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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL

CATARINENSE

Curso de Tecnologia em alimentos

Trabalho de Concluso de Estgio




Avaliao da atividade antimicrobiana dos leos essncias de Alecrim
(Rosmarinus officinalis) e Slvia (Salvia officinalis) para aplicao em alimentos

Tamires Silveira Cordeiro

Raquel Piletti
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Resumo: Tendo em vista a crescente preocupao dos consumidores com a
segurana dos alimentos aliada a uma alimentao saudvel, notria a necessidade
de encontrar novos compostos naturais com propriedade antimicrobiana. Atualmente o
uso dos leos essenciais como aditivo em alimentos vem se difundido apresentado uma
nova perspectiva de uso, com o objetivo de substituir alguns dos aditivos sintticos,
visando conservao e consequentemente o aumento da vida de prateleira, alm de
proporcionar um sabor e aroma diferenciados. Neste trabalho os leos essenciais de
alecrim e slvia foram avaliados a fim de verificar sua atividade antimicrobiana frente s
bactrias Staphylococcus aureus e Escherichia coli utilizando o mtodo de difuso em
gar e atravs da determinao da Concentrao Inibitria Mnima (CIM). As atividades
antimicrobianas dos leos essenciais de alecrim e slvia apresentaram diferenas
considerveis quando submetidas ao teste de difuso em gar, formando halos de
inibio para a cultura de Staphylococcus aureus de 1,60 cm para slvia e 2,65 cm
0,071 para o alecrim, comprovando a eficincia bacteriosttica. Porm, no observou-
se formao de halo em Escherichia coli. Os resultados do teste de concentrao
inibitria mnima comprovaram eficincia bacteriosttica para ambos os leos testados,
possivelmente pelo fato de que neste teste ocorre um maior contato com a suspenso
bacteriana. Esses resultados potencializam ainda mais a utilizao de extratos naturais
em alimentos por suas diversas propriedades.

Palavras-chave: leos essenciais, alimentos, alecrim, slvia, atividade antimicrobiana.


1. Introduo

O estudo de produtos naturais com potencial de aplicao em alimentos tem
despertado cada vez mais interesse das indstrias pela necessidade de produzir
alimentos com menos aditivos sintticos, propriedades organolpticas preservadas e
extensa vida de prateleira (STEURER, 2008). Esse interesse vem aumentando tambm

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Professora Orientadora.
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devido procura dos consumidores por alimentos saudveis e mais prximos ao
natural.

Os aditivos sintticos utilizados pela indstria de alimentos so considerados seguros,
mas sua utilizao encontra cada vez mais restries pela regulamentao
internacional. Por essa razo, pesquisas so necessrias para que aditivos naturais e
atxicos possam ser utilizados em substituio aos aditivos sintticos para prevenir a
deteriorao dos alimentos.

De acordo com Machado et al. (2011) e Souza et al. (2003), nas ltimas dcadas tm
sido um desafio para os produtores de alimentos atender as exigncias legais para
garantir a segurana alimentar, como tambm corresponder as expectativas associadas
s exigncias dos consumidores particularmente preocupados com a sade e
conscientes dos possveis efeitos dos aditivos sintticos usados na conservao dos
alimentos. Desta forma, estudam-se novos compostos que venham auxiliar na coerente
substituio dos conservantes, constantemente utilizados no controle do crescimento
microbiano, e que sejam possveis de uma incluso em um sistema de conservao de
alimentos. Neste contexto, leos essenciais de plantas condimentares j utilizados
como flavorizantes e com elevado potencial antimicrobiano ganham uma nova
perspectiva de uso.

De acordo com Souza et al. (2003), a indstria alimentcia visa produo de alimentos
incuos e que apresentem vida longa de prateleira. A utilizao de substncias naturais
de origem vegetal, torna o alimento mais atrativo ao consumidor por no apresentarem
efeito txico, mesmo quando empregadas em concentraes relativamente elevadas.

