Aula 10 - Processo Downstream II

09/06/2014
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Processo downstream II
Aula 10 Prof
a
. Dr
a
Ilana L. B. C. Camargo
Cincias Fsicas e Biomoleculares
IFSC - USP
Rompimento celular, proteo e precipitao da biomolcula alvo
PARTE A
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Processo downstream
Etapas de diferentes passos envolvidos no isolamento e purificao
Fermentao
Separao das clulas do meio de
fermentao (clarificao)
Purificao inicial ou concentrao
Purificao especfica do metablito
Purificao final

Formulao

Rompimento celular
Aps as etapas de separao e lavagem das clulas obtidas
ao final do cultivo
Critrios para a seleo da tcnica de rompimento celular:

-Tamanho da clula;
-Tolerncia a tenses de cisalhamento;
-Necessidade de controle de temperatura;
-Tempo de operao;
-Rendimento de processo;
-Gasto de energia;
-Custo e capital de investimento
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Rompimento celular
Fungos
filamentosos
Membrana citoplasmtica
Glicano
Glicoprotena
Quitina/microfibrila
Parede celular
Bactrias
Gram-positivo
Parede celular (Murena/peptdeoglicano)
Espao periplasmtico
10-80 nm
Bactrias
Gram-negativo
Espao periplasmtico
Murena
Membrana externa
Parede celular 8 nm

3 nm
Leveduras
Lipdios
Protenas
Manana
Glicano
Parede celular
75 nm
Rompimento celular
Mtodos divididos em 4 classes:
1. Mecnicos
2. No-mecnicos ou fsicos
3. Qumicos
4. Enzimticos
Parede totalmente rompida

Parede parcialmente permeabilizada

Permite que a molcula alvo seja liberada sem a formao de
fragmentos celulares
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Rompimento celular
1. Rompimento mecnico
Homogeneizador a alta presso
Constitudo de pistes projetados para aplicar altas presses, forando a
passagem da suspenso celular por um orifcio estreito seguida de coliso
contra uma superfcie rgida e imvel em uma cmara presso atmosfrica,
ou coliso contra um segundo fluxo sob presso elevada. A reduo
instantnea da presso associada ao impacto provoca o rompimento celular
sem danificar biomolculas.
Mais utilizado na Indstria!!
Prensa Francesa
Rompimento celular
Prensa Francesa escala laboratorial
mbolo
jato
cilindro
orifcio
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Rompimento celular
Fatores que afetam o desempenho de um homogeneizador
a alta presso:

Presso de operao
Velocidade de alimentao
Temperatura
Fase de crescimento do microrganismo
Condies de cultivo
Tipo de clula
Concentrao de clulas
Rompimento celular
Provoca aumento de temperatura

Sistema eficiente de refrigerao
(principalmente se a molcula alvo for termossensvel)
O processo pode aumentar a temperatura
em 1,5C para cada 1.000 psi

Aumento de 15C
1 ciclo a 10.000 psi
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Rompimento celular
A quantidade de clulas rompidas proporcional
presso na alimentao
Em geral:
Presso 5.000 a 20.000 psi
Velocidade 180 a 280 m/s
Concentrao celular 450 a 750 g/L (massa mida)
Melhoramento da eficincia do rompimento:

Recirculao do material

Desvantagens:

Custo
Degradao da molcula alvo
Gerao de fragmentos celulares pequenos
Rompimento celular
Condies de crescimento microbiano podem influenciar a
eficincia do rompimento em homogeneizador de alta presso
E. coli em meio sinttico

E. coli em meio complexo
Condies mais brandas de rompimento

H formao de parede celular espessa
E. coli com crescimento rpido tem parede celular mais fina
que as de crescimento lento (alteraes no metabolismo)
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Rompimento celular
Para a ampliao de escala no processo
de rompimento celular, deve-se manter
constante:

-Velocidade de alimentao;
-Presso;
-Temperatura de operao;
-Nmero de passagens atravs da
vlvula do homogeneizador;
-Viscosidade;
-Concentrao celular da alimentao
Presso: 0~30,000 psi/207 mpa/2,070 bar
Volume: 9 l
60L/h
Rompimento celular
Muito utilizado em escala industrial, porm nem sempre o
equipamento mais adequado
Fungos filamentosos bloqueio da vlvula de descarga
Moinho de bolas o equipamento mais adequado
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Rompimento celular
Moinho de bolas
-Fungos filamentosos
-Leveduras
-Microalgas
Esquema do Moinho de bolas
Eixo rotativo
Motor
Discos Rotativos
Alimentao
Sada
Esferas
Separador
Cmara de rompimento
Rompimento devido fora de
cisalhamento aplicada pelas
esferas de vidro contra a parede
celular das clulas
Rompimento celular
Moinho de bolas
- Condies facilmente controlveis

