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1. La cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) es la técnica analítica más versátil y con mayor mercado debido a su capacidad para el análisis de trazas y rapidez.
2. Una limitación del HPLC es la falta de operadores experimentados, debido a poco entrenamiento en las universidades y poco interés en aprender la técnica.
3. El documento proporciona detalles sobre conceptos y parámetros cromatográficos clave como tiempo de retención, altura equivalente a pl
1. La cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) es la técnica analítica más versátil y con mayor mercado debido a su capacidad para el análisis de trazas y rapidez.
2. Una limitación del HPLC es la falta de operadores experimentados, debido a poco entrenamiento en las universidades y poco interés en aprender la técnica.
3. El documento proporciona detalles sobre conceptos y parámetros cromatográficos clave como tiempo de retención, altura equivalente a pl
1. La cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) es la técnica analítica más versátil y con mayor mercado debido a su capacidad para el análisis de trazas y rapidez.
2. Una limitación del HPLC es la falta de operadores experimentados, debido a poco entrenamiento en las universidades y poco interés en aprender la técnica.
3. El documento proporciona detalles sobre conceptos y parámetros cromatográficos clave como tiempo de retención, altura equivalente a pl
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado
3 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado La cromatografa Lquida de Alta Eficiencia es la tcnica con mayor mercado en el mundo instrumental analtico gracias a su versatilidad, excelente capacidad para el anlisis de trazas, rapidez y adaptabilidad. 4 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado Limitaciones del HPLC : Falta de operadores experimentados. Razones :
-Escaso entrenamiento en las universidades (costos de equipos y escasa experiencia de la mayora de los profesores).
- Pocas personas interesadas en aprender cromatografa.
- Poca oportunidad practica de contacto con la tcnica. 6 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado 7 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado Tiempo de retencin. Tiempo que transcurre desde la inyeccin de la muestra hasta que el soluto alcanza el detector( tambin Ve, Te Tr) Tiempo muerto. Tiempo necesario para que una especie que no se retiene en la fase estacionaria alcance el detector (tambin Vm). CROMATOGRAMA Lnea base. Seal de la fase mvil Ancho del pico en la base. Medida del tiempo en donde se inicia la salida de la seal hasta donde termina sta. 8 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado Longitud de la columna Altura equivalente del plato (HEPT) H = L N Es el sitio de interaccin donde se consigue un equilibrio transitorio del eluato entre la fase estacionaria y la fase mvil. 9 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado As10% =b/a Ideal = 1 Aceptable = 0.8 a 1.3 10% Altura 10 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado 11 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado k = Nmero de moles de soluto en la fase estacionaria Nmero de moles de soluto en la fase mvil 12 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado 13 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado Procedimientos empricos = interminables ensayos de prueba y error. Ejemplos de resultados :
- k muy prximo a cero - Tailing > 2.0 - Cromatogramas con amplios sectores vacios separando bandas parcialmente solapadas. - Ninguna documentacin de los ensayos realizados - etc 1. Intentar separacin por fase reversa regular 2. Intentar por apareamiento inico 3. Probar con diferentes columnas 4. Modificar pH, temperatura, , etc. 14 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado Pico 1 Pico 2 Pico 3 Pico 4 20 min. 5 min. 15 min. 15 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado Procedimientos sistemticos = Lgica y sentido comn (Bases tericas) Reduccin de tiempos y costos !! Pico 1 Pico 2 Pico 3 Pico 4 20 min. 15 min. 5 min. Pico 1 Pico 2 Pico 3 Pico 4 20 min. 5 min. 15 min. 16 17 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado Objetivos : - Screening, identificacin o cuantificacin ?
- Nivel de concentracin (macro o microcomponentes) ?
- Precisin requerida ?
- N componentes a valorar ?
- N muestras a procesar ?
- Nivel de tecnologa disponible ?
- Operadores (habilidades, experiencia, capacitacin) 18 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado Informacin Sobre la Muestra : - Identidad de componentes de inters
- Naturaleza de la matriz ( producto natural, muestra biolgica, tabletas, etc.) 19 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado Definicin del Sistema Preliminar : - Preparacin de la muestra : Solubilizacin Extraccin Preconcentracin Derivatizacin - Detector a utilizar : IR UV/VIS Conductividad Electroqumico Fluorescencia - Peso molecular del analito (WM > 2000 Daltons WM < 2000 Daltons ?) 20 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado Definicin del Sistema Preliminar :
- Mtodo cromatogrfico para molculas con WM > 2000 Daltons : Aplicacin en anlisis de Pptidos, Protenas, Polinucletidos, etc.