Alm dos benefcios proporcionados sade, diversos estudos tm demonstrado o
efeito inibidor de condimentos no desenvolvimento de microrganismos deterioradores e
patognicos veiculados por alimentos. (PEREIRA et al., 2006).

O presente trabalho tem como objetivo caracterizar o potencial antimicrobiano dos leos
essenciais de slvia e alecrim para possvel aplicao em alimentos como alternativa de
substituio a alguns aditivos antimicrobianos sintticos.
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2. Reviso de Literatura

2.1 Deteriorao dos alimentos


Garantir a segurana, e ao mesmo tempo atender a demanda para a conservao de
atributos nutricionais e de qualidade, tm resultado na crescente busca de
conservantes naturais com potencial aplicao em alimentos que possam ser utilizados
sozinhos ou em combinao com outra tecnologia. Todavia, a escolha do
antimicrobiano deve ser baseada na compatibilidade qumica e sensorial deste com o
alimento alvo, na sua efetividade contra microrganismos indesejveis, segurana,
dentre outras caractersticas (SETTANNI; CORSETTI, 2008).

De acordo com Souza et al. (2003), os compostos de natureza vegetal, em especial as
especiarias e seus produtos derivados (leos essenciais e extratos), apresentam um
potencial relevante como agentes de inibio do crescimento de microrganismos,
mostrando que elementos que se apresentavam apenas como vetores de aromas e
gostos caractersticos, atualmente apresentam uma nova perspectiva de emprego.

Os alimentos, quer sejam industrializados ou no, mantm-se em constante atividade
biolgica, manifestada por alteraes de natureza qumica, fsica, microbiolgica ou
enzimtica, levando a perda de qualidade e reduo da vida de prateleira. Destas
alteraes, as que requerem ateno especial em relao segurana do consumidor,
so as microbiolgicas e antioxidantes (HRAS et al., 2000).

A deteriorao causada por microrganismos uma das principais preocupaes para
as indstrias de alimentos, pois esta ocorre por parmetros intrnsecos, como pH e
atividade de gua e alm disso, o crescimento microbiano se d em funo da
temperatura e nutrientes disponveis para o seu desenvolvimento. Portanto, alimentos
ricos em protenas, vitaminas e aminocidos so mais susceptveis a esse tipo de
deteriorao. Outro fator importante que leva a deteriorao e perda de qualidade dos
alimentos a oxidao de lipdeos. Quando os lipdeos so expostos a fatores
ambientais como oxignio, luz e temperatura, reaes de oxidao comeam a produzir
compostos indesejveis, sabores e odores ranosos e perda de colorao (HRAS et al.,
2000).
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O que direciona diversos estudos a verificarem o efeito antimicrobiano de alguns
condimentos no desenvolvimento de microrganismos deterioradores e patognicos
veiculados por alimentos (PEREIRA et al., 2006).

A presena de microorganismos patognicos e suas toxinas, como Escherichia coli
causa srios problemas sade dos consumidores, alm de reduzir a vida til dos
alimentos, provocando grandes perdas econmicas (Souza et al., 2003).

A bactria Staphylococcus aureus um importante patgeno devido sua virulncia,
resistncia aos antimicrobianos e associao a vrias doenas, incluindo enfermidades.
Esta bactria habita a pele, a orofaringe e com frequencia a nasofaringe do ser
humano, a partir da qual pode facilmente contaminar as mos do homem e contaminar
o alimento, devido falta de cuidado dos manipuladores, como a no obedincia das
boas prticas e lavagem incorreta das mos (XAVIER et al., 2007). Ainda de acordo
com o mesmo autor, o Staphylococcus aureus considerado o segundo ou terceiro
mais comum patgeno causador de intoxicao alimentar, perdendo em nmero
apenas para Salmonella sp. e competindo com o Clostridium perfringens.



2.2 Extratos naturais

A utilizao de plantas aromticas, possuidoras de leos essenciais, geralmente com
aes flavorizantes, comprovada ao antibacteriana e antioxidante, pode ser uma
alternativa importante para a conservao de alimentos, diminuindo a concentrao de
aditivos sintticos nesses produtos (MOREIRA et al.,2005).

