CROMATOGRAFA

LQUIDA DE ALTA EFICIENCIA

(HPLC)
La fase mvil es lquida
Particin o reparto
Adsorcin
Cromatografa lquida de alta eficiencia
Adsorcin
Intercambio inico
Exclusin molecular
Caractersticas y ventajas
Trabaja con partculas muy pequeas (< 10 m)
Presiones de 1000 - 6000 psi (pounds square inch
= libras por pulgada cuadrada, 1 atm = psi/14.7)
Cromatografa lquida de alta eficiencia
= libras por pulgada cuadrada, 1 atm = psi/14.7)
Rpida
Picos angostos (alta eficiencia)
Separa compuestos no-voltiles o trmicamente
inestables
BOMBA
INYECTOR
PRE-COLUMNA
Esquema del equipo de HPLC
CMARA DE
MEZCLA
DETECTOR
COLUMNA
A diferencia de CG, en cromatografa lquida el solvente
por si solo puede modificar la selectividad de las
separaciones.
Solventes utilizados: solventes orgnicos,
agua/solventes miscibles, agua/soluciones reguladoras
Fase mvil (solvente)
Alto grado de pureza
Alto poder solubilizante de las muestras:
evitar precipitacin en el sistema inyector o en la
columna. PELIGRO!! puede quedar el sistema
bloqueado o la columna estropearse irreversiblemente
Baja reactividad: con la muestra y/o FE
Compatibilidad con el detector utilizado (de absorcin, de
luminiscencia, electroqumicos, espectrmetro de masa, etc.
Baja viscosidad
Fase mvil (solvente)
Baja viscosidad
Adecuado punto de ebullicin
6
2
10

=
p
d
L
P
Tratamiento con He
Fase mvil (solvente)
Reacciones entre los gases y los componentes de la muestra.
Las burbujas producen oscilaciones de presin irregularidades en el
flujo fluctuaciones en la respuesta del detector cambio en la lnea
base y/o seales parsitas (se afecta la reproducibilidad).
La fase mvil no debe contener gases disueltos
He
Desgasificacin
Sistema de desgasificacin al vaco
Filtracin
Elucin con
gradiente
Elucin isocrtica: solvente de composicin constante.
Elucin con gradiente: solventes de distinta polaridad. Se
vara la composicin de la FM en forma continua o
escalonada.
Elucin isocrtica vs elucin con gradiente
gradiente
Elucin
isocrtica
Elucin isocrtica vs elucin con gradiente
Elucin isocrtica: solvente de composicin constante.
B=acetonitrilo
Elucin en gradiente: solventes de distinta polaridad. Se vara
la composicin de la FM en forma continua o escalonada.
Elucin isocrtica vs elucin con gradiente
CUANDO ES NECESARIO UN GRADIENTE?
Buena resolucin pero
alto tiempo de anlisis
Buen tiempo de anlisis
pero baja resolucin
COMPROMISO IDEAL
Sistemas de bombeo
Requerimientos
Generacin de altas presiones (1000 - 6000 psi)
Flujo libre de pulsaciones Flujo libre de pulsaciones
Caudales 0.1 10 mL/min
Componentes resistentes a la corrosin (acero
inoxidable, tefln)
Bomba recproca o de movimiento alternado
etapa de aspiracin
pistn
etapa de descarga
hacia la
columna
fase mvil
Ventajas: pequeo volumen interno, resiste presiones > a
10.000 psi, permite elucin con gradiente, caudales
constantes e independientes de la contrapresin de la
columna y la viscosidad del solvente
Desventaja: produce flujo pulsado (amortiguar)
Bomba reciprocante de doble pistn
Bomba isocrtica marca Waters
Sistemas de inyeccin de muestra
Llenado del bucle
Inyeccin de
muestra en columna
muestra
eluyente
columna
eluyente
columna
Sistemas de inyeccin de muestra
Sistemas de inyeccin de muestra
Inyeccin manual versus inyeccin automtica
> precisin
Precolumna
Composicin similar a la columna cromatogrfica
Elimina materia en suspensin y componentes de
la muestra que se unen irreversiblemente a la FE
Se usa para mejorar la vida de la columna. Se
reemplaza cuando se contamina.
Tubos de acero inoxidable. Ocasionalmente
de vidrio resistente
Rectas (10 - 30 cm de longitud) y 4-10 mm d.i.