- Eficincia depende:
1. Geometria da cmara de rompimento
(horizontal+ esferas, ou vertical), relao tima de
comprimento/dimetro = 2,5 a 3,5

2. Velocidade de agitao
Organismos menores como bactrias, precisam de velocidades
maiores que por exemplo, leveduras.

3. Tipo de agitador
Projetados para proporcionar a mxima transferncia de energia
cintica para as esferas
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3. Tipo de agitador
Rompimento celular
A) Disco com fendas fechadas
B) Discos com fendas abertas
C) Disco perfurado
D) Disco Excntrico
E) Agitador de pinos
3. Tipo de agitador
Rompimento celular
Agitadores podem estar dispostos no eixo central ou fora
dele, perpendicular ou oblquo
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4. Tamanho e composio de esferas
Rompimento celular
Composio:
-Vidro,
-Ao inox
-Cermica

Tamanho:
Bactrias 0,1 mm
Leveduras 0,5 mm
Dimetros menores proporcionam rompimentos mais eficientes,
pois h maior probabilidade de cisalhamento com clula intactas

Biomolcula localizada no espao periplasmtico esferas
maiores que auxiliaro na liberao sem necessidade de
rompimento total
5. Carga de esferas
Rompimento celular
Cmara horizontal esferas devem ocupar entre
80 85% do volume

Cmara vertical esferas devem ocupar entre
50 - 60% do volume

Carga pequena no haver frequncia de coliso suficiente

Carga grande diminui a eficincia do processo, aumentam a
temperatura e o consumo de energia
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6. Concentrao celular
Rompimento celular
Exerce pouca influncia 30 50% (v/v)
Concentraes menores geram menos calor, mas aumentam
o consumo de energia por unidade de massa de celular
7. Velocidade de alimentao
Quanto maior a velocidade menor a frao de clulas
rompidas, pois diminui o tempo de residncia no rompedor
Fluxo timo depende: velocidade do agitador, da
carga de esferas, da geometria do equipamento e das
propriedades do microrganismo
8. Temperatura
Rompimento celular
Recomendao 5 15
o
C

Prevenir a destruio da biomolcula alvo

Deve-se ter manta de resfriamento diminuir a quantidade
de calor liberada nesse processo
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Tempo de rompimento no moinho de bola
Rompimento celular
Esferas de vidro de 0,5 mm
Microrganismo Saccharomyces cerevisiae
Rompimento celular
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Rompimento celular
Ampliao da escala Moinho de Bolas
Manter constante:

- Tamanho das esferas;
- Proporo em volume entre a suspenso celular e as
esferas de vidro;
- Velocidade de rotao do eixo ou velocidade
perifrica das ps do agitador.
Mais comum: manter velocidade perifrica constante (10 a 15 m/s)
Independe do tamanho da cmara de rompimento, apesar
de depender da viscosidade do meio e tipo de agitador
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Rompimento celular
Ultra-som Energia ultra-snica gerada pelo sonicador
transmitida por uma onda
Ondas sonoras (da ordem de 20kHz) so convertidas em
vibraes em um meio lquido e causam o fenmeno de
cavitao
Vibraes geram focos de baixa presso no lquido

Bolhas muito Pequenas
Colapso Onda de choques
Impacto rompimento celular
Rompimento celular
Ultra-som
Deve-se controlar o calor

Alternativa: pulsos

Recomendao da
potncia: 0,2 a 3,0m W/mL

Valores maiores causam
danos a sonda e reduz
eficincia
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Rompimento celular
Ultra-som
Uso em larga escala invivel

Necessidade de utilizar grande quantidade de
sondas dispostas em srie e instalar um eficiente
sistema de refrigerao

Economicamente invivel!!
Rompimento celular
Desvantagens

Elevadas foras de cisalhamento podem destruir organelas
celulares e desnaturar complexos enzimticos e enzimas
localizadas prximas membrana

Gera rompimento integral da clula liberando cidos
nuclicos, organelas e fragmentos junto com a molcula
alvo contaminantes e viscosidade aumentada!!
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Rompimento celular
2. Rompimento no-mecnico
A) Choque osmtico
B) Congelamento/descongelamento
C) Termlise
D) Mtodos qumicos
Lise enzimtica
Rompimento celular
A) Choque osmtico

30 minutos soluo de
sacarose de 20% (m/v)

Centrifugao

Ressuspender em gua
destilada a 4
o
C

No h rompimento integral

Promove permeabilizao
seletiva
Indicado para bactrias Gram-negativo
com parede celular mais sensvel
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B) Congelamento/descongelamento
Rompimento celular
Formao intracelular de cristais de gelo que perfuram a clula
Rompimento total ou leso parcial formando poros
Fatores que influenciam o rompimento:

-Tipo da clula
-Idade da clula
-Temperatura
-Nmero de ciclos
Alguns microrganismos apresentam resistncia, em especial
os produtores de crioprotetores intracelulares como alguns
biopolmeros

