Biotecnologia:

A aplicao industrial da Microbiologia

Fonte: MADIGAN; MARTINKO; PARKER, 2004.
Introduo
Biotecnologia: uso industrial de microrganismos
Exmplos: conjunto de tcnicas que
Permite indstria farmacutica cultivar microrganismos para produzir os
antibiticos que sero comprados na farmcia.
Permite cultivar clulas de pimenta longa em biorreator para produo de safrol,
um leo essencial (sntese de fixador de perfumes e de inseticidas naturais)
Permite o tratamento de despejos sanitrios pela ao de microrganismos em
fossas spticas.
Biotecnologia
Abrange diferentes reas do conhecimento:
- Cincias bsicas (biologia molecular, microbiologia, gentica, genmica, embriologia etc.),
- Cincias aplicadas (tcnicas imunolgicas, qumicas e bioqumicas)
- Outras tecnologias (informtica, robtica e controle de processos).
Setores Bens e servios
Agricultura adubo composto, pesticidas, silagem, mudas de plantas ou de
rvores, plantas transgnicas, etc
Alimentao pes, queijos, picles, cerveja, vinho, protena unicelular, aditivos,
etc.
Qumica butanol, acetona, glicerol, cidos, enzimas, metais, etc
Eletrnica biosensores
Energia etanol, biogs, utilizao de MO na indstria do petrleo.
Meio Ambiente recuperao de petrleo, tratamento do lixo, purificao da gua,
controle biolgico de pragas e doenas
Pecuria embries
Sade antibiticos, esterides, hormnios e outros produtos
farmacuticos, vacinas, reagentes e testes para diagnstico, etc.
O seu impacto atinge vrios setores produtivos, gerando novas oportunidades de emprego:
plantas resistentes a doenas,
plsticos biodegradveis,
detergentes mais eficientes,
biocombustveis,
processos industriais e agrcolas menos poluentes,
mtodos de biorremediao do meio ambiente,
testes para diagnsticos e novos medicamentos.
Produtos de origem
biotecnolgica
A Biotecnologia transforma nosso dia a dia
Biosensores
A Lngua
Eletrnica
muito mais
sensvel que
a lngua
humana e foi
desenvolvida
para avaliar a
qualidade e
paladar de
bebidas,
entre elas, a
gua, vinho
leite e caf.
Existem 5 grandes grupos de interesse comercial:
1. Produo de biomassa microbiana
2. Produo de enzimas microbianas
3. Produo de metablitos
4. Produo de produtos recombinantes
5. Modificao de compostos
Processos biotecnolgicos
1. Biomassa microbiana
Divide-se em vrios processos:
Produo de leveduras para panificao. Foi utilizada como alimento na Alemanha
durante a I Guerra Mundial.
Produo de leveduras para a fabricao de etanol.
Bactrias para tratamento biolgico de efluentes.
Na alimentao do homem e de animais (SCP single cell protein) (algas e leveduras)
Como fixadores do nitrognio do ar na agricultura (rizbios).
No controle biolgico de pragas (Bacillus).
Na produo de vacinas (Corynebacterium, Bordetella, Neisseria, Mycobaterium).
Um boi de 450 kg ganha cerca de 0,45 kg de protena por dia; em
contraste, 450 kg de leveduras produziriam diversas toneladas de
protenas em apenas um dia!
Produo industrial de clulas de levedura. (a) Estgios da produo. Agentes
antiespumantes so introduzidos no fermentador para impedir a formao de um
excesso de espuma na superfcie do meio durante a aerao e agitao. (b) Fotografia
de produtos comuns de leveduras para consumo: tabletes de fermento; pacotes de
levedura ativa desidratada; frasco de levedura nutricional.
Fonte: MADIGAN;
MARTINKO; PARKER,
2004.
Enzimas so obtidas a partir de plantas, animais e microrganismos.
As enzimas microbianas tem grandes vantagens:
possvel produzir em grandes quantidades via processos biotecnolgicos;
infinitamente mais fcil melhorar a produtividade de um sistema microbiano
comparado com plantas e animais;
Sua produo controlada para o aumento da produtividade (indutores no meio,
aumento dos genes de expresso).