Columna
Rectas (10 - 30 cm de longitud) y 4-10 mm d.i.
Tamao partculas de relleno: 510 m
Columnas termostatizadas: en general se
trabaja a T ambiente. La T constante mejora el
cromatograma
Columna
Tubos de acero inoxidable. Ocasionalmente de vidrio
resistente
Rectas (10 - 30 cm de longitud) y 4-10 mm d.i.
Columna
Tamao partculas de relleno: 310 m
40.000-100.000 platos/metro
Columnas termostatizadas: en general se trabaja a T
ambiente. La T constante mejora el cromatograma
Columna
Rellenos
Relleno pelicular. Esferas de vidrio o
polmero no porosas de 30 40 m
de dimetro. En la superficie de las
esferas se deposita una capa delgada
y porosa de slica, almina, polmero. y porosa de slica, almina, polmero.
Relleno de partculas porosas.
Micropartculas porosas de slica,
almina o polmero de 3 10 m de
dimetro. Se recubren con pelculas
orgnicas que se unen qumica- o
fsicamente a la superficie.
Basados en la medida de una propiedad del
eluyente (ndice de refraccin, constante
dielctrica, densidad)
Basados en la medida de una propiedad del soluto
(absorbancia, fluorescencia, corriente lmite)
Detectores
(absorbancia, fluorescencia, corriente lmite)
Requisitos
Sensibilidad adecuada
Respuesta lineal amplia
Respuesta rpida y reproducible
Manejo sencillo
Detectores
Celda del detector UV-visible en HPLC
De la columna
Detector Fuente UV
Ventanas
de cuarzo
Detector Fuente UV
Al desecho
Ensanchamiento
extracolumna
Eficiencia de la columna
Tamao
partculas
Tamao
extracolumna
partculas
de
empaque
Tamao
de
muestra
10 m
5 m
H
H vs para partculas de diferentes dimetros
5 m
3 m
(cm/min)
Tamao de muestra
adsorcin
L-L (k = 2.3)
fase ligada (k = 4.3)
H
De acuerdo al
tipo de FE el
fase ligada (k = 4.3)
fase ligada (k = 1.2)
g muestra/ g empaque
tipo de FE el
efecto es ms
o menos
pronunciado
Ensanchamiento extracolumna
Se origina en los tubos que conectan los
componentes del sistema cromatogrfico (puerto de
inyeccin y columna, columna y detector, etc.)
radio del tubo [cm]
velocidad lineal de
r
2

24 D
M
H
ex
=
coeficiente de difusin del
soluto en fase mvil [cm
2
/s]
radio del tubo [cm]
velocidad lineal de
FM [cm/s]
CROMATOGRAFA
GASEOSA
G-L y G-FL particin G-L
FM FE MTODO INTERACCIN
Cromatografa gaseosa
G-L y G-FL
G-S
adsorcin
particin G-L
Gaseosa
lquida
slida
Ventajas:
Alta resolucin
Alta velocidad
Alta sensibilidad
Cromatografa gaseosa
Separacin de compuestos con PE ~
Limitaciones:
Muestras voltiles o fcilmente vaporizables
Deficiente para compuestos inicos o de PM > 600
Deficiente como tcnica cualitativa y preparativa
Cromatgrafo de gases
Esquema de un cromatgrafo de gases
medidor
flujo
sitio de
referencia
cromatografa de elucin
gas portador
puerto de
inyeccin
columna
registro
Detector
Esquema de un cromatgrafo de gases
- NO INTERACTIVO
- QUMICAMENTE INERTE
- DE ALTA PUREZA
-DEBE SER COMPATIBLE CON EL DETECTOR
Fase mvil: Gas de arrastre
- FLUJOS: 25 250 mL/min (columnas empacadas)
< 5 mL/min (columnas capilares)
Puerto de inyeccin
entrada gas
portador
salida de
excedente Bloque de metal
salida de purga
del septo
septo de goma
vidrio
columna
cmara de vaporizacin
excedente Bloque de metal
calentado
Columnas tubulares
abiertas (capilares)
Columnas rellenas
Columnas
Columnas
Empacadas
Capilares
SCOT (Support-coated open tubular) = soporte recubierto
WCOT (Wall-coated open tubular) = pared recubierta WCOT (Wall-coated open tubular) = pared recubierta