Primer alternativa : - Exclusin por tamao o SEC (GPC, GFC)
Otras alternativas : - C. Afinidad (anticuerpos, hormonas, etc. como fase estacionaria) - C. Intercambio Inico o IEC ( intercambiadores dbiles WAX y WCX o fuertes SAX y SCX sobre base Slica o polimrica) - Interaccin hidrofbica, IEC, RP - Fase reversa (Partculas de 300 a 1000 )
21 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado Definicin del Sistema Preliminar :
-Mtodo o forma cromatogrfica para molculas con WM < 2000 Daltons :
a. Soluble en solventes orgnicos: - Slica gel no modificada - Fase normal (NP-BPC) - Fase reversa (RP-BPC)
b. Soluble en agua : - Inico IPC, IEC - No Inico NP, RP
Compuestos Mtodo Columna Fase mvil y Aditivos Neutros No inicos RP C8 - C18 Phe - CN Agua modificador (MeOH, AcN, THF) Acidos dbiles RP Control de la Ionizacion C8 - C18 Phe - CN Agua modificador Acido Fosfrico a pH 3.0 a 3.5 Bases dbiles RP C8 - C18 Phe - CN Agua modificador 30mM Trietilamina Inicos e Ionizables RP de Apareamiento ionico Preferida C18 Alternativa C8 - CN Agua MeOH Alquilsulfonatos pH 3.5 (bases) Tetraalquilamonio pH 7.5 (cidos) Lipoflicos insoluble en solventes hidroalcoholicos NP CN NH2 Silica Solventes polares Iones inorgnicos, Aminocidos, Pptidos, derivados de Acidos nucleicos IEC SAX SCX Base silica o polimerica Agua modificador pH controlado Fuerza inica controlada Macromoleculas SEC IEC Base silica o polimerica Acuosos (GFC) Orgnicos (GPC) Estereoismeros Ismeros de posicin NP Silica Solventes no polares Enantimeros (Ismeros pticos) RP Columna Quiral Quirales C18 Acuosos Compuestos Quirales Carbohidratos Columna Amino NH2 Agua - modificador 22 23 24 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado A. Determinar longitud de onda de trabajo (Deteccin UV) :
- Mximo de absorcin -Normalmente 190 a 210 nm 254nm para muestras desconocidas.
B. Concentracin de muestra y volumen de inyeccin :
-Hasta 100 g en 20 l.
C. Control del flujo, presin y tiempo de corrida :
25 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado D. Determinar tipo y caractersticas de columna : - Forma y dimetro de partcula - Longitud de Columna 26 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado - Longitud y tipo de fase ligada C4, C8, C18, CN, Phe Bondapak CN Bondapak Phe Bondapak C18 27 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado - Y la Marca (Fabricante ) ?? 28 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado E. Establecer fase mvil de partida :
- Tipo de modificador orgnico (MeOH, ACN, THF) - Proporcin modificador : agua (%) - pH y aditivos - Modo Isocrtico vs Gradiente
29 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado - Determinacin del tipo de modificador orgnico: 30 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado Propiedades de solventes habituales de HPLC 31 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado - Determinacin de la proporcin agua - modificador orgnico:
1. Comenzar con concentracin media de modificador ? 2. Comenzar con concentracin alta de modificador ? 3. Realizar gradiente (Lineal 0 100% de modificador) y calcular composicin para corrida socrtica ?.
32 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado - Determinacin de la proporcin agua - modificador orgnico: QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado 33 . Ejercicio! 34 35 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado -Regulacin del pH de la fase mvil : Supresin Inica (Control de la Ionizacin)
a. Compuestos neutros (No ionizables) b. Compuestos cidos o bsicos (Control de la ionizacin)
AH A- + H+ B + H2O BH+ + OH- pH = pKa + log Cs / Ca Cuidado con la columna !! 36 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado 37 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado - Mejorando el Tailing : (Columnas con base de Slica) Muestra : Base Nitrogenada Conc. : 0.05 y 5.0 mg/ml Columna : C18 F.M. : Buffer MeOH (1:3) pH = 7.0 Flujo : 1.0 ml/min. Muestra : Base Nitrogenada Conc. : 0.05 y 5.0 mg/ml Columna : C18 F.M. : Buffer MeOH (2:3) con TEA 30mM pH = 3.0 Flujo : 1.0 ml/min. 38 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado F. Resultados no satisfactorios ? Cromatografa de apareamiento inico (IPC) Limitaciones :
- Generalmente uso de columnas C18. - Principal modificador orgnico es MeOH. Solvente con mayor poder de disolucin de sales. - Los contraiones de apareamiento (alquilsulfonatos, tetraalquilamonio) son difciles de remover. Modifican la selectividad de la columna. -Las sales de tetraalquilamonio, complejan la silica gel aumentando su solubilidad especialmente a pH alcalino. 39 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado - Condiciones en Cromatografa de apareamiento inico (IPC)
Para Bases :
Fase mvil : agua MeOH (20:80) + Hexanosulfonato de sodio 5mM pH : 3.0 - 4.0 con buffer 0.05 0.1M Fosfrico/Fosfato de amonio Reducir proporcin de Metanol hasta conseguir separacin manteniendo constantes el pH y la concentracin del contrain. Para cidos :
Fase mvil : agua MeOH (20:80) + Hidrxido de tetrabutil amonio 5mM pH : 7.0 7.5 con buffer de fosfatos Reducir proporcin de Metanol hasta conseguir separacin manteniendo constantes el pH y la concentracin del contrain. 40 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado G. Realizar inyecciones de prueba :