Pierozan et al. (2009), afirmam que os leos essenciais extrados de matrizes vegetais
tm sido considerados como inibidores de agentes patognicos humanos tais como
Escherichia coli, Staphylococcus sp., Bacillus sp., Streptococcus sp., Salmonella sp.,
Mycobacterium sp., Vibrio vulnificus, entre outros.

Ainda de acordo com Pierozan et al. (2009), que definem leos essenciais como
misturas complexas, de substncias volteis, insolveis em gua e solveis em
solventes orgnicos, os quais contribuem para a sua caracterizao e isolamento.
Contendo uma combinao de terpenos, monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos, ou
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mesmo de pesos moleculares baixos os hidrocarbonetos alifticos (lineares,
ramificados, saturados e insaturados), cidos, lcoois, aldedos, steres acclicos ou
lactonas e os compostos de azoto e de enxofre, exclusivamente, cumarines, e
homlogos de phenylpropanes.

A literatura atual apresenta inmeros relatos sobre atividade biolgica de extratos
vegetais, como ao antifngica (Alanis-Garza et al., 2007; Korukluoglu et al., 2008),
ao antibacteriana (Zhang et al., 2007; Al-Turki et al., 2008), atividade anti-tumoral
(Jimnez-Medina et al., 2006; Kaileh et al., 2007), ao antiinflamatria e analgsica
(Bose et al., 2007; Dlaz- Viciedo et al., 2008) atividade antioxidante (Ferreres et al.,
2007; Starzynska-Janiszewska et al., 2008), atividade antimicrobiana (Settanni;
Corsetti, 2008), dentre outras.

Neste intuito, os elementos de natureza vegetal, em especial as especiarias e seus
produtos provenientes, aparecem com relevante importncia no seu possvel uso como
provveis agentes inibitrios do crescimento microrgnico. Assim, estes elementos que
antes se apresentavam principalmente, como agentes vetores de aromas e gostos
caractersticos aos alimentos, apresentam agora uma nova perspectiva de emprego
(SOUZA, 2003).

Rosmarinus officinalis o alecrim comumente conhecido, pertencente famlia
Lamiaceae originria de pases do mediterrneo tambm cultivada no Brasil. Entre
as propriedades medicinais conhecida a antisptica. Estudos j realizados
identificaram 33 compostos qumicos no leo essencial de alecrim, os principais foram
-pineno, 1,8-cineol, cnfora, verbenona e borneol, constituindo cerca de 80% do total
do leo (SANTURIO, 2011).

A slvia (Salvia officinalis) tem sido extensivamente estudada e reconhecida por sua
capacidade antioxidante relacionada aos seus compostos fenlicos. Povh et al. (2008),
identificaram os constituintes antioxidantes da slvia como sendo carnosol, rosmadial,
cido carnosnico, rosmanol e epirosmanol, previamente encontrados em alecrim, e
notadamente conhecidos por suas propriedades antioxidantes.
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O primeiro estudo sobre propriedades antimicrobianas, publicado em 1880, descreve a
atividade antimicrobiana de leos essenciais de mostarda, cravo da ndia e canela.
Extratos de alho, canela, curry, mostarda, manjerico, gengibre a outras ervas exibem
tambm essas propriedades. Extratos do cravo da ndia reduzem o nmero de
Escherichia coli e outras bactrias durante a armazenagem de sucos, leites e chs
(BOYLE 1995; KAUR, 1999 apud ERNANDES; GARCIA, 2007).



3. Materiais e Mtodos

3.1 Anlises microbiolgicas

Segundo Tortora et al. (2005), as drogas antimicrobianas ou so bactericidas (matam o
microrganismo diretamente) ou so bacteriostticas (impedem o crescimento do
microrganismo). Esta ao antimicrobiana pode ocorrer por vrios modos de ao
como, inibio da sntese da parede celular, inibio da sntese proteica, dano a
membrana plasmtica, inibio da sntese de cidos nuclicos e inibio da sntese de
metablitos essenciais.

