Micro Arrays

Microarrays
y Biochips de ADN
Informe de Vigilancia
Tecnolgica
Microarrays
y Biochips de ADN
Informe de Vigilancia
Tecnolgica
4
MICROARRAYS Y BIOCHIPS DE ADN
El presente informe de Vigilancia Tecnolgica ha sido
realizado en el marco del convenio de colaboracin
conjunta entre Genoma Espaa y la Fundacin General
de la Universidad Autnoma de Madrid (FGUAM), entidad
que gestiona el Crculo de Innovacin en Biotecnologa
(CIBT), perteneciente al Sistema de Promocin Regional
de la Innovacin MADRI+D.
Los autores de este informe agradecen la colaboracin
ofrecida por toda la comunidad cientfica y empresarial
para la realizacin de este informe. Un especial
agradecimiento al Dr. Fernando Martn Snchez (ISCIII),
Dra. Ana Dopazo (CNIO), Dr. Laureano Simn (Medplant
Genetics, S.L.), Dr. Juan Bernal (IIB), Dr. Juan Carlos
Tercero (Pharmagen, S.A.), Dr. Carlos Briones y
Dr. Victor Parro (Centro de Astrobiologa),
a D. Pedro M. Franco de Sarabia (Biotools B&M Labs, S.A.),
Dr. Jos Manuel Guisan (CSIC), Dr. Joaqun Dopazo
(CNIO), Dr. Jos Mara Carazo (CNB-CSIC)
y Dr. Manuel Navarro (CIEMAT).
La reproduccin parcial de este informe esta autorizada
bajo la premisa de incluir referencia al mismo, indicando:
Microarrays y Biochips de ADN, Informe de Vigilancia
Tecnolgica. GENOMA ESPAA / CIBT-FGUAM.
Genoma Espaa no se hace responsable del uso
que se realice de la informacin contenida
en esta publicacin. Las opiniones que aparecen
en este informe corresponden a los expertos consultados
y a los autores del mismo.
Copyright:Fundacin Espaola para el Desarrollo
de la Investigacin en Genmica y
Protemica/Fundacin General de la Universidad
Autnoma de Madrid.
Autores: Marta Lpez (CIBT-FGUAM)
Paloma Mallorqun (CIBT-FGUAM)
Miguel Vega (Genoma Espaa)
Referencia: GEN-ES02001
Fecha: Octubre 2002
Depsito Legal: M-52478-2002
ISBN: 84-607-6228-9
Diseo y realizacin: Spainfo, S.A.
ndice de contenido
RESUMEN EJECUTIVO 7
1. INTRODUCCIN 8
2. TECNOLOGAS DE MICROARRAYS 10
2.1. Tipo de Sonda 10
2.2. Marcaje de Sondas 11
2.3. Material de Soporte 14
2.4. Inmovilizacin de ADN 16
2.5. Fabricacin 17
2.6. Escaneado y Software 21
2.7. Breves cuestiones tcnicas 23
2.8. ltimas tendencias en desarrollos tecnolgicos 24
3. APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA 26
3.1. Monitorizacin de la Expresin Gnica 27
3.2. Cribado de compuestos activos y validacin de dianas teraputicas 28
3.3. Farmacogenmica 30
3.4. Diagnstico molecular 31
Chips para identificacin de SNPs 31
Chips de caracterizacin gentica 31
Chips de deteccin de enfermedades infecciosas 32
4. ASPECTOS DE MERCADO: APLICACIN DE MICROARRAYS DE ADN
Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA 34
4.1. Arrays de alta densidad 34
4.2. Arrays de media y baja densidad 35
4.3. Mercados: Affymetrix 36
4.4. Mercados: empresas que compiten con Affymetrix 38
4.5. Estrategias de desarrollo e implantacin 40
4.6. Modelos de negocio 41
4.7. Tendencias: lab-on-a-chip 42
5
5. CASOS PRACTICOS 43
Caso Prctico 1: Biotools B & M Labs, S.A 43
Caso Prctico 2: Centro de Astrobiologa, CSIC-INTA 44
Caso Prctico 3: PharmaGen S.A. 45
Caso Prctico 4: Instituto de Investigaciones Biomdicas, CSIC-UAM 46
Caso Prctico 5: Medplant Genetics, SL 47
Caso Prctico 6: Instituto de Salud Carlos III 48
Caso Prctico 7: Centro Nacional de Investigaciones Oncolgicas (CNIO, ISCIII) 49
6. CONCLUSIONES 50
ANEXO I: Breve glosario de trminos en genmica 53
ANEXO II: ndice de Tablas, Cuadros y Figuras 54
ANEXO III: Referencias 55
6
Los microarrays de ADN y biochips se definen
como una matriz bidimensional de material
gentico, que permite la automatizacin
simultnea de miles de ensayos encaminados a
conocer en profundidad la estructura y
funcionamiento de nuestra dotacin gentica,
tanto en los distintos estados de desarrollo como
patolgicos del paciente.
Hasta la fecha no puede establecerse un autntico
estndar en microarrays de ADN, sino la
coexistencia de distintas tecnologas con el mismo
fin: el anlisis de la expresin y la variabilidad
gnica. La decisin final sobre la tecnologa a
aplicar (ej. cDNA vs. Oligos; depsito vs. Sntesis
in situ de sondas) depender de la aplicacin u
objetivo final del ensayo.
Algunas tendencias de desarrollo prometedoras
pretenden eliminar el paso de amplificacin de la
muestra e incluso la integracin de todas las
operaciones en un solo dispositivo (Lab-on-a chip
o LOAC). En este sentido, los principales motores
de la nueva generacin de microarrays y biochips
sern la integracin, la fiabilidad y la sensibilidad
del ensayo.
A continuacin se enumeran las principales
aplicaciones de microarrays y biochips en salud
humana:
Monitorizacin de la expresin gnica.
Cribado de compuestos activos y validacin de
dianas teraputicas.
Farmacogenmica. Medicina personalizada.
Diagnstico molecular y prognosis de
enfermedades.
Deteccin de agentes infecciosos.
Respecto a los aspectos de mercado, no hay duda
que Affymetrix es el actual lder del mercado,
sobre todo en la venta de arrays de alta densidad
para expresin gnica. Sin embargo, y para la
prctica clnica, donde se necesitan arrays de
menor densidad y coste, existen otras compaas
que hacen de la fiabilidad, rapidez y
simultaneidad del ensayo, sus principales valores.
Las alianzas en este sector, con objeto de
compartir bases de datos, licencias de secuencias
y tecnologas desarrolladas, son la constante del
sector en EE.UU. Adems, actualmente existe una
autntica carrera tecnolgica entre las distintas
empresas que fabrican microarrays o sus
componentes, para posicionarse como lderes de
este importante mercado de futuro.
No obstante existen todava importantes
dificultades para transferir los resultados
obtenidos con microarrays o biochips a la prctica
clnica, es decir, para que los pacientes se
beneficien de este desarrollo tecnolgico. En este
contexto, quizs la dificultad ms importante
resida en la variabilidad de los resultados
obtenidos en los ensayos, si bien se est
realizando un importante esfuerzo para la
estandarizacin de los protocolos de ensayo,
como paso previo y necesario para obtener
procedimientos y dispositivos clnicos fiables.
7
Resumen ejecutivo
A finales de los aos 80 cuatro cientficos,
Stephen Fodor, Michael Pirrung, Leighton Read y
Lubert Stryer desarrollaron una revolucionaria
tecnologa para la determinacin y cuantificacin
de ADN en una muestra. Esta tecnologa
desembocara posteriormente en la primera
plataforma de microarrays de ADN, denominada
entonces GeneChip de Affymetrix.
La principal ventaja de esta novedosa tecnologa
frente a los mtodos tradicionales (Northern,
Southern, etc.), resida en la alta densidad de
integracin (cantidad) de material biolgico que
se consigue inmovilizar, es decir, la posibilidad de
analizar simultneamente miles de genes.
Actualmente esta tecnologa se est aplicando
entre otros al anlisis de la expresin gnica,
deteccin de mutaciones y polimorfismos,
secuenciacin, seguimiento de terapia, medicina
preventiva, screening y toxicologa de frmacos, y
diagnstico molecular.
8
1. Introduccin
9
Clasificacin
de microarrays segn:
Caractersticas Nombre
Material inmovilizado
Oligonucletidos.
cDNAs.
Protenas.
Tejidos.
Gene Chips.
cDNA Array.
Protein Chip.
Tissue Chip.
Diseo del array
o surtido
Personalizado Arrayers
Industrial Cassettes
Alta: microarrays
Densidad de integracin
Generacin de la sonda
Fabricacin
Impresin
Baja: macroarrays
in situ
depositadas
Soporte rgido
(Cristal y Plstico)
Membranas
No poroso / Covalente
Poroso / No covalente
Soporte / Tipo de unin
Aplicacin
Secuenciacin por hibridacin.
Deteccin de cambios en la
expresin gnica.
Cuantificacin de la expresin
gnica.
Chips de secuenciacin.
Chips de hibridacin
comparativa.
Chips de expresin.
Una coleccin (array) de ADN consiste en un gran nmero de molculas de ADN ordenadas sobre un
sustrato slido de manera que formen una matriz de secuencias en dos dimensiones. Estos
fragmentos de material gentico pueden ser secuencias cortas llamadas oligonucletidos, o de mayor
tamao, cDNA (ADN complementario, sintetizado a partir de mRNA), o bien productos de PCR
(replicacin in vitro de secuencias de ADN mediante la reaccin en cadena de la Polimerasa). A estos
fragmentos de ADN de una sola hebra inmovilizados en el soporte, se les denomina a menudo
sondas. Los cidos nucleicos de las muestras a analizar se marcan por diversos mtodos
(enzimticos, fluorescentes, etc.) y se incuban sobre el panel de sondas, permitiendo la hibridacin
(reconocimiento y unin entre molculas complementarias) de secuencias homlogas. Durante la
hibridacin, las muestras de material gentico marcadas, se unirn a sus complementarias
inmovilizadas en el soporte del chip, permitiendo la identificacin y cuantificacin del ADN presente
en la muestra (mutaciones, patgenos, etc.). Con posterioridad, el escner y las herramientas
informticas nos permiten interpretar y analizar los datos obtenidos.
Cuadro 1. Definicin de microarray o biochip.
Tabla 1. Criterios de clasificacin en Biochips (adaptado de http://infobiochip.isciii.es).
DEFINICIN DE MICROARRAY O BIOCHIP
2.1. Tipo de Sonda
El diseo de las sondas y su produccin son
elementos clave a la hora de hacer posible la
hibridacin en el biochip. Sin la riqueza de
conocimiento y datos de secuencias disponibles
en diversas bases de datos y proyectos
genmicos, la generacin de estas sondas sera
imposible. Fsicamente, las sondas tienen tres
formas diferentes: clones de cDNA, productos de
PCR, y oligonucletidos.
Las sondas basadas en clones se depositan en la
superficie del array en forma de fragmentos o
genes completos generalmente procedentes de
libreras gnicas
1
. El tamao de estas sondas
puede ser de varios cientos de pares de bases
hasta varias kilobases. Los productos de PCR
consisten en fracciones de genes generados por
PCR procedentes de clones de cDNA, libreras
genmicas, o RNA. La longitud de estos
fragmentos suele ser de 200 a 500 pares de
bases. Las sondas consistentes en
oligonucletidos difieren de las anteriores en que
el nmero de pares de bases es ms limitado,
20-25 para anlisis de expresin diferencial y
hasta 100 para anlisis de expresin gnica.
10
2. Tecnologas de microarrays
Fig.1. Operaciones y tecnologas necesarias para la elaboracin de microarrays y biochips de ADN (elaboracin propia).
cido nucleico DIANA:
cido nucleico procedente de la muestra
problema, cuya secuencia genmica se
pretende detectar.
SONDAS de hibridacin:
Fragmentos de cidos nucleicos marcados
cuya secuencia es complementaria a la del
ADN diana.
1
International Nucleotide Sequence Database Collaboration [engloba DNA Data Bank of Japan (DDBJ), European
Molecular Biology Laboratory (EMBL/EBI) Nucleotide Sequence Database, (GenBank, USA)].
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/collab
OPERACIONES A REALIZAR
TECNOLOGAS/
TCNICAS A EMPLEAR
Eleccin del tipo de ADN
Marcaje de sondas o muestras
Material de soporte
Inmovilizacin de sondas
Fabricacin
Deteccin de la hibridacin
Procesamiento de datos
Sondas, oligos, cDNA
Enzimtico, fluorescente
Vidrio, plstico, membranas
Activa, pasiva, covalente
Impresin, sntesis in situ
Escneres, fluorimetras
Software
DISEO DE MICROARRAYS
2.2. Marcaje de Sondas
La deteccin de la hibridacin entre las sondas de ADN inmovilizadas en el soporte y los fragmentos de
material gentico de la muestra, requiere un marcaje previo para su posterior deteccin. Este marcaje
puede ser directo o indirecto:
11
Marcaje Lectura Caractersticas Ventajas Desventajas
MARCAJE DE SONDAS Y MUESTRAS PARA DETECCIN DIRECTA
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3
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Se pone en contacto
a la muestra
marcada con la
enzima con un
sustrato cromognico
capaz de absorber
radiacin.
Se incorporan a la
estructura molecular
de la sonda istopos
radiactivos.
Un marcador
fluorescente emite
luz al ser excitado
mediante una
determinada longitud
de onda.
No se necesitan
reactivos
auxiliares en el
proceso de
deteccin.
No se necesitan
reactivos
auxiliares en el
proceso de
deteccin.
Gran
sensibilidad,
facilidad de
uso,
reproducibilidad,
flexibilidad.
Las enzimas pueden
confundirse con
enzimas nativas
presentes en la
muestra, aumentando
el ruido de fondo.
Necesidad del uso de
reactivos auxiliares en
el proceso de
deteccin.
Radiactividad.
Baja resolucin.
Los escneres
necesarios para la
deteccin encarecen el
coste del ensayo.
Algunos materiales
como el plstico
producen
fluorescencia.
La seal se atena con
el tiempo.
Tabla 2. Mtodos de marcaje de ADN en microarray para deteccin directa (elaboracin propia).
12
Marcaje Lectura Caractersticas Ventajas Desventajas
MARCAJE DE SONDAS Y MUESTRAS PARA DETECCIN INDIRECTA
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La sonda se une a
biotina (indicador), y
se aade a la
muestra avidina o
estreptavidina
conjugada con
fluorocromos
(marcador).
La sonda se une a
digoxigenina
(indicador) y se
aade a la muestra
un anticuerpo
anti-DIG conjugado
con enzima
(marcador). El
sustrato de la enzima
se transforma en un
producto
luminiscente.
Altamente
sensible.
Disponibilidad
comercial de
cidos
nucleicos
marcados con
biotina.
Altamente
sensible.
Disponibilidad
comercial de
cidos
nucleicos
marcados con
digoxigenina.
Los escneres
necesarios para la
coste del ensayo.
Los escneres
necesarios para la
coste del ensayo.
Tabla 3. Mtodos de marcaje de ADN en microarrays para deteccin indirecta.
Sin duda los mtodos ms utilizados para marcaje
de sondas o dianas en microarrays son los
qumicos o enzimticos, utilizndose comnmente
los fluorforos
2
Cy3 y Cy5 (cianinas). El uso de
fluorforos permite analizar varias muestras en el
mismo array, eliminando la variabilidad que se
produce cuando se comparan los resultados de la
hibridacin de diferentes array, adems de
hacer posible el escaneado de mltiples
marcadores simultneamente, si bien presentan
dos inconvenientes:
Tan solo son capaces de analizar dos patrones
de expresin de genes, y adems el patrn de
incorporacin de los mismos no es uniforme
3
.
El gran tamao de los fluorforos contribuye a
dificultar la incorporacin enzimtica de los
nucletidos que compondrn la sonda.
Algunos de estos inconvenientes se estn
solucionando en la actualidad por medio de varias
estrategias. Una de ellas consiste en la adicin
posterior a la sntesis de nuevos fluorforos a las
secuencias, consiguindose el escaneado de ms de
dos longitudes de onda que permiten obtener mayor
cantidad de datos
4
. Adems otras compaas como
Clontech han diseado protocolos de modificacin
con grupos amino previa incorporacin de las
molculas fluorescentes.
Otros marcadores que se estn utilizando
actualmente son los fluorforos de la serie Alexa
que estn dando buenos resultados en microarrays,
y segn la compaa Molecular Probes
5
,
especializada en el rea de la tecnologa de
fluorescencia, tienen una mayor fotoestabilidad y
proporcionan una seal ms clara que otros
marcadores, incluyendo Cy3 y Cy5.