1. Inyectar estndar de analito (puede ser materia prima) 2. Inyectar cantidad suficiente para diferenciar de picos de posibles impurezas. 3. Reducir cantidad inyectada hasta tener una respuesta menor a 0.5UA para asegurar trabajar dentro del rango lineal del detector UV, aunque esto deber verificarse durante la validacin. + R e s p u e s t a
Tiempo 41 42 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado Una vez establecido un sistema apropiado (columna, solvente, parmetros instrumentales), se tiene un mtodo preliminar que deber optimizarse para mejorar al mximo la separacin cromatogrfica. 43 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado Ajuste de los parmetros cromatogrficos :
- Resolucin (R) - Capacidad (k) - Eficiencia (N) - Selectividad () 44 45 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado Formula de calculo basada en el grafico. 1. Resolucin : R = (t2 t1) . (W2 + W1) Formula dependiente de los tres factores :
- Capacidad (k) - Eficiencia (N) - Selectividad () R = ( 1). . N . k . (1 + k) 46 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado tn , tiempo de retencin del pico de inters T0 , tiempo de volumen muerto k varia simplemente ajustando la fortaleza de la fase mvil 2. Regulacin de la capacidad (k) : k = (tn t0). t0 Para fase reversa :
- A mayor proporcin de agua mayor k, o sea mayor retencin - A mayor proporcin de modificador menor k (MeOH, ACN, THF) - Cambios de pH en la F.M. no modifican tr de compuestos neutros - Cambios de pH en la F.M. producen grandes cambios en el tr de compuestos disociables. - En IPC tr aumenta con la concentracin y longitud de la cadena alqulica 47 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado La resolucin no varia linealmente con k sino con k/(1 + k) de modo que un aumento en la retencin produce significativos cambios en la resolucin solo si k<6. Rangos de k apropiados :
- 2< k<6 , sistemas con 2 a 3 seales - 2< k<10 , sistemas con 4 a 8 seales - 0.5< k<20 , sistemas muy complejos 2. Regulacin de la capacidad (k) : R = ( 1). . N . k . (1 + k) 48 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado Pico k 1 1.7 2 3.0 3 4.4 4 6.2 Pico k 1 2.8 2 5.6 3 9.3 4 14.6 2. Regulacin de la capacidad (k) : . Ejercicio ! 49 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado N , platos tericos tn , tiempo retencin del pico ensimo wtan , ancho del pico tangencial 3. Regulacin de la eficiencia (N) : N = 16(tn / wtan). N aumenta de varias formas :
- Disminuyendo el caudal - Utilizando columnas mas largas - Columnas con partculas de menor dimetro - Acoplando columnas - Aumentando la temperatura - Columnas nuevas o regeneradas - Menor longitud de tuberas y menores volmenes muertos 50 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado La resolucin no varia linealmente con la eficiencia (N) sino con su raz cuadrada (N). N N 10000 100.0 20000 141.4 40000 200.0 R = ( 1). . N . k . (1 + k) 3. Regulacin de la eficiencia (N) : 51 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado 3. Regulacin de la eficiencia (N) : Aumentar N :
- Disminuyendo el caudal - Utilizando columnas mas largas - Columnas con partculas de menor dimetro - Acoplando columnas - Aumentando la temperatura - Columnas nuevas o regeneradas - Menor longitud de tuberas y menores volmenes muertos 52 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado 4. Regulacin de la selectividad () : Coeficiente del factor de capacidad de un par de picos = k2 / k1. Agotadas las variaciones de k y N, si la resolucin no es la adecuada se intenta un cambio de selectividad. Implicaciones :
Modificaciones importantes en el sistema cromatogrfico con resultados que pueden ser imprevistos (mejores o peores).
1. Fase mvil 2. Columna 53 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado 4. Regulacin de la selectividad () : . Mejorando la fase mvil Triangulo de selectividad de solventes propuesto por Snyder segn el tipo y magnitud de interaccin 54 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado Fuerza de elucin de fase mvil: Metanol (Grupo II) Acetonitrilo (Grupo VI) Cambio de selectividad F , Fuerza total de la fase mvil Fi , Fuerza del solvente i i , Fraccin en volumen del solvente i 4. Regulacin de la selectividad () : . Mejorando la fase mvil 55 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado Solvente Fuerza de elucion Agua 0.0 Metanol 2.6 Acetonitrilo 3.2 Tetrahidrofurano 4.5 4. Regulacin de la selectividad () : . Mejorando la fase mvil 56 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado F F.M. = FMeOH MeOH + FH2O H2O FMeOH . MeOH ACN = F MeOH MeOH F ACN FACN .ACN = ACN = 2.6 x 70 3.2 F.M. MeOH - H2O (70:30) F.M. ACN - H2O
Cambio de selectividad ACN = 56.88 4. Regulacin de la selectividad () : . Mejorando la fase mvil (57:43) 57 QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado Efecto del modificador orgnico sobre la resolucin y seleccin de una fase mvil ternaria en base a los resultados. 4. Regulacin de la selectividad () : . Mejorando la fase mvil 59 60
GRACIAS POR TU ATENCION Y EXCELENTE DISPOSICION !!
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado