UNIVERSIDAD SAN MARTIN DE PORRES

FACULTAD DE ODONTOLOGA

ASIGNATURA DE MICROBIOLOGA

PRCTICA N 08

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE Staphylococcus sp.

POR: FREDDY A. MANAYAY LLAGUENTO
JUAN A. CASTRO ARREDONDO


I. COMPETENCIAS
Aislamiento e identificacin de las especies que comprende el gnero Staphyloccus sp. utilizando
los medios adecuados.
Identificacin del gnero Staphylococcus con el uso de pruebas bioqumicas, prueba de la Coagulasa
y prueba de catalasa y prueba de Novobiocina

II. INTRODUCCIN.

Los Staphylococcus sp son cocos Gram positivos de 0.5-1 m de dimetro, inmviles, aerobios y
anaerobios facultativos, caracterizados en que se agrupan de forma irregular en racimos, producen
catalasa , lo que los diferencia de los Streptococcus sp. Son bacterias poco exigentes. Se encuentran
presentes en la mucosa y en la piel de los humanos, crecen fcilmente en casi todos los medios
bacteriolgicos, y descomponen los azcares por fermentacin pero su crecimiento es mejor en agar
manitol salado y agar sangre. Tiene importancia mdica principalmente el S. aureus, y en humanos
adems de ste, el S. saprophyticus y el S. epidermidis.
Se pueden distinguir las siguientes especies:
1. S. aureus: Estafilococo patgeno. Es el agente causal de la mayora de las infecciones; se caracteriza
por producir coagulasa o fermentar el manitol, elaborar diversas toxinas, en especial la toxina , y
sintetizar en su mayora un pigmento amarillo dorado, no difusible, que colorea a las colonias.
2. S. epidermidis y S. saprophyticus: estafilococos oportunistas. Son grmenes comensales de la piel
o libres en el medio ambiente, que en ocasiones pueden intervenir en procesos patgenos. Se
caracterizan por no producir coagulasa ni toxina , no fermentan el manitol y elaboran en su mayora un
pigmento blanco aporcelanado.

III. MATERIALES Y MTODOS.
3.1. Muestras:
Secrecin purulenta de herida
Secrecin nasal, raspado de piel
Tubos con cepas conocidas

3.2. Materiales
Agar Manitol salado Agua oxigenada
Agar Nutritivo Plasma citratado
Asas en anillo Discos de Novobiocina
Hisopos estriles
Bajalenguas
Lminas portaobjetos
Gradillas
Solucin Salina Fisiolgica


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PROCEDIMIENTO
EXPERIENCIA N 01
AISLAMIENTO DE Staphylococcus Sp.
Dividir el Agar nutritivo y el Agar Manitol salado en 4 partes y en cada cuadrante cultivar : hisopado
nasal, secrecin de herida, cepa1 y cepa2
Realizar la toma de muestra de hisopado nasal, tocar suavemente el cuadrante superior izquierdo de
la superficie del Agar nutritivo y Manitol salado y caldo nutritivo al final con el mismo hisopo con que
se tom la muestra realizar un extendido en una lmina portaobjetos fijar, hacer una coloracin Gram
y observar a 100X.
Con el asa anillo realizar la siembra de la muestra por agotamiento en estra.
Cultivar de la misma manera el cuadrante superior derecho con la secrecin de herida
Cultivar de la misma manera el cuadrante inferior izquierdo con la Cepa 1
Cultivar de la misma manera el cuadrante inferior derecho con la Cepa 2
Incubar las placas cultivadas a 35 - 37C por 18 a 24 hrs.

MANITOL SALADO AGAR.
Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciacin de estafilococos
patognicos a partir de muestras clnicas.
Fundamento
Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentracin salina.
Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio; las colonias aparecen
rodeadas de una zona amarilla brillante.
Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona roja o prpura. El
extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente de carbono, nitrgeno, vitaminas y minerales, el
manitol es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentracin)
es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompaante, y el rojo fenol es el indicador de
pH.
Las bacterias que crecen en un medio con alta concentracin de sal y fermentan el manitol, producen
cidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo.
Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no fermentar el manitol.
Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan como colonias amarillas
rodeadas de una zona del mismo color.
Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas, rodeadas de una zona
del mismo color o prpura.