Demorado, elevado custo e inadequado para biomolculas
sensveis ao congelamento
C) Termlise
Rompimento celular
Temperatura da suspenso em banho termostatizado
Injeo de vapor direto

Tambor rotativo

Spray drier (nebulizao)
Autlise adequada para processos em alta escala
til para o rompimento de:

-algas,
-fungos filamentosos,
- leveduras
- bactrias
http://www.buchi.com/Spray-Drying.69.0.html
Spray Drying is a unique method to convert a
solution, suspension or emulsion into a solid
powder in one single process step.
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A temperatura e o tempo de incubao depende da clula:

Kluyveromyces fragilis proporciona a liberao de 100% da
inulinase intracelular quando aquecido a 50C, em pH 5,0
6,0, por 12 14 horas (Levedura)

E. coli: 90C por 15 minutos rompimento total (Gram
negativo)

Bacilus megaterium: 90C por 15 minutos rompimento
de menos da metade das clulas (Gram positivo)
C) Termlise
Rompimento celular
C) Termlise
Rompimento celular
Em comparao com o mtodo de ultra-som, o rompimento
por termlise apresenta a vantagem de gerar fragmentos
celulares com maiores dimenses e por isso mais fceis de
serem removveis por filtrao ou centrifugao
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Rompimento celular
3. Rompimento Qumico
A) lcalis
B) Detergentes
C) Solventes
D)Lise enzimtica
Rompimento celular
A) lcalis
Simples, barato e adequado para aplicaes em alta escala

QUANDO A BIOMOLCULA ESTVEL A pH maior que 11!!
-Amnia
-Hidrxido de sdio

Rompem e inativam os patgenos ou microrganismos
geneticamente modificados

Desvantagem:
Gerao de poluentes
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Rompimento celular
A) lcalis
Exemplo:

Erwinia carotovora - extrao de L-asparaginase

pH 11,5 por 30 minutos e reduz para pH 6,5 com cido actico

Centrifuga-se o homogeneizado
Rompimento celular
B) Detergentes
Modo de ao: dissociam protenas e lipoprotenas das
paredes celulares, provocam poros e liberam molcula-alvo.
Exemplo de tensoativos:
Sais biliares
Lauril sulfato de sdio
Dodecil sulfato de sdio (SDS)
Triton
Desvantagens:
Formao de espuma
Desnaturao e/ou precipitao de protenas
Eficincia do rompimento depende:
pH
Temperatura
Pode ser aumentada por pr-tratamento base de solvente
orgnico como acetona que estimula a autlise
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Rompimento celular
B) Detergentes
Exemplos:

Triton 0,5%

Nocardia sp para extrao de colesterol oxidase

Leveduras produo de -galactosidase
Rompimento celular
C) Solventes
Desidratantes qumicos da clula

Solventes mais usados:
Etanol
Metanol
Tolueno
Acetona
Exemplo: invertase de leveduras (intracelular ou do
espao periplasmtico)

Suspenso com 60% de clulas (massa mida) a 40C
Tolueno a 0,1M
Adiciona-se papana (auxiliar de rompimento)
Precipitao da invertase com etanol a 95% (v/v)

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Rompimento celular
D) Lise enzimtica
Mecanismo: hidrlise da parede celular seguido de
rompimento da membrana citoplasmtica devido presso
osmtica interna

Recomendao: para recuperao de biomolculas sensveis
temperatura, tenso de cisalhamento ou presses de
trabalho geradas pelos mtodos mecnicos
necessrio um estudo da eficincia de atuao enzimtica

Variveis:
pH
Temperatura
Fora inica
Concentrao celular
Concentrao enzimtica
Rompimento celular
D) Lise enzimtica
A enzima para a lise depende muito da composio da parede
Bactrias Gram-positivo e Gram-negativo
Principal estrutura = peptdeoglicano (estrutura mais rgida)
Ligaes glicosdicas - 1,4
Ligaes peptdicas
Ligaes entre os polissacardios
Ligaes entre os peptdios
N-acetil glicosamina (NAG)
N-acetil murmico (NAM)
Enzimas com ao nas ligaes
covalentes envolvidas na
estrutura do peptidoglicano:
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Rompimento celular
D) Lise enzimtica
Principais enzimas bacteriolticas:

Glicosidases
Acetilmuramilalanina amidases
Neuroaminidases
Endopeptidases
Proteases (trispina, quimiotripsina, bromelina e papana)
http://www.cryst.bbk.ac.uk/PPS95/course/10_interactions/NAMNAGb14_t.gif
Hidrlise das ligaes
glicosdicas - 1,4
Lisozima (da clara do ovo)
N-acetil glicosamina (NAG)
N-acetil murmico (NAM)
Cadeias laterais de aminocidos
Ponte cruzada de aminocidos
Rompimento celular
D) Lise enzimtica
+ eficiente em Gram-positivo

