Dr. Whasley Ferreira Duarte (UFLA) - Planejamento Experimental em Microbiologia - Aula

PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL
EM MICROBIOLOGIA
Prof Dr Whasley Ferreira Duarte Prof. Dr. Whasley Ferreira Duarte
Lavras, maio de 2012
1
SUMRIO
Planejamento experimental
Definio de bioestatstica
O que so as tcnicas de planejamento e otimizao?
Objetivos do uso das tcnicas de planejamento e otimizao em
microbiologia
P ti i i t i bi l i ? Por que otimizar experimentos na microbiologia?
Etapas da otimizao de experimentos em microbiologia
Principais tcnicas utilizadas na otimizao em microbiologia Principais tcnicas utilizadas na otimizao em microbiologia
Uso do Delineamento Composto Central e Plackett-Burman
Programas computacionais Programas computacionais
Exemplo
Bibliografia Bibliografia

<0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38

<0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
2
EXPERIMENTO PLANEJADO
??????? ???????
...alteraes em variveis de modo que seja
possvel observar as mudanas na varivel
resposta...
COMO
PLANEJAR?
This manuscript presents
interesting information.
However despite several novel
PLANEJAR?
However, despite several novel
data, manuscript is diluted and
contains too much
non-interesting data
Objetivo (s)...
V i i i d f i Variveis: quais podero exercer efeito...
Caracterizao do problema. Caracterizao do problema.
Faixa de trabalho: nveis de cada varivel Faixa de trabalho: nveis de cada varivel...
Estatstica: tcnica que melhor se adequada...
Variveis resposta ?
Conduo do experimento... Conduo do experimento...
A li d d d Anlise dos dados...
Objetivo (s)...
EXPERIMENTO PLANEJADO = ...
Resultados
We are pleased to inform
you that your manuscript,
has been accepted for p
publication in the Journal
of...
OBJETIVOS
Concluses
BIOESTATSTICA
A bioestatstica a aplicao da estatstica ao
campo biolgico.
Planejamento Planejamento
Execuo Interpretao
Bioestatstica
Coleta dos
dados
Avaliao
7
TENDNCIAS
Anlise Multivariada: utilizao de simultnea
TENDNCIAS
Anlise Multivariada: utilizao de simultnea
de todas as variveis na interpretao terica
do dados obtidos do dados obtidos
Anlise de Componentes Principais:
verificao de como amostras se relacionam.
Tcnicas de Planejamentos Experimentais
8
TENDNCIAS - MICROBIOLOGIA
9
TENDNCIAS - MICROBIOLOGIA
T t Temperatura
pH Fungos
Microbiologia Inoculo Bactrias
Carbono
Nitrognio
Fsforo
10
PLANEJAMENTO E
OTIMIZAO DE EXPERIMENTOS OTIMIZAO DE EXPERIMENTOS
11
Varivel dependente / independente
O Variveis independentes (fatores): aquelas cujos
efeitos sero estudados.
O Variveis dependentes: aquelas utilizadas como p q
resposta.
12
O QUE SO AS TCNICAS DE
OTIMIZAO? OTIMIZAO?
* Tcnicas estatsticas que * Tcnicas estatsticas que
fornecem informaes seguras
com a realizao de um nmero com a realizao de um nmero
reduzido de ensaios experimentais

<0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38

<0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
13
O QUE SO AS TCNICAS DE
OTIMIZAO?
1 fator por vez
OTIMIZAO?
Otimizao 1 fator por vez Otimizao

<0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
14
VANTAGENS DA OTIMIZAO
Reduo do n de experimentos / qualidade eduo do de e pe e tos / qua dade
resultados
Anlise simultnea dos fatores
Vrias respostas ao mesmo tempo
Cl l d i l Clculo do erro experimental
C h i t d fi i l Conhecimento do profissional

<0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
15
VANTAGENS DA OTIMIZAO
800
1000
400
600
800
r
t
i
g
o
s
0
200
400
N

a
r
0
Perodo
Fonte: FSTA
16 <0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
Fonte: FSTA
OBJETIVO DOS USO DAS TCNICAS DE
OTIMIZAO
Minimizar: tempo e custo
Maximizar: rendimento, produtividade, qualidade
Confiabilidade dos resultados

<0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
17
PORQUE OTIMIZAR EM
MICROBIOLOGIA? MICROBIOLOGIA?
Grande n de variveis
Adequao s tendncias (Ex. consumidor)
Robustez das respostas Robustez das respostas
Aplicao para tcnicas analticas (Ex. HPLC)
Rendimento / custo / qualidade