Para avaliar a eficincia antimicrobiana dos extratos naturais de slvia e alecrim, foram
realizados os testes microbiolgicos Concentrao Inibitria Mnima (CIM) e Difuso
em gar.

3.1.1 Teste Concentrao Inibitria Mnima (CIM)

A CIM determinada com uma sequncia decrescente de concentraes do composto
em um caldo, que ento inoculado com uma bactria-teste (Tortora et al., 2005).
Considera-se a CIM a menor concentrao do composto capaz de inibir o crescimento
bacteriano, (fenmeno observado pela leitura da absorbncia) aps incubao a 37C
por tempo determinado (NCCLS, 2003).

Os testes foram realizados em triplicatas, iniciando-se com o preparo dos tubos de
ensaio contendo o meio de cultura LB Broth e a suspenso bacteriana. Em cada tubo
incorporou-se uma concentrao 10 L/mL dos leos de slvia e alecrim. Os tubos
permaneceram em estufa de incubao a 37 C por 24 horas, sendo mantida agitao
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constante em um agitador Phoenix, AP -56 e posterior leitura em espectroftometro

Shimadzu, UV 1800, a 600 nanmetros (nm).




3.1.2 Teste de Difuso em gar

O mtodo empregado foi o de descrito por Althertum et al. (1999), que consiste na
fixao de um papel filtro impregnado com um antimicrobiano ou na abertura de um
poo devidamente preenchido com o antimicrobiano em questo, na superfcie de um
meio de cultura slido apropriado previamente semeado com a bactria teste, o
crescimento bacteriano poder ser inibido, formando-se ento um halo de inibio em
torno do disco ou poo (zona onde no h crescimento bacteriano), cujo di metro varia
de acordo com a velocidade de difuso do antimicrobiano testado e a sensibilidade da
bactria.

Em cada poo da placa de petri contendo gar PCA (Plate Count Agar) colocou-se

100L dos leos de slvia Posteriormente s placas foram incubadas em estufa
bacteriolgica a 37C por 2 horas. Aps a incubao procedeu-se a medio dos halos
com rgua milimetrada, considerando-se a menor distncia entre os halos.

O objetivo do teste foi avaliar a eficincia bacteriosttica dos leos de slvia e alecrim
atravs do dimetro dos halos de inibio formados.



4. Resultados e Discusses

Os resultados indicaram que os leos de slvia e alecrim apresentaram halo de inibio
considerveis para a cultura de Staphylococcus aureus, sendo de 1,60 cm e 2,65 cm
0, 071 respectivamente, comprovando assim efeito bacteriosttico, mas ambos os leos
testados no apresentaram formao de halo para a cultura de Escherichia coIi
(conforme figuras 1, 2 e 3).
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Figura 1 - Mdia do dimetro dos halos de inibio do teste de difuso em gar para as bactrias
Staphylococcus aureus e Escherichia coli.



De acordo com Burtt (2004), este resultado pode ser atribudo ao fato de que as
bactrias Gram positivas, Staphylococcus aureus so mais sensveis que as Gram
negativas, Escherichia coli, devido presena da membrana externa que restringe a
difuso dos compostos hidrofbicos atravs dos lipopolissacardeos.





a) b)

















Figura 2 - Difuso em gar para os leos essenciais de alecrim (a) e slvia (b) para a bactria E. coli.
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a) b)

















Figura 3 - Difuso em gar para os leos essenciais de alecrim (a) e slvia (b) para a bactria S. aureus



A figura 4 mostra os resultados do teste de concentrao inibitria mnima (CIM) para
os leos de alecrim e slvia. Pode-se perceber que os valores da absorbncia das
amostras contendo os leos essenciais foram menores quando comparadas a da
amostra controle, indicando uma reduo no crescimento bacteriano.
Os valores encontrados para amostra controle de Staphylococcus aureus e Escherichia
coli foram de 1,578 0,006 e 1,546 0,060 respectivamente.