2. Enzimas microbianas
Produto Microrganismo Uso Enzima Microrganismo Aplicaes Reaes
B
a
c
t

r
i
a
s
F
u
n
g
o
s
Estreptoquinase Streptococcus spp. Tratamento de pacientes Dissolve fibrina no sangue
com ataques cardacos
Glicose isomerase Streptomyces spp.; Produo de xaropes com Converte glicose em frutose
Bacillus spp. alto teor de frutose
DNA polimerase (Taq) Thermus aquaticus PCR Sntese de DNA
Escherichia coli (recombi-
nante)
Lipase Rhizopus spp. Flavorizante de alimentos Hidrolisa lipdios a glicerol e
aumenta poder clareador cidos graxos
de detergentes
Celulases Trichoderma reesii Digestivo Hidrolisa celulose a celobiose
Glicose oxidase Aspergillus spp.; Remove glicose de ovos Oxida glicose a cido glucnico
Penicillium spp. p/ secagem, remove oxig-
nio de alimentos enlatados,
refrigerantes e cerveja; usada
tambm para fabricao de
papis teste para controle
diabete
Enzimas, exemplos
3. Metablitos microbianos
Diferena entre a produo de metablitos primrios e secundrios.
Formao de lcool por leveduras um exemplo de metablito primrio.
Produo de penicilina pelo fungo filamentoso Penicillium chrysogenum um
exemplo de metablito secundrio. Observe como a penicilina no
produzida at a metade da fase log. Fonte: MADIGAN; MARTINKO; PARKER,
2004.
Durante a fase exponencial de crescimento os microrganismos produzem
substncias essenciais ao crescimento:
Aminocidos
Nucleotdeos
Protenas
cidos nuclicos
Lipdeos
Carboidratos, etc.
- So referidos como produtos do metabolismo primrio.
Normalmente sintetizam quantidades suficiente para suas necessidades mnimas.
3. Metablitos microbianos
Aminocidos
cido glutmico: condimento, flavorizante (glutamato monossdico)
* microrganismo: Corynebacterium glutamicum (mutante)
Lisina: suplemento para a protena vegetal
*Corynebacterium glutamicum (mutante com alta atividade de DAP
descarboxilase)
*Brevibacterium flavum
Durante a fase estacionria muitos microrganismos sintetizam produtos que no so
sintetizados na fase de crescimento.
- Comum nos fungos, nas bactrias esporulantes e nas filamentosas
- Pode no ter funo evidente para o metabolismo da clula.
Produtos do metabolismo secundrio
As rotas primrias so comuns na maioria dos microrganismos, mas cada produto
secundrio sintetizado por poucos microrganismos diferentes.
Metablitos secundrios
Atividade antimicrobiana
Inibidores especficos de enzimas
Promotores do crescimento
Propriedades farmacolgicas
Formam a base de um grande
nmero de processos
biotecnolgicos.
Os microrganismos produzem
baixas concentraes, da a
necessidade da clonagem
molecular.
Produtos de sntese microbiana
Penicilina
1928 (descoberta) a 1941 (industrializao):
produtividade foi aumentada em 1000 x
Testes preliminares para
comercializao do antibitico
Produtos da degradao microbiana
lcool e Vinagre
* fermentao do acar lcool vinagre
anaerobiose aerobiose
Principais microrganismos: Acetobacter spp.
cido ltico
* derivado de mltiplos usos:
lactato de sdio: deficincia de clcio
lactato de ferro: tratamento da anemia
* matria prima: amido, melao, soro de leite
* Etapas:
hidrlise do amido a glicose (cidos ou enzimas)
C
12
H
22
O
11
+ H
2
O 2C
6
H
12
O
6
fermentao da glicose
2C
6
H
12
O
6
4CH
3
CHOHCOOH
* Microrganismo: Lactobacillus bulgaricus
* Resduo de biomassa: alimentao animal
Produto Microrganismo Uso Produto Microrganismo Uso
Acetona e butanol C. acetobutylicum Solventes, fabricao de
e outros clostrdios produtos qumicos
2,3-Butanediol Bacillus polymyxa; Solvente, hidratatante
Enterob. aerogenes intermedirio qumico
cido 2-cetoglucnico Pseudomonas spp. Intermedirio na fabri-
cao de cido isoascr-
bico (isovitamina C)
Sorbose Gluconobacter oxydans Fabricao de cido
ascrbico (vitamina C)
cido ctrico Aspergillus niger Alimentos e bebidas,
cosmticos, couro
cido glucnico Aspergillus niger Alimentos, clarificadores
cido itacnico Aspergillus terreus Fab. de resinas acrlicas
cido fumrico Rhizopus nigricans Fab. de resinas e agentes
umectantes
B
A
C
T

R
I
A
S
F
U
N
G
O
S
Outros produtos da degradao (desassimilao) microbiana:
Substncias produzidas por animais e plantas sintetizadas por microrganismos.
Tecnologia do DNA recombinante: clonagem molecular
Exemplos:
- Hormnio GH
(US$ 20 milhes/Kg)
- Hormnio Insulina
(A Biobrs possui uma das quatro patentes no mundo)
4. Produo de recombinantes
Mecanismo para expulsar o hormnio
Hormnio do crescimento humano (GH):
1982 - Escherichia coli com o gene do hormnio de crescimento humano
Insulina humana:
1 biofrmaco produzido pela engenharia gentica
1982 - produo nos EUA pela empresa Lilly
Microrganismo produtor: Escherichia coli com o gene humano
para produo de insulina.
Insulina
Protena produzida no pncreas
Regulao do metabolismo de carboidratos
Produo original
Extrao a partir de animais: porcos, bois
Eficincia de ao reduzida
Vacina contra hepatite B (HBV): 1982
- Vrus difcil de cultivar em laboratrio
- Protena viral HBsAgs (antgeno) altamente imunognica
- Altas doses: rpido e elevado nvel de imunidade
Microrganismo: Saccharomyces cerevisiae com o gene
para a protena
Processos microbianos so mais especficos que processos puramente qumicos.
Permitem a adio, remoo ou modificao de grupos ou stios especficos em
molculas complexas.
Reaes que podem ser biocatalizadas:
Desidrogenao
Oxidao
Hidrogenao
Desidratao e condensao
Descarboxilao
Aminao
Desaminao
Isomerao
5. Modificao de compostos
Bacillus thuringiensis
cr
Cristais proticos contendo toxinas
com propriedades inseticidas
Biocontrole
Bacillus thuringiensis
Biominerao
* Reduo das reservas mundiais
* Explorao de minrios de baixa qualidade
* Poluio causada pelos mtodos tradicionais de extrao
uso de microrganismos mineradores
Thiobacillus thioxidans e Thiobacillus ferroxidans
cidos oxidao do minrio precipitao
A companhia Vale do Rio Doce tem um projeto em
biominerao
Thiobacillus ferroxidans
Engenharia Gentica aplicada as plantas
A bactria Agrobaterium tumefaciens possui um
plasmdeo com genes que mobilizam a
transferncia de DNA para a planta.
Vetor (ferramenta) de clonagem em plantas
Obteno de planta transgnica com o
gene da toxina de Bacillus thuringiensis
Perspectivas da biotecnologia
Vacinas de DNA:
- baixa toxicidade
- inocuidade
- estabilidade
Plantas transgnicas para produo de frmacos
- interferon
- anticorpos vegetais
- vacinas comestveis
Etapas que compem um processo biotecnolgico
Independente do tipo, um processo pode ser dividido em seis etapas
bsicas:
1. Formulao do meio de cultura
2. Esterilizao do meio, equipamentos e acessrios
3. Produo do inculo em quantidade suficiente para inocular o volume de
processo
4. Crescimento do microrganismo no biorreator em condies timas para
formao do produto
5. Extrao do produto e sua purificao
6. O tratamento/eliminao dos efluentes gerados pelo processo.
Etapas de um processo
fermentativo
Principais etapas de um processo biotecnolgico
A maioria dos biorreatores em uso so
de tanque agitado (STR)
Fermentao
Reao de oxidao-reduo em que alguns tomos do doador de
eltrons (fonte de energia) tornam-se reduzidos, enquanto outros
tornam-se mais oxidados, havendo a produo de energia pela
fosforilao em nvel de substrato.
Uma substncia orgnica originria da degradao do substrato serve
de aceptor final de eltrons
PROCESSOS FERMENTATIVOS
Em Microbiologia Industrial, o termo fermentao refere-se a
qualquer processo microbiano em larga escala, independente deste
corresponder ou no a uma fermentao. A maioria das
fermentaes industriais ocorrem em condies aerbicas.
NADH NAD
+
Piruvato
Fermentao
Etanol CO
2
Lactato
Hidrognio
CO
2
H
2
O
Respirao
NADH
NAD
+
Auttrofos Hetertrofos
Glicose
NAD
+
NADH
8 ATP
30 ATP
Alguns exemplos de fermentao com diferentes
produtos finais e respectivos microrganismos
produtores (TRABULSI; ALTERTHUM, 2008)
Pontos fundamentais de um
processo fermentativo
Escolha de microrganismos;
Escolha do meio de cultura;
Forma de conduo do processo
fermentativo;
Etapas de recuperao do produto.
Caractersticas desejveis para
microrganismos industriais
Apresentar elevada eficincia na converso de um dado
substrato;
Permitir o acmulo do produto no meio de forma a se ter
elevada concentrao do produto no caldo fermentado;
No produzir substncias incompatveis com o produto;
Apresentar constncia quanto ao comportamento
fisiolgico;
No exigir condies de processo muito complexas;
No exigir meios de cultura dispendiosos;
Permitir a rpida liberao do produto para o meio.
Matria prima para preparo dos
meios de cultura
Matria prima: sacarose
Caldo de cana-de-acar;
Melao;
Suco de frutas;
Leite;
Soro de leite;
Vinhato ou vinhaa.
Matria prima: amido
Gros/cereais: Trigo, Milho,
Cevada, centeio, arroz
Razes/Tubrculos: Mandioca,
Batata, Batata doce
Matria prima: celulose
Subprodutos da indstria de
madeiras
Bagaos
Casca de frutas
Sabugo de milho
Resduos agrcolas
Inculo-ativao/propagao
Classificao dos processos fermentativos-
quanto ao inculo
Classificao dos processos fermentativos-
quanto ao inculo
Fonte: MADIGAN;
MARTINKO; PARKER,
2004.
Uma grande usina
de fermentao
industrial.
So visveis
somente as
pores superiores
dos fermentadores,
os quais podem
apresentar altura
correspondente
a vrios andares.
(b) Sala de controle
automatizado de
uma
grande usina de
fermentao.
Fonte: MADIGAN;
MARTINKO;
PARKER, 2004.
Escalonamento industrial
Classificao dos processos
fermentativos
Quanto ao suprimento de oxignio:
Aerbio (natural ou forado). Ex.: fermentao actica e
ctrica.;
Anaerbio. Ex.: fermentao alcolica, lctica e
acetobutlica.
Quanto ao crescimento do agente:
Submerso (FSm). Em meio lquido;
Fermentao no estado slido (FSS). Crescimento de
MO sobre substratos slidos, na ausncia de gua livre.
Superfcie (em bandejas). Ex.: cido ctrico (bolores),
cultivo de clulas animais para produo de vacinas;
Tipos de biorreatores para FSS
Algumas caractersticas dos processos de FES e FSm
Fermentao em Estado Slido (FES) Fermentao Submersa (FSm)
Meio de cultivo simples, na maioria das
vezes, natural. So usados resduos
agroindustriais. O nico componente
necessrio a ser adicionado gua,
embora, outros nutrientes como fonte de N
ou minerais possam ser adicionados.
Utiliza-se, normalmente, meios sintticos,
que so economicamente inviveis quando
se pensa no scale-up do processo.
Havendo necessidade de pr-tratamentos
estes so simples mas podem modificar,
negativamente, a estrutura do substrato.
Utilizando-se meios complexos, os pr-
tratamentos so indispensveis para
solubilizar os nutrientes.
O espao ocupado pelo equipamento de
fermentao pequeno, considerando-se
o rendimento do produto, e os meios
slidos de fermentao so concentrados,
o que eleva a produtividade volumtrica.
Os bioreatores ocupam grandes espaos e
o substrato muito diludo, levando a
baixas produtividades volumtricas.
Em muitos casos, no h necessidade de
filtrao pois o produto concentrado no
substrato e pode ser usado diretamente
Havendo necessidade de extrao do
produto do substrato (ex: produo de
enzimas) gasta-se muito menos solvente
Processos de downstream necessitam da
remoo de grandes volumes de gua, o
que encarece, sobremaneira, o processo.
No entanto, com meios e processos
definidos, os protocolos de purificao
podemser simplificados.
Algumas caractersticas dos processos de FES e FSm
(continuao
Fermentao em Estado Slido (FES) Fermentao Submersa (FSm)
Como a maioria das bactrias requerem
altos nveis de atividade de gua, a FES
exclui, ou reduz sensivelmente, o
problema da contaminao bacteriana.
Trabalha-se com valores altos de atividade
de gua e isso propicia ambiente favorvel
para o crescimento de microrganismos
contaminantes.
O resduo remanescente possui um
volume reduzido e no apresenta
condies para o desenvolvimento de
patgenos.
Normalmente, grandes volumes de
resduos lquidos so gerados e estes
ainda podem apresentar grande atividade
biolgica.
Utilizando-se altas concentraes de
substrato pode-se obter altas
concentraes de produtos.
Altas concentraes de substratos podem
causar problemas de natureza reolgica e
de represso catablica.
Em muitos casos, no h necessidade de
filtrao pois o produto concentrado no
substrato e pode ser usado diretamente.
Havendo necessidade de extrao do
produto (produo de enzimas) gasta-se
menos solvente que na FSM. Porm, os
extratos podem estar contaminados com
componentes do substrato.
Processos de downstream necessitam da
remoo de grandes volumes de gua, o
que encarece, sobremaneira, o processo.
No entanto, com meios e processos
definidos, os protocolos de purificao
podemser simplificados.
Alimentos preparados com o uso de microrganismos
Alimento Matria prima Principal Microrganismo Grupo
Picles Pepinos Lactobacillus spp.
Pediococcus spp.
Bacilos, Gram+
Cocos, Gram +
Leite fermentado Leite L. acidophilus Bacilos, Gram +
Po Farinha Saccharomyces cerevisiae Levedura
Ricota Leite pasteurizado L. bulgaricus Bacilos, Gram +
Koumiss Leite de gua L. bulgaricus
Torula, Mycoderma
Bacilos, Gram +
Leveduras
Kefir Leite fresco, Streptococcus spp.
Lactobacillus spp.
Leuconostoc
Acetobacter
Cocos, Gram +
Bacilos, Gram +
Cocos, Gram +
Bacilos, Gram -
Ioogurte Leite pasteurizado L. bulgaricus
S. thermophilus
Bacilos, Gram +
Cocos, Gram +
Shoyu Arroz, Soja L. delbrueckii
Aspergillus oryzae
Sacharomyces rouxii
Bacilos, Gram +
Fungo filamentoso
Levedura
Queijos Leite S. lactis
S. cremoris
L. citrovorum
L. dextranicum
Outros microrganismos
Cocos, Gram +
Cocos, Gram +
Bacilos, Gram +
Bacilos, Gram +
Fungos
Cerveja Gros de cereais Saccharomyces spp. Leveduras
Vinho Suco de uva Saccharomyces cerevisiae
Sacch. champagnii
Leveduras
Presunto e salsichas curados Porco/Gado Pediococcus cerevisiae Cocos, Gram +
Presunto curado Porco Aspergillus, Penicillium Fungos
Diagrama de um gerador de vinagre. O sumo alcolico gotejado atravs das
aparas de madeira, e o ar introduzido de maneira ascendente a partir do fundo,
atravessando as aparas. As bactrias acticas se desenvolvem sobre as aparas de
madeira, convertendo o lcool em cido actico. Essa soluo de cido actico se
acumula na cmara coletora, sendo reciclada atravs do gerador at que o teor de
cido actico atinja pelo menos 4%, o mnimo para que um produto possa ser
considerado vinagre.
Produo de vinagre
Produo de vinho. (a)
Vinho branco. Os vinhos brancos
podem variar de praticamente
incolores a cor de palha,
dependendo das uvas empregadas.
(b) Vinho tinto. A cor dos vinhos
tintos pode variar de vermelho
plido a um vermelho intenso, tal
como em um rico borgonha. A
fotografia ilustra uma taa de
Chenin Blanc, um tpico vinho
branco ( esquerda) e outra de
vinho tinto claro (ros, direita).
Outras variedades tpicas de vinho
branco incluem chablis, vinho do
Reno, sauterne e chardonnay;
outros vinhos tintos tpicos incluem:
borgonha, chianti,claret, zinfandel,
cabernet e merlot.
Produo de vinagre
Purificao de produtos
biotecnolgicos
1. Separao de clulas e seus fragmentos
do meio de cultivo (clarificao);
2. Concentrao e/ou purificao de baixa
resoluo;
3. Purificao de alta resoluo;
4. Operaes para acondicionamento final
do produto.
Operaes Unitrias viveis em
escala industrial
Produto intracelular mtodos
mecnicos de rompimento
Produto intracelular mtodos
qumicos de rompimento
Precipitao com sais
- Sulfato de sdio, cloreto de sdio e cloreto de magnsio.
- Os sais retiram a gua de hidratao e por sua vez a solubilidade
da protena (salting out).
Precipitao com solventes orgnicos
- A adio de solvente orgnicos (etanol ou acetona) a solues
aquosas de protenas reduz a solubilidade das protenas por
reduo da constante dieltrica do meio.
Produto extracelular
Os solutos de um meio lquido (protenas, peptdeos, anticorpos) so
adsorvidos ou retidos em um leito material poroso (fase
estacionria/matriz). Atravs de um processo de eluio (fase mvel)
ocorre a remoo gradual dos solutos.
Processos cromatogrficos
Os custos referentes ao processo de separao representam de 50
a 80% do custo de produo da enzima.
Processos de custos elevados, podendo representar a quase a
metade do total de produo de uma droga, protena ou produto
biolgico.
Para que a reduo dos custos de produo ocorra importante
avaliar os equipamentos e otimizar o processo de recuperao e
purificao do produto.
Processos cromatogrficos
Cromatografia em gel
(filtrao em gel)
separa as
molculas do soluto
de acordo com os
diferentes tamanhos
moleculares.
Tem com
vantagens:
simplicidade,
rapidez e economia
do mtodo, no
necessitando de
gradientes para
eluio.
Cromatografia de Afinidade
Cromatografia Troca Inica
Eletroforese
Tcnica bastante efetiva no
isolamento, purificao e
caracterizao de enzimas.
Normalmente utilizada
como uma etapa final no
processo de purificao aps
separaes cromatogrficas
prvias.
Utilizada para
caracterizao da enzima em
relao ao peso molecular
(SDS-PAGE), determinao
do ponto isoeltrico (IEF) e
avaliao da pureza da
enzima.
Tratamentos finais
Liofilizao
Processo de remoo de um
solvente, normalmente a gua, de
uma soluo por sublimao. Os
materiais liofilizados so
apresentados na forma de p.
Os produtos liofilizados so
mais estveis, motivo este que
grande parte das protenas
comerciais se encontram na forma
liofilizada.
Cristalizao
Processo de agregao de cristais de
molculas presentes em solues
supersaturadas.
Empregada na fase final dos
processos de purificaao de protenas
(p. ex. enzimas)
Importante em processos
biotecnolgicos, pois permite a
estocagem estvel de bioprodutos.
O processo de produo
Referncias
Furtado, R. F. et al. EMBRAPA. Aplicaes de biossensores na
anlise da qualidade dos alimentos. 2008. Disponvel em :
http://www.cnpat.embrapa.br/cnpat/cd/jss/acervo/Dc_117.pdf
MADIGAN, M. T.; MARTINKO, J. M.; PARKER, J. Microbiologia de
Brock. 10 ed. So Paulo: Prentice Hall, 2004.
TRABULSI; L. R. ; ALTERTHUM, F. Microbiologia. 5 ed. So
Paulo: Atheneu, 2008.
SANTOS, D. T. et al. Potencialidades e aplicaes da
fermentao semi-slida em biotecnologia. Janus, Lorena, ano
4, n. 4, 2006. Disponvel em:
http://www.fatea.br/seer/index.php/janus/article/viewFile/44/47.
PALMA, M. B. Produo de xilanases por Thermoascus
aurantiacus em cultivo em estado slido. Tese de doutorado.
2003. Disponvel em:< http://www2.enq.ufsc.br/teses/d010.pdf>.
PESSOA JR, A.; KILIKIAN, B. V. Purificao de produtos
biotecnolgicos. So Paulo: Manole, 2005.