Avanços Recentes e Tendências Futuras Das Técnicas de Separação - Scientia Chromatographica

2008 | v. 0 | n.
0 17
S c i e n t i a Ch r o ma t o g r a p h i c a
Resumo
O ob je ti vo de uma an li se qu mi ca a ob ten o
de da dos qua li ta ti vos e/ou quan ti ta ti vos a res pe i to de um
ou mais com po nen tes de uma amos tra. Qu an do a tc ni ca
ana l ti ca es co lhi da a cro ma to gra fia, o pro ce di men to
ana l ti co pode ser di vi di do em 3 eta pas: pr-cro ma to -
grfica, cro ma to gr fi ca e ps-cro ma to gr fi ca. A eta pa
pr-cro ma to gr fi ca en vol ve a amos tra gem, o trans por te
da amos tra at o la bo ra t rio de an li se, e a eta pa de pre pa -
ro da amos tra. Tc ni cas como LLE, SPE, SFE, ASE,
SPME e ou tras so em pre ga das nes ta eta pa A eta pa cro -
ma to gr fi ca visa a se pa ra o do ana li to de seus prin ci pa is
con ta mi nan tes, ge ran do os da dos ne ces s ri os para a iden -
ti fi ca o e/ou quan ti fi ca o. Tc ni cas como HPLC-UV,
GC-ECD, LC/MS/MS, GC/MS e ou tras so fre quen -
temen te em pre ga das. A eta pa ps cro ma to gr fi ca visa
tratar os da dos qua li ta ti vos e quan ti ta ti vos ob ti dos.
No presente artigo, uma reviso crtica a
respeito destas 3 etapas envolvidas em uma anlise
cromatogrfica incluindo os fundamentos tericos, a
instrumentao, vantagens e limitaes, e aplicaes
das principais tcnicas, apresentada e discutida
criticamente, do ponto de vista do autor.
Contedo
1. Introduo
2. Tcnicas de Amostragem
3. Tcnicas de Preparo de Amostras
3.1. Extrao Lquido-Lquido (LLE)
3.2. Extrao Lquido-Slido
3.3. Extrao com Fluidos Pressurizados
3. 4. Tcnicas Miniaturizadas de Extrao
4. Limpeza (Clean-up) da Amostra
4.1. Cromatografia Lquida em Coluna Aberta
em baixa presso
4.2. Cromatografia Lquida de Alta Eficincia
(HPLC ou CLAE)
4.3. Cromatografia Lquida Multidimensional
4.4. Outros enfoques para a limpeza de amostras
5. Anlise Qualitativa e Quantitativa: o papel da
Cromatografia e Tcnicas Afim
5. 1. As Tcnicas Cromatogrficas
5.2. Anlise Qualitativa
5.3. Anlise Quantitativa
6. Tendncias na rea de Cromatografia e Tcnicas
Associadas
6.1. Preparo de Amostras
6.2. Miniaturizao das colunas cromatogrficas
6.3. Anlise rpidas
6.4. Cromatografia multidimensional
7. Concluses
8. Referencias
Avanos Recentes e Tendncias Futuras das
Tcnicas de Separao: uma viso pessoal
Fernando M. Lanas
Universidade de So Paulo
Instituto de Qumica de So Carlos
13560-970 So Carlos (SP)
Brasil
flancas@iqsc.usp.br
1. Introduo
A segunda metade do sculo XX observou
um avano sem precedentes nas tcnicas de
separao, devido aos novos desafios gerados pelo
aumento da populao mundial e a demanda por
servios a partir do incremento tecnolgico
marcante do perodo Ps-Guerra. Contrariamente
s exigncias anteriores a este perodo, quase
sempre razoavelmente atendidas por mtodos
fsicos simples de anlise como, por exemplo,
gravimetria, a complexidade dos problemas
ambientais, de sade, alimentao, energia, e
muitos outros, passou a exigir tcnicas de anlise
mais complexas. Esta necessidade trouxe a
exigncia de tcnicas mais rpidas, eficientes e,
principalmente, capazes de serem automatizadas
atravs de instrumentos complexos indisponveis
at a dcada de 1950. A popularizao dos
computadores, graas aos preos tornados mais
accessveis, possibilitou o desenvolvimento de
equipamentos totalmente comandados por um
computador pessoal de grande capacidade de
processar dados e armazen-los, a um custo o qual
hoje apenas uma pequena frao do custo da
maioria dos equipamentos que ele comanda .
A complexidade analtica no reservada
apenas rea de instrumentao: mtodos mais
elaborados (muitas vezes mais de um mtodo
usado para a mesma anlise) tem que ser
desenvolvidos e ou adaptados a esta nova
realidade, alm de passarem por etapas extensas
de validao antes do uso para que os dados sejam
reconhecidos pelas agencias governamentais as
quais regulamentam a aceitao de resultados de
anlises qumicas. No caso particular de mtodos
analticos para emprego na rea de Sade
Humana, as exigncias quanto validao das
metodologias so enormes, variando de um pas
para outro e, muitas vezes, de um rgo para outro
dentro do mesmo pas.
Na anlise de compostos-alvo (target
compounds) presentes em matrizes consideradas
complexas como alimentos, ambientais, e fluidos
biolgicos, regra geral o objetivo analisar um ou
alguns compostos em uma matriz na qual est
presente em concentraes muito baixas
(geralmente referida como anlise de traos).
Nestes casos, usualmente necessrio, empregar
18 www. sci ent i achromatographi ca. com
Abstract
The main goal when performing a chemical analysis is to obtain qualitative as well as quantitative information
about one or more components of a sample. When the analytical technique of choice is chromatography, the analytical
procedure might be divided into tree steps: (1) pre-chromatographic step; (2) chromatography; (3) pos-chromatographic
step. The pre-chromatographic step usually involves either the sample generation or collect (sampling), transport to the
laboratory, and sample preparation that usually involves several procedures such as extraction, clean up, derivatization,
pH adjustment, and so on. Several analytical techniques are used in this step, including LLE, SPE, SFE, ASE, SPME,
SBSE, among others. The chromatographic step aims the separation of the analite(s) from its natural contaminants, as
well as from the interfering species generated during the sample processing .Techniques such as HPLC-UV, GC-ECD,
LC/MS/MS, GC/MS are frequently used for this purpose. Pos chromatographic step aims to treat the qualitative and
quantitative data generated through the use of a proper chromatographic detector, doing all the required calculation,
comparison with chromatographic data bank (retention indexes), spectral libraries (UV and MS spectra). A proper
selection of the best approach for each step, as well as its correct performance under an appropriate quality assurance
system, will assure the quality of the generated results.
In the present paper, a critical review with respct to the 3 describes steps involved in a typical
qualitative/quantitative analysis using chromatographic mehods, including theoretical background, instrumentation,
advantages and limitations, and applications of the main techniques is presented and discussed.
uma srie de etapas, incluindo: extrao do analito
da amostra, sua purificao para eliminao de
potenciais contaminantes e interferentes, os quais
podem comprometer o resultado analtico, sepa-
rao empregando tcnicas de separao de alta
resoluo (HRGC, HPLC, CE e outros) e
deteco por tcnicas ainda mais complexas
como, por exemplo, a espectrometria de massas
1
.
A Figura 1 exemplifica um quadro tpico
das vrias etapas necessrias para a realizao de
uma anlise tpica de um composto presente em
baixas concentraes em matrizes complexas.
O procedimento pr-analtico inicia-se j
no delineamento do planejamento do proce-
dimento a ser utilizado, prevendo todas as etapas
pelas quais a amostra dever passar. Uma vez
estabelecido o protocolo do estudo, a amos-
tragem usualmente a primeira etapa do
procedimento experimental. Ela visa a seleo de
alguns componentes de um universo, o qual
possa represent-lo com a mxima fidelidade
possvel. Por exemplo, no caso de um pomar
contaminado com pesticidas, na prtica seria
impossvel analisar-se todos os frutos possivel-
mente contaminados.
A amostragem serve para assegurar que as
frutas a serem avaliadas, neste exemplo,
representam de maneira fidedigna o pomar como
um todo. No caso de amostras de alimentos, por
exemplo, o Codex Alimentarius recomenda
vrios guias (guidelines) para a amostragem de
frutas e vegetais. Regra geral, aps a amostragem
a parte selecionada para a anlise encaminhada
para o laboratrio de anlise quase sempre
longe do local onde a amostragem ocorreu.
Assim, o transporte e armazenagem so de
extrema importncia para assegurar a integridade
da amostra a ser analisada. Raramente a amostra
j se encontra em uma forma apropriada para a
anlise, requerendo que as substncias de
interesse sejam removidas da matriz original (por
exemplo, para anlise de hormnios em frango
necessrio inicialmente remover-se o hormnio
da matriz para depois efetuar-se a anlise
instrumental por exemplo, atravs de HRGC).
Esta etapa denominada preparo da amostra.
O preparo da amostra tem como principal
objetivo isolar o(s) componente(s) de interesse
de outros compostos presentes na matriz os quais
podero interferir posteriomente na deter-
minao analtica. Muitas vezes esta etapa
tambm denominada de extrao mas, em muitos
casos, no necessria uma etapa de extrao
para que o analito possa ser avaliado por uma
tcnica instrumental. Aps o isolamento dos
compostos de interesse da matriz, pode ser
necessria uma etapa complementar de limpeza
(clean up) da amostra, particularmente em se
tratando de anlises complexas.
A limpeza da amostra (clean up)
quase sempre empregada na anlise de amostras
ambientais, fluidos biolgicos, alimentos e
similares pois, devido a grande quantidade de
compostos presentes nestas matrizes, invaria-
velmente a tcnica de extrao no ser
suficiente para gerar uma extrato isento de
contaminantes. Muitas vezes nesta etapa
muda-se o solvente original de extrao para
evitar problemas posteriores com detectores de
cromatografia, por exemplo, ou efetua-se a
concentrao dos compostos de interesse pela
reduo do volume de solvente. Assim, esta
etapa complementa a anterior visando a
preparao da amostra o mais isento possvel de
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Homogeinizao
Extrao Anlise
Concentrao
ou diluio
Limpeza
(clean-up)
Reduo do tamanho
Figura 1. 1.Diagrama esquemtico das principais etapas envolvidas na anlise qumica de amostras complexas.
compostos qumicos os quais possam interferir
na tcnica instrumental de anlise. Alguns
autores incluem o clean up como uma forma de
preparo da amostra, outros no. O importante
entender o papel de cada uma delas. Aps esta
etapa, a amostra est pronta para a anlise
instrumental.
A anlise instrumental, neste caso
cromatografia, visa a determinao da identidade
(anlise qualitativa) e da quantidade (anlise
quantitativa) do composto presente inicialmente
na amostra em anlise. As tcnicas mais utilizadas
para esta finalidade so a cromatografia gasosa
(GC) e a cromatografia lquida (LC), acopladas a
tcnicas apropriadas de deteco. Outras tcnicas
como eletroforese capilar (CE), cromatografia
com fluido supercrtico (SFC), e outras, tambm
tem sido utilizadas, porm em menor escala. A
identificao dos componentes isolados geral-
mente feita atravs do acoplamento entre a tcnica
cromatogrfica de separao e uma tcnica de
identificao, como a espectrometria de massas
(MS). A quantificao efetuada avaliando-se a
rea ou a altura dos picos gerados no
cromatograma, atravs de softwares dedicados a
esta finalidade.