Para eficincia em Gram-negativo, realizar
pr-tratamento para desestabilizar a
membrana externa: EDTA (desestabiliza LPS)
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Rompimento celular
D) Lise enzimtica
Tabela 1. Carboidratos cujos monmeros so ligados por ligaes
glicosdicas - 1,4 e suas enzimas lticas
Carboidratos Enzimas
Peptidioglicano Lisozima
Celulose Celulases
Lactose -galactosidase
Xilana Xilanase
Quitina Quitinase
Celobiose Celobio-hidrolase
Rompimento celular
D) Lise enzimtica
Leveduras

O sistema mais adequado para rompimento celular
constitudo por glucanases, proteases e
manases, que atuam em conjunto, pois elas
hidrolisam componentes especficos da parede,
como glucanas, protenas e mananas
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Rompimento celular
D) Lise enzimtica
Vantagens:

Fcil controle de pH e temperatura do meio;
Baixo investimento de capital;
Alta especificidade para degradao da parede celular;
Uso em associao com mtodos mecnicos ou no-mecnicos.

Alm disso, enzimas especficas podem ser utilizadas para liberar
apenas biomolculas de interesse e, com isso, simplificar as
etapas posteriores de purificao.

Desvantagens:

Alto custo da enzima (invivel em escala industrial)
Variao da eficincia da lise enzimtica com o estado
fisiolgico do microrganismo

Preservao da biomolcula-alvo
Aps rompimento, protenas podem ser degradadas por
proteases. Portanto, necessrio:

1) Diminuir a temperatura
2) Adicionar inibidores de proteases
Enzimas que possuem no Stio ativo grupamentos de sulfidrila
livres podem ser inativado por:

Oxidao (ex. grupamentos sulfidrilas livres no stio) por isso,
deve-se adicionar agentes redutores (-mercaptoetanol 5 a
20 mM) ou ditiotreitol (1 a 5 mM);

ons metlicos adiciona-se agentes complexantes (EDTA
0,1 a 10mM) nas suspenses de rompimento. Exceo: enzima-
alvo metal-dependente.
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Inibidores de proteases
Aumento da viscosidade aps o rompimento

cidos nuclicos e protenas estruturais

Adio de nucleases pode melhorar as caractersticas
reolgicas do meio desde que no destruam a molcula-alvo

A variao de pH tambm pode ser utilizada para reduzir a
viscosidade do homogeneizado celular
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PARTE B
Precipitao da molcula-alvo
Uma perturbao, qumica ou fsica, em uma soluo
protica causa a formao de partculas insolveis de
protena, recuperadas posteriormente por uma
operao de separao slido-lquido
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Escala laboratorial Escala industrial
Mtodo tradicional de concentrao e purificao
Precipitao: sem elevada capacidade de separao de diferentes
protenas mtodo de moderado poder de purificao
Precede processos de elevada resoluo: cromatografia
Mtodo agressivo

Protenas precipitadas tm sua estrutura tridimensional
modificada funo bioqumica depende da estrutura

Portanto, s vivel quando a adequada conformao da
protena recuperada aps a precipitao
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Precipitao fracionada
Os meios que contm a protena a ser purificada
apresentam, em geral misturas de diferentes
biomolculas e as precipitaes devem ser conduzidas
em duas ou mais etapas
Primeira etapa remoo de protenas indesejveis menos
solveis

Seguintes etapas precipitao de uma ou mais biomolcula
alvo
Precipitao simples, em um nico estgio concentrao

Precipitao fracionada largamente utilizada industrialmente
para a purificao
Inconveniente:

Pouca reprodutibilidade dos resultados obtidos em laboratrio
Reduo da eficincia observada com o aumento da escala

O sobrenadante de uma precipitao fracionada o material
inicial para o prximo fracionamento e podem ocorrer sub ou
superprecipitaes, mudanas conformacionais e perdas
Principal varivel a concentrao de precipitante. Porm, pH,
temperatura, fora inica e concentrao de protenas tambm
podem ser usadas como variveis
Resoluo de fracionamento melhor em concentraes
menores de protena total, pois fenmenos de co-precipitao e
perdas de material no precipitado so reduzidos
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Fracionamento em dois cortes ou dois estgios
Primeiro corte
Adio de precipitante em concentrao suficiente para
remover os contaminantes menos solveis que a protena de
interesse

Remove-se o precipitado formado

Segundo corte
Adiciona-se mais precipitante para promover a precipitao da
protena desejada na nova fase precipitada e os contaminantes
mais solveis que a protena de interesse permanecendo em
soluo
Em geral, um fracionamento com solventes orgnicos
ocorre com 20 a 30% (v/v) de etanol ou acetona, e o
segundo corte, acima de 50% (v/v)
Penicillium janthinellum
-xilosidase precipita em
[menor] de etanol, pois
sua massa molar bem
maior (110 kDa) que a
da xilanase (~20 kDa)
Fracionamento em 3 cortes
Precipitao de xilanase e B-xilosidase
% etanol
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Rendimento em atividade ()