EXPERIENCIA N 02
PRUEBAS PARA LA IDENTIFICACION DE Staphylococcus sp.

PRUEBA DE LA CATALASA:
En una lmina portaobjetos colocar una gota de perxido de hidrgeno (agua oxigenada)
Con un aplicador de madera o asa de siembra coger una porcin del centro de la colonia sospechosa
y realizar una emulsin
Observar la presencia o no de burbujas

INTERPREATACIN:
La rpida aparicin y produccin sostenida de burbujas de gas o efervescencia indica una reaccin
positiva.
CATALASA (+): Presencia de burbujas
CATALASA (-): No burbujas

FUNDAMENTO:
La catalasa es una enzima que descompone el perxido de hidrgeno (H2O2) en oxgeno y agua.
H2O2+ catalasaH2O + O2 (burbujas de gas)

De esta manera las bacterias se protegen del efecto txico del H2O2, que es un producto final del
metabolismo aerobio de los azcares.
Los Staphylococcus son productores de catalasa por lo tanto son catalasa (+)

PRUEBA DE LA COAGULASA:


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En un tubo colocar 05 ml de caldo nutritivo estril + 0.5 de plasma citratado, colocar una porcin de
la colonia sospechosa (catalasa positiva) y realizar una emulsin
Incubar a 37C por 2 a 4 hrs.
Realizar la observacin: formacin de cogulo.
COAGULASA POSITIVO: Formacin de cogulo
COAGULASA NEGATIVO: No formacin de cogulo
INTERPRETACIN:
La reaccin se considera positiva ante cualquier grado de coagulacin visible dentro del tubo. La
reaccin se observa mejor inclinando el tubo.

Si es positiva, el coagulo permanece en el fondo del tubo. Las bacterias fuertemente coagulasa positivas
pueden producir un coagulo en 1 a 4 horas; por lo tanto, se recomienda observar el tubo a intervalos de
30 minutos durante las primeras 4 horas de la prueba.
Algunas cepas de S. aureus pueden formar fuertes fibrinolisinas que disuelven el coagulo recin
formado. Por consiguiente, pruebas positivas pueden pasar inadvertidas si no se observa el tubo a
intervalos frecuentes.
Otras cepas de S. aureus pueden producir slo suficiente coagulasa como para dar una reaccin
positiva tarda luego de 18 a 24horas de incubacin; por lo tanto, todas las pruebas negativas a las 4
horas, deben observarse despus de las 18 a 24 horas de incubacin.

FUNDAMENTO:
Staphylococcus aureus posee dos tipos de coagulasa:
a. Una endocoagulasa o coagulasa ligada o "clumping factor" que est unida a la pared celular.
Esta acta directamente sobre el fibringeno provocando la formacin de cogulos o grumos
cuando se mezcla una suspensin bacteriana con plasma citratado (test en lmina)
b. Una exocoagulasa o coagulasa libre que acta mediante la activacin de un factor (CRF),
formndose un complejo coagulasa-CRF, el cual reacciona con el fibringeno producindose un
cogulo de fibrina (test en tubo).































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FLUXOGRAMA DE DIAGNSTICO DE Staphylococcus sp















CRECIMIENTO EN
AEROBIOSIS
CATALASA POSITIVO
FERMENTACION DE LA GLUCOSA
STAPHYLOCOCCUS MICROCOCCUS
COAGULASA

+
-
+
-
S. SAPROPHYTICUS
S. HAEMOLITICUS
HEMOLISIS
OTRAS ESPECIES
BETA ALFA GAMMA
+
-
RESISTENCIA A LA
NOVOBIOCINA
S. AUREUS




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IV. RESULTADOS Y DISCUCIN












































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V. CONCLUSIONES.













VI.CUESTIONARIO
01 -Mencione 04 especies de Estafilococos y las enfermedades que estos producen.
02 -Mencione 05 factores de patogenicidad del Staphylococcus aureus.
03 -Fundamente la Prueba de Coagulasa.
04 -Fundamente la Prueba de Catalasa.







































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VII. REFERENCIAS
1. Leboffe, M. J., y B. E. Pierce. Microbiology Laboratory and application. 2a edition. Morton Publishing
Co., USA. 2006.









































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VIII. ANEXO.


Esquema de identificacin de Staphylococcus aureus