Neste volume inaugural do peridico
Scientia Chromatographica, cujo objetivo exata-
mente discutir estas tcnicas de preparo de amostra,
separao (LC, GC, SFC e outras) e identificao
(Espectrometria de Massas, dentre outras), este
trabalho visa apresentar, de forma crtica e atual,
segundo o ponto de vista do autor, os recentes
avanos na rea e as tendncias futuras. Esses
assuntos sero ampliados e discutidos em detalhes
nos futuros volumes do peridico em questo,
atravs das vrias sesses dedicadas s etapas
pr-cromatogrficas, diferentes tcnicas de
separao e etapas ps-cromatografia.
2. Tcnicas de Amostragem
A amostragem , invariavelmente,
considerada uma das etapas mais crticas do
procedimento analtico, uma vez que a seleo
incorreta do material a ser analisado inviabiliza
qualquer tentativa de correo posterior do
problema
2
. Deve ser lembrado que a amostragem
visa o isolamento de uma quantidade muito
pequena de uma amostra a qual faz parte de um
universo muito maior (exemplo: alguns litros de
gua para representar a condio de um rio
inteiro!!!). Neste caso, o material orgnico
presente na gua varia de ponto a ponto tanto na
extenso quanto na profundidade, dificultando
sobremaneira o projeto de amostragem. Alm
disso, pelo fato do rio ser um sistema dinmico e
no esttico, o momento da amostragem tambm
importante, o que requer o registro tambm do
momento da amostragem para futuras cor-
relaes. De forma anloga, a amostragem de
sedimentos de rio uma etapa igualmente
complexa e difcil, ampliada pelo fato de poucos
guias internacionais a este respeito (diferen-
temente de gua e solo). Apesar dos esforos da
Comunidade Europia em normatizar as tcnicas
de amostragem de solo, pouco avano foi
atingido na prtica
3-5
. Em qualquer caso, e
independentemente da matriz e das substncias
de interesse, a anlise de matrizes complexas
especialmente as naturais como ambiental,
alimentos e fluidos biolgicos deve ser
precedida de um plano de amostragem,
preferencialmente validado.
Todo o planejamento, execuo, inter-
pretao de resultados, e redao dos relatrios
de anlise devero estar dentro de um sistema de
qualidade compatvel com sua finalidade
6
.
3. Tcnicas de
Preparo de Amostras
Aps a etapa de amostragem, a parte isolada
a qual agora deveria ser denominada sub-amostra
mas que, na prtica, continua sendo denominada
amostra, deveria idealmente ir diretamente para a
anlise instrumental, o que raramente feito. Isso
deve-se ao fato de que em geral o produto da
amostragem contm contaminantes prprios da
matriz, alm de outros agregados durante o
processo ou transporte (por exemplo, comum
recebermos no laboratrio amostras de batata, para
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anlise de resduos de pesticidas, contendo terra).
A sub-amostra, contendo os compostos de
interesse e os contaminantes, e doravante
denominada amostra por simplicidade e por refletir
a nomenclatura efetivamente utilizada nos
laboratrios de anlise, dever ento ser
transformada para outra forma mais apropriada
para a anlise. No caso de anlise de frmacos em
fluidos biolgicos, por exemplo, a presena de
protenas e outras macromolculas, assim como de
outras substncias menores, pode interferir,de
diferentes maneiras, na anlise. Deve ser lembrado
que estas matrizes contem centenas de compostos
qumicos, a maioria em concentrao superior do
frmaco, o que dificulta ainda mais sua deter-
minao qualitativa e quantitativa. Muitas vezes
existe ainda a necessidade de converter-se uma
substncia da forma na qual se encontra para outra
mais amena para a anlise (devido a problemas de
estabilidade trmica, falta de volatilidade, ausncia
de grupos funcionais adequados para deteco
espectroscpica e outras), atravs de proce-
dimentos de derivatizao. Este conjunto de aes,
usualmente denominado genericamente de preparo
de amostras, envolve diversas etapas no labora-
trio, das quais a mais importante e complexa ,
sem dvida, a etapa de extrao. Em muitos casos
atualmente, a etapa de extrao pode ser
combinada com a concentrao dos analitos,
derivatizao e outros procedimentos, em uma
nica etapa para o preparo da amostra. Existem
vrias tcnicas de extrao, dependendo do estado
fsico, qumico e a complexidade da amostra e dos
compostos a serem extrados, sendo as principais
discutidas a seguir.
3.1. Extrao Lquido-Lquido (LLE)
Na extrao lquido-lquido (LLE, liquid-
liquid extraction) duas fases imiscveis so
empregadas: uma fase A, a qual contm o soluto
de interesse X, e uma fase B a qual ser colocada
em contacto com ela. Desta forma, ocorrer uma
distribuio do soluto X entre as duas fases, aps o
que o componente X poder ser submetido a outro
processo de extrao ou encaminhado para a
anlise por HPLC.
De acordo com a teoria geral do equilbrio
qumico, para um processo reversvel
X
A
X
B
A constante de equilbrio pode ser expressa
pela lei de distribuio de Nernst como
K
[X]
[X]
D
B
A
=
onde K
D
a constante de equilbrio, [X]
B
a
concentrao de X na fase B (numerador da
expresso), e [X]
A
a concentrao de X na fase A.
A situao experimental ideal seria aquela
na qual o equilbrio fosse altamente favorecido no
sentido da transferncia de X para a fase B, ou seja,
que o valor de K
D
fosse elevado. Valores pequenos
de K
D
indicam que o processo desfavorecido e
que a transferncia de X para a fase B ocorrer em
pequena extenso. Esta equao possui 3 restries
principais, as quais so usualmente observadas
para extrao de solutos a serem analisados por
LC: (1) a concentrao de X deve ser bastante
baixa em A e em B; (2) a forma molecular de X
deve ser a mesma nas duas fases; (3) as duas fases
devem ser imiscveis.
Dependendo da forma com a qual as duas
fases so colocadas em contacto, trs modos
principais de extrao so possveis: batelada,
contnua, e em contra-corrente.
3.1.1. Extrao em batelada
Na extrao em batelada, um lquido
contendo o soluto dissolvido agitado com um
segundo lquido imiscvel, em um recipiente
fechado, at que o equilbrio seja estabelecido.
As duas fases so colocadas em repouso e, ento,
separadas mecanicamente para que a fase
contendo o soluto de interesse seja usada em
outras operaes (outras extraes, ou a anlise
instrumental). Este procedimento usualmente
realizado com um simples funil de separao
A extrao em batelada uma forma de
extrao lquido-lquido bastante utilizada em
laboratrios analticos. Apresenta como
principais vantagens a simplicidade, pequeno
Figura 2. Exemplo de equipamentos empregados em
extrao contnua.
investimento na aquisio dos dispositivos de
vidro necessrios para a extrao, recuperao
boa do soluto se o experimento for bem projetado
e executado, e requer pequena especializao do
operador. Como principais desvantagens esto o
grande volume de solventes txicos utilizados e a
exposio do operador ao contato com seus
vapores; tempo de extrao geralmente longo para
que uma boa transferncia do soluto ocorra de
uma fase para a outra; dificuldade em informatizar
a tcnica; baixa seletividade. Um grande esforo
foi dispendido na ltima dcada com a inteno de
contornar estas dificuldades, com algum sucesso.
O desenvolvimento de micro dispositivos em
chips, e de dispositivos robticos
7-10
para LLE,
sugere que a miniaturizao desta tcnica poder,
em breve, provocar o ressurgimento de seu uso em
larga escala.
3.1.2. Extrao contnua
Nesta forma de extrao um lquido
passado continuamente, de forma dinmica,
atravs de (ou sobre) um lquido estacionrio o
qual contm a amostra, at que todo o
componente desejado seja removido. As duas
fases so separadas fisicamente, e a que contm o
constituinte de interesse usada para outras
operaes. Uma vez que o lquido extrator passa
atravs ou sobre o material rapidamente,
provavelmente na extrao contnua no seja
estabelecido um equilbrio. Entretanto, como o
processo de extrao continua por um tempo
prolongado (geralmente vrias horas) todo o
componente de interesse pode ser extrado.
Quando o valor de K
D
for muito pequeno para o
analito de interesse (K
D
< 1) e consideravelmente
diferente do valor de K
D
dos outros componentes
da amostra, muitas extraes em batelada
devero ser necessrias para a remoo do
componente de interesse da amostra.
O projeto do equipamento utilizado na
extrao contnua deve levar em conta se o
solvente a ser adicionado amostra (solvente
extrator) mais leve ou mais pesado do que a
soluo contendo os solutos de interesse (Figura 2).
O extrator apresentado na Figura 2a
empregado quando o soluto extrator mais leve
do que a soluo contendo a amostra. O solvente
colocado no frasco (A), e aquecido fazendo
com que os vapores passem para o topo do tubo
central (B), condensando no condensador (C).
As gotas do condensado caem atravs do funil de
aste longa (D) para o fundo da soluo a ser
extrada. As gotas do extratante sobem pela
soluo, extraindo medida em que se movem,
at alcanar a superfcie. Quando o nvel do
lquido extratante no tubo central atinge o brao
lateral (F), o extratante volta para o frasco de
destilao (A). O processo ento repetido.
A Figura 2b mostra um esquema de um
extrator empregado quando o solvente de extrao
mais denso do que a soluo que contm a
amostra. O solvente extrator colocado no frasco
de destilao (A) e aquecido; os vapores passam
para a parte superior do tubo diretamente na
superfcie da soluo a ser extrada (D) e, por serem
mais densas, as gotculas atravessam a soluo at
o fundo, extraindo medida em que descem. A
presso hidrosttica forar o extratante atravs do
brao lateral (E) e de volta para o frasco de
destilao. O processo ento repetido at que todo
o soluto de interesse tenha sido removido.
Processos de extrao contnua so,
usualmente, bastante demorados (horas at dias). A
vantagem desta tcnica que solutos com valores de
K
D
pequenos, os quais dificilmente seriam extrados
por processos de batelada, podem ser removidos da
amostra atravs de uma extrao contnua.
3.2. Extrao Lquido-Slido
Existem vrias tcnicas analticas empre-
gadas na extrao dos compostos de interesse em
matrizes slidas e semi-slidas, desde simples e
baratas (porm com vrios inconvenientes) como a
extrao com solvente sob agitao, at bastante
sofisticadas como as tcnicas que empregam
solventes pressurizados.
Na prtica atual, as tcnicas mais empre-
gadas para este tipo de amostra empregam
solventes lquidos ou um fluido pressurizado
(SFE, ASE, SWE e outras). Dentre as tcnicas
que empregam solventes lquidos a Extrao
Soxhlet (Sox) e a Extrao em Fase Slida (SPE)
so as mais utilizadas.