<0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
18
ETAPAS DO PROCESSO DE OTIMIZAO
Variveis
independentes
(fatores)
Delineamento
experimental
Experimento
(validao)
(triagem ou no)
(validao)
Clculos
Experimento
Variveis
dependentes

<0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
19
ETAPAS DO PROCESSO DE OTIMIZAO
Definir objetivos
Considerar todas as variveis independentes
Reali ar os e perimentos Realizar os experimentos
Clculos
Elaborar os modelos das respostas
ANAVA para verificar ajuste do modelo
S f i d t Superfcie de resposta
Validar os resultados experimentais
20 <0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
PRINCIPAIS TCNICAS UTILIZADAS PARA
OTIMIZAR EXPERIMENTOS EM MICROBIOLOGIA OTIMIZAR EXPERIMENTOS EM MICROBIOLOGIA
O Experimento em uma etapa: Delineamento
Composto Central (DCC) e Fatorial Completo
O Experimentos sequenciais: Plackett-Burman e p q
Fatoriais Fracionados

<0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
21
USO DO DELINEAMENTO COMPOSTO CENTRAL
ROTACIONAL (DCCR) ROTACIONAL (DCCR)
Ef i d dif d li Efeito de 5 diferentes concentraes de glicose,
Extrato de levedura e NaCl no cultivo de Lentinus
edodes edodes
3 Fatores em 5 nveis
T d bi ( t i ) 5 5 5 125 i Todas as combinaes (matriz) 5 x 5 x 5 = 125 ensaios
Delineamento Composto Central 17 ensaios
Fonte: Biochemical Engineering Journal, 2010
22
ROTACIONAL (DCCR)
Valores codificados: +1 e 1
ROTACIONAL (DCCR)
Valores codificados: +1 e -1
Fatores Valorescodificados
1 +1
e
d
u
r
a
1 +1
Glicose(g/L) 10 30
NaCl(g/L) 1 2
Extratolevedura(g/L) 2 6
Pontos fatoriais 2
n
t
r
a
t
o

l
e
v
e
Pontos fatoriais 2
2
3
= 8 ensaios
Glicose
E
x
t
2 8 ensaios

<0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38

<0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
23
Pontos axiais 2 x n = 6
8 pontos fatoriais + 6
pontos axiais = 14 ensaios

<0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
24
(2
n
)
1/4
= (2
n
)
1/4
N 2 3 4 5 6
1,41 1,68 2,00 2,37 2,82

<0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
25
Pontos centrais 3
Nmero total de ensaios = Nmero total de ensaios
pontos fatoriais + axiais + central
8 + 6 + 3 = 17
3 Fatores: extrato levedura NaCl e 3 Fatores: extrato levedura, NaCl e
glicose
5 nveis: -1,68, -1, 0, 1 e 1,68

<0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
26
ROTACIONAL (DCCR)
Ensaios
Glicose
(g/L) NaCl (g/L)
Extrato
levedura(g/L)
Crescimento
micelial (g/L)
ROTACIONAL (DCCR)
1 0 0 0
2 0 0 1,68
3 1 1 1
4 1 68 0 0 4 1,68 0 0
5 1 1 1
6 1 1 1
7 0 0 0
8 1 1 1
9 1 1 1
10 1 1 1
11 0 1 68 0
17 ensaios
11 0 1,68 0
12 1 1 1
13 1 1 1
14 1,68 0 0
15 0 0 0
16 0 0 1,68
17 0 1,68 0

<0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
27
ROTACIONAL (DCCR)
Glicose NaCl
Extrato
levedura
Crescimento
micelial (g/L)
ROTACIONAL (DCCR)
Ensaios
Glicose
(g/L)
NaCl
(g/L)
levedura
(g/L)
micelial (g/L)
L.edodes
1 0(20) 0(1,5) 0(4,0) 3,32
2 0 (20) 0 (1 5) 1 68 (7 3) 3 07 2 0(20) 0(1,5) 1,68(7,3) 3,07
3 1(10) 1(2,0) 1(6,0) 3,28
4 1,68(3,2) 0(1,5) 0(4,0) 3,08
5 1(30) 1(1,0) 1(6,0) 3,44
6 1(30) 1(2,0) 1(2,0) 1,51
7 0(20) 0 (1,5) 0(4,0) 3,54
8 1(10) 1(1,0) 1(2,0) 3,46
9 1(30) 1 (1 0) 1 (2 0) 3 43 9 1(30) 1(1,0) 1 (2,0) 3,43
10 1(30) 1(2,0) 1(6,0) 3,58
11 0(20) 1,68(2,3) 0(4,0) 3,32
12 1(10) 1(1,0) 1(6,0) 1,91 ( ) ( , ) ( , ) ,
13 1(30) 1(2,0) 1(2,0) 3,07
14 1,68(36,8) 0(1,5) 0(4,0) 3,40
15 0(20) 0(1,5) 0(4,0) 3,53
( ) ( ) ( ) 16 0(20) 0(1,5) 1,68(0,64) 3,32
17 0(20) 1,68(0,66) 0(4,0) 3,44
28
d
e
s
(
g
/
L
)
s
a

L
.

e
d
o
d
B
i
o
m
a
s
s

<0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
29
d
e
s
(
g
/
L
)
s
a

L
.

e
d
o
d
B
i
o
m
a
s
s

<0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
30
d
e
s
(
g
/
L
)
s
a

L
.

e
d
o
d
B
i
o
m
a
s
s

<0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
31
Modelo pvalor R
2
Linear 0,04 0,90
Quadrtico 0,03 0,97
Cbico 0,21 0,96
Y = ax
2
+ bx + c
Produo mxima (otimizada) de biomassa de L. edodes = 3,56 g/L
Glicose = 15 0 g/L Glicose = 15,0 g/L
NaCl = 0,5 g/L
Extrato levedura = 5 5 g/L Extrato levedura = 5,5 g/L
32
s
s

p
r
e
d
i
t
o
V
a
l
o
r
e
s
Valores reais
33 <0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
(DCCR) (DCCR)
Validao
V l dit bi d L d d 3 56 /L Valor predito para biomassa de L. edodes = 3,56 g/L
Ensaio: Glicose = 15,0 g/L
NaCl = 0,5 g/L
Extrato levedura = 5,5 g/L
Valor obtido para biomassa de L. edodes = 3,65 g/L
34 <0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
FACE CENTRADA (DCCF) FACE CENTRADA (DCCF)
= 1 = (2
n
)
1/4
35
FACE CENTRADA (DCCF)
Ex.: Avaliar efeito da temperatura e concentrao de
slidos solveis totais (Brix) na produo de compostos
slidos solveis totais (Brix) na produo de compostos
volteis por Saccharomyces cerevisiae na fermentao
da polpa de jabuticaba.
O Variveis independentes: brix e temperatura
O V i l d d t t lt i O Varivel dependente: composto volteis
O Nmero de ensaios: 12
O Design do experimento: DCCF O Design do experimento: DCCF
O Pontos centrais: 6
O Anlise dos dados: O Anlise dos dados:
O Otimizao:
O Validao:
36
O Validao:
Fonte: J ournal of Food Science, 2011
Ensaios Brix Temperatura Compostovolteis(mg/L)
1 0 0 738,60
2 0 0 717,26
3 1 1 579,43
4 0 1 878,77
5 1 1 1033,55
6 1 1 1005,63
7 1 0 777,50
8 0 0 727,85
9 0 0 774 54 9 0 0 774,54
10 0 0 741,19
11 1 0 780,34
12 1 1 454,68
13 0 0 751,88
14 0 1 421,59
37 <0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
Y =732 34 16 61*Temp+243 70*Brix+38 16*Temp*Brix+75 19*Temp
2
53 53*Brix
2
Y = 732.34 -16.61 Temp+243.70 Brix+38.16 Temp Brix+75.19 Temp
2
-53.53 Brix
2
38 <0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
O Oti i ?
O Otimizao?
Concentrao estimada: 976 mg/L
? Condies timas: ?
T t 1 (20 C) Temperatura: -1 (20 C)
Brix: +1 (22 Brix) Brix: 1 (22 Brix)
39
O Validao:
Temperatura: -1 (20 C)
Brix: +1 (22 Brix)
C di ti Condies timas:
964 mg/L 964 mg/L
40
FATORIAIS FRACIONADOS E PLACKETT & BURMAN
Grande n experimentos: 5 fatores
Composto Central = 45 ensaios
Fatorial completo = 3125 ensaios
O Fatorial fracionado O Fatorial fracionado
O Plackett & Burman
Triagem

<0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
41
Grande n experimentos 5 ou mais fatores
O Fatorial fracionado
F d i t Frao do experimento
Ex.: 8 fatores 2
8-4
= 2
4
= 16 ensaios
2
8-5
= 2
3
= 8 ensaios (no vivel) 2
8-5
= 2
3
= 8 ensaios (no vivel)
O Plackett & Burman acima de 8 fatores O Plackett & Burman acima de 8 fatores
Ensaios mltiplos de 4 p
Sempre: fatores + 4 ensaios (mnimo)
Ex.: 8 fatores 12 ensaios

