MICROBIOLOG

A

INTEGRANTES:
INGARUCA LAZO, Katherine
LAZO CRDENAS, Mishel
ORDOEZ BALDE!N,
Ga"riela
#ALACIOS GALINDO, C$sar
#ERALES %ILC&EZ, 'ean
RA#RE ROSALES, '(ssel)n
TAI#E CONDORI Dennis
AISLAMIENTO Y
SELECCIN PRIMARIA
DE BACTERIAS
PRODUCTORAS DE
Docente: JOS CARLOS
AZABACHE ASMAT
I. OBJETIVOS
Aislar bacterias productoras de amilasas a partir de muestras de tierra.
II. MARCO TEORICO
Las amilasas son enzimas etracelulares !ue "idrolizan el almid#n$ %
!ue puede ser producido por di&erentes microor'anismos$ entre ellos las
bacterias % "on'os. Estas enzimas tienen di&erentes aplicaciones en la
industria$ se utilizan para modi&icar las caracter(sticas de almidones
naturales$ es asi$ !ue en panader(a % moliner(a se usa para la reducci#n
de la )iscosidad de las pastas$ aceleraci#n del proceso de &ermentaci#n$
incremento del )olumen de pan$ me*oramiento de la mi'a % tetura$
mantenimiento de &rescura % sua)idad$ me*oramiento de la tetura de las
pastas$ reducci#n de tiempo de mezclado$ incremento del )olumen de
masa+ en cer)ecer(a$ para el proceso de malteado+ cereales$
alimentaci#n con pre cocidos para in&antes$ alimentos instant,neos+
c"ocolate % cocoa$ para la manu&actura de *arabes+ en industria
alimentaria para la producci#n de edulcorantes.
Actualmente en nuestro medio$ no se "an pro&undizado estudios de
producci#n de amilasa$ utilizando bacterias sil)estres % sustratos de
ori'en a'r(cola con alto contenido de almid#n. Este polisac,rido es ideal
para la inducci#n de las permeasas !ue "idrolizan el almid#n en
productos como detrinas$ maltosa % 'lucosa$ !ue lue'o de "idrolizarlos
"asta monosac,ridos$ apro)ec"ados por las bacterias para su
metabolismo$ la epresi#n de la enzima amilasa ecedente$ !ueda en el
medio &ermentado !ue puede ser recuperada posteriormente.
Las enzimas son sustancias or',nicas elaboradas por las c-lulas )i)as
capaces de desencadenar % de re'ular reacciones !u(micas especi&icas
en el interior o en el eterior de las c-lulas )i)as sin eperimentar
modi&icaciones en su propia estructura !u(mica.
Los microor'anismos como las bacterias producen enzimas$ !ue pueden
ser amilasas etracelulares. Como por e*emplo de amilasa bacteriana$
se pueden citar. las al&a amilasas /obtenidas &undamentalmente
deBacillus subtilis0 son enzimas !ue licuan el almid#n % !ue se utilizan
para la producci#n de ad"esi)os o de recubrimientos a base de almid#n
para papeles $ en panader(a o en otras industrias alimentarias o para la
obtenci#n de productos de desencolado en la industria tetil.
Los microbios productores de enzimas pueden encontrarse en di)ersos
ambientes. en ambientes marinos por e*emplo $ se "an "ec"o
b1s!uedas % aislamientos de cepas de bacterias nati)as productoras de
sustancias bioacti)as $ como el de las amilasas etracelulares . Estas
enzimas en el sector industrial tienen un desarrollo !ue se "a producido
en &orma eplosi)a en los 1ltimos a2os. Las amilasas se emplean como
aditi)os en la industria alimentaria.
En el aislamiento de bacterias productoras de amilasas etracelulares se
utiliza el m-todo de &ormaci#n de macro colonias. Es necesaria un medio
base al cual se le incorpora el sustrato correspondiente a una
concentraci#n determinada. La acti)idad enzim,tica de las cepas sobre
los sustratos en prueba se determina por la presencia % tama2o de la
zona de "idr#lisis alrededor de las macro colonias.