3.2.1. Extrao Soxhlet
A Extrao Soxhlet, ou alguma de suas
variaes, foi uma das tcnicas de extrao mais
empregadas para amostras slidas na segunda
metade do sculo XX. O equipamento utilizado
nesta tcnica relativamente simples (Figura 3),
o que auxiliou na sua popularizao.
O slido a ser extrado , geralmente,
pulverizado e colocado em um cartucho feito de
papel de filtro ou de algodo (E), no centro da
cmara (A). O solvente extrator aquecido no
frasco (B) e os seus vapores sobem atravs do
brao lateral (C) at o condensador (D) onde
liquefeito. O lquido permanece nesta cmara
aumentando de volume e extraindo o slido at
que o nvel de lquido atinja o topo do brao
lateral (F). Neste ponto, a presso hidrosttica
dentro da cmara faz com que o solvente seja
sifonado de volta ao frasco de destilao. Este
processo continua at que todo o soluto tenha
sido removido do slido. Trata-se, portanto, de
uma extrao contnua do tipo lquido-slido.
A maior limitao desta tcnica o tempo
necessrio para obter-se um bom rendimento de
extrao, usualmente muitas horas ou at dias, o
que tem feito com que novas tcnicas mais
rpidas e automatizadas venham sendo desen-
volvidas com a inteno de substitu-la. Em
meados da dcada de 70, uma nova tcnica foi
introduzida, denominada Extrao em Fase
Slida SFE (Solid Phase Extracion).
3.2.2. Extrao em Fase Slida (SPE)
A Extrao em Fase Slida (SPE) uma
tcnica de separao lquido-slido, baseada nos
mecanismos de separao da cromatografia lquida
de baixa presso, tambm conhecida como
cromatografia lquida clssica. Do ponto de vista
prtico, a SPE, na sua forma mais simples e
conhecida, comporta-se como uma cromatografia
lquida empregando-se uma pequena coluna
aberta, usualmente denominada cartucho de
extrao, a qual contm a fase slida (denominada
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Figura 3. Extrator Soxhlet.
fase estacionria em cromatografia). A soluo
contendo o analito de interesse colocada no topo
superior do cartucho e aspirada com pequeno
vcuo ou pressionada levemente com uma seringa
ou gs, de forma a penetrar no cartucho. Aps toda
a fase lquida haver sido drenada, o analito retido
no cartucho eludo com um pequeno volume de
solvente de forma a coletar-se o analito em uma
concentrao j apropriada para anlise. A Figura 4
ilustra um exemplo tpico de um cartucho para
extrao em fase slida, enquanto que a Figura 5
mostra as principais etapas envolvidas na SPE
quando o objetivo isolar um composto (ou uma
classe) presente em uma amostra complexa.
Dentre os principais modos de operao
em SPE destacam-se
11
:
Concentrao ou Enriquecimento
O objetivo principal passar-se, atravs do
cartucho, um grande volume de amostra de forma a
aprisionar-se somente o analito, deixando passar o
solvente e interferentes. Em etapa seguinte, elui-se
o analito de interesse com pequena quantidade de
solvente, de forma que o analito coletado estar
bastante mais concentrado que na amostra original.
Este tipo de procedimento muito comum na
anlise de amostras de interesse em qumica
ambiental, nas quais usualmente o analito de
interesse encontra-se extremamente diludo
(exemplo: micropoluentes em gua potvel) e sua
determinao direta por cromatografia difcil ou
invivel. Aps a etapa de concentrao, a amostra
Figura 5. Principais etapas empregadas em SPE visando o isolamento de um composto (ou classe de compostos).
Figura 4. Ilustrao de um cartucho tpico empregado em Extrao em Fase Slida (SPE).
estar em um nvel de concentrao apropriado
para ser analisada diretamente por uma tcnica
analtica de interesse.
Isolamento do Analito (Clean-up)
Neste caso o objetivo principal no o de
concentrar a amostra mas sim isolar o analito de
interesse dos interferentes da matriz. A amostra
original pode j ser concentrada o suficiente para
a anlise por uma tcnica apropriada, mas os
constituintes da matriz podero interferir no
processo de anlise. Um exemplo bastante tpico
de aplicao do clean-up na anlise de
resduos de agrotxicos em alimentos. Uma vez
tratar-se de uma matriz muito complexa, com
centenas de compostos qumicos presentes,
necessrio isolar-se o pesticida dos outros
componentes presentes no extrato, antes da
medida analtica. Deve ser observado que os dois
procedimentos apresentados no so mutua-
mente excludentes, de forma que pode-se desejar
efetuar a concentrao do analito e o clean-up
da amostra em um mesmo procedimento de
extrao em fase slida.
Isolamento da Matriz
Neste procedimento o objetivo reter na
fase slida os interferentes da matriz, ao invs do
analito de interesse (o qual passa direto com o
solvente da amostra). O analito coletado em um
frasco para a anlise e os interferentes so retidos
no cartucho o qual descartado. Este procedimento
usualmente utilizado para clean-up e no para a
concentrao de amostras.
Estocagem de Amostra
Este caso bastante empregado para a
anlise de amostras as quais se encontram em local
distante do laboratrio analtico. Um exemplo
tpico a anlise de gua de rio/lago/mar,
localizados longe do laboratrio que desenvolve o
estudo. Neste caso, os cartuchos so transportados
at a fonte de gua e procede-se primeira etapa da
anlise no local, a qual consiste em passar-se a gua
atravs do cartucho, de forma a reter-se os analitos
de interesse. Aps esta etapa, o cartucho contendo
o analito de interesse armazenado em baixas
temperaturas e transportado at o laboratrio
analtico. Uma das principais vantagens deste
procedimento evitar-se o transporte de grandes
volumes de amostra quando vrias amostras forem
analisadas, assim como na anlise de compostos
lbeis e/ou volteis. importante efetuar-se um
estudo preliminar para conhecer-se a estabilidade
do analito de interesse no cartucho a ser empregado
(tempo de estocagem, temperatura, natureza do
cartucho, etc.).
Os mecanismos de separao em SPE so
os mesmos da cromatografia lquida; como
conseqncia, as fases slidas empregadas em
SPE so as mesmas empregadas em cromato-
grafia lquida de baixa presso. A escolha da fase
slida apropriada depende da natureza do analito
de interesse e da matriz na qual ele se encontra.
Os principais mecanismos atualmente em uso em
SPE so: adsoro; partio (fase normal e fase
reversa); troca inica; excluso por tamanho.
Estes mecanismos esto associados a
processos qumicos e fsicos que atuam durante a
separao. Dentre as principais foras qumicas
atuantes entre as molculas do analito e do sorbente
(fase slida) destacam-se as foras inicas; ligaes
de hidrognio, interaes do tipo dipolo-dipolo;
dipolo-dipolo induzido; dipolo induzido dipolo
induzido (foras de disperso).
3.2.3. Seleo do Formato em SPE
O formato mais popular em SPE o de
cartucho. Para tal, usualmente emprega-se o
corpo de uma seringa plstica (polipropileno)
dentro do qual o material de empacotamento fica
retido entre dois discos (frits) de polietileno. A
parte inferior do cartucho afunilada e apresenta
uma extenso a qual encaixa em dispositivos
para efetuar-se vcuo de diferentes fabricantes.
Existem tambm cartuchos com o corpo de vidro
ou teflon, usados na tentativa de evitar-se a
presena de materiais extrados do cartucho de
polipropileno. De forma anloga, existem frits
feitos de ao inox, titnio e polipropileno. Estes
2008 | v. 0 | n. 0 25
cuidados so particularmente importantes nos
casos do uso de amostras muito diludas e
detectores seletivos e sensveis como captura de
eltrons e espectrometria de massas.
A Figura 6 ilustra alguns formatos
empregados em SPE. Alm destes formatos, outras
possibilidades desenvolvidas em vrios laboratrios
esto sendo comercializadas, algumas com sucesso.
O formato mais popular em SPE continua
sendo, de longe, o tipo cartucho, seguido dos
discos. Entretanto, vrios outros formatos tm
surgido recentemente com o intuito de melhorar o
desempenho da SPE, principalmente facilitando a
automao, diminuindo o tempo de anlise,
permitindo custos mais baixos por anlise, maior
flexibilidade, etc. Uma destas variaes consiste
em utilizar-se uma mistura de cartucho com disco
(Figura 7). Neste caso, o disco colocado dentro
de um cartucho de SPE, e o procedimento de
anlise similar aquele usado para discos.
A principal vantagem deste sistema permitir o
uso dos dispositivos e de sistemas de automao
empregados para os cartuchos convencionais de
SPE.
Outro formato, particularmente interessante
quando anlises rpidas so desejadas, uma vez
que permite fluxos bastante elevados, o uso de
um cartucho empacotado com uma camada fina de
partculas (mas mesmas usadas em SPE conven-
cional). Assim, teremos uma situao similar
anterior (Figura 7a), porm com partculas ao invs
de disco (Figura 7b).
Um dos mais recentes formatos, de grande
utilidade para indstrias farmacuticas e de
biotecnologia, o de placas contendo 96 (ou mais)
reservatrios (Figura 7c). Cada reservatrio
contm uma coluna de SPE na forma de um disco
com uma camada fina de empacotamento . Este
Figura 6. Formatos empregados em SPE.
Figura 7. Formatos alternativos de SPE.
arranjo permite a anlise de um nmero grande de
amostras, simultaneamente, sendo de particular
utilidade em laboratrios onde a anlise rotineira
de muitas amostras praticada. Uma das
inconvenincias neste caso a maior facilidade
com que ocorre contaminao usando este
formato. A proximidade entre os reservatrios faz
com que qualquer vazamento em um deles
facilmente contaminar o outro. Isto pode ocorrer
devido a vrios motivos, tais como o bloqueio de
um dos reservatrios, usando um dispositivo de
vcuo, e a conseqente contaminao de
reservatrios vizinho. Outra fonte comum de
contaminao a base da placa .
Quando um nmero menor de amostras
deve ser processado, uma boa alternativa foi
recentemente introduzida pela empresa Ansys
Diagnostics. Ela consiste em usar-se pontas
empregadas em pipetas volumtricas digitais
contendo um disco de SPE (Figura 7d). A
principal vantagem deste sistema o fato de
dificultar contaminao, uma vez que as pontas
da pipeta so descartveis. Outra vantagem
permitir o fluxo bi-direcional do solvente (para
cima ou para baixo) e dispensar o uso de
dispositivo de vcuo. O surgimento de outras
empresas comercializando este formato poder
dar margem a uma ampliao na oferta deste tipo
de SPE, a custos mais acessveis.