Figura 4 - Teste de Concentrao Inibitria Mnima CIM para as bactrias Staphylococcus aureus e
Escherichia coli.
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Alm disso, quando comparados os resultados de absorbncia das amostras contendo
os leos observa-se que o melhor resultado para o leo de alecrim (0,035 0,014) e
(0,018 0,015) sendo este o mais efetivo contra bactrias do que o leo de slvia
(0,450 0,037) e (0,490 0,078), evidenciando quase total inibio de crescimento das
bactrias Staphylococcus aureus e Escherichia coli, respectivamente.

Resultados semelhantes foram encontrados em estudos de efeitos antimicrobiano de
alguns leos por Poiana et al. (2008), que tambm observaram a eficincia
bacteriosttica do leo essencial de alecrim, e que assim como outros leos, por
possur como principais constituintes em sua composio compostos como 1,8 cineol,
cnfora e borneol, apresentam ao antimicrobiana contra Escherichia coli e
Staphylococcus aureus.

Aps a realizao dos testes microbiolgicos observou-se que os resultados
encontrados foram confrontantes quando comparados a no formao de halos e a
reduo da absorbncia das amostras com os leos essenciais frente bactria
Escherichia coli. Este resultado explicado ao fato de que no teste de difuso em gar
a formao de halo proporcional a difuso dos leos, e que por ter sido relativamente
baixa no foi suficiente para inibir o crescimento da E. coli, que conforme citado
anteriormente, possui maior resistncia em comparao a S. aureus. J para o teste de
concentrao inibitria mnima, o contato entre os leos e a suspenso bacteriana
maior, e proporciona o efeito para ambas as bactrias.

De acordo com Moreira et al. (2010) e Steurer (2008), a atividade antimicrobiana dos
leos essenciais clara, mas o mecanismo de ao antimicrobiana ainda no est
completamente entendido. H consenso de que os compostos aromticos e fenlicos
sos os principais responsveis pela atividade antimicrobiana, onde exercem seus
efeitos diretamente na membrana citoplasmtica, provocando alteraes na sua
estrutura e funes. Os mesmos autores afirmam que componentes presentes em
menor quantidade tambm desempenham seu papel importante, envolvendo-se em
interaes sinrgicas com os compostos fenlicos. Ainda de acordo com Steurer
(2008), esses mecanismos no funcionam como alvos separados e podem ocorrer em
consequncia dos outros.
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Quanto quantidade de leos essenciais a ser empregada Burt (2004), afirma que
varia muito conforme o sabor e, alm disso, a eficincia relativa muda conforme a
composio do produto, bem como a metodologia empregada nos ensaios tambm
gera dificuldades de comparao entre os resultados obtidos.



5. Consideraes finais


Diante dos resultados obtidos nos testes microbiolgicos, pode-se concluir que os leos
essenciais de slvia e alecrim apresentam-se como alternativa promissora para
aplicao em alimentos, visando prevenir a deteriorao e consequente aumento da
vida de prateleira. Podem ser usados principalmente para auxiliar na preveno da
contaminao proveniente da manipulao de alimentos, sobretudo para a bactria
Staphylococcus aureus que encontrada na pele dos seres humanos.

As principais vantagens da utilizao de extratos naturais em alimentos que alm da
atividade antimicrobiana, proporcionam ao consumidor uma opo pela escolha de um
alimento com substncias conservadoras naturais, no apresentam efeito txico mesmo
quando empregadas em concentraes relativamente elevadas.

Pode-se concluir tambm que so necessrios mais testes microbiolgicos para avaliar
as concentraes a serem utilizadas, com atividade antimicrobiana, mas sobretudo sem
alterar as caractersticas sensoriais dos alimentos.






6. Referncias Bibliogrficas

ALTERTHUM, Flavio TRABULSI, Luiz Rachid; GOMPERTZ, Olga Fischman.
Microbiologia. 3. ed. So Paulo: Atheneu, 1999. 586 p.



BURT, S.A. Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in
foods. International Journal of Food Microbioloby, v.94, p.223-253, 2004.
12

ERNANDES, Fernanda Maria Pagane Guereschi; GARCIA-CRUZ, Crispin Humberto.
Atividade antimicrobiana de diversos leos essenciais em microrganismos isolados do
meio ambiente. B.CEPPA, v. 25, n. 2, p. 193-206, 2007.



HRAS, A. R.; HADOLIN, M.; KNEZ, Z.; BAUMAN, D. Comparison of antioxidative and
synergistic effects of rosemary extract with -tocopherol, ascorbylpalmitate and citric
acid in sunflower oil. Food Chemistry, v. 71, n. 2, p. 229-233, 2000.



MACHADO et al. Aplicao de antimicrobianos naturais na conservao de alimentos.
Embrapa Agroindustrial Tropical ISSN, v. 2179-8184, n. 145, p. 31, 2011.



Moreira, M. R., Ponce, A. G., Valle, C. E., & Roura, S. I. (2005), apud BARBOSA,
Lidiane Nunes. Propriedade antimicrobiana de oleos essenciais de plantas
condimentares com potencial de uso como conservante em carne e amburguer
bovino e testes de aceitao. 2010. 121 f.Dissetao (Mestrado) - Curso de Biologia,
Instituto de Biocncias, Universidade Estadual Paulista, 2010.



NCClS Testes de susceptibilidade antimicrobiana de Acinetobacter spp. pelo NCCLS
Microdiluio caldo e difuso em disco. J Clin Microbiol, v.42, n. 11, p. 5102-5108,
2008.



PEREIRA; M.C.; VILELA, G.R.; COSTA, L.M.A.S.; SILVA, R.F.; FERNANDES, A.F.;
FONSECA, E.W.N.; PICCOLI, R.H. Inibio do desenvolvimento fngico atravs da
utilizao de leos essenciais de condimentos. Cinc. agrotec.,Lavras, v. 30, n. 4, p.
731-738, 2006.



PIEROZAN et al. Caracterizao qumica e atividade antimicrobiana de leos
essenciais de espcies de Slvia L. Cinc. Tecnol. Aliment. Vol. 29, n 4.2009.



POIANA et al. Antimicrobial Effect of Some Essential Oils. Journal of Essential Oil
Research, v.20 p. 373-379, 2008.



POVH, J. A; ONO, E.O. Crescimento de plantas de Salvia officinalis sob ao de
reguladores de crescimento vegetal. Cinc. Rural, v. 38, n. 8, 2008.



SANTURIO, D.F. Atividade antimicrobiana de leos essenciais de condimentos
sobre Escherichia coli isoladas de sunos, aves e bovinos. 2011. 56 f. Dissertao
13

(Mestrado) Ps Graduao em Cincia e Tecnologia dos Alimentos, Universidade
Federal de Santa Maria RS, 2011.



SETTANNI, L.; CORSETTI, A. Application of bacteriocins in vegetable food
biopreservation. International Journal of Food Microbiology, v. 121, p. 123-138,
2008. apud MACHADO, T. F. Aplicao de antimicrobianos naturais na conservao de
alimentos. Embrapa Agroindstrial Tropical, ISSN 2179-8184, 145, 2011.



SOUZA, Evandro Leite et al.Especiarias: uma alternativa para o controle da
qualidade sanitria e de vida til de alimentos, frente s novas perspectivas da
indstria alimentcia. Higiene Alimentar, v.17, n.113, p. 38-42, 2003.



STEURER. F. Especiarias: aplicaes e propriedades. 2008. 31 f. Trabalho de
Concluso de Curso. Qumica de alimentos, Universidade Federal de Pelotas RS, 2008.



TORTORA, Gerard J.; FUNKE, Berdell R.; CASE, Christine L. Microbiologia. 8.ed
Porto Alegre: Artmed, 2005. 894 p.



XAVIER et al. Prevalncia de Staphylococus aureus em manipuladores de alimentos
das crches municipais da cidade de Natal. RBAC,vol. 39, n3, p. 165-168, 2007.