2.1. Enzima amilasa: Accin y clasificacin
Las amilasas son enzimas las cuales "idrolizan mol-culas de almid#n
dando como productos detrinas % pol(meros compuestos
pro'resi)amente por unidades de 'lucosa Esta &amilia de enzimas
"idrol(ticas esta compuesta por a prote(nas catal(ticas. al&a3amilasa$
beta3amilasa+ 'lucoamilasa+ isoamilasa. Se encuentran ampliamente
distribuidas en te*idos )e'etales$ donde *ue'an un rol mu% importante en
la de'radaci#n del almid#n en la 'erminaci#n de las semillas+ en te*idos
animales$ cumpliendo una misi#n di'esti)a+ % en di)ersas especies de
microor'anismos como "on'os % bacterias .
Como bien es conocido las cadenas de almid#n est,n compuestas por
dos 'randes sub3cadenas$ amilosa % amilopectina. La al&a3amilasa se
caracteriza por atacar los enlaces 4$53al&a3'licos(dicos en el centro de la
cadena de los polisac,ridos$ por lo !ue se la conoce como endoamilasa$
produciendo 'lucosa$ maltosa % oli'osac,ridos.
La enzima al&a3amilasa en su accionar de'rada la amilosa en maltosa
% pe!ue2os compuestos de 'lucosa. Sin embar'o$ esta enzima solo es
capaz de de'radar parcialmente la amilopectina % el 'luc#'eno debido a
!ue no es capaz de desdoblar los enlaces 'licosidicos436 encontrados
en los puntos de rami&icaci#n de la cadena del polisac,rido. 7or otro
lado$ La beta3amilasa$ presente en plantas % bacterias$ tambi-n cumple
la &unci#n de de'radar los enlaces 4$53a3'lucos(dicos pero comienza su
acci#n por el etremo libre no reductor del almid#n$ liberando maltosa al
i'ual !ue la enzima al&a3amilasa. La "idr#lisis se detiene en los puntos
de rami&icaci#n de la amilopectina % el residuo se conoce como detrina
l(mite. La pululanasa o isoamilasa$ tambi-n perteneciente a la esta
&amilia$ "idroliza los enlaces 4$63al&a3'licos(dicos !uitando las ramas de
la amilopectina o las detrinas. Si eiste un acompa2amiento 'eneral del
comple*o de las amilasas se puede lo'rar e&ecti)a una de'radaci#n total
del almid#n.
En cuanto a la nomenclatura de las enzimas de la &amilia amilasa$
mundialmente se reconoce a la comisi#n enzimolo'ica /E.C.0 !uien es el
encar'ado de identi&icar a todas % cada una de las enzimas eistentes.
Este instituto reconoce la enzima al&a3Amilasa como E.C. 8.9.4.4. Su
nombre sistem,tico es al&a34$53'lucan353'lucano"idrolasa. Otros
nombres comunes en el comercio % el ,mbito cient(&ico son 'luco'enasa
% endoamilasa. Estas se caracterizan en lle)ar a cabo la reacci#n de
endo"idr#lisis !ue se sit1a de los enlaces 4$53al&a3:3'lucosidicos en
polisac,ridos !ue contienen 8 o m,s enlaces 4$53al&a3:3'lucosidicos.
Los 'rupos reducidos son liberados en una con&i'uraci#n al&a. Este
termino al&a$ esta relacionado con la con&i'uraci#n anom-rica inicial de
los 'rupos de azucares liberados .
;3amilasa bacteriana /EC 8.9.4.40. La ;3amilasa "idroliza el enlace
'lucos(dicos interno dando lu'ar a productos de ba*o peso molecular$
solubles % menos )iscosos$ cu%a ruptura est, limitada por la presencia
de los enlaces 'lucos(dicos a3436 en los puntos de rami&icaci#n de la
mol-cula del almid#n nati)o /amilopectina0. Los productos de "idr#lisis
tienen con&i'uraci#n a en la 'lucosa del etremo reductor. Se piensa !ue
la enzima act1a por la acci#n combinada de los 'rupos carboilo e
"istidina del centro acti)o. Las a3amilasas obtenidas de Bacillus subtilis
)ar am%ioli!(tedaciens tienen un ion calcio &uertemente li<'ado por
mol-cula$ !ue es necesario para la acti)idad de= enzima % !ue lo
esta<biliza en 'ran medida &rente a= calentamiento. Se utiliza como
enzima soluble en tratamientos de dos "oras a >? @C % pA ?$?3B como
una alternati)a a la utili<zaci#n de ,cido clor"(drico !ue produce
ecesi)os compuestos coloreados % la &ormaci#n de productos de
re)ersi#n. :ebido a !ue los almidones de patata % de cereales cerosos
no pueden tratarse por 'elatinizaci#n$ se les somete a un pro<ceso en
dos etapas$ en el !ue se a2ade una se'unda dosis de enzima % se
conti<n1a et tratamiento "asta lo'rar el contenido deseado de 'lucosa .