3.2.4. SPE empregando Disperso em
Matrizes Slidas
A tcnica denominada Disperso em Matriz
Slida (Matrix Solid-Phase Dispersion) usa um
suporte slido, geralmente contendo uma fase
quimicamente ligada (ex: C-18), atuando como um
abrasivo para produzir uma ruptura na arquitetura
da amostra, facilitando o processo de extrao. A
amostra sofre disperso na superfcie do material
suporte - fase quimicamente ligada, formando uma
nova fase mista o que proporciona o isolamento de
analitos presentes em vrias matrizes
12
. A tcnica
foi empregada pela primeira vez em 1989 por
Barker e colaboradores com o intuito de isolar
resduos de drogas em tecidos. Denominada
originalmente disperso em fase slida
13
, na prtica
ela consistia em uma modificao da SPE para
aceitar amostras slidas e semi-slidas tais como
matrizes biolgicas. Barker empregou um cartucho
vazio de SPE, sendo que a amostra de tecido era
previamente homogeneizada com C-18, uma fase
slida muito empregada em SPE. Aps transferir a
mistura para o cartucho, a eluio era feita como
em SPE. A Figura 8 ilustra o arranjo original
utilizado por Barker
13
.
Nesta tcnica, o suporte possui vrias
funes. Em primeiro lugar age como um abrasivo
que promove a ruptura da arquitetura geral da
amostra. Em segundo lugar, quando uma fase
lipoflica do tipo C-18 empregada ela age como
um solvente o qual ajuda na ruptura das
membranas celulares. Em terceiro lugar, o material
misturado ainda pode ser usado como
empacotamento de uma coluna e pode ser eludo
sequencialmente com solvente
12
. Esta tcnica tem
encontrado vrias aplicaes, principalmente na
anlise de amostras biolgicas
14,15
.
Na prtica, este processo pode ser dividido em
duas etapas, sendo que a primeira consiste no preparo
do cartucho contendo a amostra e a segunda na
eluio dos analitos de interesse. A fase slida
(exemplo: C-18) pesada e transferida para um
recipiente adequado para posterior triturao (a). A
amostra (exemplo: tecido animal) adicionada fase
slida (b) e ambos so triturados (c) at uma pasta
2008 | v. 0 | n. 0 27
Figura 8. Esquema do arranjo original utilizado por Barker
para a disperso em fase slida [25].
homognea ser obtida (30 60 seg. tipicamente). Este
sistema ir conter a amostra distribuda
uniformemente sobre a superfcie da fase slida,
como demonstrado atravs de microscopia eletrnica
de varredura
12
. A amostra ento colocada no
cartucho (d) previamente contendo um filtro (frita)
sobre o qual coloca-se (e) ento outro filtro (frita).
A seguir adiciona-se o solvente (f) e procede-se a
eluio com auxlio de uma pequena presso (g) para
diminuir o tempo de extrao. O extrato obtido
poder ser analisado diretamente, caso j esteja na
forma, pureza e concentrao adequados, ou sofrer
outras operaes como centrifugao, filtrao,
derivatizao, concentrao, dependendo da tcnica
analtica ser empregada.
A Figura 9 ilustra as etapas envolvidas na
processo de disperso em fase slida.
Apesar de ser uma tcnica relativamente
nova, vrias aplicaes da Disperso em Fase
Slida podem ser encontradas na literatura,
ilustrando o crescimento do interesse pela tcnica.
Uma de suas grande aplicaes, no momento,
como uma das etapas mais importantes em um
enfoque para a anlise de multi-resduos de
pesticidas em alimentos denominado QUECHERS
(Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe,
ou seja, Rpido, Fcil, Barato, Efetivo, Robusto e
Seguro)
16
.
3.3. Extrao com Fluidos Pressurizados
As tcnicas de extrao empregando fluidos
pressurizados tiveram como principal objetivo a
eliminao (ou, pelo menos, a diminuio) do
emprego de grandes volumes de solventes
orgnicos txicos, comuns em LLE. O termo
Figura 9. Etapas envolvidas no processo de Disperso em Fase Slida.
extrao com fluidos pressurizados ou extrao
com solventes pressurizados (pressurized solvent
extraction, PSE) tem sido empregado para
englobar as vrias tcnicas de extrao as quais
utilizam solventes em presses superiores
ambiente (> 1atm). Estas tcnicas tm sido
empregadas para a anlise de amostras slidas
(alimentos, solos, polmeros) e, em menor escala,
semi-slidos como sedimento de rio (e, muito
raramente, lquidos). As tcnicas mais empregadas
em PSE so a extrao com fludo supercrtico
(SFE), extrao com solvente sub-crtico (sub-
SFE) e a extrao acelerada com solventes (ASE).
Apesar de apresentarem caractersticas prprias de
cada tcnica, elas possuem vrios pontos em
comum. Com pequenas diferenas, devido s
caractersticas individuais de cada tcnica, o
esquema da Figura 10. pode englobar os principais
componentes de qualquer sistema para PSE.
O solvente (lquido, fluido sub-crtico ou
fluido supercrtico), armazenado no reservatrio
(A), bombeado atravs do sistema (B) de
pressurizao em direo cela de extrao (D) a
qual contm a amostra. A presso monitorada
pela vlvula (C) e a temperatura pelo forno (E)
onde a cela de extrao instalada. Um restritor
na sada do sistema (F) assegura a presso interna
do sistema, sendo o extrato obtido ao passar por
ele direcionado para o sistema de coleta (G), o
qual pode ser um frasco vazio, um frasco com um
solvente apropriado, o injetor de um cromat-
grafo, ou outro dispositivo de interesse.
3.3.1. Extrao com Fluido
Supercrtico (SFE)
Um fluido supercrtico uma substncia
qumica cuja temperatura e presso se encontram,
ambas, acima de seu estado crtico
17-20
. Esta
caracterstica confere aos fluidos supercrticos
propriedades diferentes dos gases e lquidos, as
quais podem ser utilizadas com diversas vantagens
na rea de extrao. Os fluidos supercrticos
apresentam elevado poder de solvatao, servindo
como excelentes solventes, ao mesmo tempo em
que sua elevada difusividade permite fcil
penetrao em matrizes complexas, auxiliando na
remoo dos solutos de interesse. Apesar de que
nas dcadas de 80 e 90 vrios solventes foram
avaliados para atuarem como solventes em SFE
(incluindo alcanos leves, alcois, SF6, freons,
amnia e vrios outros), a maioria dos estudos
atuais empregam o dixido de carbono, CO
2
Isto
se deve ao conjunto favorvel de propriedades as
quais incluem baixa toxicidade, facilidades de ser
produzido e purificado, e condies relativamente
brandas para atingir o estado crtico (Tc = 43
o
C e
PC = 73 bar). Devido s caractersticas ambien-
talmente corretas, o CO
2
no estado supercrtico
considerado um solvente verde - dentro da
grande nfase atual denominada Green
Chemistry Qumica Verde-, ou seja, um solvente
o qual no traz problemas ao meio ambiente. Uma
das limitaes do uso de CO
2
sua baixa
polaridade, o que dificulta a extrao de solutos
semi-polares e polares. Existem duas formas
2008 | v. 0 | n. 0 29
Figura 10. Esquema genrico de um sistema para Extrao com Fluido Pressurizado (PSE).
principais para contornar esta limitao: (1) o uso
de presses elevadas, bastante acima da crtica; (2)
adio de modificadores orgnicos, os quais so
solventes polares agregados ao CO
2
em pequenas
concentraes (geralmente 1-5 % v/v).
A instrumentao tpica empregada em
SFE apresentada de forma simplificada na
Figura 11.
A amostra colocada dentro da cela de
extrao, a qual lacrada e instalada no forno
previamente aquecido temperatura desejada.
O CO
2
pressurizado pela bomba em direo
cela de extrao; aps a remoo da amostra, os
componentes de interesse so coletados em um
dispositivo apropriado, geralmente um frasco
contendo um solvente.
A SFE uma tcnica de grande utilizao
principalmente nas reas de alimentos, combus-
tveis, sade e meio ambiente
21-32
. Uma vantagem
desta tcnica a facilidade com a qual pode ser
acoplada em linha com tcnicas cromatogrficas de
anlise, permitindo acoplamentos em linha do tipo
SFE-GC, SFE-LC, sFE-CE e outros
33-35
.
3.3.2. Extrao Acelerada
com Solventes (ASE)
Esta tcnica bastante similar SFE, porm
usualmente emprega um solvente orgnico
pressurizado, no necessariamente no estado
supercrtico, ao invs de CO
2
. Os mais utilizados
so solventes lquidos, como o metanol, tolueno ou
acetona, abaixo das condies crticas, porm em
presses suficientemente elevadas para assegurar
que estar no estado lquido durante a extrao.
Esta tcnica tem sido empregada principalmente na
extrao de substncias presentes em matrizes
slidas, tais como solos e polmeros
36-38
, apresen-
tando vantagens sobre seus concorrentes como a
extrao Soxhlet (maior tempo de extrao) e a
lquido-lquido, realizada em frascos agitados
(maior volume de solvente extrator). Alm disso, a
escolha apropriada da temperatura e da presso do
solvente permite uma extrao seletiva de apenas
determinados compostos de interesse. A ASE tem
sido tambm empregada com sucesso na extrao
de matrizes semi-slidas como sedimentos e
similares
39
.
3.3.3. Extrao com Fluido Sub-Crtico
(sub-SFE)
O fluido sub-crtico um solvente cuja
temperatura e/ou presso esto abaixo do ponto
crtico. Dentre os vrios fluidos avaliados para uso
como solvente extrator, o que apresenta melhores
resultados a gua, dando origem a uma tcnica
denominada extrao com gua sub-crtica (SWE,
subcritical water extraction). Esta tcnica
similar SFE e ASE, sendo ambientalmente
correta pela total excluso do uso de solventes
orgnicos. A seletividade do solvente escolhida
atravs da presso e da temperatura, podendo
variar desde um carter apolar at semi-polar.
Apesar de ser um solvente polar nas condies
normais de temperatura e presso, aumentando a
Figura 11. Esquema simplificado das principais partes de um extrator para SFE (note a semelhana com os componentes da Figura 10).
temperatura e mantendo-se a presso o suficiente
para evitar uma mudana para o estado de vapor, a
constante dieltrica da gua muda de 80 (a 25
o
C)
para 27 (a 25
o
C). Portanto, sua polaridade pode
ser selecionada atravs da escolha das condies de
temperatura e presso
40
. Na prtica, devido ao
aumento do poder de corroso da gua com a
temperatura, as condies empregadas esto
sempre abaixo da condies crticas para este
solvente (PC= 220 bar; Tc= 374
o
C).
O maior emprego da SWE tem sido na
anlise de poluentes orgnicos em matrizes
ambientais, porm pode ser empregada, na maioria
dos casos, em amostras analisadas por SFE e ASE.
3. 4. Tcnicas Miniaturizadas de Extrao
3.4.1. Micro Extrao em Fase Slida (SPME)
A Extrao em Fase Slida (SPE), descrita
anteriormente, uma tcnica bastante vantajosa
de extrao quando comparada aos mtodos
clssicos, tais como Extrao Lquido-Lquido e
extrao Soxhlet, principalmente no referente
economia de tempo e de solvente. Entretanto,
ainda apresenta alguns problemas os quais
devero ser eliminados para sua aceitao maior.