FSOT (fused-silica open tubular)
!OT (orous la"er open tubular)
Columnas macrocapilares (megabore)# $ % &'( )m
flujo
Dimetro
interno
(100 a 700 m)
poliimida
Columnas tubulares abiertas (capilares)
Columnas
Slice fundida
poliimida
Soporte recubierto
con FE lquida
SCOT WCOT FSOT
Propiedades y caractersticas de columnas tpicas de CG
Fases estacionarias Nombre comercial
Polidimetilsiloxano OV-1, SE-30
Poli(fenilmetildimetil)siloxano [10% fenil] OV-3, SE-52
Ejemplos de algunas fases estacionarias usadas
en cromatografa de gases
Poli(fenilmetildimetil)siloxano [10% fenil] OV-3, SE-52
Poli(fenilmetil)siloxano [50% fenil] OV-17
Poli(trifluoropropildimetil)siloxano OV-210
Polietilenglicol Carbowax 20M
Poli(dicianoalildimetil)siloxano OV-275
FE no-polar poli(dimetilsiloxano)
CG de 10 compuestos en FE de distinta polaridad
69 hexano 5
80 metil etil cetona 4
97 propanol 3
36 pentano 2
56 acetona 1
PE (C) Compuesto
Los compuestos aparecen casi en orden creciente de sus
puntos de ebullicin. El determinante principal de la retencin
en esta columna es la volatilidad de los compuestos
117
102
98
138
126
butanol
3-pentanona
heptano
pentanol
octano
6
7
8
9
10
CG de 10 compuestos en FE de distinta polaridad
FE polar poli(etilenglicol)
80 metil etil cetona 4
97 propanol 3
36 pentano 2
56 acetona 1
PE (C) Compuesto
alcanos
cetonas
La FE muy polar retiene los solutos polares. Los primeros que se eluyen son
los 4 alcanos, le siguen las 3 cetonas y por ltimo los 3 alcoholes. La fuerza
determinante de la retencin es el enlace de hidrgeno con la FE.
propanol
butanol
pentanol
69
117
102
98
138
126
hexano
butanol
3-pentanona
heptano
pentanol
octano
5
6
7
8
9
10
Efecto de la temperatura en el cromatograma
Isotrmica a 45 C
Isotrmica a 145 C
Programada
Detector de conductividad trmica
Detector de ionizacin de llama (FID)
llama
electrodo colector
terminal de la columna
gas portador
H
2
aire
Detector de captura electrnica
aislante
de la columna
al desecho
(Ni
63
, Sr
90
)
de la columna
al desecho
emisor radiactivo
+
electrodo
-
electrodo
CONDUCTIVIDAD
TRMICA
IONIZACIN
DE LLAMA
CAPTURA
ELECTRNICA
COMPUESTOS Orgnicos e
inorgnicos. Algunos
daan los filamentos
(HCl, Cl
2
, haluros de
alquilo)
Orgnicos.
No responde
a CO, CO
2
,
SO
2
, H
2
O
Con tomos
electronegat.(halu
ros de alquilo,
organometlicos,
organofosforados)
GAS PORTADOR H
2
, He N
2
, He N
2
, Ar
SENSIBILIDAD Moderada Muy buena Muy buena SENSIBILIDAD Moderada Muy buena Muy buena
LINEALIDAD Buena Amplia Limitada
TEMPERATURA
LMITE
400 C 400 C 225 C (Tr)
350 C (
63
Ni)
OTROS No destructivo.
Afectado por
variaciones de
temperatura y caudal
Destructivo,
requiere 3
gases y
electrmetro
No destructivo,
requiere licencia,
muestras secas y
electrmetro
Anlisis cuantitativo en CL y CG
Uso de patrones
externo e interno
S
P
S
Uso de patrn externo
rea S
[S]
[S]/[P]
rea S
rea P
rea S
x
S
x
rea S
x
rea P
S
x
P
CROMATOGRAFA ACOPLADA A ESPECTROMETRA
DE MASAS
Un espectrmetro de masas acoplado a un cromatgrafo
lquido o a un cromatgrafo de gases es un potente
detector para anlisis cualitativo y cuantitativo
La espectrometra de masas es una tcnica basada en La espectrometra de masas es una tcnica basada en
ionizar molculas gaseosas, acelerarlas en un campo
elctrico y separarlas de acuerdo a sus masas
Un espectro de masas es un grfico que muestra la
abundancia relativa de cada fragmento que llega al
detector de un espectrmetro de masas