= E1 E2

E1 = frao de atividade solvel no corte 1
E2 = frao de atividade solvel no corte 2
Aumento de pureza (AP)

AP = E1 E2
P1 P2
P1 a frao de protena total solvel no corte 1
P2 a frao de protena total solvel no corte 2
Em solues aquosas a precipitao pode ocorrer:

Com o aumento (salting-out)

Com diminuio (salting-in)

Concentrao de sais
Adio de solventes orgnicos

Polieletrlitos

Polmeros no inicos

Calor

Ajuste de pH
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Aumento da concentrao de sais (salting-out)

Adio de 1,5 a 3 M de sal resulta em aprisionamento das
molculas de gua pela solvatao de ons;

Regies hidrofbicas das protenas ficam expostas e interagem e
se agregam entre si.

Com diminuio da concentrao de sais (salting-in)

Induz interaes inicas e agregao entre as molculas de
protenas

Globulinas precipitam sob fora inica baixa porque as foras
eletrostticas repulsivas so insuficientes para estabilizar as
protenas em soluo
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Sais mais adequados so aqueles que:
-Apresentam elevada solubilidade
-Aumentam tenso superficial do solvente
-Resultam no menor nvel de hidratao das zonas hidrofbicas
-Aumentam a probabilidade de interao entre estas zonas
Sais mais empregados:
Citrato de sdio,
Sulfato de sdio,
Sulfato de amnia
(Salting-out) Sais neutros
Mtodo mais comumente usado para separao de protenas

Protena precipitada no desnaturada e a atividade recuperada aps
dissoluo

Sais podem estabilizar as protenas contra: desnaturao,
protelise ou contaminao bacteriana
Ampliao da escala:
Difcil de ser reproduzida em
larga escala
Solventes orgnicos
+++
Solvente orgnico

Regio hidrofbica
Agregaes das protenas por interaes eletrostticas entre
superfcies com cargas de sinais opostos em meio aquoso
contendo solvente orgnico
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Solventes orgnicos

O Solvente deve:

-Ser totalmente miscvel com a gua (lcoois e cetonas)
-No reagir de modo direto com as protenas
-Ter um bom efeito precipitante

Os mais utilizados:
Metanol, etanol, acetona
N-propanol, i-propanol, 2-metoxietanol, e outros lcoois, steres ou cetonas

lcoois com maiores cadeias alifticas so mais desnaturantes
Solventes orgnicos
Vantagem:
Reduo da densidade do meio lquido favorecendo a
sedimentao do precipitado, podendo eliminar, inclusive, o uso
da centrfuga

Parmetro crtico na ampliao da escala:
Controle da transferncia de calor (manter temperaturas baixas!)

Causa perda no rendimento e na qualidade final do produto
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Precipitao por polmeros
Polietileno glicol (PEG)
PEG alta massa molecular, neutro e miscvel com a gua
disponvel em diversos graus de polimerizao

Precipitaes so conduzidas em baixas concentraes de PEG
(15 a 30% m/v) no muito viscosa e muitas protenas
precipitam

Efeito estabilizante sobre protenas no necessita de
resfriamento

[PEG] necessria para uma dada separao depende do tamanho
da protena e da massa molar do polmero e inversamente
proporcional [protena]

Remoo do PEG ultrafiltrao, adio de etanol e separao
pela formao de duas fases pela adio de sais.
Polieletrlitos
Precipitao por polmeros
Polmeros inicos solveis em gua baixo custo e
seu uso em baixa [ ]
Mais usados:
Poliction polietilenoimina (PEI) carga +, pKa de 10 a 11
Precipita cidos nuclicos e protenas

Polinion cido poliacrlico (PAA)
Uso restrito, pois a protena e o polieletrlito devem ter
cargas opostas. Deve-se operar longe do PI, assim como
do pH de estabilidade da enzima.

Precipitao pode ser feita a T.A.

Modo de ao (teorias):
1) Agregao do polmero protena por floculao
2) Mecanismo eletrosttico pela neutralizao de cargas
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Precipitao pela temperatura
Temperaturas prximas do ambiente favorecem a manuteno da
protena em soluo
Variao de temperatura causa precipitao de protenas de
duas formas:

1) Diminuio da Temperatura: provoca reduo da solubilidade de
protenas e sais

2) Aumento da Temperatura: induz interaes hidrofbicas e
aumenta a interferncia das molculas de gua nas ligaes de
hidrognio, resultando em desnaturao da molcula, expondo os
grupos hidrofbicos que interagem com outras molculas e formam
agregados insolveis
Precipitao Isoeltrica Indstria alimentcia

- Mais expressiva para protenas com baixa constante de
hidratao ou com alta superfcie hidrofbica (globulina e
casena)

Vantagem:
Baixo custo dos cidos (2 a 10 M) e minerais utilizados
(fosfrico, clordrico e sulfrico)

Desvantagem:
- O uso de cido pode causar desnaturao irreversvel
- Muitas protenas so sensveis a baixos pH e
desestabilizao provocada pelo nion, que pode ser
evitada com o uso de cidos com ons estabilizantes,
como acetato ou sulfato
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Precipitao por afinidade

Interao especfica e seletiva de uma protena e um ligante,
geralmente um substrato ou um inibidor se a protena uma
enzima, que pode estar ligado a uma matriz insolvel ou livre em
soluo.

Aplicao da tcnica limitada, pois ligantes estveis a preos
razoveis ainda no esto disponveis.

Ex: Lactato desidrogenase - purificada com copolmero de cido
metacrlico com um ligante de corante de Cibracon blue em
metilmetracrilato que solvel em pH neutro e insolvel em pH cido, com
rendimento de 50% e aumento de pureza de 13 vezes
Precipitao por afinidade
Imunoprecipitao

Adio de um anticorpo ligante especfico protena que
causa uma interao molecular protena-anticorpo

Formao de agregados precipitao
Protena de fuso engenharia gentica
Protena + cauda de poli- histidina
Purificao auxiliada com quelatos metlicos para
precipitao por afinidade (Zinco, cobre, nquel e cobalto)

O precipitado formado dissolvido com adio de um
tampo contendo EDTA que solubiliza o quelato formado
com a protena
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Precipitao por ons metlicos
Classificao de grupos de ons de metais polivalentes
podem ser eficientes na precipitao de protenas:
1) Ligam-se fortemente aos cidos carboxlicos ou aos
compostos nitrogenados, como aminas: Mn
2+
, Fe
2+
,
Co
2+
, Ni
2+
, Cu
2+
, Zn
2+
, e Cd
2+
.
2) Ligam-se aos cidos carboxlicos, porm no se ligam
ao grupo amina: Ca
2+
, Ba
2+
, Mg
2+
e Pb
2+
.

3) Ligam-se fortemente aos grupos sulfidril: Ag
+
e Hg
+

protena + on metlico: reduo da solubilidade por mudanas no
pI e formao de ligaes cruzadas com outras protenas por se
tratarem de ons multivalentes
Ampliao da escala
Bom contato
entre protena
e precipitante
Permitir
nucleao e
bom
crescimento
das partculas
precipitadas
Baixa
desnaturao
Precipitao
Principal problema no projeto do biorreator
Altas concentraes localizadas do precipitante
Danos aos agregados por cisalhamento
Formao de espuma ou bolhas de ar
Co-precipitao de protenas
Evitar:
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39
Ampliao da escala
Processo contnuo
Tanque agitado
mecanicamente
Reator de fluxo
pistonado
Processo descontnuo
Tanque agitado
mecanicamente
Processos com tempos de
nucleao elevados
(evitar efeitos de
desnaturao e co-
precipitao);
Vantagem de incorporar
precipitao longos perodos
de envelhecimento para
assegurar o aumento do
agregado adequadamente
Tempo de reteno da mistura
no pode ser elevado e o
rendimento varia com as
condies da mistura;
Incorpora-se uma zona de
turbulncia ao reator para
evitar problemas de
precipitao no-uniforme;
Vantagens na mistura e
transferncia de calor
Ampliao da escala
Precipitao muitos atrativos

No aumento da escala perda no rendimento
perda na qualidade final do
produto devido a problemas
relacionados ineficincia da mistura
e transferncia de calor em volumes
grandes de trabalho
09/06/2014
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Ampliao da escala
Em geral, manter constante

pH, concentrao do precipitante e temperatura do processo
Potncia transmitida por unidade de volume durante a agitao e
o tempo do processo
No modificar a tenso de cisalhamento imposta obter
agregados de precipitados de densidade e tamanhos constantes

Na precipitao por ao de solventes:
Controlar a transferncia de calor
Tanque agitado mecanicamente
Reatores de fluxo pistonado

Oferecem vantagens no controle desses parmetros resultando em
um fracionamento mais preciso e reduo de perdas por
desnaturao

Extrao Lquido-Lquido em
sistemas de duas fases imiscveis
09/06/2014
41
sistemas de duas fases imiscveis
Fase aquosa + Solvente purificao de antibiticos e cidos
orgnicos h 60 anos!!

Protenas altamente sensveis desnaturao, podem ser
purificadas em sistemas constitudos por duas fases aquosas
imiscveis (SDFA) em decorrncia de uma partio diferenciada
da molcula alvo e impurezas entre as fases lquidas.

Alto teor de gua (75 80% em massa) garante a manuteno
das propriedades biolgicas das protenas.

As propriedades superficiais das protenas so fatores
decisivos: massa molecular, carga eltrica e hidrofobicidade
sistemas de duas fases
Substncia P mais solvel na fase de topo em relao
a de fundo.

Haver um aumento do grau de pureza da molcula alvo
caso os contaminantes apresentem mais solubilidade na
fase de fundo
P
P
P
P
P
P
P
C
C
C
C
C
C
C
C
C
P
P
P
P
P
P
P
C
C
C
C
C
C
C
C
Fase de Topo (T)

Fase de Fundo (F)
Sistema de duas fases aquosas imiscveis. T, fase
de topo (leve), F,fase de fundo (pesada), P,
produto e C, contaminantes
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Fases so formadas pela reunio de determinados polmeros,
polieletrlitos, ou ainda, polmeros em combinao com
solutos de baixa massa molar, em uma mesma soluo
formando 4 grupos:

1) Sistemas formados por 2 polmeros no inicos:
Polietilenoglicol (PEG) / Ficoll;
PEG/dextrana (Dx);
PEG/polivinil lcool;
polipropilenoglicol (PPG)/Dx;
metilcelulose/hidroxipropildextrana;
Ficoll/Dx

2) Sistemas formados por um polieletrlito e um polmero no-
inico:
Sulfato dextrana de sdio/polipropileno glicol
Carboximetilcelulose de sdio/metil celulose
3) Sistemas de 2 polieletrlitos:
Sulfato dextrana de sdio/carboximetildextrana de sdio
carboximetildextrana de sdio/carboximetilcelulose de sdio

4) Sistemas compostos por um polmero no-inico e um
composto de baixa massa molar:
polipropilenoglicol (PPG)/glicose
PEG/glicose
PEG/sulfato de magnsio
PEG/citrato de sdio

Sistemas PEG/sal so muito utilizados devido rpida separao
de fases, baixo custo e, principalmente, maior seletividade na
separao das molculas
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43
Diagrama de fases
Composio em
massa da molcula
com maior
concentrao na fase
superior (menor
densidade)
Molcula com maior concentrao
na fase inferior (maior densidade)
Composio inicial Fase superior
Fase inferior
Ambos os componentes do sistema
esto presentes nas fases lquidas
Reta TMB = linha de amarrao (tie-line)

Sistemas cuja composio inicial encontra-se sobre uma mesma linha de
amarrao possuem a mesma composio final (fase de topo e de fundo), porm a
relao de volumes entre as fases diferente para cada composio, de acordo
com a razo entre TM e BM
Curva de equilbrio
ou binodal
Mistura
PEG

Fosfato
Decantao
Quanto maior a massa molecular do polmero, menor a
concentrao necessria para a formao de duas fases;

Valores de pH e temperatura tambm so variveis que
influenciam a curva binodal.
PEG

Fosfato
Mistura
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44
Partio de protenas entre as duas fases regida pela
condio de menor potencial qumico ou maior solubilidade
Biomolcula apresentar maior concentrao na fase onde
sua solubilidade for maior
K = Cti/Cfi
Coeficiente de partio
Cti = [soluto i] na fase de topo (g/L)
Cfi = [soluto i] na fase de fundo (g/L)
K usado para avaliao da extenso das separaes nos
sistemas de duas fases aquosas. K distintos para a molcula
de interesse e para as demais indicam a ocorrncia de
purificao.

Hidrofobicidade, carga superficial e massa molar das
protenas assim como pH e fora inica da soluo so
determinantes para o valor de K
K tambm varia com o pH e com a massa molar de PEG
Amiloglicosidase 67.000 Da
PEG - 300 Da
PEG - 400 Da
PEG - 600 Da
K Topo
K fundo
PEG

Fosfato
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Extraes baseadas em afinidade
Ligante, substncia que se ligar molcula alvo, acoplado
por ligao covalente ao polmero.

Ligante pode ser substncia natural ou molcula sintetizada
Aumenta o rendimento da purificao
Extraes baseadas em afinidade
Sistema
Material
Purificado
Ligante
PEG/palmitato
BSA e a-
lactalbumina
cidos graxos
PEG/fosfato Protena A IgG humana
PEG/dextrana Tripsina
Inibidor de
tripsina
Dextrana/hidropro
pildextrana
Quimiosina pepstatina
PEG/fosfato Amido Glicoamilase
Exemplos de material purificado por partio de afinidade
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Clarificao de suspenses microbianas
Extrao de clulas e fragmentos
Slidos de pequena dimenso
(fragmentos de membrana)

Densidade prxima da gua
(bolores)

Inviabilizam centrifugao, pois Fc deve ser alto!
Reduo de nmero de operaes unitrias no processo