Um deles refere-se etapa de desoro do analito
aprisionado no cartucho de SPE: ou emprega-se
volumes razoveis de solvente (quantidade
bastante inferiores s empregadas em LLE e
Soxhlet, mas ainda considerveis) ou emprega-
se a desoro trmica a qual requer um
equipamento especial, geralmente de elevado
custo. Outro problema da SPE tem sido a grande
variabilidade da qualidade dos adsorventes de
um fabricante para outro. Assim, a mudana de
marca de fabricante, mesmo empregando o
mesmo tipo de fase estacionria (ex. C-18)
geralmente ocasionar na necessidade de adapta-
es nos volumes de solventes para que o mtodo
funcione adequadamente. Ou seja, esta mudana
geralmente requer uma validao do mtodo com
todas as suas conseqncias (principalmente
econmicas e de tempo). Assim, altamente
desejado o aparecimento de mtodos os quais
possam contornar estes problemas. Uma opo
recentemente desenvolvida com tal finalidade a
micro extrao em fase slida (SPME).
A Micro Extrao em Fase Slida
(SPME) uma tcnica relativamente simples do
ponto de vista instrumental. Na sua forma
original, baseia-se na absoro dos analitos por
uma fibra de slica modificada quimicamente,
com posterior dessoro trmica dos analitos em
um cromatgrafo a gs
41.42
. Nesta verso, o
sistema SPME foi construdo a partir de uma
seringa convencional para cromatografia, marca
Hamilton, modelo 7000, contendo uma fibra de
slica em seu interior.
A microseringa usada para introduzir a
fibra no injetor do cromatgrafo a gs, e proteg-la
enquanto no estiver em uso. Antes de colocar a
fibra dentro do mbolo, uma gota de cola do tipo
epoxi colocada na fibra a qual deixada
endurecer. Isto ir manter a fibra na posio
adequada na seringa. O comprimento ideal da fibra
varia dependendo principalmente do injetor do
cromatgrafo a ser empregado; valores ao redor de
10 cm so tpicos. O dimetro da fibra tambm
pode variar, sendo utilizado nos experimentos
iniciais um dimetro externo de 170 mcrons, e a
fibra no oca. Nos experimentos realizados no
incio da dcada de 90, ainda durante o
desenvolvimento da tcnica, Pawliszyn
43
inves-
tigou o uso da poliimida que reveste a slica
fundida como um meio de concentrao de
analitos, e comparou o desempenho com a slica
sem nenhum revestimento externo. Estudou as
diferentes variveis que influenciam o processo de
extrao, incluindo o tempo de exposio da
soluo a ser analisada fibra; a linearidade da
tcnica; a reprodutibilidade; seletividade e
interferentes. Este autor props que em SPME no
ocorre uma extrao exaustiva, mas sim um
equilbrio entre a fase aquosa (as aplicaes
apresentadas referem-se determinao de analitos
em gua) e a fase orgnica estacionria.
Pawliszyn
43
mostrou haver uma relao
linear entre a quantidade sorvida na fase
estacionria e a concentrao na amostra. Apesar
de originalmente desenvolvida para a anlise de
micropoluentes orgnicos em gua, a SPME tem
2008 | v. 0 | n. 0 31
encontrado aplicao em vrios campos como na
anlise de aromas e flavorizantes em frutas;
volteis no ar; medicamentos em urina e muitas
outras aplicaes. Um livro recente ilustra as
aplicaes da SPME em vrios campos de
interesse
44
. A tcnica ainda continua em fase de
desenvolvimento, apesar de j estar disponvel
comercialmente.
Os dois principais modos de operao em
SPME so a extrao direta e a extrao via
headspace (Figura 12). No modo extrao direta
(Figura 12a) o recobrimento da fibra inserido
diretamente na amostra e os analitos so
transportados da amostra para a fase extratante.
Para acelerar o processo emprega-se agitao
mecnica para transportar os analitos do meio da
soluo para a vizinhana da fibra. Para amostras
gasosas, a conveco natural do ar suficiente para
facilitar o rpido equilbrio. Para matrizes aquosas,
tcnicas mais eficientes de agitao tais como
agitao mecnica ou sonicao so necessrias.
No modo headspace (Figura 12b), os analitos
necessitam ser transportados atravs da barreira de
ar antes de atingirem o recobrimento da fibra.
Esta modificao serve, principalmente,
para proteger a fibra de possveis danos
provocados por interferentes de elevada massa
molecular, ou baixa volatilidade presente nas
amostras, tais como materiais hmicos (amostras
ambientais) e protenas (amostras biolgicas).
Este modo de extrao permite mudanas na
matriz como, por exemplo, no pH, sem danos na
fibra. A quantidade de analito extrado na fibra
(utilizando-se o mesmo frasco de amostra) no
equilbrio, ser a mesma empregando-se o modo
direto ou headspace, desde que o volume de
headspace e de amostra sejam iguais. Isto ocorre
pelo fato de que a concentrao no equilbrio
independente da localizao da fibra no sistema
amostra/headspace. Se estas condies no
forem observadas, uma diferena significativa
entre os modos direto e headspace ser
observada para analitos bastante volteis. Por
outro lado, a cintica de extrao ser bastante
dependente do modo de extrao selecionado.
O nmero de parmetros experimentais a
serem otimizados e controlados em SPME
bastante superior aos do SPE e LLE. Dentre os
principais fatores experimentais que afetam a
eficincia de extrao encontram-se
11
: escolha
do revestimento da fibra; temperatura da
extrao; tempo da extrao; pH; velocidade de
agitao; fora inica.
Desoro dos analitos retidos em SPME
para anlise por LC
Quando o objetivo utilizar a SPME
como tcnica de preparo de amostra para anlise
por GC, a dessoro do analito retido na fibra
feita de maneira simples, inserindo-se a mesma
no injetor aquecido do cromatgrafo. Ocorrer
dessoro trmica e os analitos sero direcio-
nados para a coluna com a ajuda do gs de
arraste. Para LC a situao infelizmente bem
Figura 12. Principais modos de operao em SPME.
2008 | v. 0 | n. 0 33
mais complexa, existindo dois modos principais
de dessoro: fora de linha (off-line) e em
linha (on-line). No sistema fora de linha, aps
a etapa de extrao a fibra inserida em um
frasco contendo um solvente apropriado e os
analitos so solubilizados e posteriormente
injetados no cromatgrafo para anlise. No
sistema em linha aps a extrao a fibra
introduzida em uma interface a qual conectada
a coluna de LC. Um solvente passa atravs de
uma vlvula e lava a fibra, provocando dessoro
dos analitos os quais so direcionados pelo
solvente para a coluna de LC e analisados.
Lanas e colaboradores desenvolveram vrias
interfaces para o acoplamento em linha
SPME-LC
45
, inclusive empregando sinergis-
ticamente dessoro com solvente e aquecimento
para aumentar o rendimento da extrao
46
.
Alguns pesquisadores e agncias que
regulamentam o uso de agentes txicos e
alimentos ainda apresentam ressalvas tcnica,
julgando-a semi-quantitativa e no quantitativa,
o que poderia impedir de torna-se, por exemplo,
um mtodo oficial da US-EPA ou US-FDA.
Considerando-se o imenso interesse que a SPME
tem despertado recentemente , pode-se esperar
um grande avano na mesma nos prximos anos
tanto do ponto de vista fundamental, na
instrumentao (maior automao e novas fases
estacionrias) e aplicaes.
I n-tube SPME
Uma variao do acoplamento SPME-LC,
denominada in-tube SPME foi desenvolvida para
a microextrao e pr-concentrao de solutos
menos volteis e/ou termicamente instveis. Um
capilar de slica fundida, com a superfcie interna
revestida com a fase extratora (quimicamente
ligada) funcionando como um dispositivo para
SPME, acoplado em linha com o sistema LC,
permitindo a automao do processo de extrao,
maior preciso do mtodo analtico e menor
tempo de anlise.
No caso de anlise de amostras biolgicas
atravs do sistema in-tube SPME, estas so
injetadas praticamente no seu estado fisiolgico,
diminuindo a exposio dos analistas aos fluidos
biolgicos e minimizando perdas do soluto durante
o processo de extrao. Todo o soluto extrado
introduzido na coluna analtica, aumentando a
sensibilidade do mtodo analtico
47
.
3.4.2. Extrao Sortiva em Barras de Agitao
A extrao sortiva em barra de agitao
(SBSE), introduzida no final da dcada passada
por Baltussen et al.
48
, baseia-se nos princpios
estabelecidos para SPME, ou seja, equilbrio de
partio. Uma barra de agitao magntica (10 a
20 mm de comprimento) revestida com 25-125
L (0,3-1,0 mm espessura) de polidime-
tilsiloxano (PDMS) tem sido utilizada nas
SBSEs.
O mecanismo de extrao dos solutos na
fase PDMS baseado na absoro. Este processo
de reteno mais fraco, quando comparado com
a adsoro (fibras mistas SPME), o que permite
rpida dessoro trmica dos solutos em
temperaturas medianas. O equilbrio de partio
ou capacidade de reteno de um determinado
soluto em PDMS, no influenciado pela
presena dos interferentes da matriz ou de outros
solutos, o que resulta em mtodos analticos com
ampla faixa de linearidade.
A SBSE controlada pelo coeficiente de
partio dos solutos entre as fases, PDMS e
aquosa. O coeficiente de partio tem sido
correlacionado com o coeficiente de distribuio
octanol-gua (K
o/w
). Embora no totalmente
correto, o K
o/w
tem sido utilizado para estimar a
eficincia do processo SBSE para um determi-
nado soluto
49,50
.
Para as anlises SBSE/LC de compostos
termolbeis ou de elevada massa molar, o
processo de dessoro SBSE tem sido realizado
atravs da insero da barra SBSE em um micro
tubo contendo alguns L de um solvente lquido.
Geralmente emprega-se como solvente de
dessoro, neste caso, a prpria fase mvel ou
um solvente orgnico, podendo ocorrer com
agitao magntica ou em banho de ultra-som, e
com ou sem controle da temperatura. Poucas
referncias bibliogrficas descrevem a tcnica
SBSE/LC empregando o processo de dessoro
em fase lquida.
Lanas e colaboradores recentemente
desenvolveram uma interface similar quela
desenvolvida para SPME/LC para emprego em
SBSE/LC
51
.
Os mtodos cromatogrficos empregando
tcnicas miniaturizadas de preparo de amostras
descritos na literatura apresentam alta sensibili-
dade, seletividade, linearidade, exatido e preciso,
de acordo com critrios internacionais de validao
analtica. Estes mtodos tm sido aplicados para
determinaes de diversos solutos em diferentes
reas, tais como: ambiental, farmacutica, forense,
alimentos, clnico, dentre outras.
3.4.3. Extrao Dinmica em
Fase Slida (SPDE)
Apesar de que a SPME e SBSE so as
tcnica miniaturizadas mais empregadas no
momento para o preparo de amostras para anlise
cromatogrfica, outras surgiram recentemente e
sero discutidas a seguir.
A Extrao Dinmica em Fase Slida,
SPDE (Solid Phase Dynamic Extraction)
emprega um sistema muito similar ao da SPME,
porm com o agente extrator sendo colocado na
parede interna do tubo ao invs da parede externa
como em SPME. Utiliza uma seringa comum de
cromatografia, dentro da qual a fibra de SPDE
mantida como em SPME. A exposio da fibra,
tcnicas de dessoro e demais aspectos prticos da
tcnica so similares SPME; um diagrama
esquemtico da mesma pode ser visto na Figura 13.
A seringa contendo a fibra com o revesti-
mento (sorvente) na parede interna inserida na
amostra, e os analitos extrados. A dessoro
pode ser efetuada com aquecimento, ou solven-
tes, como nas outras tcnicas miniaturizadas.
A empresa que comercializa o sistema
para SPDE efetuou vrias comparaes com a
SPME, tentando demonstrar a superioridade
desta tcnica. Bicchi e colaboradores em estudo
comparativo ressalta os pontos positivos da
SPDE
52
. At o presente quase todas as publi-
caes nesta tcnica so da empresa a qual
comercializa os produtos para a mesma, e de
grupos de pesquisa ligados a ela. Espera-se que
mais trabalhos sejam publicados no futuro
prximo, para que as vantagens e limitaes da
mesma fiquem melhor conhecidas.
3.4.4. Micro Extrao por Sorvente
Empacotado (MEPS)
A Micro Extrao por Sorvente
Empacotado, MEPS (Micro Extraction by
Packed Sorbent) emprega uma seringa contendo
uma agulha, na forma de um pequeno cartucho,
contendo um sorvente. Na prtica, uma verso
miniaturizada da SPE, empregando ao invs de
Figura 13. Extrao Dinmica em Fase Slida (SPDE).
cartuchos plsticos ou de vidro, discos ou outros
formatos, uma agulha empacotada com a fase
slida. As etapas empregadas para o preparo de
amostra por esta tcnica so similares aos descritos
para SPE, e os sorventes empregados so basi-
camente os mesmos.
Abdel-Rehim publicou recentemente
resultados comparando a MEPS com SPE e
SPME, ressaltando as caractersticas destas
tcnicas, e destacando os aspectos da MEPS os
quais considera favorveis tcnica
53
. A Tabela 1
resume alguns dos principais fatores envolvidos
nestas tcnicas.
Tabela 1. Comparao entre MEPS, SPME e SPE, de
acordo com Abbel-Rehim (53).
Fator MEPS SPE SPME
Quantidade
de sorvente
0,5-2 mg 50-2.000 mg Espessura 150 mm
Preparo
da amostra
1-2 min 10-15 min 10-40 min
Reutilizao 1-2 min Nenhuma 50-70 extraes
Recuperao Boa Boa Baixa
Sensibilidade Boa Boa Boa
3.4.5. Microextrao em
Fase Lquida (LPME)
Uma alternativa s tcnicas miniaturizadas
descritas anteriormente foi desenvolvida por
Pedersen-Bjergaard e Rasmussen
54
empregando
uma fibra oca. Denominada Microextrao em Fase
Lquida, LPME (liquid phase microextraction),
utiliza uma fibra oca constituda por uma membrana
capilar porosa e hidrofbica, cujos poros so
impregnados com um solvente extrator orgnico e o
seu lmen preenchido com um volume muito
pequeno (microlitros) de uma fase aceptora. A fase
aceptora (solvente orgnico) no entrando em
contacto direto com a fase doadora (matriz aquosa)
Permite o uso de agitao durante o processo
de extrao, como empregado em SPME e SBSE.
Esta tcnica foi motivo de recente reviso
na lngua portuguesa
55
, a qual descreve os
fundamentos da tcnica, parmetros a serem
otimizados na prtica (praticamente os mesmos
da SPME e SBSE) e aplicaes.
4. Limpeza (Clean-up) da Amostra
A etapa de extrao no assegura que o
composto de interesse presente no extrato possa ser
diretamente introduzido em um cromatgrafo para
anlise. Usualmente, uma vez que as tcnicas de
extrao no so seletivas, outros compostos alm
dos de interesse usualmente estaro presentes no
extrato, podendo interferir na anlise cromato-
grfica. A soluo mais utilizada para este
problema efetuar-se o clean-up do extrato, o
que pode ser efetuado por vrias tcnicas
dependendo das caractersticas dos compostos de
interesse, da matriz e dos contaminantes que se
quer excluir do extrato. Dentre as principais opes
as mais empregadas atualmente so a cromato-
grafia lquida, alm da extrao em fase slida
(SPE), e a extrao lquido-lquido (LLE) j
discutidas anteriormente.
4.1. Cromatografia Lquida em Coluna
Aberta em baixa presso
Apesar de muito antiga quanto concepo,
a cromatografia lquida clssica ainda ampla-
mente empregada no clean-up de extratos
produzidos por diferentes tcnicas, em especial na
anlise de produtos naturais e resduos de pesticidas
em alimentos. uma tcnica muito simples a qual
pode ser conduzida em uma bureta contendo uma
torneira para controlar o fluxo da fase mvel, dentro
da qual coloca-se uma material slido como slica,
alumina, florisil, trocadores de ons e outros, para
funcionar como fase estacionria. A amostra
introduzida na coluna e os componentes do extrato
que no forem de interesse usualmente so
eliminados com solventes apropriados, deixando a
amostra limpa destes componentes (clean-up). Os
compostos de interesse, retidos na fase estacionria,
so depois eluidos com solventes apropriados e
estaro prontos para injeo em um cromatgrafo
lquido ou gasoso. Uma vez que neste tipo de coluna
emprega-se partculas de dimetro relativamente
grandes (usualmente maiores que 40 mcrons), neste
procedimento no se objetiva a separao de
compostos individuais mas uma diminuio da
complexidade do extrato para a anlise cromato-
grfica. Uma desvantagem importante desta tcnica
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o tempo necessrio para o clean-up, usualmente
vrias horas, alm do emprego de grandes volumes
de solventes txicos. Esta ainda uma das tcnicas
mais populares para esta finalidade devido a sua
simplicidade, baixo custo operacional e pequeno
investimento em equipamento.
4.2. Cromatografia Lquida de Alta
Eficincia (HPLC ou CLAE)
Na prtica a diferena entre alta, mdia e
baixa presso no facilmente determinada.
Assim, quando uma eficincia maior no processo
desejada, usualmente diminui-se o tamanho das
partculas da fase estacionria, o que acarreta um
aumento da presso na coluna. Isto requer o uso de
presses maiores (usualmente com ajuda de uma
bomba) para que a anlise possa ocorrer em uma
escala de tempo razovel. Todas as formas de
cromatografia lquida, inclusive em presses
elevadas, tm sido empregadas para o clean up
de amostras. A principal vantagem do uso de
partculas menores (e, como conseqncia,
presses mais elevadas) a maior eficincia da
separao, e o uso de equipamentos controlados
por computadores, facilitando a automao total da
anlise. A contra-partida o custo mais elevado
tanto na aquisio da instrumentao quanto
operacional para as tcnicas que empregam
presses mais elevadas.
4.3. Cromatografia Lquida
Multidimensional
Em funo da maior eficincia, as colunas
de menor tamanho, com partculas menores e
fechadas nas duas extremidades, podem ser mais
facilmente acopladas em linha (on-line) com
outra(s) coluna(s), permitindo um arranjo instru-
mental bastante verstil e poderoso usualmente
denominado cromatografia lquida multidimen-
sional. Neste caso, duas ou mais colunas
operando com distintos mecanismos de
separao podem ser acopladas umas s outras
de forma a aumentar a seletividade e a eficincia
da separao. Geralmente a primeira coluna
empregada para uma pr-separao, ou como um
clean-up, enquanto que a segunda a que
efetivamente realiza a anlise. No exemplo de
amostras de alimentos, a primeira coluna pode
operar no modo excluso por tamanho e a
segunda em fase reversa, por exemplo. A
amostra introduzida na primeira coluna e as
macromolculas e outros interferentes so
eliminados da coluna, enquanto que os compos-
tos de interesse so retidos. A seguir uma fase
mvel apropriada, com o auxlio de uma vlvula
de comutao de coluna, remove os compostos
de interesse da primeira coluna e os transfere
para a segunda, onde a anlise ocorre. Um
enfoque similar pode ser utilizado para limpeza
de amostras de fluidos biolgicos contendo um
frmaco de interesse, compostos quirais em
diferentes matrizes (neste caso usualmente a
segunda coluna uma coluna quiral) e vrias
outras aplicaes. Este tipo de enfoque tem
ganho bastante adeptos na ltima dcada,
devendo tornar-se um importante enfoque na
limpeza de amostras complexas.
4.4. Outros enfoques para a limpeza de
amostras
Alm das tcnicas discutidas, existem vrias
outras empregadas para o clean-up de amostras
j discutidas neste trabalho, incluindo a LLE, SPE,
SFE, ASE e outras. Algumas destas tcnicas, como
a SPME, permitem efetuar-se extrao, clean-up
e concentrao (enriquecimento) em uma nica
etapa, enquanto que outras como a SPE efetuam
especificamente a limpeza da amostra. Algumas
tcnicas permitem o acoplamento em linha
(on-line) com uma tcnica cromatogrfica,
facilitando a automao total da anlise. Neste
caso, o extrato direcionado da extrao direta-
mente para a tcnica cromatogrfica ou similar,
sem etapas intermedirias. Um dos trabalhos
pioneiros nesta rea foi efetuado no laboratrio do
autor deste trabalho, atravs do acoplamento em
SFE e eletroforese capilar para a extrao,
concentrao e anlise de amostras complexas
56
.
Este tipo de enfoque dever tornar-se mais popular
no futuro prximo.
2008 | v. 0 | n. 0 37
5. Anlise Qualitativa e
Quantitativa: O papel da
Cromatografia e Tcnicas Afim
5.1. Tcnicas Cromatogrficas
Estando os compostos de interesse em uma
forma qumica apropriada para sua determinao
qualitativa e/ou quantitativa por uma tcnica
instrumental, alm de isentos de interferentes (ou
de grande parte deles, no caso de amostras
complexas), e em uma concentrao apropriada, a
ltima etapa do procedimento analtico ser a
identificao e a quantificao. Dois enfoques mais
comuns so: (1) a anlise de compostos conhecidos
(target), usualmente empregado em laboratrios
de rotina; e (2) a anlise de desconhecidos,
usualmente um desafio maior uma vez que a
determinao quantitativa depender antes da
identificao dos compostos de interesse. Dentre
um largo espectro de tcnicas instrumentais
disponveis, as cromatogrficas e relacionadas
(eletroforese capilar, por exemplo) tm um papel
de destaque devido velocidade de anlise,
eficincia, possibilidade de processar vrias
amostras atravs de amostradores automticos,
facilidade na quantificao, e automao total do
procedimento, dentre outros recursos. Neste artigo
o enfoque ser direcionado para o uso das tcnicas
cromatogrficas de anlise.