2
Osborn J. (2000). A review of radioactive and non-radioactive-based techniques used in life science applications. Part I:
Blotting techniques. Innovations Forum Life Science News 6, Amersham Pharmacia Biotech.1-4.
3
Handbook of Fluorescent Probes and Research Products. Molecular Probes [Actualizacin: 11 Dic. 2001]:
http://www.probes.com/handbook/print/0805.html
4
Call D. (2001). DNA microarrays: their mode of action and possible applications in molecular diagnostics. Veterinary
Sciences Tomorrow, Issue 3, August, 1-9.
5
Molecular Probes: http://www.probes.com
La tcnica de deteccin de cidos nucleicos no
radiactiva ms sensible hasta el momento es aquella
que utiliza sondas de ADN marcadas con biotina y
detectadas a travs de conjugados enzimticos de
Avidina. Adems, para amplificar an ms la seal
se puede acoplar una segunda enzima a la molcula
de avidina y estreptavidina
2
. Despus del uso de la
Biotina como marcador indirecto, la Digoxigenina es
el marcador ms utilizado en la actualidad.
Algunos expertos consultados para la realizacin
de este informe mencionan la enorme importancia
que puede tener la desaparicin del marcaje
de las sondas para el desarrollo de nuevas
plataformas de biochips. Segn estos expertos,
nuevos mtodos de deteccin no basados
en el marcaje de las sondas, tales como deteccin
ptica, electroqumica, o espectrometra
de masas MALDI-TOF
6
sern determinantes
a la hora de desarrollar biochips con nuevas
aplicaciones. Estas tcnicas permitiran una mayor
sensibilidad y reduciran las cantidades de
muestra necesarias, y en mayor grado de
importancia, simplificara el proceso de
preparacin de la muestra al omitir pasos previos
de amplificacin (PCR).
13
Cuadro 2. ltimas tendencias en deteccin de la hibridacin de ADN en Biochips (elaboracin propia).
6
Matrix-assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry.
DETECCIN DE LA HIBRIDACIN SIN MARCAJE DE SONDAS:
Deteccin ptica: Resonancia de Plasmones en Superficie (SPR).
Tcnica basada en fenmenos pticos que tienen lugar sobre la superficie de un metal,
permitiendo la deteccin de cambios en la concentracin de masas del chip.
Ejemplo: Biacore (http://www.biacore.com/technology/technology.lasso).
Deteccin ptica: Tecnologas Avanzadas de Resonancia de Espejos.
Miden pequeas variaciones en el ndice de refraccin y grosor de la superficie del sensor.
Ejemplo: IAsys, propiedad de Thermo Labsystems
(http://www.affinity-sensors.com/technol.htm).
Deteccin por Mtodos Electroqumicos.
La deteccin de la hibridacin puede ser directa, por medio de fenmenos de oxidacin del ADN a
travs de electrodos, o indirectamente mediante indicadores redox activos que se unen
fuertemente al ADN de cadena doble (N. Popovich, Mediated electrochemical detection of nucleic
acids for drug discovery and clinical diagnostics. IVD Technology, 2001, 7, 36-42). Por medio de
molculas mediadoras se extraen electrones del ADN que amplifican la seal. Se consigue una
alta sensibilidad y requiere protocolos sencillos e instrumentos de deteccin relativamente
asequibles.
Ejemplo: Xanthon Inc., NanoChip de Nanogen, Codelink de Motorola.
Deteccin por Espectrometra de Masas MALDI-TOF.
Mediante un espectrmetro de masas se predice la secuencia de los fragmentos de ADN
basndose en su masa molecular.
Ejemplo: SpectroCHIP de Sequenom.
Tradicionalmente los sustratos slidos de los
biochips se dividen en porosos y no porosos.
Los chips porosos son chips en los que las
interacciones entre el material a inmovilizar y el
soporte slido de inmovilizacin no tienen por lo
general carcter covalente
7
. Los soportes ms
comnmente empleados son pequeas porciones de
geles, o membranas porosas de nylon o
nitrocelulosa presentes sobre portaobjetos de cristal.
El uso de superficies porosas como soporte para
inmovilizar cidos nucleicos supone una gran
ventaja al ofrecer mayor superficie de unin que los
soportes lisos.
Los chips lisos o no porosos son aquellos en los
que el material se encuentra por lo general
inmovilizado covalentemente a la superficie slida
que le sirve de soporte y que puede ser cristal o
cualquier otra superficie como silicio, plstico u oro.
Aunque las membranas de nylon y nitrocelulosa
siguen utilizndose en la actualidad, han sido
sustituidas en la mayora de los casos por
alternativas que permiten mayor resolucin de los
puntos, adems del uso de la fluorescencia como
mtodo de deteccin y el uso de dos fluorocromos
simultneamente. Sin embargo, algunos biochips
utilizan membranas o sustancias porosas que
recubren la superficie de un cristal, mejorando la
resolucin de los puntos. El uso de
micropartculas (slice o agarosa) en la mayora
de los casos es complementario al de
membranas.
Existe un buen nmero de alternativas a estos
soportes que estn todava en desarrollo, como la
inmovilizacin del ADN sobre geles de acrilamida
(http://www.motorola.com), o sobre matrices de
oro (http://www.interactiva.de). Adems, Nanogen
(http://www.nanogen.com) ha desarrollado un tipo
de soporte totalmente diferente a las plataformas
que utilizan membranas o cristal como soporte.
Estos biochips consisten en un conjunto de
electrodos cubiertos por una fina capa de agarosa.
Los microelectrodos generan un campo elctrico
que controla la deposicin de las sondas y la
hibridacin con las secuencias diana.
14
7
Hoheisel, J.D.; Diehl, F.; Scheideler, M.; Hauser, N.; Aign, V.; Matysiak, S.; Beier, M. (2001). Improving DNA-chip
Technology; Chemical Aspects.
8
Lee, G.; Chen, S.; Huang, G.; Sung, W.; Lin, Y. (2001). Microfabricated plastic chips by not embossing methods and
their applications for DNA separation and detection. Sensors and Actuators B 75. 142-148.
CARACTERSTICAS DE LOS SOPORTES
Superficies Porosas Superficies Lisas
Membrana de Nylon
Membrana de
Nitrocelulosa
Cristal/Cuarzo Micropartculas Plstico
8
Las interacciones entre el material a
inmovilizar y el soporte slido de
inmovilizacin no tienen carcter
covalente.
Suelen inmovilizarse fragmentos de cDNA
o productos de PCR.
El mtodo de marcaje suele ser por
radiactividad o enzimtico.
Amplio rango de
caractersticas
fsico-qumicas.
Los cidos
nucleicos se
adhieren a
partculas que a
su vez quedan
atrapadas en la
estructura de la
membrana.
El material se encuentra
covalentemente inmovilizado
a la superficie slida que le
sirve de soporte.
Pueden inmovilizarse
oligonucletidos o
fragmentos de cDNA.
El mtodo de marcaje suele
ser por fluorescencia.
Alto ruido de fondo
Menor ruido
de fondo
Tabla 4. Tipos de soportes utilizados en microarrays y biochips de ADN (elaboracin propia).
2.3. Material de Soporte
Segn los expertos consultados, a continuacin se enumeran las ventajas y los inconvenientes de los
distintos soportes:
15
SOPORTES PARA MICROARRAYS Y BIOCHIPS
Tipo de soporte Ventajas Desventajas
Tabla 5. Ventajas y desventajas de soportes utilizados en microarrays y biochips de ADN (elaboracin propia).
Membranas de Nylon y de
Nitrocelulosa
Mayor capacidad de soporte
de ADN debido a su
superficie porosa.
Reutilizables.
Bajo coste.
Mayor ruido de fondo
fluorescente.
Capacidad de miniaturizacin
limitada.
Deformacin de la membrana.
Baja resolucin.
Superficies porosas de
micropartculas
Mayor flexibilidad
Superficies lisas
de cristal
Mnimo volumen de
hibridacin.
Mayor capacidad de
miniaturizacin.
Soporte inerte.
Permite el uso de dos
fluorocromos a la vez.
Alta resolucin.
Capacidad para aguantar
altas temperaturas y
lavados de elevada fuerza
inica.
En el caso del cuarzo,
hidroxilado de forma
natural.
Restriccin de la capacidad de
carga.
Limitacin del nmero de
experimentos por surtido.
Superficies lisas de plstico
Mnimo volumen de
hibridacin.
Gran capacidad de soporte
de ADN.
Mayor capacidad de
miniaturizacin.
Soporte inerte.
Ruidos de fondo por
fluorescencia.
Generalmente, para conseguir la inmovilizacin
especfica de las sondas se requiere adems una
modificacin previa del oligonucletido o cDNA
por medio de la activacin mediante grupos
amino, tiol o biotina (en este caso es necesario
cubrir la superficie del soporte con
estreptavidina). No obstante, algunos expertos
consultados sealan la existencia de problemas de
prdida de activacin durante los procesos de
lavado, y la necesidad de desarrollar mtodos
ms estables.
La forma ideal de inmovilizacin de cidos
nucleicos a la superficie del soporte sera aquella
que controlase la distancia a la cual se une cada
cido nucleico, de modo que cada una de las
sondas tenga total libertad para interaccionar de
manera especfica e independiente con la
muestra. Para ello se debe incorporar a la sonda
una molcula espaciadora que la ancle al soporte
y que a su vez permita su interaccin con la
muestra.
Tanto la activacin de la sonda como el soporte
requieren tiempo y esfuerzo, lo que supone un
problema a la hora producir a gran escala. En estos
casos, existe la posibilidad de adquirir
comercialmente soportes ya activados (Ej. Corning
Inc., Motorola), si bien esta opcin puede resultar
costosa en laboratorios de investigacin.
16
9
Medical Device Link. IVD Technology [Actualizacin: Oct. 2001]: http://www.devicelink.com/ivdt/archive/01/09/002.html
Pasiva Activa
Activacin de la superficie Electrnica.
Grupos aldehdo.
Grupos amino.
Estreptavidina.
Activacin de la sonda
Grupos amino.
Grupos tiol.
Biotina.
Tabla 6. Inmovilizacin de ADN (elaboracin propia).
2.4. Inmovilizacin de ADN
En los ltimos aos se han desarrollado mltiples tcnicas de inmovilizacin de sondas sobre la superficie
de los microarrays. Estos procedimientos dependern de la aplicacin final del microarray y del tipo de
soporte utilizado
9
.
Las tcnicas de inmovilizacin no covalentes (adsorcin fsica, irradiacin ultravioleta) no son
recomendadas en el uso de microarrays ya que se dan fenmenos de hibridacin no especfica. No
obstante, la inmovilizacin electrnica de sondas es una tcnica no covalente que actualmente est
disponible comercialmente (Nanogen). Los mtodos utilizados en la inmovilizacin de sondas sobre la
superficie slida de microarrays, se basan en la unin covalente de las mismas al sustrato por medio de
procedimientos qumicos.
La preparacin de los soportes de cristal o silicio generalmente implica un tratamiento previo con grupos
reactivos amino o aldehdo, de manera que formen una capa uniforme de grupos reactivos qumicamente
estables, hidroflicos, para evitar uniones no especficas de las sondas con el soporte.
17
10
Schena, M. (2000). Microarray Biochip Technology. Chapter 2. Microfluidic Technologies and Instrumentation for Printing
DNA Microarrays. Telechem International. Eaton Publishing.
Existen dos tcnicas
10
para inmovilizar los fragmentos de ADN en el soporte del array, sintetizar los
oligonucletidos en el propio soporte, mediante ciclos sucesivos o depositar mediante un brazo robotizado
el fragmento presintetizado que corresponda.
2.5. Fabricacin
Bases de datos
pblicas
Anlisis de la
variacin
gnica
Anlisis de la
expresin
gnica
Sntesis de
Oligos
mediante
fotolitografa
Bases de datos
propias
Compra de
productos de
PCR
Sntesis de
productos de
PCR
Hibridacin de la
muestra con ADN
diana marcado
Lavado, deteccin
de la seal,
interpretacin de
datos
Construccin de libreras de cDNA
Deposicin de
fragmentos de ADN
en el soporte mediante tcnicas
de espoteado
FABRICACIN DE MICROARRAYS Y BIOCHIPS
Fig. 2. Proceso de fabricacin y utilizacin de un microarray o biochip de ADN (elaboracin propia).
Los parmetros que definen las caractersticas de cada tecnologa de fabricacin de biochips vienen
determinados por la densidad y diseo del chip, composicin bioqumica, versatilidad, reproducibilidad,
eficacia, calidad, coste y facilidad de automatizacin.
Identificacin
de secuencias
de ADN de
inters
Chip comercial
(Affymetrix)
18
Mtodos para la fabricacin de Microarrays y Biochips
Principios tcnicos Empresas
Impresin sin contacto (Ink-Jet)
Impresin por contacto
Sntesis in situ
Otras tcnicas
Inyectores
piezoelctricos
Cristales piezoelctricos (cermicas) se
localizan en las cercanas del capilar de
vidrio que contiene la muestra. Se genera
un pulso elctrico mediante la aplicacin
de voltaje, lo que causa la deformacin
del cristal, presiona el capilar y expulsa
una pequea cantidad de fluido por la
extremidad del capilar.
Esta tecnologa combina una bomba y
jeringa con una vlvula microsolenoide
que suministra cantidades de muestra del
orden de los nanolitros.
Las agujas o pins se empapan en la solucin
que contiene la muestra, con lo que una
pequea cantidad de sta se transfiere al
extremo de la aguja. Cuando este extremo
toca la superficie del chip, una gota de la
muestra queda impresa en ella.
Incyte Pharma
Combion
Agilent
Roseta
ProtoGene
PerkinElmer
Cartesian Technologies
Affymetrix
Arrayit.com
GeneMachines
Genetix
Jeringa-Solenoide
(Syringe-solenoid)
Pin printing o
Microspotting
Fotolitografa
Qumica directa
En el soporte slido se une covalentemente
una molcula que tiene en un extremo un
agente protector fotodegradable. La luz se
dirige a travs de una mscara, degradando
el agente qumico protector, y permitiendo
la unin de los nucletidos, cada uno con un
nuevo agente protector, con el enlace
covalente del soporte. El proceso se repite
con distintos nucletidos y distintas
mscaras, hasta conseguir el oligo con la
secuencia adecuada.
Cada punto de ensayo contiene un
segmento de ADN inmovilizado en un
soporte poroso. Por medio de unos
electrodos se activa una reaccin
electroqumica por la cual se incorporan
sucesivos nucletidos nuevos.
Affymetrix
Combimatrix
Microarrays 3D
Micro impresin hmeda
XNA on Gold
Utilizan soportes tridimensionales.
Permite la sntesis in situ y est basada
en tcnicas fotolitogrficas.
Basada en tcnicas fotolitogrficas.
La superficie de cristal est cubierta por una
capa de oro recubierta de un grupo tiol al
que se le une una segunda capa de
molculas de biotina y estreptavidina. La
mscara utilizada para su diseo consiste en
una capa hidrofbica de tefln.
Pamgene
Amersham plc
CLONDIAG
Technologies
Interactiva
Tabla 7. Mtodos para la fabricacin de microarrays y biochips (elaboracin propia).
19
Mtodos para la fabricacin de Microarrays y Biochips
Ventajas Desventajas
Impresin sin contacto (Ink-Jet)
Impresin por contacto
Sntesis in situ
Otras tcnicas
Inyectores
piezoelctricos
Jeringa-Solenoide
(Syringe-solenoid)
Rapidez, sencillez, coste moderado, altas
velocidades de deposicin (varios miles de
muestras por segundo), buena capacidad
de miniaturizacin de los puntos (20-80 m)
y densidad de integracin
(10.000 puntos/cm
2
). Se pueden
inmovilizar oligos y cDNAs.
Mtodo sencillo y fiable, bajo coste. Se
pueden inmovilizar oligos y cDNAs.
Burbujas de aire que
reducen la fiabilidad del
sistema, necesidad de
utilizar volmenes de
muestra relativamente
grandes.
Volumen de muestra
necesario demasiado
grande, tan solo es
capaz de dispensar un
volumen mnimo del
orden de 4-8 nL,
con que la capacidad
de miniaturizacin
(250-500 m) y
densidad de integracin
(200-400 puntos/cm
2
)
est limitada.
Pin printing o
Microspotting
La impresin mediante pins se puede
realizar sobre placas multipocillo o bien
sobre portaobjetos. Alta densidad de
integracin (10.000 puntos/cm
2
) y
moderada capacidad de miniaturizacin
(100 m). Se pueden inmovilizar oligos y
cDNAs. Relativo bajo coste y flexibilidad.
Alta densidad de integracin (244.000
puntos/cm
2
) y capacidad de miniaturizacin
(<10 m), solo se pueden sintetizar oligos
con una longitud de ~
25 nucletidos.
Flexibilidad, moderada capacidad de
miniaturizacin.
Se pueden inmovilizar y sintetizar sondas
Fotolitografa
Qumica directa
Las muestras deben ser
sintetizadas,
purificadas y
almacenadas por
separado.
Costoso de elaborar,
requiere muchas
mscaras que resultan
costosas.
Todava en desarrollo,
baja densidad de
integracin (1.000
puntos/cm
2
) aunque la
densidad terica es 100
veces mayor.
Microarrays 3D
Micro impresin hmeda
XNA on Gold
La capacidad de unin de estos soportes
porosos es superior a la de los soportes
bidimensionales debido a su mayor rea
interna.
Vlida para la sntesis in situ de las
matrices e inmovilizacin de
oligonucletidos previamente sintetizados.
Alta densidad de integracin, flexibilidad,
compatible con la mayora de los sistemas
de deteccin.
(No hay informacin
disponible).
Problemas con el empleo
de la fluorescencia
debido a la alta
reflectividad del oro.
Tabla 7. Mtodos para la fabricacin de microarrays y biochips (elaboracin propia).
20
PRINCIPALES ARRAYERS DISPONIBLES EN EL MERCADO
Empresa Producto Enlace web
Affymetrix Affymetrix 417 Arrayer http://www.affymetrix.com
Biomerieux http://www.biomerieux.com
Biorobotics MicroGrid II, Pro, TAS http://www.biorobotics.com
Cartesian technologies
PixSys, ProSys, PegaSys
PA systems PixSys and
Prosys NQ systems
http://www.cartesiantech.com
Clontech http://www.clontech.com
DNAmicroarray http://www.dnamicroarray.com
Genetix http://www.genetix.co.uk
GeneMachines OmniGrid microarrayer http://www.genemachines.com
GenomeSystems http://www.genomesystems.com
Genometrix http://www.genometrix.com
GenomicSolution http://www.genomicsolutions.com
Genpak
genpakARRAY 21
micro-arrayer system
http://www.genpakdna.com
G Sim http://www.gesim.de
Hitachi Genetic
Systems
SPBIO Microarray
Spotting Station
http://www.hitachi-soft.com/gs
Labman Automation
Ltd
http://www.labman.co.uk
Molecular Dynamics GEN III Array Spotter http://www.mdyn.com
Packard BioChip Arrayer http://www.packardinst.com
TeleChem International ChipMaker 2 and 3 http://arrayit.com
Medway ADVANCE-2000-I http://www.medway.ch
Eurogentec EuroGridder SDDC
http://www.eurogentec.be/catalog/
dna_array/index.html
RoboDesign RoboArrayer http://www.robodesign.com
Tabla 8. Relacin de las Empresas ms relevantes dedicadas a la comercializacin de Arrayers (elaboracin propia).
Entre los componentes principales de un arrayer estn los robots controlados por ordenadores, estaciones
de lavado y de secado. Los robots estn diseados para recolectar automticamente las muestras
localizadas en placas multipocillo mediante distintas agujas simultneamente.
21
Mientras que la industria est continuamente
buscando la alternativa que le proporcione
mayores beneficios, el mundo acadmico
necesita soluciones ms baratas ya que sus
necesidades de beneficio son menores. En un
intento por atender ambas demandas, empresas
como Perkin-Elmer y Axon estn trabajando en
la elaboracin de escneres de alta tecnologa y
a su vez desarrollando modelos de gama baja
que sean adecuados para su uso en pequeas
compaas o centros de investigacin.
Por tanto, la diversidad en cuanto a las
demandas est causando gran divergencia en los
productos desarrollados por los fabricantes de
escneres.
2.6. Escaneado y Software
Tabla 9. Relacin de alguna de las Empresas ms relevantes dedicadas a la comercializacin de Escneres con aplicacin
en Microarrays (elaboracin propia).
PRINCIPALES ESCNERES DISPONIBLES EN EL MERCADO
Empresa Producto Enlace web
Affymetrix Inc. Affymetrix 428 scanner http://www.affymetrix.com
Alpha Innotech AlphaArray Reader http://www.alphainnotech.com
Amersham/Pharmacia
http://www.apbiotech.com/application/
microarray
Applied Precisin
ArrayWoRx microarray
scanner
ArrayWoRx microarray
reader
http://www.api.com/dvarrayworx.html
Axon Instruments
GenePix 4000B
microarray scanner
http://www.axon.com/GN_Genomics.html
Biomedical
Photometrics Inc.
MACROscope, confocal
microscope
http://www.confocal.com
Curagen
GeneScape software
suite
http://www.curagen.com
Fuji Medical BAS phosphorimagers http://www.fujimed.com
GeneFocus DNAscope scanner http://www.genefocus.com
General Scanning ScanArray 4000 http://www.gsilumonics.com
Genomic Solutions
GeneTAC Biochip
Analyzers
http://www.genomicsolutions.com
Molecular Dynamics Avalanche Microscanner http://www.mdyn.com
MWG Biotech GMS 418 array scanner http://www.mwgdna.com
PerkinElmer Life
Sciences
ScanArray Lite, 4000,
4000XL, 5000, 5000XL
http://lifesciences.perkinelmer.com/
index.asp
Virktek Vision Int. Inc.
ChipReader
ChipReader Extreme
http://www.virtek.ca
22
EMPRESAS QUE DESARROLLAN SOFTWARE PARA GENMICA
Empresa
Institucin
Aplicacin Producto Enlace web
BioDiscovery
Bases de datos; arrays
de ADN
GeneDirector http://www.biodiscovery.com
Affymetrix
Affymetrix LIMS,
MicroDB
http://www.affymetrix.com
BioDiscory
Media Cybernetics
Scanalytics, Inc.
Imaging Research, Inc.
Imaging Research, Inc.
BioDiscovery, Inc.
Rosetta Biosoftware
Silicon Genetics
Applied Maths
GeneData AG
LION Bioscience AG
OmniViz, Inc.
Affymetrix
Gene Network
Sciences
Informax, Inc.
Acadmica
Farmacuticas
Otros
Partek, Inc.
Invitrogen ResGen
The Whitehead
Institute for Genome
Research
Stanford Univ.
TIGR
Berkeley University
Bioconductor
Universidad de Mlaga
Eisen Lab
software
Software tools
Dr. Terry Speed's
Microarray Data
Analysis Group
Bioconductor
project
engene
http://rana.lbl.gov/EisenSoftware.htm
http://www.tigr.org/softlab
http://www.stat.berkeley.edu/users/terry/
zarray/Html/index.html
http://www.bioconductor.org
http://www.engene.cnb.uam.es
Pre-procesamiento de
arrays de ADN
Anlisis de
datos
ImaGen
Array-Pro
MicroArray Suite
ArrayVision
TM
system
ArrayStat
GeneSight
Rosseta Resolver
GeneSpring
TM
GenMaths
GeneData
Expressionist
arraySCOUT-
Omniviz Functional
Genomics
Data Mining Tool
(DMT)
BioMine
Xpression NTI
Partek Pro
Pathway 4
Software
GeneCluster
Calidad
alta
Calidad
media
Anlisis de imagen de
arrays de ADN
http://www.mediacy.com/arraypro.htm
http://www.scanalytics.com/product/hts/
microarray.html
http://www.imagingresearch.com/products/
ARV.asp
http://www.imagingresearch.com
http://www.biodiscovery.com/genesight.asp
http://www.rosettabio.com/products/
resolver/default.htm
http://www.sigenetics.com/GeneSpring/
index.html
http://www.applied-maths.com/ge/ge.htm
http://www.genedata.com/products/
expressionist
http://www.lionbioscience.com/solutions/
arrayscout
http://www.omniviz.com/products/
index.htm
http://www.affymetrix.com
http://www.gnsbiotech.com/biomine.shtml
http://www.informaxinc.com/solutions/
xpression/index.html
http://www.partek.com
http://pathways.resgen.com/tour/
http://www.genome.wi.mit.edu/cancer/
software/genecluster2/gc2.html
Tabla 10. Relacin de alguna de las Empresas ms relevantes dedicadas a la comercializacin de Software con aplicacin
en microarrays (Fuente: Dr. Jos Mara Carazo).
El anlisis de los datos y la interpretacin de los mismos mediante herramientas software, es sin duda uno de los
principales escollos en la utilizacin de la tecnologa de microarrays y biochips. Los avances en la capacidad de
gestin y almacenamiento de las bases de datos son esenciales para mejorar la calidad de la informacin obtenida
mediante tcnicas de Minera de Datos o Data Mining, que permiten la elaboracin de modelos de anlisis como
por ejemplo aquellos que agrupan genes o experimentos en funcin de diferentes patrones (clustering).
23
2.7. Breves cuestiones tcnicas
Adems de los gastos derivados de la adquisicin directa del arrayer, hay que considerar otros costes no
tan obvios pero igualmente importantes. Imprimir un array de alta densidad requiere un gran nmero de
sondas, lo que resulta muy caro para un laboratorio de investigacin. En algunos casos se recomienda
realizar previamente la secuenciacin de las sondas para la verificacin de sus secuencias, lo que
encarece an ms su obtencin. Algunas empresas como Clontech, Incyte y Operon proporcionan oligos
ya verificados u oligos de diseo. Otro factor a tener en cuenta es el uso necesario de la PCR en los
laboratorios que posean microarrays de ADN. Esta tcnica es esencial para controles de calidad y
verificaciones de las secuencias, y aunque en la actualidad la mayora de los centros poseen la
instrumentacin, hay que considerar los gastos derivados de su uso recurrente.
EMPRESAS QUE COMERCIALIZAN SONDAS PARA MICROARRAYS
Empresa Nombre del producto Enlace web
Operon technologies Array-Ready Oligo sets http://www.operon.com/arrays/arraysets.php
Lion Bioscience arrayTAG
http://www.lionbioscience.com/eng/
index_c_1_7.htm
Clontech
Atlas Ready-to-print Long
Oligo
http://www.clontech.com/products/literature/
pdf/brochures/AtlasReadytoPrint.pdf
Incyte Genomics Easy to spot products http://www.incyte.com/index.shtml
Research Genetics
GeneStorm expression-
ready full-length clones
http://www.resgen.com/full_length/index.php3
Stratagene
GeneConnection Discovery
clone collection QuikSpot
PCR products
http://www2.stratagene.com/gc/
discoveryclones.asp
I.M.A.G.E.
Consortium cDNA
libraray
Biological resources from
UK Human Genome
Mapping Project Resource
Centre
http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Biology/
descriptions/image.html
Tabla 11. Relacin de alguna de las Empresas ms relevantes dedicadas a la comercializacin de sondas con aplicacin en
microarrays (elaboracin propia).
Adems de los costes asociados a las
infraestructuras y materiales, el diseo y manejo
de microarrays es laborioso y consume gran
cantidad de tiempo y recursos, por lo que es
necesaria la incorporacin de personal dedicado a
tiempo completo. Segn expertos consultados el
nmero de personas destinadas al mantenimiento
de la plataforma de microarrays es de una media
de 4, mientras que el tiempo medio necesario
para la puesta en marcha de las infraestructuras
de microarrays es de 6 a 12 meses, pudiendo en
ocasiones necesitar de 1 a 2 aos. Este periodo
se correspondera al tiempo que se requiere para
la adquisicin de datos experimentales
satisfactorios a partir de la adquisicin del
instrumental.
24
Genechip de Affymetrix (http://www.affymetrix.com): biochips de ADN fabricados mediante
tcnicas fotolitogrficas. Pese a ser una denominacin comercial en ocasiones es empleada para
referirse a los biochips de ADN en general.
GEM arrays de Incyte (http://www.incyte.com): biochips para el anlisis de la expresin gnica.
Spectrochip de Sequenom, (http://www.sequenom.com): son chips de silicio de 2 x 3 cm
aproximadamente, con un surtido de puntos para al anlisis de ADN mediante espectrometra de
masas (MALDI-TOF). Se utilizan para el genotipado y secuenciacin.
Nanochip de Nanogen (http://www.nanogen.com). Combinan la tecnologa de microarrays con los
lab-ona chip, de los cuales hablaremos ms adelante. Esta tcnica utiliza la microelectrnica para
mover y concentrar molculas cargadas hacia los sitios diseados en el microchip, por lo que
tambin se denominan matrices electrnicamente activas.
Cuadro 3. Terminologa de empresas que fabrican chips.
2.8. ltimas tendencias en nuevos desarrollos tecnolgicos
Las tendencias hacia nuevos desarrollos tecnolgicos se pueden clasificar en tres grupos segn el
objetivo que persigan:
Tendencia 1 FIABILIDAD
Tecnologa Bioelectrochips
Descripcin
Mtodo electrnico que mantiene las hebras de DNA unidas debido a la
carga negativa de stas, y lo obliga a hibridar bajo condiciones controladas,
moviendo y concentrando las muestras solo en los puntos deseados.
Ventajas
Permite al cliente disear el chip. Puede reutilizarse e incluso cambiar las
secuencias de las muestras. Rapidez (resultados en varios minutos) y
precisin (mayor que en los GeneChips de Affymetrix segn expertos
consultados).
Desventajas
Tan solo est catalogado por el momento para su uso en investigacin de
determinadas enfermedades.
Ejemplo
Nanogen (http://www.nanogen.com) comercializa Active Microelectronic
Devices o Matrices Electrnicamente Activas.
25
Tendencia 2 SENSIBILIDAD
Tecnologa PNAs (peptide nucleic acid)
Descripcin
Unidades repetidas de N- (2-aminoetil)-glicina unidas por enlaces amino, y
bases nucleotdicas unidas a la estructura.
Ventajas
Ms estables frente a proteasas y nucleasas, y producen
una mayor seal.
Desventajas
Se ha observado una prdida de especificidad en la hibridacin (segn
expertos consultados).
Ejemplo Radius BioSciences (Microarrays de ADN y PNA).
Tendencia 3 INTEGRACIN
Tecnologa Dispositivos microfludicos o LOAC* (Lab-on-a-chip)
Descripcin
Dispositivos que emplean campos elctricos para mover molculas, clulas,
partculas o lquidos a travs de microcapilares construidos sobre chips de
cristal, plstico, silicio o cuarzo. Este tipo de chip contiene un conjunto de
microcanales y microcmaras donde tienen lugar las reacciones que
permiten el anlisis de la muestra. El mtodo predominante para la
separacin de los productos de reaccin es la electroforesis, ya que la
cromatografa es muy complicada de miniaturizar.
Ventajas
El volumen de fluidos y de muestra que se necesita es mnimo,
consiguiendo as que el ensayo se realice en menos tiempo, y que el precio
del dispositivo se reduzca debido al ahorro en reactivos. Eliminacin de la
etapa de inmovilizacin de sondas. Mtodo de deteccin porttil, de usar y
tirar, que adems permita realizar tanto la preparacin de la muestra, como
el anlisis y la deteccin de los reactivos dentro de un mismo dispositivo de
fcil manejo.
Desventajas
El coste final del ensayo se encarece debido principalmente a la
miniaturizacin, no obstante, la tecnologa de microsistemas est avanzando
de tal modo que en un futuro cercano se conseguirn sistemas ms
eficientes.
Ejemplo
Agilent (http://www.agilent.com), en colaboracin con Caliper
(http://www.caliper.com), ha desarrollado el LabChip
11
, un dispositivo que
combina materiales de cristal, cuarzo y plstico, y que contiene mltiples
capilares que permiten el acceso a las muestras. Las aplicaciones de estos
chips se centran principalmente en ensayos enzimticos y celulares, as
como en ensayos de ARN y ADN. Agilent ofrece adems un servicio de
asesoramiento y de diseo del chip, principalmente orientado a la eleccin
de las sondas ms adecuadas para la deteccin de la diana en la que
estemos interesados.
Tabla 12. Tendencias para futuros desarrollos tecnolgicos (elaboracin propia).
11
Krishnan, M.; Namasivayam, V.; Lin, R.; Pal, R.; Burns, M.A. (2001). Microfabricated reaction & separation systems.
Curr. Op. Biotech., 12, 92-98.
Tras la secuenciacin del genoma humano, la demanda de instrumentos tecnolgicos que facilitarn la
bsqueda de genes y sus patrones de expresin ha sido espectacular. Las aplicaciones de los
microarrays en el sector de la salud humana se pueden resumir en la siguiente tabla:
26
3. Aplicaciones de los microarrays
y biochips en Salud Humana
APLICACIONES DE MICROARRAYS Y BIOCHIPS
Objetivo Tcnica Aplicacin
Caracterizacin
del ADN
Cuantificacin
del ADN
Comparacin
del ADN
Secuenciacin por Hibridacin
(Sequencing by Hybridization
o SBH).
Identificacin por hibridacin.
Anlisis de la expresin gnica.
Descubrimiento de nuevos
frmacos.
Identificacin de polimorfismos.
Diagnstico molecular.
Farmacogenmica.
Comparacin de secuencias
homlogas.
Genmica (funcionalidad de
genes).
Deteccin de mutaciones y
variaciones en el genoma.
Caracterizacin del perfil gentico
de enfermedades.
Farmacogenmica.
Validacin de dianas
teraputicas.
Caracterizacin de la accin
molecular de compuestos activos.
Tabla 13. Aplicaciones de microarrays y biochips (elaboracin propia).
27
DIFERENCIAS ENTRE MICROARRAYS Y BIOCHIPS
Chip de ADN Microarray de ADN
Tipo de impresin
Material gentico
inmovilizado
Densidad de
integracin
Coste
Ventaja
Desventaja
Impresin por deposicin.
Fragmentos de cDNA.
10.000-15.000 / microarray
(aunque pueden alcanzarse
densidades mucho mayores).
Bajo.
Se pueden caracterizar genes
nuevos al inmovilizar
secuencias annimas.
Necesita un paso previo
de PCR.
Impresin por sntesis.
Oligonucletidos.
200.000-300.000 / chip.
Alto.
Puede no necesitar PCR previa.
Sistema ms utilizado para el anlisis
del transcriptoma.
Genes de inters y regiones no
codificantes deben ser identificadas
previamente.
Tabla 14. Diferencias entre microarrays y biochips (elaboracin propia).
Desde un inicio los microarrays y biochips se
utilizaron para analizar patrones de expresin de
genes con el fin de vislumbrar las bases moleculares
de los procesos de la vida (ej. el ciclo celular). Si
bien con posterioridad se han ido incrementando sus
aplicaciones haca la comprensin del desarrollo de
tejidos y rganos e incluso la caracterizacin de
enfermedades de base molecular como el cncer.
El anlisis de la expresin gnica es til en el
diagnstico y tratamiento de enfermedades ligadas a
patrones de expresin gentica particulares. Los
arrays de ADN son especialmente tiles para la
clasificacin de tumores y la identificacin de
parmetros (marcadores) que permitan estimar el
pronstico de la enfermedad. Se puede estudiar la
funcin de los genes al facilitar la identificacin de
aquellos genes activados, inhibidos o mutados
(polimorfismos) de forma diferencial cuando se
comparan tejido sano y enfermo.
Sin embargo, los datos procedentes del anlisis de
la expresin gnica tienen sus desventajas, ya que
los niveles de mRNA pueden no reflejar los niveles
de protena, y la expresin de una protena no
siempre tiene una consecuencia fisiolgica. As pues,
sera necesario utilizar una tcnica de anlisis con
indicadores ms sofisticados como la localizacin de
las protenas y sus tasas de recambio, cambios
estructurales y modificaciones de protenas.
Existen otras tecnologas que no estn basadas en
arrays de ADN, como por ejemplo TOGA
12
(Total
Gene Expresion Analysis), SAGE
13
(Serial Analysis
of Gene Expresion), READS (Restriction Analysis
of Differentially Expressed Sequences), y RT-PCR
(Real Time PCR), que permiten el anlisis de la
expresin gnica a media o baja densidad, es
decir, el nmero de genes que se pueden analizar
en un solo experimento es de menor magnitud
que en el caso de tcnicas que permiten
resultados a gran escala, como los microarrays de
ADN. El caso de TOGA es diferente, ya que pese a
no estar basado en tecnologas de arrays, s
permite un anlisis de la presencia y
concentracin de mRNA por medio de un sistema
automatizado y de alta resolucin por el cual se
cuantifica el cDNA total.
3.1. Aplicacin 1:
Monitorizacin
de la Expresin Gnica
12
Digital Gene Technologies Inc.: http://www.dgt.com
13
Genzyme Molecular Oncology: http://www.genzymemolecularoncology.com
La aproximacin tradicional al proceso de descubrimiento de nuevos frmacos, su posterior desarrollo y
anlisis toxicolgico, est evolucionando en los ltimos aos debido al mayor conocimiento del genoma
humano y a la utilizacin de tcnicas de cribado a gran escala como son los microarrays de ADN.
28
Anlisis de la expresin gnica en clulas y tejidos normales
El patrn de expresin de un gen proporciona informacin indirecta acerca de su funcin. Si llegamos
a caracterizar las secuencias homlogas de una familia gnica, as como los procesos que
desencadenan la expresin selectiva de sus genes, podremos disear frmacos que activen dicha
expresin de manera especfica, minimizando los efectos secundarios.
Anlisis comparativo de la expresin gnica en condiciones patolgicas
La regulacin negativa o positiva de la expresin de un gen puede ser la causa de la patologa o bien
el resultado de la misma. Aunque el principal objetivo sea actuar sobre el gen cuya expresin causa
la patologa, tambin se busca modificar la actividad de alguno de los genes que se expresan como
consecuencia de la enfermedad con el fin de aliviar sus sntomas. Por lo tanto, la posibilidad de
comparar la expresin de miles de genes en tejidos o clulas enfermas y normales, permitir la
identificacin de mltiples dianas teraputicas potenciales.
Anlisis de la expresin gnica en sistemas modelo
El uso de animales como modelos de enfermedades proporciona gran cantidad de informacin y la
posibilidad de comparar sus patrones genticos de expresin. Estos experimentos se suelen realizar con
ratones transgnicos que o bien sobre expresan genes especficos, o bien carecen de alguno de estos
genes (mutaciones puntuales, knockouts, etc). Otros modelos ms sencillos que tambin se utilizan son
las levaduras (Saccharomyces cerevisiae), o gusanos (Caenorhabditis elegans) y peces (Zebrafish).
Anlisis de la expresin gnica en patgenos
Una de las ventajas que presenta el trabajo con genomas procedentes de microorganismos es su
pequeo tamao, lo que ha permitido la secuenciacin de un gran nmero de ellos en poco tiempo.
Entre sus genes se hallan los que codifican factores de virulencia que se encuentran regulados por
agentes ambientales tales como la temperatura. Los microarrays pueden ser aplicados igualmente en
el estudio de la expresin de los genes virales durante el curso de la infeccin y periodo de latencia,
as como en el estudio de la respuesta del organismo hospedador frente al patgeno.
Cuadro 4. Aplicaciones derivadas del anlisis de la expresin gnica (elaboracin propia).
Cuadro 5. Etapas en el descubrimiento de nuevos frmacos (elaboracin propia).
Mtodo
tradicional
Diana
biolgica
Clonacin Frmaco
Genmica
Secuencia
gnica
Diana
teraputica
Frmaco
candidato
Genmica
reversa
Diana
teraputica
Gen
Frmaco
candidato
3.2. Aplicacin 2: Cribado de compuestos activos y validacin
de dianas teraputicas
29
Las aplicaciones de microarrays y biochips en el
mbito de la generacin de frmacos son
especialmente numerosas: contribuyen a la
identificacin de dianas teraputicas ms
efectivas; permiten conocer mejor el mecanismo
de accin de medicamentos, mejorando su
eficacia y eficiencia; e incluso pueden determinar
los efectos secundarios de un frmaco en
desarrollo, evitando la entrada en ensayos clnicos
en caso de detectar toxicidad.
Los arrays de ADN son una herramienta
potencial para la investigacin de los mecanismos
por los cuales actan distintos frmacos,
su implicacin en rutas metablicas, y posibles
efectos secundarios.
La monitorizacin de la expresin de genes con
potencial txico puede ser de especial inters
para las industrias farmaceticas. La identificacin
de los productos expresados por estos genes
pueden ser usados para el seguimiento de un
tratamiento farmacolgico y el efecto de distintas
dosis del mismo, haciendo ms fcil el desarrollo
de nuevos compuestos. El uso de arrays de ADN
en este caso presenta grandes ventajas cuando el
frmaco es difcil de rastrear por mtodos
convencionales, o bien los efectos esperados
requieren largos periodos de tiempo.
PAPEL DE LOS MICROARRAYS DE ADN:
DESCUBRIMIENTO DE NUEVOS FRMACOS
En este campo se persigue en primer lugar, la identificacin de genes y mecanismos
moleculares nuevos
14
que permitan el desarrollo de un abordaje teraputico totalmente diferente a
los ya existentes, o bien la mejora de los mismos.
La identificacin de nuevas dianas teraputicas mediante microarrays de ADN ha seguido dos
estrategias durante los ltimos 4 aos, la mayora relacionadas con el cncer.
Estrategia 1: Identificacin de compuestos con patrones de expresin de la actividad celular nicos,
con el objetivo de que estos indiquen la presencia de un nuevo compuesto con alguna de las
actividades conocidas.
De esta forma, el Instituto Nacional de Cncer de Estados Unidos ha analizado la actividad
inhibitoria del crecimiento celular de aproximadamente 70.000 compuestos frente a un panel de 60
clulas tumorales humanas
15
.
La estrategia a seguir en este tipo de estudios comprende la creacin de bases de datos de anlisis
de expresin gnica con el objetivo de realizar clusters que renan los genes segn su implicacin
en determinados procesos relacionados con el proceso cancergeno. As, se elaboran microarrays con
marcadores genticos especficos de proliferacin celular, progresin del ciclo celular, regulacin de la
sntesis proteica, metabolismo de frmacos, etc. La batera de compuestos disponibles se analiza
mediante este microarray, lo que dar lugar a un conjunto de datos relacionados con los cambios en
la expresin gnica inducidos por cada compuesto.
Nuevo Gen Nueva diana Nuevos frmacos
14
Debouck, C.; Goodfellow, P.N. (1999). DNA microarrays in drug discovery and development. Nature Genetics
Supplement. Vol 21, Jan. 48-50.
15
Scherf, U.; Ross, D.T.; Waltham, M.; Smith, L.H.; Lee, J.K.; Tanabe, L.; Kohn, K.W.; Reinhold, W.C.; Myers, T.G.;
Andrews, D.T.; Scudiero, D.A.; Eisen, M.B.; Sausville, E.A.; Pommier, Y.; Botstein, D.; Brown, P.O.;
Weinstein, J.N. (2000). A gene expression database for the molecular pharmacology of cancer. Nat Genet; 24:23644.
30
Estrategia 2: Utilizacin del genoma de levaduras como modelo para el screening de dianas
teraputicas.
El genoma completo de S. Cerevisiae se conoce extensamente, y ha sido sujeto a numerosos anlisis
de mutaciones. La identificacin de nuevos compuestos activos es posible mediante la comparacin
de la expresin gnica en mutantes con alteraciones conocidas expuestos a bateras de
compuestos
16
.
En segundo lugar la implementacin de nuevas tecnologas que aumenten la eficiencia del
proceso de descubrimiento y desarrollo de nuevos frmacos. El uso de los microarrays de ADN
podra reducir el tiempo empleado en realizar estas etapas, y disminuir el nmero de compuestos que se
descartan tras haber consumido tiempo y medios econmicos en ensayos clnicos.
De esta forma, los microarrays de ADN se utilizan en el anlisis de la expresin gnica para la
validacin de dianas, el estudio del perfil de activacin e inactivacin de dianas durante el proceso de
optimizacin de agentes teraputicos, mejor conocimiento de los mecanismos moleculares y
relaciones entre la actividad y la estructura, as como la prediccin de efectos secundarios, y
descubrimiento de marcadores de diagnosis, prognosis, y otros marcadores moleculares
17
.
Adicionalmente, el anlisis de la expresin gnica por medio de microarrays de ADN permite la
observacin del modo de accin del frmaco, y la identificacin de los factores responsables de la
sensibilidad, toxicidad, y resistencia de los frmacos
18
.
Cuadro 6. Objetivos de la utilizacin de microarrays de ADN en el proceso de descubrimiento y desarrollo de nuevos
frmacos (elaboracin propia).
16
Gray, N.S.; Wodicka, L.; Thunnissen, A.-M.W.H.; Norman, T.C.; Kwon, S.; Espinoza, F.H.; Morgan, D.O.; Barnes, G.;
LeClerc, S.; Meijer, L.; Kim, S.-H.; Lockhart, D.; Shultz, P.G. (1998). Exploiting chemical libraries, structure, and
genomics in the search for kinase inhibitors. Science; 281:5338.
Brachat, A.; Pierrat, B.; Brungger, A.; Heim, J. (2000). Comparative microarray analysis of gene expression during
apoptosis-induction by growth factor deprivation or protein kinase C inhibition. Oncogene; 19:5073-82.
17
Clarke, P.A.; Poele, R.; Wooster, R.; Workman, P. (2001). Gene expression microarray analysis in cancer biology,
pharmacology, and drug development: progress and potential. Biochemical Pharmacology 62:1311-1336.
18
Workman, P. (2001). New drug targets for genomic cancer therapy: success, limitations, opportunities and future
challenges. Curr Cancer Drug Targets; 1:3347.
Turton, N.J.; Judah, D.J.; Riley, J.; Davies, R.; Lipson, D.; Styles, J.A.; Smith, A.G.; Gant, T.W. (2001). Gene expression
and amplification in breast carcinoma cells with intrinsic and acquired doxorubicin resistance. Onco-gene.; 20:1300-6.
Robert J (2001). Resistance to cytotoxic agents. Curr Opin Pharmacol; 1:3537.
La presencia de formas gnicas alternativas o
expresiones atpicas de genes implicados en la
accin de un frmaco o el metabolismo, puede
manifestarse como una resistencia a la terapia o
bien una respuesta atpica a la misma. Los
estudios farmacogenmicos correlacionan el perfil
gentico de los individuos con la repuesta de cada
uno de ellos a un frmaco determinado. La
informacin obtenida con estos resultados se
utiliza para disear arrays de ADN que puedan ser
utilizados en la seleccin de frmacos a medida, y
con ello se consigan tratamientos ms eficaces y
atenuar posibles efectos secundarios en el
paciente.
La respuesta de cada paciente a un frmaco est
intrnsecamente ligada a las caractersticas genticas
del paciente, moduladas por factores fisiolgicos,
patolgicos y ambientales. As, la particular dotacin
gentica del paciente incide tanto en los factores
farmacocinticos, determinantes de la concentracin
del frmaco en su lugar de accin, como en los
factores farmacodinmicos (accin especfica del
frmaco) ligados a la manifestacin propia de la
enfermedad y a la reaccin adversa. La
farmacogenmica pretende realizar una teraputica
individualizada al determinar el frmaco de eleccin
para la manifestacin especfica de la enfermedad
en el paciente, y la dosis apropiada para conseguir
el efecto teraputico minimizando el riesgo de
reacciones adversas.
3.3. Aplicacin 3:
Farmacogenmica
31
Herramientas Tradicionales
Desarrollo de un conocimiento
ms global de los cambios que
conducen a los procesos de
malignidad.
Mejor conocimiento del
mecanismo molecular durante los
procesos de identificacin,
optimizacin y ensayos clnicos.
Identificacin y validacin de nuevas dianas teraputicas.
Prediccin de pacientes tratados con frmacos con mayor posibilidad de xito.
Desarrollo de terapias a medida para cada paciente.
Microarrays y biochips
Descubrimiento de indicadores de
diagnstico y pronstico as como
marcadores de respuesta a
distintas terapias.
Identificacin de genes
implicados en la resistencia a
frmacos.
INTEGRACIN DE MICROARRAYS EN LA LUCHA CONTRA EL CNCER:
FRMACOS A MEDIDA
Fig. 3. Herramientas y estrategias utilizadas para el desarrollo de terapias contra el cncer (elaboracin propia).
La gran promesa que presentan los microarrays en la investigacin del cncer es la clasificacin de
tumores en clases basadas en los patrones de expresin de los mismos. Estas clasificaciones se realizan
por medio de un clustering u organizacin de los genes en mapas de expresin gnica a modo de rboles
filogneticos. Clases diferentes de tumores pueden presentar distintos comportamientos clnicos, y por
tanto deben abordarse mediante terapias diferentes, apropiadas para cada clase o subclase.
La obtencin de informacin til a travs de
tcnicas genmicas tradicionales (ej. PCR) o bien
mediante el uso de microarrays o bichips de ADN,
tiene una clara explotacin comercial, en el
mbito del diagnstico y prognosis de
enfermedades. Los chips que se estn
desarrollando en la actualidad con aplicaciones en
diagnstico molecular son de distinta naturaleza:
Chips para identificacin de SNPs
La deteccin de mutaciones y polimorfismos
permite el estudio de todas las variantes de un
mismo gen, caractersticas de cada individuo, y la
deteccin de mutaciones en genes que participan
en enfermedades complejas. Se pretende
conseguir la identificacin de marcadores
especficos para determinadas enfermedades o
repuestas a frmacos, mediante la identificacin
de SNPs
19
(polimorfismos de un solo nucletido).
En este tipo de chips de ADN, lo que se fija al
soporte son oligonucletidos sintticos de 7 a 30
bases, pues con mayor nmero es difcil
identificar mismatch. Cada uno de ellos
representa un fragmento de un determinado gen,
de modo que se puedan localizar variantes de
genes conocidos, as como detectar mutaciones
por delecin o insercin. Este tipo de anlisis se
realiza fijando a la matriz secuencias que
contengan mutaciones conocidas (por ejemplo,
todas las de un determinado gen), para detectar
cul es la que tiene ese gen en la muestra
problema.
Chips de caracterizacin gentica
Los anlisis genticos se emplean para encontrar
la posible predisposicin de una persona hacia
una enfermedad basndose en el anlisis de
mutaciones en un individuo o en una familia.
3.4. Aplicacin 4: Diagnstico
molecular
19
Single Nucleotide Polymorfism (Polimorfismo de un solo nucletido).
32
Para elaborar un chip de diagnstico y
caracterizacin tumoral, se utilizan secuencias que
contienen distintas mutaciones en protooncogenes
o en genes supresores de tumor, cuya presencia
en las clulas tumorales atribuye distintas
caractersticas al tumor en cuestin.
El Centro Nacional de Investigaciones Oncolgicas
Carlos III, (CNIO), ha sido el primer centro
espaol que fabrica y utiliza sus propios biochips
para su aplicacin en cncer. Los oncochips del
CNIO contienen un total de 6.514 genes,
seleccionados por su implicacin en procesos
tumorales a partir de los 35.000 genes
identificados por el Proyecto Genoma Humano.
Entre sus aplicaciones se encuentran la prediccin
del desarrollo clnico de un tumor y de su posible
respuesta a distintos frmacos, as como
informacin fundamental para los investigadores
que trabajan en el campo de la oncologa bsica.
Chips de deteccin de
enfermedades infecciosas
Actualmente existen varias lneas de desarrollo de
chips para diagnstico molecular de enfermedades
infecciosas, como el SIDA o la hepatitis,
convergiendo todas ellas hacia la integracin y
facilidad de ensayo. Estos chips permiten el
genotipado de las cepas infecciosas a partir de
muestras del paciente.
Si las herramientas de amplificacin de ADN han
supuesto una primera revolucin para el
diagnstico molecular de enfermedades
infecciosas (kits de PCR), al permitir un anlisis
ms rpido y fiable que los ensayos tradicionales
mediante anticuerpos (ensayos serolgicos), los
chips de diagnstico molecular de enfermedades
infecciosas, que estn actualmente en fase de
desarrollo, supondrn una segunda revolucin de
igual o mayor magnitud.
33
DESARROLLO DE CHIPS PARA APLICACIONES EN MICROBIOLOGA
20
Virus Estatus en 2001 Soporte y sondas
Genotipado Virus de la
hepatitis C
Resistencia al virus del VIH
Disponible
comercialmente
En desarrollo
industrial
Disponible
comercialmente
En desarrollo
industrial
En desarrollo
acadmico
Oligos en membrana de nitrocelulosa
Genotipado Virus de la
hepatitis B
En desarrollo
acadmico
Oligos en membrana de nitrocelulosa Genotipado Papilomavirus
En desarrollo
acadmico
Oligos en membrana de nylon Identificacin de mycobacterias
En desarrollo
acadmico
Productos de PCR en membrana de
nylon
Identificacin de Enterococcus
Disponible
comercialmente
Genotipado de Helicobacter
pylori
En desarrollo
acadmico
nylon
Patognesis de E. Coli
En desarrollo
acadmico
nylon
Identificacin de Streptococcus
En desarrollo
acadmico
Identificacin de especies de
Campylobacter
En desarrollo
acadmico
Oligos en membrana de nitrocelulosa Deteccin de Listeria
En desarrollo
acadmico
Oligos en membrana de nitrocelulosa Deteccin de Brucella
Oligos en membrana de
nitrocelulosa
Oligos en array microelectrnico
Sntesis in situ de oligos
Resistencia de mycobacterias
a rifampicina
En desarrollo
industrial
Disponible
comercialmente
Sntesis in situ de oligos
Oligos en membrana de nylon
Tabla 15. Desarrollo de chips para aplicaciones en microbiologa (elaboracin propia).
20
Anthony, R.M.; Brown, J.T.; French, G.L. (2001). DNA array Technology and Diagnostic Microbiology. Expert. Rev. Mol.
Diag. 1(1). 30-38.
34
Los microarrays de ADN o biochips que se comercializan actualmente se dividen en alta y baja densidad
21
,
teniendo ambos aplicaciones distintas de acuerdo al usuario final.
Compaas farmacuticas
y biotecnolgicas
Comunidad acadmica
e investigadores
Tabla 16. Usuarios de las Tecnologas de Microarrays (elaboracin propia).
4. Aspectos de mercado:
aplicacin de microarrays de ADN
y biochips en salud humana
Centran sus esfuerzos en acelerar
los niveles de produccin.
Caracterstica
principal
Necesidades mucho menores en
cuanto a resultados a gran escala.
Problemas de automatizacin y
obtencin de resultados a gran escala.
Debilidades Medios econmicos restringidos.
Altos presupuestos. Fortalezas
Recursos humanos bien formados
y con bajo coste.
Caracterizacin de la accin
molecular de compuestos activos.
Verificacin y validacin de dianas
teraputicas.
Farmacogenmica.
Arrays de media
/alta densidad
Identificacin de genes de inters.
Caracterizacin de mecanismos
patolgicos.
Anlisis de la expresin gnica.
Diagnstico molecular
Arrays de baja
densidad
21
La densidad de un array hace referencia al nmero de puntos activos sobre una superficie en donde se depositan las
sondas o oligos de ADN.
22
Gottlieb, S. (2001). The Coming Biochip Boom: Gene Chips Go Clinical. Gilder Biotech Report, Oct., Vol. 1, n 1.
La empresa lder en arrays de alta densidad es
hasta el momento Affymetrix, con un 60% del
mercado total de chips de ADN, y que tiene a los
investigadores entre sus principales clientes. Este
tipo de arrays permite una gran densidad de
integracin y la realizacin de un importante nmero
de ensayos de manera simultnea. El GeneChip de
Affymetrix se usa de manera relativamente
frecuente en laboratorios de investigacin,
vendindose ms de 100.000 unidades
anualmente
22
a un precio que oscila entre los 50 y
2.280 dependiendo del chip. Entre los principales
productos que se comercializan estn los chips VIH
que pueden detectar cepas resistentes a
determinados frmacos, los chips p53 que se utilizan
para la deteccin de mutaciones asociadas a una
mayor predisposicin a desarrollar procesos
cancerosos, y el chip citocromo P450 que es capaz
de identificar aquellos individuos que tengan ms
dificultades para metabolizar los frmacos de uso
comn.
Las tcnicas fotolitogrficas utilizadas por
Affymetrix para la sntesis in situ de oligos,
permiten obtener hoy por hoy chips
comercializables con los tamaos de punto ms
pequeos (390.000 puntos/cm
2
segn fuentes de
la propia compaa).
4.1. Arrays de alta densidad
35
Fig. 4. Comparacin de las densidades de los arrays producidos por diferentes compaas en el ao 2000.
100.000
10.000
1.000
100
10
Alta densidad
Media densidad
Baja densidad
A
f
f
y
m
e
t
r
i
x
V
y
s
i
sC
l
o
n
t
e
c
h
C
M
S
M
o
t
o
r
o
l
a
C
e
p
h
e
i
d
N
a
n
o
g
e
n
A
g
i
l
e
n
t
DENSIDAD DE ARRAYS COMERCIALES
23
Los arrays de media y baja densidad
suelen utilizarse para trasladar a una escala
ms prctica, los resultados obtenidos
(ej. secuencias de inters o mutaciones)
con arrays de alta densidad. Las caractersticas
de precisin y velocidad de anlisis
de los arrays de media y baja intensidad, permiten
que se posicionen en sectores de mercado con
mayor margen de negocio, como por ejemplo el
sector clnico. El punto fuerte de los chips de
Affymetrix, la alta densidad de integracin, tiene
menor valor en estos sectores donde se busca
fiabilidad, rapidez, simultaneidad y flexibilidad para
abordar los problemas concretos del cliente.
Proveedores de instrumental
GeneMachines, BioRobotics, Molecular Dynamics, Nanogen,
Packard Biosciences.
Proveedores de chips
Stratagene, Clontech, Tahara, MWR, Perkin elmer/NEN.
Proveedores de soluciones integradas
Genomic Solutions.
Cuadro 7. Proveedores de arrays de baja y media densidad (elaboracin propia).
4.2. Arrays de media
y baja densidad
23
Nelson, T.R. (2000). Chip, Chip, Array! An Analysis of DNA Chip Technology. Equity Capital Markets, Dain Rauscher
Wessels. Dec. 7.
Los expertos consultados para la realizacin de este
informe, corroboran los datos y tendencias
expuestos en los informes de mercado realizados
por importantes consultoras, si bien un nmero
importante de ellos piensa que se han subestimado
las posibilidades que presentan los microarrays de
baja densidad, sobre todo a la vista de los
importantes desarrollos que se estn produciendo en
microfludica, electrnica y microsistemas. Estos
desarrollos permitiran la integracin de todas las
operaciones necesarias para llevar a cabo ensayos y
prctica clnica, de manera rpida y precisa
(ej. Tecnologa Lab-on-a-chip).
Hasta la fecha, los microarrays de ADN ms
utilizados segn la encuesta realizada por ABRF
(Association of Biomolecular Resource Facilities) en
el 2001
25
son los de Affymetrix
26
. Esta compaa
sigue una estrategia de implantacin en el
mercado parecida a la que mantuvo Microsoft con
sus programas informticos, manteniendo
acuerdos con diversas compaas que se dedican
al mismo sector, con el fin de crear una plataforma
comn y forzar al mercado a utilizar su modelo,
aunque este no sea tan flexible para el sector
clnico como otras plataformas. Para el mercado
sanitario, un sector de grandes mrgenes y alto
valor aadido, la mejor plataforma sera aquella
que no solo fuese la ms rpida y precisa, sino
tambin la que atrajera a la mayor coleccin de
sondas de ADN con aplicaciones en diagnstico
molecular, es decir, la ms flexible.
36
24
Electronics Journal. January/February (2002): http://www.electronicsjournal.com/content/backissues/0201/0201frame.html
25
2000/2001 ABRF Microarray Research Group Study: A Current Profile of Microarray Laboratories. G. Grills, C.;
Griffin, A.; Massimi, K.; Lilley, K.; Knudtson, J. Van E.
26
Affymetrix no solo se centra en aplicaciones farmacuticas, sino que adems est interesado en trasladar su plataforma
a otros sectores, como el de los anlisis de calidad de agua. Por este motivo tiene un acuerdo con Lyonnaise des Eaux,
una de las principales empresas que suministra agua a los pases europeos, para el desarrollo de chips especficos que
incluyan bacterias, virus y parsitos ms frecuentes.
1999
86
8
6
79
9
12
2004
Microarrays
Otros Biochips
Microfludica
Fig. 5. Estimacin de la cuota de mercado de Microarrays
y Biochips (Frost & Sullivan).
Productos Descripcin Tendencias
GeneChips (sntesis in situ)
Gene Array escners
Microarrays de
oligonucletidos y
escner.
Fuerte crecimiento.
Arrays por deposicin (spotted)
Arrayer Ping & Ring y Escner lser confocal
Microarrays
personalizados.
Bajo crecimiento.
Tabla 17. Tendencias de implantacin de microarrays en el Mercado. Adaptado de: Fronline Strategic Consulting, Functional
Genomics Report, A Strategic Market Analysis (2002).
4.3. Mercados: Affymetrix
Segn las estimaciones de la firma Frost &
Sullivan del ao 2001
24
, el valor del mercado de
microarrays y biochips de ADN en el ao 2000 fue
de 531 millones de dlares, mientras que los
anlisis financieros y pronsticos de mercado de
esta consultora sealan que la tasa de
crecimiento para los prximos aos ser del 65%
anual. Del total de este mercado, el 60%
corresponde a microarrays de alta densidad cuya
finalidad principal es la investigacin encaminada
a la bsqueda de nuevos frmacos y la minera de
datos genmicos.
37
27
Affymetrix: http://www.affymetrix.com/products/index.affx
Producto
Arrays catalogados
Arrays personalizados
Instrumental
Arabidopsis Genome Array.
Drosophila Genome Array.
E. Coli Genome Array.
Human Genome Focus Array.
Human Genome U133 Set.
Human Genome U95 Set.
Murine Genome U74 Set.
Rat Genome U34 Set.
Rat Neurobiology U34 Array.
Rat Toxicology U34 Array.
Test3 Array.
Yeast Genome S98 Array.
El GeneChip permite el anlisis
cuantitativo y cualitativo de los niveles de
expresin gnica de organismos biolgicos
relevantes.
Los chips son redundantes, el material
inmovilizado consiste en oligos de
aproximadamente 25 nucletidos, y slo
pueden ser analizados mediante
instrumentos de Affymetrix.
Custom Arrays.
Permite la posibilidad de usar GeneChips
con los parmetros y secuencias que se
deseen.
CustomExpress Arrays.
Permite el diseo del chip usando el
catlogo de sondas disponibles.
Made-to-Order Arrays.
Cartridge Carriers.
CYP450 Assay.
HuSNP Mapping Assay p53 Assay.
GenFlex Tag Array.
Arrays de
anlisis de ADN
Arrays no disponibles en catlogos.
Cartucho.
Fluidics Station 400. Cmaras de hibridacin.
Hybridization Oven 640. Horno de hibridacin.
Scanner System with Workstation. Escner.
Complete GeneChip Instrument
System.
Contiene el set completo con la cmara,
horno de hibridacin, escner y soporte
informtico.
Data Mining Tool (DMT).
Laboratory Information
Management System (LIMS).
Microarray Suite Software.
MicroDB Software.
NetAffx Analysis Center.
Software and Computer Packages.
Soporte informtico para el anlisis y
organizacin de los datos.
Software
Componentes
adicionales
Genotipado (deteccin de SNPs), anlisis
del gen p53, anlisis de CYP450.
Permite el diseo de arrays personalizados.
Anlisis de la
expresin
gnica
Aplicacin Descripcin
TECNOLOGAS DE AFFYMETRIX
27
Tabla 18. Catlogo de productos y tecnologas de Affymetrix (elaboracin propia).
38
28
Trilateral Project B3b. Comparative study on biotechnology patent practices. Patentability of DNA fragments:
http://biotech.about.com/cs/patentdebate/
29
Japan Patent Office: http://www.jpo.go.jp/
30
European Patent Office: http://www.european-patent-office.org
31
U.S. Patent and Trademark Office: http://www.uspto.gov/
32
DeCode Genetics: http://www.decodegenetics.com
33
Agilent Technologies: http://www.agilent.com
34
Incyte Genomics: http://www.incyte.com/index.shtml
35
Motorola Life Sciences: http://www.motorola.com/lifesciences
36
http://www.motorola.com/lifesciences/news
El uso de fragmentos de ADN como sondas genera
un gran nmero de dudas acerca de la propiedad
intelectual de las mismas. Segn un estudio
conjunto
28
publicado por la Oficina de Patentes
Japonesa (JPO
29
), Europea (EPO
30
), y
Estadounidense (USPTO
31
), un fragmento de ADN
con una utilidad determinada, por ejemplo, una
sonda para el diagnstico de una enfermedad
especfica, es potencialmente patentable siempre
que cumpla los tres criterios fundamentales de una
patente: novedad, invencin y aplicacin industrial.
De esta forma, no basta con caracterizar un
fragmento de ADN basndose en su homologa con
una protena de funcin conocida, y suponiendo que
la secuencia formar parte de un gen estructural.
Por tanto, el diseo de un kit de diagnstico con
mltiples sondas debe tener en cuenta la propiedad
intelectual de estas, y las licencias de uso necesarias
para su comercializacin.
Dentro de este contexto, Affymetrix tiene un
acuerdo con DeCode Genetics
32
para tener
acceso a la base de datos genmica que estos
ltimos poseen y Agilent Technologies
33
tambin tiene un proyecto de colaboracin con
Incyte Genomics
34
, por el cual esta compaa
permite la disponibilidad de su base de datos de
genes patentada denominada Life-Seq.
Por ltimo remarcar que actualmente Affymetrix
est interesado en fabricar unos biochips con los
que se pueda analizar cmo responden los
pacientes a distintos tratamientos frente a
enfermedades como la depresin, asma,
hipertensin, cncer de mama, migraas,
hipercolesterolemia y otros.
4.4. Mercados: empresas que
compiten con Affymetrix
Varias compaas de tamaos muy diversos se estn
posicionando paulatinamente en el mercado de los
microarrays y biochips haciendo competencia a
Affymetrix por el liderazgo del sector de la
genmica. Estas compaas son principalmente
Motorola, Corning, Agilent Technologies (spin-off de
Hewlett-Packard), Incyte y Nanogen, que tienen en
comn pertenecer al sector de los semiconductores,
y que estn extendiendo sus actividades al sector de
los biochips:
Motorola
35
est utilizando su experiencia en
sensores y circuitos para producir biochips que
contengan microelectrodos conectados a
fragmentos de ADN. Esta plataforma consiste en
la fabricacin de chips de baja densidad que
pueden canalizar 36 dianas de ADN o ARN
simultneamente. El sistema usa molculas
orgnicas que forman circuitos electrnicos,
proceso que se conoce como bioelectrnica, y que
permite detectar la hibridacin de las molculas
de ADN. De esta manera, no es necesario el uso
de fluorescencia y por tanto no precisan
escneres. Esta compaa tiene acuerdos con
Packard Instrument Company y el Argonne
National Laboratory para comercializar biochips.
Todos los productos de Motorola Life Sciences estn
desarrollados a partir de una tecnologa de la que es
propietaria la empresa, denominada Codelink 3D
Gel Platform. Se basa en la utilizacin de matrices
tridimensionales de poliacrilamida que permiten una
mayor superficie de contacto para la posterior
inmovilizacin de oligos.
No obstante, las ltimas informaciones
consultadas indican que Motorola ha vendido la
plataforma Codelink bioarray a la compaa
Amersham plc
36
.
bound target
oligonucleotide probe
linker
polyacrylamide matrix
free target
aqueous environment
39
37
Corning Life Sciences: http://www.corning.com/lifesciences/Greater_Europe/en/
38
Nanogen: http://www.nanogen.com
39
40
Incyte Genomics: http://www.incyte.com/index.shtml
41
Hyseq Pharmaceuticals Inc: http://www.hyseq.com
Corning Inc.
37
Una de las compaas ms
importantes en la industria de la fibra ptica, ha
formalizado una alianza a finales del ao 2001
con Genencor para crear una nueva plataforma
llamada Silicon Biotechnology, la cual pretende
desarrollar chips biolgicos de deteccin ptica y
biochips.
Nanogen
38
, como ya ocurra con Motorola,
tambin hace uso de la bioelectrnica, pero en
este caso tambin a la hora de fabricar el biochip.
La deteccin de la hibridacin se realiza utilizando
las propiedades elctricas naturales del ADN, que
est cargado negativamente. Mediante la
aplicacin de corriente elctrica se consigue que
las molculas cargadas de ADN se muevan y
concentren en los lugares de anlisis, controlando
as las muestras que queramos analizar. Esta es
una gran ventaja a tener en cuenta por los
usuarios, quienes pueden usar el chip ms de una
vez e incluso cambiar las secuencias de las
muestras.
Los estudios que han analizado la plataforma de
Nanogen y de Motolora
39
sealan que los
NanoChips de Nanogen son ms precisos que los
GeneChips de Affymetrix, ya que estos ltimos
tienen un porcentaje de falsos negativos que no
seran aceptables en aplicaciones diagnsticas, donde
se requiere una precisin cercana al 100%. Adems
otra de las ventajas que presenta la plataforma de
Nanogen es el hecho de que sus biochips analizan
directamente el ADN en lugar del ARN.
La aplicacin actual del NanoChip se centra en
la deteccin de mutaciones y marcadores que por
el momento tan solo est catalogado para uso en
investigacin, relacionado con enfermedades
como el cncer, la talasemia, patologas
coronarias y vasculares, hipertensin,
metabolismo y resistencia a frmacos.
Incyte Genomics
40
es una compaa posicionada
en el sector de la bioinformtica que desarrolla
para su uso comercial bases de datos genticos y
moleculares (LifeSeq y LifeExpress), as como
software especfico para manejar informacin
biolgica (LifeTools). Adems de estos
productos la compaa comercializa clones y
productos de PCR listos para ser utilizados en
arrays de ADN. Incyte ofrece tambin un conjunto
de chips de alta densidad denominados
LifeArray, con aplicaciones potenciales en
anlisis de la expresin gnica y toxicidad de
frmacos.
Incyte lleva 5 aos implicado en litigios con
Affymetrix, con relacin a las patentes de
microarrays, litigio que ha desembocado en un
acuerdo entre ambas compaas, a la vista de la
nulidad de algunas reivindicaciones contenidas en
las patentes de Affymetrix.
Hyseq Pharmaceuticals Inc.
41
cre Callida
Genomics a finales del ao pasado con el objetivo
de centrarse en la comercializacin y desarrollo
de herramientas de secuenciacin y anlisis de
Producto Aplicacin Descripcin
Soportes
activados
Cmaras de
hibridacin
UltraGAPS Coated Slides
GAPS ll Coated Slides
Hybridization Chamber
O-rings
Superficies de cristal cubiertos de
aminosilanos.
Capacidad de impresin de oligos de ms
de 50 nucletidos.
Cristal ultra fino que permite mayor
precisin en la lectura por escner.
Cmaras de hibridacin reutilizables.
Tabla 19. Catlogo de productos y tecnologas de Corning Life Sciences (Fuente: Corning Life Sciences).
40
42
Orchid Biosciences: http://www.orchid.com
43
ADN basadas en tcnicas de secuenciacin
mediante hibridacin (Sequencing by
Hybridization Technology, SBH). N-Mer Inc. es
una compaa subsidiaria que se encarga de
desarrollar chips de secuenciacin de alta
precisin. Como consecuencia de varios litigios
mantenidos con Affymetrix, N-Mer posee ahora un
acuerdo con esta compaa por el cual tiene
derecho a utilizar la plataforma Genechip de
Affymetrix as como hacer uso de la tecnologa de
secuenciacin por hibridacin de la cual es
propietaria Callida Genomics.
Estos chips tienen la intencin de ser universales
ya que tienen la capacidad de secuenciar
cualquier gen sin la necesidad de conocer la
secuencia o gen de referencia, lo que les confiere
adems una ventaja competitiva al evitar los
problemas derivados de la propiedad industrial de
las sondas utilizadas (ver seccin 4.3). Hyseq
comenz con este proyecto en colaboracin con
Perkin Elmer comercializando el chip bajo el
nombre de HyChip, y ofreciendo servicios a
otras empresas farmacuticas como Chiron para
el descubrimiento y desarrollo de nuevos
frmacos, adems de aplicaciones en
farmacogenmica y anlisis de polimorfismos.
Orchid Biosciences
42
, el lder actual de la
industria dedicada a la farmacogenmica
43
, tiene
puesto su inters en este emergente sector,
concretamente en plataformas de diagnstico y
microarrays que permiten la obtencin de datos a
gran escala con aplicaciones en el descubrimiento
de frmacos. El uso de biochips en el proceso de
cribado y validacin de un frmaco puede reducir
el coste de los 2 dlares actuales hasta los
0,0001 dlares.
Agilent Technologies, spin-off of Hewlett-
Packard, es un ejemplo de empresa dedicada en
sus comienzos al sector de las comunicaciones y
electrnica, y que actualmente ha diversificado
sus actividades al sector qumico y biotecnolgico.
Poseen un servicio de consulta personalizada en
el diseo de sondas para su utilizacin en
microarrays, as como en la elaboracin de
protocolos. Entre sus productos se encuentran los
kits de cDNA para el anlisis de la expresin
gnica y bsqueda de dianas teraputicas en
humanos, ratn, rata y Arabidopsis, realizados en
colaboracin con Incyte Genomics, quien
proporciona acceso a sus bases de datos
LifeSeq. Asimismo, poseen arrayers con
tecnologa ink-jet que permiten la produccin de
microarrays personalizados.
Otros productos que comercializan son kits de
marcaje e hibridacin, cmaras de hibridacin, y
escner propio. Agilent comercializa el software
empleado para el anlisis de las imgenes, en
cambio, el procesamiento e interpretacin de los
datos corre a cargo del sistema de anlisis de
Rosetta Inpharmatics. Otra empresa con la cual
Agilent tiene acuerdos de colaboracin es Caliper,
quien ha desarrollado el LabChip.
4.5. Estrategias de desarrollo
e implantacin
Una de las maniobras utilizadas por la mayora de
las compaas es la proteccin de sus productos
mediante patentes.
Para una empresa biotecnolgica, la implantacin
de una tecnologa tan novedosa como los
microarrays, exige el diseo de una estrategia de
posicionamiento en el mercado que sea
competitiva respecto a posibles competidores.
Tanto las grandes como las pequeas compaas
prefieren centrarse en la proteccin de un mtodo
especfico de anlisis o investigacin, para luego
desarrollar a su alrededor un entorno de patentes
relacionadas con ese mtodo en particular.
Ejemplos claros son, Nanogen, que posee varias
patentes sobre el uso de biochips electrnicos,
Hyseq, cuyo objetivo es dominar el mercado de la
hibridacin con oligonucletidos, y Affymetrix,
quien ha dominado hasta el momento la idea
original de chip de ADN.
En sectores tan novedosos como el de los
microarrays de ADN, una de las estrategias de
mercado ms significativas consiste en ser el
primero en comercializar un producto,
proporcionando a los clientes de estas tecnologas
una herramienta fiable. El objetivo es instalarse en
el mercado con fuerza y dificultar la salida de otros
41
44
Fronline Strategic Consulting, Functional Genomics Report, A Strategic Market Analysis (2002).
45
Amersham Biosciences: http://www.apbiotech.com
46
Rosetta Inpharmatics, Inc.: http://www.rii.com
47
Merck & Co., Inc.: http://www.merck.com
productos procedentes de competidores, ya que
los usuarios suelen ser fieles a aquellos
proveedores que conocen desde un comienzo.
Cuando un nicho de mercado ya est creado, y
una segunda compaa emerge con nuevos
productos, es difcil provocar cambios en los
hbitos de los consumidores que llevan al menos
dos aos utilizando un producto determinado.
Esta transicin es especialmente dificultosa
cuando la tecnologa de microarrays est dirigida
a la creacin de bases de datos, proceso que
requiere del establecimiento de estndares que
exigen la utilizacin de herramientas comunes.
4.6. Modelos de negocio
Segn un estudio realizado el presente ao por
FrontLine Consulting
44
, el mercado biotecnolgico
que explota la genmica funcional presenta cuatro
modelos de negocio. Estos cuatro modelos
propuestos pueden trasladarse a ejemplos
concretos de empresas con base tecnolgica, las
cuales estn incorporando las tecnologas de ADN
en sus planes de futuro.
El primer modelo consistira en aquellas empresas
farmacuticas convencionales que poseen un
departamento de I+D dedicado a la investigacin
y desarrollo de nuevos productos y procesos. Este
es el caso de Amersham Biosciences
45
, que se
form de la unin de dos compaas procedentes
del sector sanitario, Amersham plc (anteriormente
Nycomed Amersham plc) y Pharmacia Corporation
(anteriormente Pharmacia & UpJohn Inc.). No
obstante, este modelo no es tan obvio en el caso
de las tecnologas de microarrays, ya que stas
suelen ser empresas con un pasado dedicado a
tecnologas de la comunicacin y con amplios
conocimientos en el sector de los
semiconductores, como es el caso de Agilent
Technologies, Inc. Las empresas con tradicin
farmacutica se han ido adaptando al cambio que
supone la entrada de estas tecnologas.
El segundo modelo vendra a describir las compaas
que han adoptado como estrategia la formalizacin
de acuerdos de licencias con centros o grupos de
investigacin que posean la tecnologa que ms les
interese. De esta forma, pueden adquirir patentes
sin necesidad de disponer de un departamento
dedicado en exclusividad a I+D. Un claro ejemplo es
Affymetrix, quien en los ltimos aos se ha hecho
con un portafolio de aproximadamente 70 patentes
en tecnologas de arrays de ADN, adems de tener
pendientes cientos de aplicaciones.
La alianzas son el tercer modelo y supone una
estrategia adicional que prcticamente todas las
compaas realizan, mediante la cual se pueden
acceder a fuentes de informacin o tecnologas bajo
acuerdos entre empresas o centros de investigacin.
En este sentido, Incyte mantiene colaboraciones
actualmente con Agilent Technologies, Inc.,
Amersham Pharmacia Biotech o Corning Inc.
El cuarto y ltimo modelo son las fusiones y
adquisiciones, ms frecuentes a medida que el
mercado se especializa y la competencia crece.
stas se producen generalmente por una
compaa que busca la adquisicin de
conocimiento por parte de expertos, y
simultneamente ampliar su campo de
actividades, mediante la compra de compaas de
menor tamao, las cuales tienen mayores
posibilidades de subsistir formando parte de
multinacionales. Rosetta Inpharmatics, Inc.
46
fue
adquirida por MSD
47
a mediados del pasado ao
2001, siendo la primera de ellas una de las
empresas pioneras en el sector de la genmica y
la bsqueda de nuevos frmacos, mientras que
Merck es una compaa farmacutica lder en
salud humana. Incyte a su vez realiz unas
campaas muy agresivas de adquisicin de
compaas ms pequeas que en aquel momento
estaban destacando por lo avanzado de sus
tecnologas. De esta forma, adquiri entre 1996 y
1998 Hexagen, Synteni y Genome Systems.
42
48
Micro-Systems Technology, MST.
49
Caliper: http://www.calipertech.com/products
50
Aclara BioSciences, Inc.: http://www.aclara.com
51
Micronics, Inc.: http://www.micronics.net
52
Tecan: http://www.tecan.com
53
Burstein Laboratories: http://bursteinlabs.com/tech.htm#prod
Los dispositivos lab-on-a-chip, tambin llamados
Micro Total Anlisis Systems (TAS), permiten al
investigador miniaturizar e integrar los procesos
ms complejos de laboratorio, logrando la
optimizacin de protocolos, reduccin de los
volmenes de reaccin, e integracin de mltiples
ensayos en un nico chip.
Estas tecnologas fueron desarrolladas en un primer
momento a partir de las tecnologas de
microsistemas
48
. Los dispositivos microfludicos son
generalmente chips de cristal o de plstico, y utilizan
una combinacin de fenmenos de presin, electro-
smosis, electroforesis y otros mecanismos para
mover las muestras y los reactivos (con volmenes
del orden de picolitros o microlitros) a travs de
canales y capilares microscpicos. El dimetro de
estos microcanales es del orden de 10 a 100
micrometros, aunque algunos de ellos pueden llegar
a tamaos tan pequeos como las pocas decenas de
manmetros.
El objetivo final ser la integracin de la
preparacin de la muestra, la purificacin,
almacenamiento, mezcla, deteccin y otras
funciones, en el interior del chip. El mercado de
los Lab-on-a-chip se encuentra en estos
momentos en una fase ms temprana que en el
caso de los microarrays y a corto plazo estos
dispositivos tendern a situarse en un puesto
dirigido por las aplicaciones ms inmediatas.
Hay pocos productos disponibles en el mercado que
realicen este tipo de procesos de separacin
electrofortica. Entre ellos se encuentran los
Labchip de ADN, ARN y protenas de Caliper
49
, que
entre otras aplicaciones est diseado para acelerar
el proceso de descubrimiento de nuevos frmacos.
Aclara BioSciences, Inc.
50
, comercializa un
sistema de deteccin microfludica llamado
LabCard que permite la separacin de una
gran variedad de muestras, incluidas aquellas que
se basan en el marcaje con dianas moleculares
eTag, tambin propiedad de Aclara. Este sistema
hace posible el anlisis mltiple de cidos
nucleicos y de protenas directamente desde la
muestra de origen, ya sean lisados de clulas o
suero. El dispositivo microfludico recibe el
nombre de Arteas, que ha superado con xito
los problemas iniciales relativos a la evaporacin
de los fluidos.
Micronics Inc. y Micro Agri Systems estn
desarrollando chips celulares con sistemas
similares a los citmetros de flujo. Micronics,
Inc.
51
, posee un conjunto de productos que basan
su tecnologa en dispositivos integrados que
poseen microcanales por los cuales mezclas
separadas de fluidos pueden desplazarse sin
mezclarse. Este transporte tiene lugar nicamente
por medio de movimientos de difusin de las
partculas a travs de un gradiente de
concentracin. De esta forma, las molculas ms
pequeas se movern con rapidez, mientras que
las de mayor tamao quedarn atrapadas en la
muestra.
Algunas compaas como Tecan
52
han desarrollado dispositivos microfludicos
en discos compactos, plataforma que recibe
el nombre comercial de LabCD,
y que fue desarrollada en un principio por Gamera
Bioscience, actualmente parte integrante
de Tecan. Burstein Laboratories
53
tambin
ha diseado una plataforma parecida denominada
BioCompact Disc (BCD).