-Fase de topo: protenas e molcula alvo
-Interface ou fase fundo (rica em sal): clulas, fragmentos e
cidos nuclicos e polissacardeos
www.qmc.ufsc.br/organica/exp7/liquido.html
No laboratrio
Extrao descontnua
Funil de separao
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Equipamentos na indstria
Seja qual for o tipo do equipamento, em geral, eles so
operados de forma contnua, com alimentao em contra-
corrente das fases
Pesquisa
rea de Biotecnologia operao semicontnua com
uma das fases sendo mantida
estacionria e outra alimentada
continuamente na forma de
fase dispersa.
Fase contnua (onde se tem a amostra)

Fase dispersa (fase adicionada para extrao)
Fases
Extratores e colunas de extrao lquido-lquido tm
basicamente duas funes:
1. Estabelecer o contato entre as fases lquidas no
sistema pela disperso de uma fase na outra, com o
objetivo de possibilitar a transferncia de massa;

2. Separar os dois lquidos depois da extrao.
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48
Mistura: conjunto de gotas de uma fase
dispersas no contnuo da outra
Fases
Gotas de pequeno dimetro: elevada rea de contato entre
fases e possibilita boa eficincia de transferncia de massa
Muito pequenas dificuldades para posterior decantao
e separao das duas fases
Tempo de separao
Separao obtida rapidamente aps homogeneizao

Depende:
- Velocidade de coalescncia das bolhas

- Tipo de agitao exercida

- Fatores relacionados composio do sistema
polmero/sal Mais rpido
polmero/polmero mais lento
(Viscosidade)
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Equipamentos na indstria
1. Equipamentos por estgios

Compostos por subunidades discretas (estgios) onde as
fases so colocadas em contato, misturadas, separadas
e enviadas para subunidades adjacentes.

O equilbrio entre as fases alcanado em cada estgio

2. Equipamentos de contato diferencial

Fornecem rea de contato para a transferncia de massa
ao longo de praticamente todo o comprimento do
equipamento.

O equilbrio no estabelecido em nenhum ponto do
extrator, sendo as fases separadas somente na
extremidade deste
http://labvirtual.eq.uc.pt/siteJoomla/index.php?Itemid=148&id=63&option=com_content&task=view
Misturador-decantador
1. Equipamentos por estgio
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50
Extrao em operao em corrente cruzada
Srie de misturadores-decantadores
Extrao em operao em corrente cruzada
Srie de misturadores e decantadores
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Coluna de pratos perfurados
Fase dispersa = leve
Forma-se barragem abaixo do
prato, onde fase leve se acumula
Passagem atravs dos pratos
provoca a disperso em
nmero elevado de gotas e
gera rea de transferncia de
massa do estgio superior
Fase pesada, escoa
descendentemente e entre um
estgio e outro passa pela regio
externa das barragens
2. Equipamento de contato diferencial
Extrao sem regies de separao de fases ao longo da coluna
Coluna spray
Fase dispersa alimentada por distribuidor
para que haja melhor disperso
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Coluna spray

Vantagem:

Construo muito simples

Desvantagem:

Baixa eficincia de transferncia de massa
(inexistncia de acessrios para melhorar disperso ou
nveis altos de mistura axial)
Recheio tipo aleatrio
Tamanho < 1/8 do dimetro
da torre

Ex: anel de Raschig e outros
cilindros

Material: plstico, cermico,
metlico

Recheio tipo estruturado
Unidades maiores

constitudas de placas finas ou
folhas de material plstico ou
metlico recurvado,
densamente empacotado,
geometria regular
Coluna de Recheio ou Empacotadas

Reduz o efeito da
mistura axial, mas
taxas de transferncia
de massa no
elevada
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Coluna de discos rotativos
http://www.chemicalonline.com/article.mvc/Podbielniak-Contactor-A-Unique-Liquid-Liquid-0001
Equipamento centrfugo
Extrator Podbielniak
Escoamento contra-corrente
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Equipamento centrfugo Extrator Podbielniak Pod
Tempo de residncia baixo
Separa sistemas de compostos que apresentam diferenas de
densidade muito pequenas

Pode-se combinar um misturador externo e uma centrfuga

Equipamento centrfugo
Centrfuga de discos Decantador
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Extrao contra-corrente
Equipamento de contato diferencial
Vantagens da extrao lquido-lquido em sistemas de duas fases
1. Possibilidade de operao contnua em larga escala
temperatura ambiente;

2. Manuteno das protenas em soluo em meio a
polmeros ou sais que as protegem da desnaturao;

3. Possibilidade de eliminao de algumas etapas do
processo de purificao para molculas intracelulares,
devido separao de clulas e seus fragmentos em uma
determinada fase (geralmente fundo) simultnea ao
fracionamento de protenas e outras molculas.
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Esquema completo
Pessoa Jr, A & Kilikian BV. Purificao de Produtos
Biotecnolgicos. 1ed., Ed Manole, Barueri, SP, 2005.
Captulos 2, 5 e 6

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