La enzima Beta3amilasa es reconocida en la comisi#n enzimol#'ica
como E.C. 8.9.4.9.$ su nombre sistem,tico corresponde al de 4$53al&a3:3
'lucan malto"idrolasa. Su &unci#n es actuar en la reacci#n de "idr#lisis
de los enlaces al&a34$53'lucosidicos del almid#n con in)ersi#n en la
con&i'uraci#n del carbono 4 pas,ndolo de la con&i'uraci#n al&a a la beta+
as( como de remo)er las unidades de maltosa continuas presentes en
los terminales no3reductores de la cadena polisac,rida. Los 'rupos
sul&i"idrilos son esenciales para la acti)idad$ por lo !ue la enzima se
inacti)a por oidaci#n$ por los metales pesados % sus sales. . Su
producto es beta3maltosa.
Beta3amilasa "a sido descrita como una prote(na abundante la cual se
puede encontrar en 'randes cantidades tanto en te*idos de
almacenamiento de almid#n % #r'anos de plantas . Muc"os Cereales
contienen tambi-n la enzima beta3amilasa % al&a3amilasa aun!ue esta
ultima en concentraciones menores$ tan solo ocupa aproimadamente
8CD de contenido total de prote(nas sintetizadas durante la 'erminaci#n.
Estas dos amilasas pueden ser distin'uidas una de otra$ mediante el
punto de inacti)aci#n !ue presentan a un pA determinado. La enzima
al&a3amilasa es inacti)ada a un pA en el ran'o de 5.> 3 ?.C. Mientras !ue
a este mismo ran'o la beta3amilasa es estable. La enzima E.C. 8.9.4.9.$
es inacti)ada en un pA alrededor de 6.C3B.C$ % en caso reciproco las
al&a3amilasa son estables ba*o estas condiciones .
Otra enzima perteneciente a esta peculiar &amilia es la Elucoamilasa
tambi-n reconocida como amilo'lucosidasa. En la nomenclatura
internacional esta identi&icada como E.C.8.9.4.8.$ % su nombre
sistem,tico es 4$53al&a3:3'lucano 'luco"idrolasa. Su &unci#n es actuar
en la reacci#n de "idr#lisis en cadenas de polisac,ridos operando en los
enlaces 4$53al&a3:3'lucosa !ue est,n de manera residual despu-s de
"aberse epuesto la cadena a la acci#n de al&a % beta amilasa . El
principal producto &inal de la acci#n de la 'lucoamilasa sobre el almid#n
es 'lucosa$ lo !ue la di&erencia claramente de la al&a % beta amilasas. La
enzima tambi-n produce pe!ue2as cantidades de oli'osac,ridos. La
sacari&icaci#n del almid#n puede alcanzar "asta F6D de detrosa. La
acci#n de la enzima causa in)ersi#n de la con&i'uraci#n$ produciendo
beta3'lucosa. Las 'lucoamilasas son inacti)as sobre almid#n nati)o.
III. MATERIALES G 7ROCE:IMIEHTO
a. MATERIALES.
Muestra.
Tierra de culti)o
Medio de culti)o.
A'ar Almid#n Etracto de Le)adura
Reacti)os$ colorantes % soluciones.
A'ua destilada est-ril
Alco"ol %odado
Almid#n
Soluci#n de lu'ol
Set de coloraci#n ERAM
Soluci#n salina &isiol#'ica
Materiales de )idrio
Asa :ri'lasI%
Ba'uetas
BeaIer ?CC Ml
L,minas porta ob*etos
7ipetas de 4C mL % 4 mL
7lacas 7etri
E!uipos.
Estu&a
Microscopio.
Otros.
Asa bacteriol#'ica$ Al'od#n$ Balanza$ Colador$ Eradillas$
7lum#n indeleble.
b. 7ROCE:IMIEHTO.
Pre enriquecimiento
Recolectamos adecuadamente las muestras del suelo
Colocamos en bolsas de polietileno de primer uso
Transportamos al laboratorio
Adicionamos almid#n$ c,scaras de tub-rculos$ ra(ces u otros
desec"os !ue conten'an almid#n
Remo)emos % "umedecimos diariamente por 6 d(as.
Preparacin de las muestras de tierra
Cumplido el tiempo de pre enri!uecimiento$ "omo'enizamos la
muestra adecuadamente
Retiramos las part(culas 'ruesas$ como ramas$ piedras$ etc.
Tamizamos con la a%uda de un colador
7esamos 4C ' de suelo % colocamos en un beacIer conteniendo
FC mL de a'ua destilada. Aomo'enizamos
Calentamos la muestra a >?@C
Aacemos diluciones decimales en a'ua destilada est-ril.
Cultivo
Sembramos C$4 mL de las tres 1ltimas diluciones$ de la muestra
sometida a tratamiento t-rmico$ en placas conteniendo a'ar
almid#n
Incubamos a 8C@C durante 95 a 5> "oras.
IV. RESJLTA:OS
4. :iluci#n a
10
2
9. :iluci#n a
10
3
8. :iluci#n a
10
4
A partir de la diluci#n
10
2
de las
muestras de suelo$ se obser)a
abundantes colonias de bacterias$ no
est,n mu% ale*adas.
Colonias de color blanco$ cremosas
Con bordes lisos o irre'ulares.
Colonias ple'adas
Cantidad de colonias. 9F
JKC . L 8 M
10
1

Se obser)a producci#n de amilasa /6
A partir de la diluci#n
10
3
de las muestras
de suelo$ se obser)a mu% pocas colonias de
bacterias !ue est,n mu% ale*adas.
Colonias de color blanco$ cremosas
Con bordes lisos o irre'ulares.
Colonias ple'adas
Cantidad de colonias. 4>
JKC . L 9 M
10
1

Ho se obser)a producci#n de amilasa
A partir de la diluci#n
10
4
de las
muestras de suelo$ se obser)a mu% pocas
colonias de bacterias !ue est,n ale*adas.
Colonias de color blanco$ cremosas
Con bordes lisos o irre'ulares.
Colonias ple'adas
Cantidad de colonias. 95
JKC . L 9 M
10
1
Se obser)a producci#n de amilasa /8
manc"as blancas0
5. :iluci#n a
10
5
V. :ISCJSINH :E RESJLTA:OS.
Al sembrar 4CCOl diluciones de "asta 4.4CCCCC de la muestra de
suelo en las placas se obtu)o crecimiento masi)o en la placa
/4.4CC0 con tan solo 95 "oras de incubaci#n$ pero en estas
muestras la presencia de JKC es in&erior a 5 4C6'.7or otro lado$
se pudo comprobar la presencia de las bacterias con acti)idad
amilasa en la tierra. Tambi-n podemos notar !ue al realizar una
siembra pro&unda es m,s probable obtener JKC$ pues puede
darse una separaci#n de c-lulas bacterianas % la muerte de
ciertas bacterias sensibles al calor.
Al sembrar las bacterias de amilasas aisladas en 5 placas de
a'ar almid#n$ se pudo notar !ue en 9 de ellas se dio la p-rdida de
acti)idad enzim,tica$ este &en#meno pudo "aberse dado por
contaminaci#n o por desacti)aci#n del sistema !ue desencadena
la producci#n de enzima. La desacti)aci#n se pudo producir por la
presencia de &uentes de carbono de menor tama2o !ue el
almid#n en el medio$ "aciendo innecesaria la producci#n de
amilasas. Esto concuerda con la in)esti'aci#n realizada por
:"arani en 9CC5$ en la !ue establece !ue la producci#n de
amilasas depende de la naturaleza de la &uente de carbono$
siendo la me*or el almid#n.
VI. COHCLJSIOHES
?. La amilasa es una enzima !ue "idroliza al almid#n !ue tiene
m1ltiple aplicaciones$ esta enzima tiene tres tipos al&a$ beta %
ome'a$ obteni-ndose a partir de &uentes animales$ )e'etales %
microbianas+ teniendo como &uente m,s usada para el aislamiento
de bacterias productoras de amilasa al suelo$ para nuestro
A partir de la diluci#n
10
5
de las muestras
de suelo$ se obser)a pocas colonias de
bacterias !ue est,n mu% ale*adas.
Colonias de color blanco$ cremosas
Con bordes lisos o irre'ulares.
Colonias ple'adas
Cantidad de colonias. 94
JKC . L 9 M
10
1
Ho se obser)a producci#n de amilasa
an,lisis utilizamos tierra de suelo enri!uecida con almid#n$ !ue
nos permiti# obser)ar "ab(a bacterias !ue produzcan amilasa$ %
elencontrando como resultado positi)o en dos placas en diluci#n
a
10
2
% en diluci#n
10
4
$ pero con ma%or presencia en la de
10
2
.
Obser)amos la producci#n de amilasa solo en dos placas 7etri
con un crecimiento de manc"as blancas &orm,ndose colonias
bacterianas$ pero notamos !ue en dos placas no "a% producci#n
de amilasa %a !ue no se presenci# nin'una acti)idad$ esto debido
a contaminaci#n o por desacti)aci#n del sistema !ue
desencadena la producci#n de enzima.

En las si'uientes colonias obser)amos un color blanco cremoso
con bordes lisos % ple'adas &orm,ndose as( numerosas colonias
en las di&erentes placas unas ale*as entre si % otras no tanto.
VII. CJESTIOHARIO
1. Finalidad de aislar productoras de amilasa
Tiene el &in de optimizar procesos % con)ertirlos en bioprocesos
/proceso !ue usa c-lulas )i)as completas o sus componentes para
obtener los cambios &(sicos o !u(micos deseados en la industria0
La amilasa es la enzima m,s estudiada en este campo debido a su
in&luencia directa en la de'radaci#n del almid#n uno de los productos
alimentarios m,s eplotados a ni)el mundial.
2. Por qu se calienta la muestra a !"# C$
:ebido a !ue las al&a amilasas pueden ser obtenidas de di&erentes
&uentes !ue di&ieren en el 'rado de "idrolisis !ue presentan sobre la
mol-cula del almid#n$ as( como en su estabilidad t-rmica$ por
e*emplo la al&a amilasa bacteriana puede ser utilizada a temperaturas
de >?@ C o ma%ores$ mientras !ue la al&a amilasa producida por
"on'os se inacti)an alrededor de los 6C@ C.
Las a3amilasas obtenidas de Bacillus subtilis )ar am%ioli!(tedaciens
tienen un ion calcio &uertemente li<'ado por mol-cula$ !ue es
necesario para la acti)idad del enzima % !ue lo esta3biliza en 'ran
medida &rente al calentamiento.
%. &u microor'anismos productores de amilasa soportan
altas temperaturas$
Bacillus coa'ulans
Bacillus lic"eni&ormis
Bacillus stearot"ermop"ilus
(. Por qu se )usca tener menor colonias productoras de
amilasa$
7ara obser)ar el crecimiento del microor'anismo productor de
amilasa % comparar &rente a otros microor'anismos en i'ual
condici#n e identi&icar el !ue tiene ma%or crecimiento % la me*or
&uente de "idrolisis de almid#n.
". Cmo se procede para aislar microor'anismos que de'raden
amilasa$
Cultivo Est*tico. En el culti)o est,tico$ la celulosa se obtiene
en &orma de 'el$ en el cual la celulosa es aproimadamente el
4D del peso total. Estudios realizados muestran !ue$ en un
primer estado$ el microor'anismo incrementa su poblaci#n
'racias al consumo de o('eno disuelto !ue se encuentra en
el medio de culti)o+ durante este tiempo$ el microor'anismo
sintetiza cierta cantidad de celulosa en el medio l(!uido. S#lo
las bacterias !ue se encuentran cerca de la inter&ase
airePmedio de culti)o % tienen disponibilidad de o('eno$
pueden mantener su acti)idad % producir celulosa$ la cual
&orma capas superpuestas+ a medida !ue transcurre el tiempo
de &ermentaci#n$ el espesor de la pel(cula se incrementa por la
'eneraci#n de nue)as capas en la super&icie$ &ormando una
estructura de capas suspendidas en el medio de culti)o. El
principal incon)eniente con las &ermentaciones en culti)o
est,tico es !ue se re!uiere de tiempos lar'os % una 'ran ,rea
super&icial$ lo !ue no "ace pr,ctica su producci#n a 'ran
escala.
Cultivo A'itado: Al realizar las &ermentaciones en culti)o
a'itado se pueden obtener pellets de celulosa o
a'lomeraciones amor&as de las &ibras$ los cuales dependen
del tipo de reactor % condiciones de operaci#n empleados.
Estos culti)os pueden realizarse por lotes o en continuo$ en
reactores de tan!ue a'itado o airli&t. El culti)o a'itado se
in)esti'a con miras a escalar el proceso a ni)el industrial$ pero
las ba*as producti)idades reportadas$ menores !ue en culti)os
est,ticos$ "acen !ue no sea &,cil su escalamiento+ la ba*a
producti)idad obedece al "ec"o de !ue la a'itaci#n &a)orece
el crecimiento de c-lulas no productoras de pol(mero !ue
consumen el sustrato$ denominadas celulosa/30+ al'unos
autores atribu%en este &en#meno a mutaciones !ue lesionan la
ma!uinaria enzim,tica encar'ada de la polimerizaci#n de la
'lucosa. 7or otra parte$ se "an aislado % caracterizado cepas
altamente productoras en culti)o a'itado$ tales como
Acetobacter %linum BCR?$ Acetobacter %linum subsp.
sucro&ermentans B7R9CC4 % Acetobacter sp. AF+ la producci#n
encontrada es 4.5$ 5.C % 9.8 )eces superior respecti)amente
con relaci#n a la reportada empleando la cepa caracterizada
ATCC 4C95?. Jn incon)eniente adicional !ue presenta este
m-todo de culti)o es la "abilidad de las c-lulas de Acetobacter
para con)ertir la 'lucosa en ,cidos 'luc#nico % ceto'luc#nico$
por lo !ue se consume la 'lucosa del medio en detrimento del
rendimiento para la celulosa.

+. ,dentificacin de la -idrolisis de almidn.
El lu'ol con el almid#n &orman un comple*o color ca&-3purpura
!ue desaparece cuando el almid#n "a sido de'radado.
.. Cmo se procede para aislar microor'anismos que
de'radan prote/nas$
El aislamiento de cepas puede lle)arse a cabo del si'uiente es!uema
a partir de una muestra de suelo.
La muestra de suelo se suspende en a'ua est-ril.
El sobrenadante se dilu%e 4C34 a 4C34C )eces.
Muestras de estas series de diluciones /c.a. 4CC QL0 se
siembran sobre )arios medios de culti)o /dependiendo del tipo
de microor'anismos !ue !ueramos aislar0 % lue'o se incuban.
Se a(slan colonias separadas de distinta mor&olo'(a % se
puri&ican por resiembra.
Los culti)os puros se mantienen en tubos de ensa%o como
culti)os en medio s#lido listos para realizar las pruebas de
selecci#n.
El procedimiento de selecci#n puede ser acelerado
&recuentemente probando la acti)idad biol#'ica de los aislados
iniciales directamente.
VIII. BIBLIOERAKIA
BrocI Biolo'(a de los microor'anismos. 4CR edici#n /9CC80. J. 7arIer$ J.M.
MartinIo$ M.T. Madi'an. 7earson Education.
Manual 7r,ctico de Microbiolo'(a. 8R edici#n /9CC?0. R. :(az$ C. Eamazo$ I.
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EraS Aill Interamericana. M-ico.
:a)is$ B. :.$ :ulbecco$ R. 4FB>. Tratado de Microbiolo'(a. 9da. Edici#n. Ed.
Sal)at Editores. Espa2a.
IM. AHEMOS
MUESTRAS DE ALMIDON
IMAGEN DE LA TIERRA
NUTRITI%A &IR%IENDO
TUBOS DE ENSA*O UBICADAS
DEACUERDO A SU DEGRADACION
TUBOS DE ENSA*O CON
LAS MUESTRAS DE TIERRA
NUTRITI%A
Se+"ra,( ,e la +-estra
en al+i,(n
#i.ete( ,e la +-estra .ara
s- sie+"ra
Sie+"ra ,e las +-estras Sie+"ra en esta,( ,e
esterili,a,