-zag similar a una serie de
pliegues, con los enlaces peptdicos organizados en planos de inclinacin alterna (alternando planos descendentes y
planos ascendentes). Cuando dos o ms hebras- interaccionan forman una hoja plegada , que puede formarse entre dos
cadenas peptdicas o entre diferentes segmentos de una misma cadena peptdica (figura 8).
En la hoja-, los grupos C=O y N-H de los enlaces peptdicos de cadenas adyacentes (o de segmentos
adyacentes de una misma cadena) estn en el mismo plano apuntando uno hacia el otro, de tal forma que es posible
establecer puentes hidrgeno entre ellos. Los puentes de hidrgeno son ms o menos perpendiculares al eje principal de
la estructura en hoja plegada. Las hojas pueden ser paralelas (cuando las dos cadenas peptdicas corren en la misma
direccin) o antiparalelas (cuando corren en sentido contrario).


Figura 8: tipos de hoja-. Imagen tomada y modificada de (Koolman & Rhm, 2004).
Espirales-P
II
: esta conformacin es muy comn para las cadenas polipeptdicas en agua, siendo adoptada entre
otras por poli-L-Prolina, poli-Glicina y poli-Alanina. Este tipo de estructura es comnmente adoptada por las protenas
desplegadas. Su estabilidad esta dada por maximizar la entropa de la cadena al tiempo que expone al agua todos los
tomos capaces de formar puentes hidrogeno, de forma tal de alterar lo menos posible la organizacin natural del agua.
Bucles y giros: las estructuras secundarias vistas hasta el momento se caracterizan por ser zonas de
conformacin repetitiva, es decir, se repiten los valores de y en los residuos adyacentes. Sin embargo, adems de
estas estructuras en las cadenas polipeptdicas podemos encontrar regiones no repetitivas. Muchas de estas zonas no
repetitivas son bucles y giros que provocan cambios en la direccin de la cadena polipeptdica. Esto posibilita que la
protena tenga una estructura compacta. En el pasado se denomino a estas zonas regiones no repetitivas como ovillo
aleatorio (random coil). Esta definicin no es correcta, puesto que los valores de y caen en regiones bien
definidas dentro del grfico de Ramachandran. Sin embargo, en los extremos N- y C-terminal de las protenas pueden
encontrarse regiones de ovillo aleatorio con gran movilidad conformacional.
Hoja antiparalela Hoja paralela
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Figura 9: representacin esquemtica de un giro- ilustrando el puente-H entre el residuo i e i+3.
Los giros son secuencias cortas de aminocidos en una conformacin caracterstica que impone un giro brusco
de 180 a la cadena principal de un polipptido. Los giros se pueden clasificar de acuerdo a la separacin entre los dos
residuos de los extremos:
Giro-: separado por cuatro enlaces peptdicos.
Giro-: separado por tres enlaces peptdicos. Constituye el tipo mas frecuentemente encontrado. Lo
esencial de este giro es que el carbonilo de un residuo i forme un puente hidrgeno con el grupo amino
del residuo i+3. En consecuencia la cadena puede cambiar bruscamente de direccin. A menudo los
giros beta conectan hojas beta antiparalelas. Aminocidos como Asn, Gly y Pro, que se acomodan mal
en estructuras de tipo o , aparecen con frecuencia en este tipo de estructura. En una protena globular
los giros pueden incluir a casi un tercio de los residuos de la protena.
Giro-: separado por dos enlaces peptdicos
Giro-: separado por un enlace peptdico
Giro- : separado por cinco enlaces peptdicos
En algunos casos, los giros pueden ubicarse uno despus de otros formando regiones de giros mltiples.
Adems de los giros, existen regiones mas largas de conformacin no repetitiva denominas loops o bucles
(figura 10). Estos carecen de una estructura interna de puentes hidrgeno definida y por tanto poseen una mayor
movilidad. Los loops que conectan elementos de estructura secundarias son generalmente cortos (80% son menores
de 10 aminocidos de longitud). Sin embargo, los loops largos (mayor o igual a 10 residuos) suelen conectar
dominios diferentes en una misma protena (figura 10).

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Figura 10: presencia de un bucle en una protena mostrando la alta flexibilidad conformacional que presenta la regin (rojo).

Relacin estructura-funcin: la transicin T-R en la hemoglobina humana (practico_C.kin)
La hemoglobina (Hb) es la protena responsable de transportar oxgeno en la sangre desde los pulmones a los
tejidos. Para poder cumplir su funcin, la afinidad por oxgeno debe estar finamente regulada. Desde un punto de vista
estructural, esta regulacin esta mediada por la transicin entre dos estados principales, el "estado-T" (por tenso,
tambin conocido como no ligado o "desoxi"); y el "estado R" (por relajado, tambin llamado ligado a "oxgeno" u oxi).
En estos ejercicios guiados estudiaremos los cambios a nivel de estructura cuaternaria que ocurren durante esta
transicin T-R y su importancia en determinar las propiedades funcionales de la proteina, tales como el proceso
cooperativo de unin al oxgeno, la regulacin alostrica por pH y regulacin alostrica por aniones.
Organizacin estructural de la hemoglobina
La molcula de Hb presente en el adulto es un tetrmero de dos cadenas y dos cadenas (Figura 11). En
humanos contienen 141 y 146 residuos, respectivamente. Sus secuencias son diferentes, pero homlogas (comparten un
origen evolutivo comn), y comparten una estructura terciaria tipo todo hlice-. Cada subunidad est formada por 6
hlices principales y 2 hlices cortas que conforman el tipo de plegado conocido como globina. Las hlices se
denominan secuencialmente de la A a la H, que es el esquema de nombres tradicionales. Por ejemplo, la histidina
proximal (el residuo encargado de unir el Fe del grupo hemo a la protena) a menudo se llama His F9, ya que es el
residuo 9 de la hlice F. (En la cadena humana se corresponde con el residuo 87). Las hlices forman un manojo
aproximadamente cilndrico, con el grupo hemo y su tomo de Fe central ligado en un bolsillo hidrofbico entre las
hlices E y F.
Ambas cadenas y de la Hb se asemejan a la mioglobina (la protena fijadora de O
2
de cadena nica presente
en el msculo), tanto en la estructura terciaria en general como en el uso de un tomo de Fe en el centro de un grupo
hemo como el sitio donde el oxgeno se une reversiblemente. El hemo est rodeado de un bolsillo hidrofbico, lo cual es
necesario a fin de que el oxgeno se una de forma reversible sin producir oxidacin de la protena junto a otras
reacciones indeseables. De hecho, los residuos hidrofbicos rodean el sitio de unin tan estrechamente que para que el
O
2
pueda entrar o salir del mismo, es necesario que distintas partes de la protena se pongan en movimiento para permitir
el paso de la molcula de gas. En consecuencia las propiedades dinmicas son esenciales para que sea posible la unin a
O
2
y este proceso restrictivo tambin aumenta la especificidad de la unin del ligando.
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Figura 11: Estructura cuaternaria de la hemoglobina (izquierda). Detalle de una subunidad del plegado tipo
globina (derecha) donde se destaca el grupo hemo, la histidina proximal y distal.

A pesar que presenta similitudes a nivel de estructura terciaria con la mioglobina, ambas cumplen diferentes
funciones en el cuerpo. Mientras que la mioglobina presenta una fuerte afinidad por el oxigeno, sirviendo como deposito
del mismo en los msculos, la hemoglobina debe ser capaz de regular la afinidad por el oxigeno. De esta manera la
hemoglobina tiene una alta afinidad por el oxigeno en los pulmones, donde la concentracin de oxigeno es alta, y una
baja afinidad por el mismo en los tejidos, donde la concentracin es baja. La afinidad por el oxigeno no tan solo es
regulada por los niveles del mismo, sino tambin por factores adicionales. El secreto para entender como funciona a
nivel molecular este mecanismo de regulacin reside en la estructura cuaternaria de la hemoglobina.
En contraste con las protenas monomricas, tales como la mioglobina, las protenas multimricas pueden
exhibir alosterismo. La funcin de una protena alostrica es regulada por molculas (llamados efectores) que
interaccionan con la protena. En el caso de la hemoglobina, el oxigeno es a la vez un ligando y un efector.

Importancia de la transicin T-R
Los grupo hemos son los responsables de la unin al oxgeno. Pequeos cambios tanto en su conformacin como
en su entorno pueden modificar la afinidad de los mismos por el oxgeno. Los grupos hemo se encuentran muy distantes
unos de otros en la protena, de modo que las interacciones entre ellos deben estar mediadas por cambios en la estructura
proteica. As, las subunidades pueden encontrarse en un estado de baja afinidad por el oxigeno (no ligado o desoxi),
denominado estado-T (de "tensa"), ya que contiene interacciones estabilizantes extras entre las subunidades; o en un de
alta afinidad por el oxgeno denominado estado-R (de relajado) ya que las interacciones que se oponen a la unin del
oxgeno y estabilizan el tetrmero son algo ms dbiles. En algunos organismos esta diferencia es tan pronunciada que
sus molculas se disocian en dmeros de Hb en la forma oxigenada. La Hb humana ligada tambin se disocia cuando se
diluye, lo que plantea problemas en el uso de sustitutos de la sangre libre de clulas basadas en Hb porque la protena
disociada se excreta rpidamente.
Cabe destacar que la Hb no es un sistema puro de dos estados, pero la transicin de T a R proporciona la
explicacin ms importante, de primer nivel de su funcin. Para estudiar la transicin entre ambos estados, se llevar a
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cabo una comparacin entre las estructuras cristalinas de la desoxi-hemoglobina humana, que est en el estado-T sin
ligandos en el sitio de unin de O
2
, y la carbomonoxi-hemoglobina humana, que se encuentra en el estado-R y contiene
ligandos en los 4 sitios. Estas estructuras de Hb fueron las primeras resueltas con una resolucin bastante alta y se
estudiaron detalladamente (Baldwin & Chothia, 1979). Pueden encontrarse en el Protein Data Bank (PDB) bajo los
cdigos de acceso 3HHB y 1HCO.
El cambio entre los estados R y T requiere la interaccin de subunidades y no se produce en la mioglobina, o en
monmeros de cadena o aislados. Estos monmeros unen O
2
muy bien, lo cual sera til para cargar O
2
en los
pulmones, pero no permitira la liberacin para su entrega a los tejidos. Por lo tanto, la caracterstica central crtica de la
funcin de la hemoglobina es cmo logra, usa y controla alostricamente la cooperatividad entre los 4 sitios de unin en
el tetrmero para ajustar la unin de O
2
para satisfacer las necesidades fisiolgicas.

Cooperativismo en la unin a oxigeno
Las interacciones entre las subunidades y son crticas para la cooperatividad en la unin del oxgeno. En una
primera aproximacin, la molcula de hemoglobina se compone de dos "dmeros" (
1
-
1
y
2
-
2
) que giran uno en
relacin al otro como cuerpos rgidos en la transicin R-T. Al comparar la estructura de ambas molculas notaremos que
el dmero
1
-
1
sufre un reordenamiento interno relativamente pequeo, pero su rotacin total es considerable. La
rotacin neta de los dos dmeros altera las interacciones entre s, sobre todo en el sitio efector alostrico entre
1
y
2
y en
la interfase entre
1
-
2
donde las mutaciones tienen el mayor efecto sobre las propiedades alostricas de la Hb.
La relacin del sitio de unin a los cambios en la conformacin de protenas esta mediada por la unin del Fe en
el grupo hemo a la His proximal en la Helice F. La unin del O
2
al Fe resulta en cambios de estructura terciaria que
pueden entonces transmitir sus efectos a otras subunidades en el conjunto tetramrico (figura 12). Esto permite al O
2

unirse en una subunidad y afectar indirectamente la afinidad de otras subunidades. Los cambios en la interfaz de la
subunidad (junto con los cambios en el Fe) alteran el equilibrio entre las estructuras cuaternarias desoxi y oxi al tiempo
que un cambio de estructura cuaternaria altera la afinidad por ligando dentro de una subunidad dada. Cada O
2
que se une
aumenta la probabilidad de llevar el tetrmero al estado oxi, y una vez que sucede este cambio, la afinidad por el O
2
en
todos los sitios aumenta porque los cambios de estructura local ya han ocurrido o son ms fciles de llevar a cabo.
En la interfaz entre 1 y 2, las subunidades se desplazan una contra la otra entre el estado-T (desoxi) y el
estado-R (oxi). A pesar que la simetra no es exacta, hay partes similares de las subunidades que contactan entre s: la
hlice C, y el "codo FG" entre las hlices F y G. Dado que la transicin es un movimiento complejo orquestado entre el
encaje de dos conjuntos de contactos muy diferentes en los dos estados, esta interfaz es fundamental para hacer
funcionar el alosterismo en la Hb. Se demostr que las mutaciones de los residuos en esta interfaz tienen especial
influencia sobre la cooperatividad y el alosterismo.

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Figura 12: Alosterismo en la hemoglobina. El ligando, en este caso el O
2
, facilita la unin de ms molculas de ligando,
estabilizando alostricamente la estructura relajada de mayor afinidad por el mismo. El O
2
se une a la primera subunidad e induce un
cambio en la conformacin que se transmite a las otras subunidades de la protena. Imagen tomada de (Martinez, Jorge, 2012).

Regulacin por pH
Los puentes salinos que se establecen en las interfases entre las distintas subunidades juegan un rol importante
en la dependencia del pH de la unin de oxgeno, lo cual es conocido como el Efecto Bohr. Los puentes salinos entre
1

y
2
y en el extremo C-terminal de
2
estabilizan el estado-T (desoxi). La His 146 se titula a un pH muy cercano al
fisiolgico, por lo cual las interacciones establecidas por este residuo son muy sensibles al pH. A pH bajo, cuando ms
protones estn presentes, es ms probable encontrar protonado al N del anillo de His dndole una carga positiva,
reforzando la interaccin con Asp 94. Esto favorece el estado T, disminuyendo la afinidad por el O
2
.
Hay tambin una contribucin al Efecto Bohr debido a las cadenas laterales cargadas en la cavidad central del
tetrmero, donde por ejemplo la unin del anin que favorece el estado T es pH dependiente. El efecto del pH o efecto
Bohr, puede ser considerado como una regulacin alostrica por la unin de protones. Es importante biolgicamente,
porque promueve la descarga de oxgeno en los tejidos donde las concentraciones de protones son elevados debido, por
ejemplo, a la produccin de cido lctico en el msculo.

Regulacin por 2,3-BFG
La desoxi Hb presenta sitios de unin a fosfato en la cavidad central del tetrmero, los cuales estn ausentes en
la oxi Hb. En la oxi Hb, las subunidades se acercan entre si, expulsando los grupos fosfatos del 2,3-bisfosfoglicrato
(2,3 BFG), y permitiendo que los extremos N-y C-terminal interacten. El 2,3 BFG y otros fosfatos se unen mucho ms
fuertemente a la estructura cuaternaria desoxi, por lo que necesariamente desplazan el equilibrio hacia desoxi-Hb, y
16
debido a esto disminuyen la afinidad por O
2
. Estas molculas de fosfato de regulacin son tiles en la sangre, debido a
que sus concentraciones se pueden controlar para cambiar la curva de afinidad de la Hb por el O
2
a fin de que se trabaje
en la parte ms pronunciada y eficiente en las condiciones imperantes en los pulmones y los tejidos.

Bibliografia:
Baldwin, J., & Chothia, C. (1979). Haemoglobin: the structural changes related to ligand binding and its allosteric
mechanism. Journal of Molecular Biology, 129(2), 175220.
Koolman, J., & Rhm, K. H. (2004). Color Atlas of Biochemistry (2 Rev Enl.). Thieme.
Martinez, Jorge. (2012). el moderno prometeo: Protenas alostricas. Recuperado abril 17, 2012, a partir de
http://elmodernoprometeo.blogspot.com.ar/2011/10/proteinas-alostericas.html
Nelson, D. L., & Cox, M. M. (2004). Lehninger Principles of Biochemistry, Fourth Edition (4th ed.). W. H. Freeman.
Ni, M., Jirt, J., Koata, B., Jenkins, A., & McNaught, A. (Eds.). (2012). torsion angle. IUPAC Compendium of
Chemical Terminology (2.1.0 ed.). Research Triagle Park, NC: IUPAC. Recuperado a partir de
http://goldbook.iupac.org/T06406.html
Prevelige, P. E., Jr. (2011). New approaches for antiviral targeting of HIV assembly. Journal of Molecular Biology,
410(4), 634640. doi:10.1016/j.jmb.2011.03.074