4.7. Tendencias:
lab-on-a-chip
43
5. Casos prcticos
A continuacin se presentan siete casos prcticos de implantacin de la tecnologa de microarrays
de ADN en Espaa.
CASO PRCTICO 1
Nombre de la institucin o empresa: Biotools B & M Labs, S.A. http://www.biotools.net
Actividad principal: Comercializacin de Kits de diagnstico molecular
Tecnologa e Implantacin
Aplicaciones
Resultados
Microfludica y Bioelectrnica.
N de personas trabajando en laboratorio de Microarrays: 6.
Tipo de expertos pertenecientes al proyecto:
1 Becario, 3 Doctores, 3 Tcnicos,
1 Gestor de proyecto.
reas de experiencia de los expertos: Diagnstico molecular,
Cncer, Gestin y Marketing.
Tiempo de uso de la tecnologa de Microarrays desde la
puesta en marcha: 1-2 aos.
Tiempo dedicado en la puesta en marcha de la tecnologa
Microarrays: 1-2 aos.
Factores considerados al elegir el uso de la tecnologa de
Biochips:
Mejora de procesos ya implantados.
Beneficio y rapidez.
Flexibilidad del sistema.
Automatizacin.
En un estudio previo se identificaron 3 tecnologas,
apostando por aquella de implantacin a menor plazo y de
desarrollo tecnolgico ms consolidado.
Sector de inters actual: cncer y SIDA. Futuro:
agroalimentacin y medioambiente.
Trabajan conjuntamente con tres grupos de investigacin de
EE.UU. (mayor flexibilidad que en Espaa).
Proyectos en curso que hacen uso de la tecnologa de
Microarrays:
Desarrollo de kits de diagnstico y tipado de HPV.
Desarrollo de kits de diagnstico de enfermedades
parasitarias.
Desarrollo de kits de identificacin de componentes
crnicos en alimentos.
Desarrollo de kits de identificacin forense.
Desarrollo de kits de diagnstico precoz de cnceres de
vejiga y prstata.
En un ao tendrn listo un producto preliminar: kit LOAC
de diagnstico molecular para cncer de prstata y vejiga.
No pretende dar servicios, solo comercializar un producto.
Fuente de origen de las muestras: muestras humanas,
alimentos crudos y preparados.
Fuente de origen de las sondas: cDNA, Plsmidos, Productos
de PCR, Clones.
Operaciones internas:
Aislamiento de ARN.
Preparacin de muestras (marcaje).
Preparacin de sondas Hibridacin.
Factores determinantes en la realizacin de operaciones
internas:
Repetibilidad de resultados.
Robustez de la tcnica.
Posibilidad de automatizacin de procesos.
Dificultades encontradas:
Coste.
Reproducibilidad.
Robustez.
Ventajas encontradas: posibilidad de automatizacin.
Inters en Lab-on-a-Chip integrados de RNA, DNA y
protenas (LOAC mixtos).
Affymetrix no ofrece robustez, reproducibilidad, y flexibilidad, caractersticas esenciales para ellos.
No pretenden ser distribuidores de empresas grandes. Quieren acuerdos de colaboracin (patentes).
Los microarrays presentan dificultades debidas a la fijacin de las sondas y no dan resultados tan fiables como los LOAC (Lab-on-a-Chip).
Principal limitacin: preparacin de las muestras (en un futuro ser sangre).
Grado de satisfaccin de las tecnologas de Microarrays:
Satisfecho: Preparacin de muestras (marcaje).
Preparacin de sondas, Hibridacin, Documentacin, Soporte tcnico.
Poco Satisfecho: Calidad del array, Calidad de los datos obtenidos, Software.
Nada Satisfecho: Escaneado.
Perspectivas futuras del uso de microarrays:
Alto inters: Lab-on-a-chip.
Medio inters: Arrays de cDNA, Arrays de protenas, otros mtodos de deteccin.
Poco inters: Arrays de tejidos.
Escaso inters: GeneChip Affymetrix, Non-Affy Chips, Otros soportes, Otras tcnicas de inmovilizacin.
44
CASO PRCTICO 2
Nombre de la institucin o empresa: Centro de Astrobiologa (CSIC-INTA) http://www.cab.inta.es
Actividad principal: Investigacin bsica y aplicada en astrobiologa
Aplicaciones
Resultados
Tipo de Tecnologa de fabricacin de Microarrays adquirida: Microspotting (Genetic MicroSystems,
Affymetrix y BioRobotics).
Tiempo de uso o de implantacin de la tecnologa de Microarrays: 2-3 aos.
N de personas trabajando en laboratorio de Microarrays: 4.
Tipo de expertos pertenecientes al proyecto: 2 Doctores, 2 Tcnicos.
reas de experiencia de los expertos: marcaje, inmovilizacin y soportes, impresin del array,
diagnstico molecular, microbiologa.
Tiempo dedicado en la puesta en marcha de la tecnologa Microarrays estimado y real: 6-12 meses.
Factores considerados al elegir el uso de la tecnologa de Microarrays:
Principalmente inters por entrar en la tecnologa de microarrrays.
Automatizacin.
Proyectos en curso que hacen uso de la
tecnologa de Microarrays:
Deteccin de polimorfismos de nucletidos
(SNPs).
Estudio de expresin diferencial de genes en
bacterias.
Microarrays de protenas.
Aislamiento de ARN.
Preparacin de sondas.
Hibridacin.
Construccin de libreras.
Escaneado.
Anlisis de datos de imagen.
Factores determinantes en la realizacin de
operaciones internas: todas estas operaciones
forman parte de la investigacin que nos
proponemos.
Dificultades encontradas:
Escaso asesoramiento tcnico por parte de las
empresas proveedoras de los robots de
microspotting.
Precios elevados del material fungible.
Ventajas encontradas:
Elevada sensibilidad de la tcnica.
Versatilidad para realizar estudios sobre DNA
o protenas.
Procesamiento paralelo de muchas muestras.
Fuente de origen de las muestras: bacterias
extremfilas, virus.
Fuente de origen del material biolgico
inmovilizado en el chip: productos de PCR,
clones, oligos, anticuerpos, protenas.
Muy satisfecho: escaneado, calidad de los datos obtenidos.
Satisfecho: documentacin, calidad del array, preparacin de sondas, hibridacin, preparacin de
muestras (marcaje).
Poco Satisfecho: soporte tcnico, software.
Alto inters: Non-Affy Chips, Arrays de cDNA, Arrays de protenas, Lab-on-a-chip, otras tcnicas
de inmovilizacin, otros mtodos de deteccin, microarrays mixtos (ADN, protenas).
Medio inters: otros soportes, otras tecnologas de fabricacin.
Escaso inters: arrays de tejidos, GeneChip Affymetrix.
La bioelectrnica y nuevos mtodos de deteccin sin marcaje son en su opinin el futuro de la
tecnologa de microarrays.
Consideran difcil implantar los biochips en los laboratorios con pocos recursos econmicos.
Empresa spin off para la produccin y comercializacin de microarrays de ADN, para el anlisis
gentico de virus y otros microorganismos patgenos de inters sanitario.
45
CASO PRCTICO 3
Nombre de la institucin o empresa: PharmaGen, S.A. http://www.pharmagen.es
Actividad principal: Desarrollo y Comercializacin de Kits de Diagnstico Molecular
Aplicaciones
Resultados
Tipo de Tecnologa de fabricacin de Microarrays
adquirida: Microspotting (BioRobotics).
Tiempo de uso o de implantacin de la
tecnologa de Microarrays: 6-12 meses.
N de personas trabajando en laboratorio de
Microarrays: 4.
Tipo de expertos pertenecientes al proyecto: 3
Doctores, 1 Tcnico.
Tiempo dedicado en la puesta en marcha de la
tecnologa Microarrays: 6-12 meses.
Proyectos en curso que hacen uso de la tecnologa de Microarrays:
Mecanismo accin frmacos antitumorales.
Cncer.
Aislamiento de ARN y Preparacin de muestras (marcaje).
Hibridacin.
Escaneado y Anlisis de datos de imagen.
Factores determinantes en la realizacin de operaciones internas: operatividad y desarrollo de know-how:
Dificultades encontradas: estandarizacin de condiciones anlisis.
Ventajas encontradas: desarrollo de protocolos estandarizados que reducen la variabilidad en los
resultados.
Operaciones externas: construccin de libreras.
Factores determinantes en la subcontratacin de servicios externos: tiempo y coste:
Dificultades encontradas: informacin muy pobre sobre las libreras de sondas.
Ventajas encontradas: ahorro de tiempo.
Fuente de origen de las muestras: muestras humanas.
Fuente de origen del material biolgico inmovilizado en el chip: productos de PCR, clones, cDNA, plsmidos.
Los mayores problemas surgen de la informacin y servicio tcnico de algunos proveedores. El
software de lectura, cuantificacin y anlisis de datos es manifiestamente mejorable para usuarios no
especializados y requiere la utilizacin de expertos bioinformticos.
El anlisis de resultados post-hibridacin que es la etapa ms importante, para la que se dispone de
pocas herramientas y de alto coste, y requiere fuertes inversiones en equipo, software y tiempo de
anlisis de expertos.
Muy satisfecho: Hibridacin, Calidad del array.
Satisfecho: Preparacin de muestras (marcaje), Preparacin de sondas, Escaneado, Calidad de los
datos obtenidos.
Poco satisfecho: Documentacin, Soporte tcnico, Software.
Perspectivas futuras del uso de Microarrays:
Alto inters: Arrays de cDNA, Otras tcnicas de inmovilizacin.
Medio inters: Arrays de protenas, Lab-on-a-chip, otros soportes, otros mtodos de deteccin.
Poco inters: Arrays de tejidos, GeneChip Affymetrix, Non-Affy Chips.
reas de experiencia de los expertos:
Marcaje.
Inmovilizacin y soportes.
Impresin del array.
Cncer.
Factores considerados al elegir el uso de la
Inters por entrar en la tecnologa de
microarrrays.
46
CASO PRCTICO 4
Nombre de la institucin o empresa: Instituto de Investigaciones Biomdicas, CSIC-UAM
Actividad principal: Investigacin en Endocrinologa Experimental/Oncologa/Metabolismo
Direccin WEB: http://www.iib.uam.es
Aplicaciones
Resultados
Tipo de tecnologa de fabricacin de Microarrays
adquirida: Microspotting.
tecnologa de Microarrays: 6-12 meses.
Microarrays: 5.
Tipo de expertos pertenecientes al proyecto: 2
Doctores, 3 Becarios.
reas de experiencia de los expertos: marcaje,
inmovilizacin y soportes, impresin del array,
expresin gnica.
Expresin de genes de cerebro fetal bajo control de hormona tiroidea.
Regulacin de la expresin gnica en cerebelo.
Aislamiento de ARN.
Hibridacin.
Operaciones externas:
Fabricacin del array.
Escaneado.
Factores determinantes en la realizacin de operaciones internas: experiencia previa y versatilidad:
Dificultades encontradas: coste de las colecciones de cDNA.
Ventajas encontradas: realizar todos los procesos en el mismo mbito.
Factores determinantes en la subcontratacin de servicios externos: falta de equipo adecuado:
Dificultades encontradas: incomodidad de realizar las lecturas fuera del Instituto, desplazamientos,
reserva de tiempo en los equipos.
Ventajas encontradas: ninguna.
Fuente de origen de las muestras: ratn, rata.
Fuente de origen del material biolgico inmovilizado en el chip: productos de PCR, cDNA.
Algunos experimentos se han realizado usando chips de Affimetrix por empresa subcontratada
(Medplant Genetics).
Las principales dificultades son poca experiencia y la falta de escner, un factor muy limitante en los
experimentos.
Satisfecho: preparacin de muestras (marcaje), preparacin de sondas, hibridacin.
Poco Satisfecho: escaneado, calidad del array.
Nada satisfecho: calidad de los datos obtenidos.
Alto inters: GeneChip Affymetrix, Arrays de cDNA.
tecnologa Microarrays:
Estimado, 1-2 aos.
Real: 2-3 aos.
microarrrays.
Relacin beneficio/coste.
Automatizacin.
47
CASO PRCTICO 5
Nombre de la institucin o empresa: Medplant Genetics, SL http://www.medplantgenetics.com
Actividad principal: Identificacin y validacin de genes y protenas como marcadores
para diagnstico y dianas teraputicas. Farmacogenmica.
Aplicaciones
Resultados
adquirida:
Microspotting (Microrobotics): servicio de
diseo y fabricacin de chips.
Fotolitografa (Affymetrix): proveedor de
GeneChips.
tecnologa de Microarrays: 2-3 aos.
Microarrays: > 6.
8 Doctores, 1 Tcnico, 7 Licenciados
contratados.
Marcaje.
Impresin del array.
Cncer.
Toxicologa.
microarrrays.
Recomendacin de expertos.
Relacin beneficio/coste.
Automatizacin.
Identificacin y validacin de genes asociados a cncer y enfermedades neurolgicas.
Proyectos contratados por empresas farmacuticas.
Estudios de expresin gnica contratados por laboratorios pblicos de investigacin.
Aislamiento de ARN y Preparacin de muestras (marcaje).
Hibridacin.
Escaneado y Anlisis de datos de imagen.
Procesamiento ontolgico.
Factores determinantes en la realizacin de operaciones internas:
Optimizacin de sensibilidad.
Especificidad.
Reproducibilidad.
Dificultades encontradas: los arrays de cDNA rinden resultados no reproducibles.
Ventajas encontradas: es mucho ms fcil lograr la necesaria estandarizacin de procesos para la
consecucin de resultados reproducibles y comparables, utilizando los microarrays de Affymetrix o de
oligonucletidos imprimidos.
Fuente de origen de las muestras: humano, ratn, rata, levadura, E. Coli, arabidopsis.
Fuente de origen del material biolgico inmovilizado en el chip: oligos.
Muy satisfecho: Calidad del array, Calidad de los datos obtenidos.
Satisfecho: Preparacin de muestras (marcaje), Preparacin de sondas, Hibridacin, Escaneado,
Documentacin, Soporte tcnico.
Poco Satisfecho: Software.
Alto inters: GeneChip Affymetrix, Arrays Medplant de oligos.
Medio inters: arrays de protenas.
48
CASO PRCTICO 6
Nombre de la institucin o empresa: Instituto de Salud Carlos III http://biotic.isciii.es
Actividad principal: Investigacin y desarrollo de nuevas tecnologas para el tratamiento
de la informacin gentica y su aplicacin en la investigacin biomdica y la prctica clnica.
Aplicaciones
Resultados
adquirida: Microspotting.
Microarrays: 3.
2 Doctores, 1 Licenciado.
Marcaje.
Impresin del array.
Inmovilizacin y soportes.
Bioinformtica.
microarrrays.
Mejora de procesos ya implantados
Deteccin de microorganismos patgenos basados en sus secuencias genticas.
Identificacin de virus empleando protenas.
Hibridacin.
Escaneado.
Calidad de los reactivos.
Instrumentacin adecuada.
Formacin del personal.
Dificultades encontradas: ajuste de protocolos.
Ventajas encontradas: independencia de otros servicios, mejora en la transmisin y anlisis de
resultados.
Servicios externos: aislamiento de ARN.
Fuente de origen de las muestras: diversos microorganismos patgenos en humanos.
Fuente de origen del material biolgico inmovilizado en el chip: oligos, anticuerpos, protenas.
Satisfecho: Preparacin de muestras (marcaje), Preparacin de sondas, Hibridacin, Escaneado,
Calidad del array, Calidad de los datos obtenidos, Documentacin, Soporte tcnico, Software.
Observacin: Mejorar la adquisicin de datos y fiabilidad de los escneres.
Alto inters: Arrays de protenas, Otros mtodos de deteccin, Arrays de SNPs.
Medio inters: Lab-on-a-chip.
Bajo inters: Arrays de tejidos.
Escaso inters: Arrays de cDNA.
49
CASO PRCTICO 7
Nombre de la institucin o empresa: Centro Nacional de Investigaciones Oncolgicas http://www.cnio.es
Actividad principal: Investigacin y desarrollo en oncologa.
Aplicaciones
Resultados
adquirida: Microspotting (Biorobotics).
Microarrays: > 6.
6 Doctores, 4 tcnicos.
reas de experiencia:
Marcaje.
Impresin del array.
Cncer.
microarrays.
Linfomas B de clula pequea: anlisis de expresin con microarrays de cDNA.
Linfomas B de clula grande: anlisis de expresin con microarrays de cDNA.
Cncer de mama hereditario no asociado a mutaciones en los genes BRCAS. Desarrollo de un
biochip de expresin de cDNAs.
Caracterizacin de genes candidatos localizados en regiones cromosmicas definidas por LOH y CGH
en linfomas no Hodgkin.
Estudio mediante arrays de cDNA de los genes implicados en la sensibilidad y resistencia a paclitaxel
en cncer de mama y ovario.
Aislamiento de ARN.
Preparacin de muestras (marcaje) y sondas.
Hibridacin y Escaneado.
Conocimiento y control de todos los procesos.
Flexibilidad, fundamentalmente en el tratamiento de datos.
Dificultades encontradas: las colecciones de DNA comerciales son de fiabilidad variable y dudosa, y el
proceso de amplificacin y conservacin de estos clones ha de ser muy riguroso; es de extrema
importancia tener todos los procesos bajo control para asegurarse que los resultando obtenidos
corresponden a diferencias en la biologa de las muestras que se estn comparando, y no a diferencias
introducidas por la tcnica; tecnologa cara.
Ventajas encontradas: sistema de screening a gran escala con un gran potencial.
Fuente de origen de las muestras: humano, ratn, rata.
Fuente de origen del material biolgico inmovilizado en el chip: oligos (en prueba), cDNA, Plsmidos,
Productos de PCR, Clones.
Satisfecho: preparacin de muestras (marcaje), preparacin de sondas, hibridacin, escaneado,
calidad del array, calidad de los datos obtenidos, documentacin, soporte tcnico, software.
Observacin: la calidad de los resultados obtenidos es alta. No obstante, es una tcnica con muchas
posibilidades y en la que caben importantes mejoras.
Alto inters: arrays de cDNA, Arrays de tejidos, Lab-on-a-chip.
Medio inters: Non-Affy Chips.
Bajo inters: arrays de protenas, otras tcnicas de inmovilizacin y o tros mtodos de deteccin.
Una tendencia acusada que se ha observado,
tanto por parte de la mayora de los expertos que
han participado, como en la documentacin
analizada en la elaboracin de este informe, es la
prdida de inters que se muestra por los
dispositivos de alta densidad de oligos, en
particular los GeneChips de Affymetrix. Estos
microarrays suponen un desembolso demasiado
elevado para muchos centros de investigacin y
empresas, que optan por otras alternativas: bien
por arrays de alta densidad de cDNAs, dado que
las tcnicas de fabricacin no fotolitogrficas
permiten hoy en da conseguir densidades de
integracin y costes muy atractivos; o bien por
arrays de baja o media densidad, que cubren las
necesidades experimentales y las expectativas en
cuanto a fiabilidad y precisin.
La tendencia mostrada en el prrafo anterior
contrasta con la aceptacin internacional de las
tecnologas comercializadas por Affymetrix, que
constituyen una herramienta bsica de los
proyectos de genmica que se llevan a cabo en el
norte de Europa y al otro lado del Atlntico. Las
razones para esta tendencia espaola podran ser
las siguientes:
La vocacin, de muchos de los expertos
entrevistados, por el desarrollo de kits de
diagnstico molecular, donde los arrays de alta
densidad y de sntesis in situ (Affymetrix) son
menos apreciados.
El alto coste de adquisicin y operacin de la
plataforma tecnolgica de Affymetrix, que la
hacen tan solo disponible a un grupo muy
reducido de centros y empresas de
investigacin y, por lo tanto, de investigadores.
La escasa disposicin de estas herramientas en
rgimen de servicio, tanto por universidades,
centros de I+D y empresas, como ocurre en
otros pases de nuestro entorno, abaratando los
costes de explotacin y experimentacin.
Adems, una mayor participacin de grupos de
investigacin espaoles en proyectos
internacionales de genmica funcional y
estructural, donde los microarrays de Affymetrix
juegan un papel principal, contribuira a un mayor
conocimiento y utilizacin de estas tecnologas.
Los resultados procedentes de arrays de alta
densidad utilizados en el anlisis de la expresin
gnica son de gran valor, pero es necesario
conseguir una mejor normalizacin de los
resultados y una mayor estandarizacin de los
protocolos de ensayo. Por ejemplo, parece
necesario desarrollar protocolos comunes que
permitan comparar adecuadamente los resultados
obtenidos por distintas plataformas tecnolgicas
(Ej. Oligos vs. cDNAs), bajo unas mismas
condiciones de ensayo. Este problema afecta
especialmente al mbito clnico, donde los
problemas de reproducibilidad en los resultados
obtenidos estn ralentizando el desarrollo de
aplicaciones clnicas reales: diagnstico y
prognosis de enfermedades, farmacogenmica...
Quizs sea sta otra de las razones que est
llevando a los grupos de investigacin, y a las
empresas espaolas, hacia arrays de media y
baja intensidad, donde se reducen las variables
que intervienen en el ensayo y, por lo tanto, es
ms fcil estandarizar los protocolos y conseguir
una mayor fiabilidad en los resultados. Adems,
no cabe duda de que una mayor implicacin de
investigadores clnicos (hospitales) en el
desarrollo de estos protocolos, aportando
muestras, condiciones reales de ensayo y
adquiriendo experiencia en su manejo y
capacidades, es fundamental para la integracin
de esta nueva tecnologa, en la prctica
hospitalaria.
Adems, hay que tener en cuenta que, en funcin
del objetivo perseguido con la utilizacin de
microarrays o biochips de ADN, ya sea el anlisis
de la expresin gnica, la caracterizacin de
perfiles genticos, la farmacogenmica, el
diagnstico molecular o su inclusin en proyectos
de drug discovery, se necesita integrar la
informacin procedente de estos ensayos con
datos originados por otros mtodos de genmica
estructural, genmica funcional o de protemica.
En general, el anlisis de los perfiles de
transcripcin, aunque muy importante, no es
suficiente para explicar los cambios funcionales
observados en la clula. Adems, los niveles de
expresin de ARN detectados en el array deben
con frecuencia confirmarse con tcnicas
tradicionales complementarias, lo que supone una
labor adicional.
50
6. Conclusiones
Actualmente existen en Espaa grupos de
investigacin y empresas que bien fabrican
arrays, fabrican y ensayan con arrays, o
sencillamente ensayan con arrays, de manera
directa o indirecta, a travs de terceros. Todos
ellos parecen tener un problema comn: la
bioinformtica.
La bioinformtica, necesaria para almacenar y
procesar la informacin que se deriva de la
hibridacin del microarray, constituye actualmente
uno de los principales cuellos de botella para el
desarrollo de estos experimentos. Los resultados
obtenidos con microarrays y biochips de ADN se
deben procesar y correlacionar utilizando datos
almacenados de diversa manera en diversos
bancos de datos, y la ausencia de estandarizacin
hace muy difcil la aplicacin de programas
informticos universales. Adems, el software de
procesamiento de los datos experimentales se
disea expresamente para cada tipo de array y
las empresas lo comercializan junto con su
producto. Esto supone una desventaja a la hora
de combinar diferentes metodologas y
estandarizar los resultados de la comunidad
cientfica, lo que supone una de las principales
quejas de este colectivo. La necesidad de utilizar
procedimientos bioinformticos, que requieren
una alta dedicacin de personal especficamente
cualificado, hace recomendable la formacin y
ubicacin de personal bioinformtico en cada
grupo de investigacin o empresa, que planee
usar microarrays y biochips de ADN de forma
rutinaria. En este contexto, Genoma Espaa est
estudiando la puesta en marcha de un Centro
Virtual de Bioinformtica, con objeto de prestar
servicio a los proyectos de esta rea, as como
para desarrollar aplicaciones propias.
Otra importante observacin es el inters
creciente por dispositivos de deteccin porttiles
(Lab-on-a-Chip o LOAC), que pueden utilizarse
potencialmente para la mayora de las
aplicaciones de un microarray, aunque podran
ser ms adecuados cuando la deteccin porttil
y/o la rapidez sean una prioridad. En este
contexto, las nuevas tcnicas de deteccin no
basadas en el marcaje de las muestras, y que no
necesiten pasos previos de amplificacin del ADN
diana (presente en la muestra), permitirn en un
futuro desarrollar dispositivos porttiles, rpidos,
sensibles y fiables para el diagnstico molecular.
Adems, La utilizacin de sondas formadas por
oligos sintticos modificados de ADN (Por
ejemplo, PNAs) es otra de las ltimas tendencias
que proporcionan una mayor seal de
especificidad en la hibridacin.
Mientras que la microfludica es la tecnologa que
ha permitido el desarrollo de los Lab-on-a-Chip, la
microelectrnica y bioelectrnica han sido las
responsables de la elaboracin de nuevos
dispositivos que permiten un control total de los
procesos de diseo del chip, hibridacin y
deteccin. Precisamente la integracin de
disciplinas cientficas distintas, es decir, la
interdisciplinaridad de la investigacin en reas de
biologa, fsica e informtica, son los principales
motores en el desarrollo de las tecnologas de
microarrays y biochips de ADN, situacin sta que
sera deseable se produjera en Espaa.
La posibilidad de combinar la inmovilizacin de
protenas, ADN, e incluso ARN, en dispositivos
mixtos, es una de las opciones que barajan
tanto empresas como centros de investigacin.
Esto permitira ensayos simultneos en aquellos
casos en que la informacin proporcionada por la
hibridacin de ADN no fuera suficiente. Existen
todava muchos problemas respecto a la
optimizacin de las condiciones fsico-qumicas de
protenas y cidos nucleicos, y en al caso de ARN,
en cuanto a la estabilidad qumica del mismo.
La mayora de los laboratorios y empresas
usuarias de la tecnologa de microarrays ha
optado por no subcontratar parte de sus
actividades, en el desarrollo de sus
investigaciones. Tan slo el acceso a libreras y
sondas de ADN se constituyen como operaciones
externas, generalmente por razones de propiedad
intelectual. El tiempo empleado en la preparacin
de personal para la prctica de las diferentes
tcnicas ha compensado hasta el momento, tanto
a grupos de investigacin como a las empresas,
ya que prefieren tener el control de cada uno de
los procesos con el fin de mejorar su know-how.
Actualmente, el nmero de pequeas empresas
dedicadas al subsector del mercado de los
microarrays est proliferando, as como grandes
empresas que comienzan a ofrecer servicios
externos especializados, como valor aadido
debido a la experiencia que han ido adquiriendo
durante estos ltimos aos.
51
Farmacogenmica: estudio del impacto que
presentan las variaciones genticas en la
eficacia y toxicidad de los frmacos. Tambin se
define como el estudio de cmo el componente
gentico de un paciente determina la respuesta
frente a una terapia determinada. Esta
disciplina pretende predecir esta respuesta por
medio de informacin gentica y genmica,
haciendo posible una monitorizacin de los
ensayos clnicos y del proceso de desarrollo de
nuevos compuestos farmacuticos. La
farmacogenmica ser aplicada en el fututo con
el fin de eliminar el procedimiento de prueba-
error que normalmente se usa en los ensayos
clnicos con pacientes a la hora de buscar
aquellos frmacos que mejor se adapten a sus
necesidades y posean menores efectos
secundarios. La seleccin y exclusin de
pacientes proporcionar por tanto un criterio de
diferenciacin muy til en el desarrollo de
terapias individualizadas.
La farmacogenmica utiliza varias herramientas
que proporciona la gentica molecular:
Subtractive cloning, Differential display,
Expressed sequence tag (ETS) sequencing,
Serial analysis of gene expression (SAGE), y la
Hibridacin con microarrays de cDNA, que
supone una gran ventaja frente a las anteriores
en cuanto a su rapidez y alto rendimiento.
El trmino farmacogentica suele
intercambiarse a menudo con el
farmacogenmica, aunque el primero en
realidad es un trmino ms concreto que
consiste en el estudio de la respuesta a un
determinado frmaco como consecuencia de la
herencia gentica del paciente.
Genmica funcional: estudio de las relaciones
existentes entre genotipos particulares y
fenotipos especficos.
Farmacoprotemica: estudio de la
subclasificacin de pacientes en base al anlisis
de las protenas que expresan. Esta forma de
tipificacin de los pacientes es mucho ms
funcional que la que proporciona la
farmacogenmica, fundamentada en el
genotipado del individuo, que no incluye
efectos aadidos como las modificaciones
post-traduccionales.
Farmacoterapia: tratamiento de pacientes
basado en al anlisis gentico como medio de
diagnstico y clasificacin de patologas,
objetivo final de la farmacogenmica.
La farmacocintica puede definirse como el
enfoque cuantitativo del comportamiento de los
frmacos en el organismo, abarcando los
mecanismos por los cuales este ltimo influye
en la concentracin de stos, sea
introducindolos y distribuyndolos por el
sistema (absorcin y distribucin),
modificndolos (metabolismo,
biotransformacin) o desechndolos (excrecin).
La farmacodinmica, en contraste, incluye el
estudio de los efectos bioqumicos y fisiolgicos
de las drogas, as como el de sus mecanismos
de accin. Puede entenderse, entonces, que la
primera rama incluye lo que el organismo le
hace a la droga y la segunda, el efecto que el
frmaco tiene sobre el organismo.
Polimorfismos en enzimas responsables del
metabolismo de frmacos conllevarn por tanto
diferentes efectos farmacocinticos, mientras que
polimorfismos en receptores y otros efectores de
estos frmacos provocarn diversos efectos
farmacodinmicos en los pacientes. Estas
diferencias son el principio de la necesidad de
enfocar la medicina desde el punto de vista de la
farmacogenmica, en la cual la terapia se adapta
al paciente y no a la enfermedad.
53
ANEXO I
Breve glosario de trminos en genmica
54
TABLAS
Tabla 1. Criterios de clasificacin en Biochips
(adaptado de: Informacin sobre
biochips del ISCIII,
http://infobiochip.isciii.es).
Tabla 2. Mtodos de marcaje de ADN en
microarray para deteccin directas.
Tabla 3. Mtodos de marcaje de ADN en
microarrays para deteccin indirecta.
Tabla 4. Tipos de soportes utilizados en
microarrays y biochips de ADN.
Tabla 5. Ventajas y desventajas de soportes
utilizados en microarrays y biochips
de ADN.
Tabla 6. Inmovilizacin de ADN.
Tabla 7. Mtodos para la fabricacin de
microrrays y biochips.
Tabla 8. Relacin de las Empresas ms
relevantes dedicadas a la
comercializacin de Arrayers.
Tabla 9. Relacin de alguna de las Empresas
ms relevantes dedicadas a la
comercializacin de Escneres con
aplicacin en microarrays.
comercializacin de Software con
aplicacin en microarrays
(Fuente: Dr. Jos Mara Carazo).
comercializacin sondas con aplicacin
en microarrays.
Tabla 12. Tendencias para futuros desarrollos
tecnolgicos.
Tabla 13. Aplicaciones de microarrays y
biochips.
Tabla 14. Diferencias entre microarrays y
biochips.
Tabla 15. Desarrollo de chips para aplicaciones
en microbiologa.
Tabla 16. Usuarios de las Tecnologas de
Microarrays.
Tabla 17. Tendencias de implantacin de
microarrays en el Mercado. Adaptado
de Fronline Strategic Consulting,
Functional Genomics Report, A
Strategic Market Analysis (2002).
Tabla 18. Catlogo de productos y tecnologas
de Affymetrix.
Tabla 19. Catlogo de productos y tecnologas
de Corning Life Sciences (Fuente:
Corning Life Sciences).
CUADROS
Cuadro 1. Definicin de microarray o biochip.
Cuadro 2. ltimas tendencias en deteccin de la
hibridacin de ADN en Biochips.
Cuadro 3. Terminologa de empresas que
fabrican chips.
Cuadro 4. Aplicaciones derivadas del anlisis de
la expresin gnica.
Cuadro 5. Etapas en el descubrimiento de nuevos
frmacos.
Cuadro 6. Objetivos de la utilizacin de
microarrays de ADN en el proceso de
descubrimiento y desarrollo de
nuevos frmacos.
Cuadro 7. Proveedores de arrays de baja y
media densidad.
FIGURAS
Fig.1. Operaciones y tecnologas necesarias
para la elaboracin de microarrays y
biochips de ADN.
Fig.2. Proceso de fabricacin y utilizacin de un
microarray o biochip de ADN.
Fig.3. Herramientas y estrategias utilizadas para
el desarrollo de terapias contra el cncer.
Fig.4. Comparacin de las densidades de los
arrays producidos por diferentes
compaas en el ao 2000.
Fig.5. Estimacin del mercado de Microarrays y
Biochips.
ANEXO II
ndice de Tablas, Cuadros y Figuras
Nota: Las Tablas, Cuadros y Figuras que no indican fuente de informacin son de elaboracin propia.
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28020 Madrid
Telfono: 91 449 12 50
Fax: 91 571 54 89
www.gen-es.org

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