As tcnicas cromatogrficas admitem vrias
classificaes, a depender do enfoque do autor
57
. A
classificao mais popular no momento, de acordo
com a natureza fsica da fase mvel apresentada
na Figura 14.
Apesar de seu desenvolvimento no incio do
sculo XX, as tcnicas cromatogrficas tiveram uma
grande aceitao como tcnica analtica
principalmente aps o desenvolvimento da
Cromatografia Gasosa (GC) durante a dcada de 50,
e da Cromatografia Lquida de Alta Eficincia
(HPLC) no final da dcada de 60 e incio da dcada
de 70. A Cromatografia com Fluido Supercrtico
teve seu desenvolvimento somente na dcada de 80,
com a comercializao dos primeiros equipamentos.
A Cromatografia Gasosa (GC)
considerada hoje uma tcnica madura, empregada
principalmente na anlise de compostos volteis,
de polaridade baixa e mdia, e termicamente
estveis nas temperaturas empregadas nas anlises.
Seu uso pode extrapolar estas condies, mediante
Figura 14. Classificao das tcnicas cromatogrficas de acordo com a natureza fsica da fase mvel.
prvias etapas de transformao qumica (por
exemplo, derivatizao de cidos; pirlise de
polmeros; complexao de metais e outras
operaes). O desenvolvimento das colunas
tubulares abertas (geralmente referidas como
capilares), proporcionou o aparecimento de
colunas de vrios metros de comprimento, o que
aumentou muito a eficincia quando comparadas
com as colunas empacotadas (ou recheadas). Alm
disso, por terem a parte central vazia (um filme fino
depositado na parede interna) estas colunas
oferecem pequena resistncia passagem do gs de
arraste, permitindo o uso de colunas de at centenas
de metros de comprimento. Devido enorme
eficincia destas colunas (centenas de milhares de
pratos), o que leva a uma alta resoluo pois N um
fator importante na resoluo, seu emprego tem
motivado o nome de Cromatografia Gasosa de Alta
Resoluo (HRGC) para a tcnica.
A Cromatografia Lquida de Alta
Eficincia (HPLC) teve seu desenvolvimento
favorecido pelo interesse nas anlises de
compostos os quais no eram amenos GC. As
primeiras dificuldades encontradas com o uso de
partculas relativamente grandes (dp>- 20
microns), adaptadas da LC clssica, foram
rapidamente contornadas com o desenvol-
vimento de novas fases com partculas menores,
mais homogneas e com menor contedo de
metais, principalmente slica de novas geraes.
O desenvolvimento das fases quimicamente
ligadas ampliou ainda mais o espectro das
aplicaes da tcnica, em especial as fases
reversas baseadas em grupos octadecil (C-18) e
octil (C-8) quimicamente ligadas slica
58
. O
desenvolvimento de partculas menores, as quais
melhoraram a eficincia das colunas, trouxe um
novo desafio: o aumento significativo da presso
na coluna, e a exigncia de novos desenvol-
vimentos instrumentais para a nova realidade.
A Cromatografia com Fluido Supercrtico
(SFC) a mais jovem das tcnicas cromato-
grficas a receber ateno em larga escala.
Apesar de seu desenvolvimento na dcada de 80
haver sido bastante promissor, sua ampla
utilizao ainda no se confirmou, tendo alguns
nichos especializados como na anlise de
frmacos (em especial enantimeros), polme-
ros, e detergentes. Inicialmente oferecida em
duas verses, uma utilizando colunas empaco-
tadas com partculas, similares as de HPLC, e
outra empregando colunas capilares tubulares
abertas, similares s de HRGC, apenas a primeira
persiste comercialmente. Considerando o grande
destaque que a Qumica Verde (Green
Chemistry), possui atualmente, e o fato da SFC
utilizar principalmente CO
2
como fase mvel,
considerado um solvente ambientalmente
correto, previsvel que seu desenvolvimento na
prxima dcada seja acelerado.
5.2. Anlise Qualitativa
Uma vez sendo os compostos de interesse
isolados de seus contaminantes e interferentes, por
uma das tcnicas descritas, o efluente da coluna
direcionado para algum tipo de sensor (detector)
para que suas propriedades sejam utilizadas na
identificao do mesmo. Durante muitos anos a
maior propriedade empregada na anlise
qualitativa era o tempo de reteno do composto,
ou seja, o tempo que ele passa na coluna
cromatogrfica. Associado com algum tipo de
seletividade dos detectores (por exemplo o captura
de eltrons para organoclorados, o de fluorescncia
para hidrocarbonetos aromticos), o tempo de
reteno servia como indicativo da presena de um
composto na amostra. O aumento da complexidade
dos problemas analticos, o interesse em analisar-se
compostos em concentraes mais baixas, a
necessidade de melhor conhecimento de
propriedades de frmacos em amostras biolgicas e
outros fatores, comearam a dificultar o uso
somente do tempo de reteno para esta
determinao. Mesmo empregando diversos
artifcios como ndices de reteno, tcnicas
quimiomtricas e outros, assim como detectores
mais seletivos como ECD, NPD e PDA, o fato
que diferentes compostos podem ter o mesmo
tempo de reteno em dadas condies
experimentais, dificultando a identificao dos
picos, especialmente em amostras complexas e
desconhecidas. O desenvolvimento de detectores
mais elaborados, os quais podem fornecer tambm
informaes estruturais em especial detectores
espectromtricos como espectrometria de massas
trouxe um grande avano neste campo.
O desenvolvimento do acoplamento entre
cromatografia gasosa de alta resoluo e
espectrometria de massas (HRGC/MS) sem a
necessidade de interfaces, e a reduo do preo
do equipamento, ampliou em muito o uso desta
tcnica na determinao de compostos volteis e
semi-volteis. Apesar do acoplamento entre
cromatografia lquida e MS ainda no haver
atingido a simplicidade e a maturidade da
GC/MS, o desenvolvimento de interfaces que
operam a presso ambiente (API), especialmente
o Electrospray (ESI) e a Ionizao Qumica a
Presso Ambiente (APCI), trouxeram novo
alento rea
58
. Um reforo considervel foi a
ampliao da oferta de diferentes analisadores, o
corao do espectrmetro de massas. Alm
dos quadrupolos e ion traps, populares desde a
dcada de 1970 com o surgimento dos detectores
seletivos de massas (MSD), o revival dos
analisadores do tipo ToF (Time-of-Flight)
ampliou as possibilidades do uso de MS com
maior resoluo, a preos razoveis. O surgi-
mento do GC-ToF e LC-ToF possibilitou uma
melhoria considervel na identificao dos picos
cromatogrficos. Analisadores ainda mais pode-
rosos, como os baseados em ressonncia de ons
em um cclotron (FT-ICR) ainda so pouco
utilizados acoplados a cromatgrafos, devido ao
elevado custo desta tecnologia, recentemente
sendo comercializada.
Em algumas reas, tais como na anlise de
frmacos e drogas veterinrias em matrizes
biolgicas, em qumica forense e protemica,o
uso de mais de um estgio de ionizao deu
origem aos sistemas em tandem ou MS/MS,
cujo acoplamento tanto com LC quanto com
HRGC se mostraram de grande auxlio na anlise
qualitativa (GC/MS/MS e LC/MS/MS).
Sistemas hbridos,empregando uma combinao
de diferentes analisadores, (como, por exemplo,
o Q-ToF um sistema com dois analisadores de
massas em tandem sendo um deles do tipo
quadrupolo e o outro tempo de vo) permitem o
emprego das caractersticas distintas dos
analisadores de forma a obter-se uma montagem
adequada para a aplicao de interesse. Outras
tcnicas espectroscpicas tais como infra-
vermelho com transformada de Fourier (FT-IR)
e ressonncia magntica nuclear (NMR) tambm
tm sido acopladas com sucesso a tcnicas
cromatogrficas, devendo ampliar seu escopo de
uso na prxima dcada.
5.3. Anlise Quantitativa
O advento dos computadores pessoais a um
custo razovel, praticamente eliminou o uso de
registradores potenciomtricos e integradores
eletrnicos dos laboratrios de cromatografia.
Alm da aquisio de dados, o computador
contendo um software apropriado capaz de
processar os dados, efetuar clculos, elaborar
grficos de calibrao e imprimir relatrios
contendo os dados. tambm empregado no
comando de praticamente todas as funes do
cromatgrafo, desde a introduo da amostra at as
condies da coluna, fase mvel, temperatura do
detector e outros parmetros experimentais.
Adicionalmente, o computador comanda os
detectores como um espectrmetro de massas,
gerando espectros, comparao com bilbliotecas de
dados, tempos de reteno e outras facilidades.
Outros programas como pacotes quimiomtricos
podem ser integrados como o software principal,
ampliando o escopo de uso do sistema. Uma das
etapas crticas na anlise quantitativa, via
cromatografia, o estabele- cimento de grficos de
calibrao empregando padres analticos de
identidade e pureza bem conhecidos. Um software
apropriado atualmente j contm vrias funes
para a construo destes grficos, permitindo o uso
de tcnicas de quantificao baseadas no uso de
padro interno, padro externo ou adio padro. A
escolha da tcnica depende do analito, da matriz e,
principalmente, do objetivo do trabalho. Por
exemplo, para registro de produtos em rgos
governamentais, as exigncias daquele rgo
devem ser seguidas para que o resultado seja aceito
pelo rgo para a finalidade que se prope.
2008 | v. 0 | n. 0 39
6. Tendncias na rea de
Cromatografia e Tcnicas
Associadas
6.1. Preparo de Amostras
Uma das etapas mais crticas no preparo
de amostras, em especial amostras complexas de
origem vegetal ou animal, o isolamento dos
compostos de interesse da matriz original
(extrao). Apesar de que as tcnicas clssicas
como extrao lquido-lquido e extrao
lquido-slido continuam a serem utilizadas (e
provavelmente ainda sero por muitos anos), a
substituio destas por tcnicas que minimizam
o uso de solventes orgnicos, como a SPE, e
tcnicas empregando fluidos pressurizados, vem
ocorrendo gradativamente. O grande apelo
ambiental observado na ltima dcada dever
conduzir para tcnicas ainda mais radicais nas
quais estes solventes so completamente
eliminados, incluindo a SPME, SBSE e simi-
lares. Havendo surgido inicialmente com poucos
tipos de fibras, hoje a SPME j oferece um
grande nmero de possibilidades tanto para uso
em GC quanto em HPLC. A SBSE ainda
limitada pela comercializao de apenas barras
de PDMS comercialmente, porm vrios outros
materiais tm sido empregados em difrentes
laboratrios atravs de barras construidas no
prprio grupo de pesquisa
59,60
. Espera-se uma
ampliao na oferta de fibras para SPME e barras
para SBSE, para uma maior aceitao destas
tcnicas em diferentes reas de aplicao. O
surgimento de interfaces para acoplar estas
tcnicas com HPLC, e amostradores automticos
para tcnicas miniaturizadas de preparo de
amostra, sugerem uma ampliao de seu escopo
de aplicaes para os prximos anos.