<0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
42
Analisar 11 fatores = 2048 ensaios
Fatorial fracionado 2
11-7
16 experimentos
43 <0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
Plackett-Burman analisar 11 fatores
16 experimentos
44 <0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
PLACKETT & BURMAN
Plackett-Burman analisar 11 fatores
Ensaios pH Inculo Temperatura Glicose ExtratoLevedura Peptona K
2
HPO
4
MgSO
4
CaCl
2
CuSO
4
MnSO
4
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
4 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
7 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
8 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
10 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
12 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
13 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
14 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
16 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
45
<0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
FATORIAIS FRACIONADOS
Fatorial Francionado 2
11-6
analisar 11 fatores = 32 ensaios
Ensaios pH Inculo Temperatura Glicose ExtratoLevedura Peptona K
2
HPO
4
MgSO
4
CaCl
2
CuSO
4
MnSO
4
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
4 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
7 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
8 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
10 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
12 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
13 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
14 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
16 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
46
<0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
FATORIAIS FRACIONADOS
Fatorial Francionado 2
11-6
analisar 11 fatores = 32 ensaios
Ensaios pH Inculo
Temperat
ura Glicose ExtratoLevedura Peptona K
2
HPO
4
MgSO
4
CaCl
2
CuSO
4
MnSO
4
17 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
18 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
19 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
20 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
21 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
22 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 22 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
23 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
24 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
25 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
26 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
27 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
28 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
29 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
30 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
31 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
32 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
47
<0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
Fator pvalor
pH 0,44
Inculo 0,03
T t 0 21 Temperatura 0,21
Glicose 0,02
ExtratoLevedura 0,81
Peptona 0,31
K2HPO4 0,25
M SO4 0 01 MgSO4 0,01
CaCl2 0,92
CuSO4 0,37
MnSO4 0,15
48
<0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
DELINEAMENTO COMPOSTO CENTRAL
2 fatores com efeito significativo
11 ensaios
Ensaios
Glicose
(g/L)
Inculo
(g/L) Etanol(g/L)
1 1 1
2 1,41 0
3 0 0
4 0 1 41
Glicose: 10 e 20 g/L
4 0 1,41
5 1,41 0
6 1 1
7 1 1
Inculo: 2 e 4%
7 1 1
8 1 1
9 0 0
10 0 0
11 0 1,41
49
<0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
(
g
/
L
)
E
t
a
n
o
l

(
50
<0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
Modelo pvalor R
2
Linear 0,04 0,90
Y = ax + b
Produo mxima (otimizada) de etanol (g/L)
Glicose = 18 0 g/L Glicose = 18,0 g/L
Inculo = 3,5 %
51
<0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
PROGRAMAS COMPUTACIONAIS
Gratuitos ou pagos
Especficos
Abrangentes Abrangentes
Facilidade de uso
52
<0,5
<0,48
<0,46
<0,44
<0,42
<0,4
<0,38
53
54
55
Design Experts Plackett-Burman
56
Design Experts Fatoriais Fracionados
57
EXEMPLO
Objetivo: otimizar degradao de fenol por Candida j g p
tropicalis
58
VARIVEIS ? VARIVEIS ?
9 variveis procedimento mais adequado?
59
60
CONSIDERAES FINAIS
Experimentos em Microbiologia: efeitos de muitos
fatores
Ganho de tempo, produtividade, qualidade p , p , q
Nmero reduzido de experimentos
T i d ti i Tcnicas de otimizao.
61
BIBLIOGRAFIA BSICA RECOMENDADA BIBLIOGRAFIA BSICA RECOMENDADA
- Rodrigues, M.I. & Rodrigues, A.F.L. Planejamento de experimentos e otimizao g , & g , j p
de processos. Ed. Campinas, SP: Casa do Esprito, Amigo, Fraternidade, F e
Amor, 2009.
C l d V &M t DC Pl j t d i t d - Calado, V. & Montgomery, D.C. Planejamento de experimentos usando o
Statistica. Ed. e-Papers, RJ , 2005.
- Filho, P.F. Introduo ao planejamento e anlise estatstica de experimentos. , p j p
Apostila. Disponvel em:
http://www.ufscar.br/~des/docente/fogo/IPAEE/Arquivos/Capitulo_1.pdf . Acesso
em 23 de junho de 2011.
- Montgomery, D.C. Design and Analysis of Experiments. Ed. J onh Wiley & Sons,
New York, 2001.
- Nwabueze, T.U. Basic steps in adapting response surface methodology as
mathematical modelling for bioprocess optimisation in the food systems.
International J ournal of Food Science & Technology, n. 45, p. 1768-1776, 2010.
62

Dr. Whasley Ferreira Duarte (UFLA) - Planejamento Experimental em Microbiologia - Aula

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