Outro fator importante tem sido o
desenvolvimento e aprimoramento de sistemas os
quais permitem integrar, em um s equipamento, o
preparo de amostra, concentrao, e introduo de
uma alquota no cromatgrafo de forma totalmente
automatizada. Exemplo deste tipo de enfoque
apresentado na Figura 15.
A amostra introduzida em um cartucho
de SPE atravs de um amostrador automtico; os
analitos so isolados de contaminantes e
concentrados no cartucho sendo, posteriormente,
dessorvidos com um solvente apropriado. Uma
poro deste extrato transferida automa-
ticamente para o injetor de um cromatgrafo, o
qual permite a injeo de grande quantidade de
amostra (at vrias centenas de microlitros).
Cada composto separado tem seu espectro de
massas determinado, e a anlise qualitativa e
quantitativa desenvolvida de acordo com o
protocolo do mtodo analtico carregado no
computador do sistema. Este acoplamento exem-
plificado pode ser simplificado como SPE-
(LVI)GC-MS. Apesar de seu grande potencial,
este tipo de sistema no tem sido ainda
amplamente explorado, possivelmente devido ao
custo ainda elevado.
Figura 15. Diagrama esquemtico de um acoplamento SPE-GC/MS.
2008 | v. 0 | n. 0 41
6.2. Miniaturizao das colunas
cromatogrficas
A miniaturizao das colunas cromato-
grficas no traz como principal benefcio
economia de espao, como poderia parecer a
primeira vista. Na verdade, um dos principais
benefcios da miniaturizao a economia de
solventes (em LC uma coluna capilar consome
entre 200 e 1.000 vezes menos solvente do que as
convencionais de dimetro interno igual a 4,0
mm) e de amostra (em uma coluna capilar de LC
injeta-se alguns nanolitros de amostra contra
vrios microlitros na convencional). Alm disso,
vrias tcnicas espectromtricas, a exemplo da
espectrometria de massas, em vrias circuns-
tncias so mais facilmente acopladas cromato-
grafia quando so empregadas colunas capilares.
O uso de velocidades de fluxos (vazo) menores
tambm melhora a deteco quando detectores
dependentes da concentrao (como UV-VIS)
so empregados, devido menor diluio dos
solutos na fase mvel.
A Figura 16 mostra uma comparao em
escala entre os principais dimetros de colunas
empregadas em Cromatografia Gasosa nos ltimos
anos, desde as convencionais de dimetro interno
ao redor de 4 mm at as capilares com d.i 0,1 mm.
Nota-se na figura uma enorme diminuio no
dimetro da coluna, a qual acarreta menor
diminuio na quantidade de amostra e de fase
mvel. Uma situao anloga verificada em
Cromatografia Lquida, indo das colunas tradi-
cionais de 4 mm de d.i. , ainda bastante utilizadas,
at as capilares (Figura 17). Entretanto, a minia-
turizao em LC ainda bastante lenta, apesar de
oferecer ainda mais benefcios do que em GC.
Somente recentemente as empresas fabricantes de
equipamento comearam a desenvolver equipa-
mentos projetados especificamente para LC capilar.
Nesta rea de miniaturizao em cromato-
grafia e tcnicas relacionadas, um recente desen-
volvimento o qual merece ateno na rea de
microchips utilizados para a fabricao de
dispositivos para as diversas tcnicas de separao.
Estes dispositivos aparentemente devero ter nichos
especficos tais como em situaes onde pequeno
Figura 17. Comparao (em escala) entre o dimetro
interno das principais colunas empregadas em
Cromatografia Lquida Analtica (HPLC).
Figura 16. Comparao (em escala) entre o dimetro
interno das principais colunas empregadas em
Cromatografia Gasosa.
espao importante (naves espaciais), anlises
especficas, anlise em campo e outras. Entretanto,
ainda ser necessrio um desenvolvimento
bastante grande para que as mesmas venham a
substituir o formato atual destas tcnicas na anlise
de amostras complexas (fluidos biolgicos),
matrizes difceis (como sedimento de rio, extratos de
plantas) e situaes nas quais centenas de compostos
precisam ser separados com elevada eficincia
(derivados de petrleo, lipdeos em amostras
naturais). No momento, uma situao intermediria
entre os dois extremos, com a diminuio da
dimenso das colunas e equipamentos, parece ser
mais vantajosa, especialmente enquanto os
microchips ainda esto sendo aperfeioados com o
uso de novos materiais e tcnicas de preparo. A
prxima dcada elucidar esta questo.
6.3. Anlise rpidas
Existem situaes prticas nas quais a
eficincia no o fator preponderante mas sim a
rapidez da anlise como no caso da fabricao em
escala industrial de um composto, bem conhecido,
cujo setor de controle de qualidade precisa dar
resposta rpida para o setor de produo. Neste
caso, tanto empregando HRGC, HPLC ou SFC, a
alternativa a miniaturizao. Em HRGC, a
diminuio no dimetro interno do tubo
possibilita um aumento acentuado na eficincia
(N); como conseqncia, colunas de menor
comprimento podem ser utilizadas sem perda
considervel da resoluo cromatogrfica. Em
muitos casos, colunas de 5 metros decomprimento
com um dimetro interno igual a 100 microns ou
menos, podero ser suficientes para conseguir
separaes adequadas em menos de um minuto.
Em LC, a melhor alternativa a diminuio do
tamanho das partculas para aumentar-se a
eficincia, o que possibilita diminuir o
comprimento da coluna e o tempo de anlise.
Apesar de 5 microns ser hoje o tamanho padro
das partculas empregadas em LC, colunas de 1,5
a 3,5 mcrons tendem a se tornar mais utilizadas
na prxima dcada. Pelo fato destas anlises
rpidas exigirem repostas mais rpidas dos
equipamentos, e a diminuio do tamanho das
partculas aumentar as presses no sistema, as
empresas de equipamentos tem se adequado a esta
nova forma de obter-se anlises rpidas,
usualmente referidas como U-HPLC (ultra high
pressure liquid chromatography). Diferentes
empresas tm apresentado vrias solues (em
muitos casos adaptaes nos cromatgrafos
convencionais para operarem em presses mais
elevadas), com diferentes nomes. Uma alternativa
a este enfoque o uso de colunas monolticas, nas
quais ao invs de partculas a coluna contem um
monolito. Como a permeabilidade destas colunas
bastante grande, fluxos (vazes) maiores so
empregadas sem sacrifcio da eficincia,
permitindo anlises rpidas (61,62). A oferta
comercial de colunas monolticas ainda
limitada, e os novos avanos nesta rea devero
trazer novas propostas na prxima dcada.
6.4. Cromatografia multidimensional
Na sua forma mais simples e tradicional, a
cromatografia multidimensional emprega duas
colunas (GC, LC ou uma de LC e outra de GC)
sendo a primeira usualmente uma coluna genrica
(como OV-1 em GC e C-18 em LC) e a segunda
uma coluna seletiva (ex. uma coluna quiral). A
amostra introduzida na primeira coluna e ao chegar
o tempo de reteno do composto de interesse
(exemplo, dois enantimeros) a amostra
transferida da primeira para a segunda coluna
atravs de uma vlvula. Assim, a primeira coluna
neste exemplo serve como clean up para a
amostra, eliminando compostos que poderiam
deterior a coluna quiral se fossem nela intro-
duzidos. Este tipo de enfoque muito empregado na
anlise de amostras complexas como resduos e
contaminantes em alimentos e de frmacos em
fluidos biolgicos
63
. Na rea petroqumica tem sido
empregado h anos para fracionar amostras
complexas atravs do uso de duas ou mais colunas
64
.
Uma das limitaes desta tcnica a
transferncia de apenas parte da amostra atravs da
vlvula, o que vem sendo solucionado com o uso da
cromatografia abrangente (comprehensive). Neste
caso, usualmente emprega-se uma coluna de maior
comprimento como a primeira coluna e uma mais
rpida e menor como a segunda. O pico amostrado
vrias vezes na primeira coluna e as fraes so
transferidas para a segunda coluna, atravs de um
modulador (GC), ou vlvula (LC) para uma anlise
rpida. Um software apropriado permite o
tratamento dos dados e gerao de grficos bi e
tri-dimensionais, possibilitando a obteno de
muitas informaes a respeito da amostra. de
interpretao. O acoplamento com espectrometria
de massas simples, e tem sido realizado com
sucesso gerando sistemas do tipo (GCxGC)-MS;
(LCxLC)-MS, (SFCxSFC)-MS e outros. Este
enfoque ainda recente, e bastante promissor para a
anlise de amostras complexas
65-68
.
7. Concluses
A Complexidade Dos Problemas
Analticos A Serem Solucionados Nos Prximos
Anos (Matrizes Mais Complexas, Compostos
Em Concentraes Mais Baixas, Aumento Na
Seletividade E Outros) Requer Ferramentas
Cada Vez Mais Sofisticadas. Desde A
Amostragem, Preparo Da Amostra, Isolamento
Dos Solutos De Interesse At O Processamento
Dos Dados E Gerao Dos Relatrios, Muitas
Etapas So Neces- Srias.
Uma das tendncias atuais na rea a
miniaturizao de todas as etapas, objetivando a
minimizao (ou eliminao) do uso de solventes
orgnicos no preparo de amostra (SPME, SBSE e
outras), diminuio da quantidade de amostra,
possibilitando anlises menos evasivas em seres
humanos e animais (HRGC, micro-LC, c-SFC), e
o acoplamento a tcnicas espectroscpicas as
quais fornecem informaes para a identificao
dos compostos de interesse (LC/NMR,
GC/MS/MS, LC-PDA, LC/MS/MS).
A integrao on-line entre preparo de
amostra, clean up e separao cromatogrfica
com um detector seletivo a soluo ideal,
sempre que possvel (ex: SPE-GC/MS),
eliminando os vrios inconvenientes existentes
durante as etapas de transferncia do analito em
um mtodo analtico complexo.
O uso de dispositivos micro-fabricados
apresentou uma evoluo importante nos ltimos
10 anos, mas parece ainda bastante distante dos
laboratrios analticos de rotina. Tudo indica que
na prxima dcada dever ocupar um espao
maior dentro da instrumentao analtica, em
especial na denominada bio-analtica. Enquanto
isso, a miniaturizao das tcnicas de preparo
de amostra (SPME, SBSE, LPMS e MEPS,
dentre outras), das colunas cromatogrficas, e
dos detectores (ex. MS), particularmente se
acoplados em linha (on-line), parece ser uma
tendncia na rea a qual dever demorar muitas
dcadas para ser totalmente substituda.
Na perspectiva do autor, o horizonte da
anlise qumica para as prximas dcadas parece
cada vez mais amplo e propcio para os usurios
das tcnicas cromatogrficas e afim.
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