BETANINAS

Materiales:
Erlenmeyer de 250mL
Vaso precipitado de 50mL
Embudos de vidrio
Beakers de 500mL, 250mL y 100mL
Pipetas de 1mL, 2mL, 5mL, 10mL
Placas Petri
Termmetro !asta 150"#
Ba$uetas
Probetas de 100mL y 250mL
Tubos de 10mL
%icropipetas de &100 ' 1000uL(, con tips
Pin)as
Reactivos:
*cido #+trico 0,1%
-os.ato *cido de /odio 0,2 % &0a
2
1P2
3
,21
2
2(
Determinacin de Contenido de Betanina:
4%5todo reportado por la -*2 &1672( y #ai y #orke &2000(,8
9isolver una cantidad de e:tracto en tampn acido c+trico ' .os.ato de %c ;llvaine &p1
5,<( y diluir a un volumen conveniente &1:100 ayrampo, 1:50 beterra$a( para obtener
una absorbancia comprendida entre 0,2 y 0,7, #entri.u$ar la solucin si es necesario o
.iltrar al vac+o con papel de paso r=pido y medir la absorbancia usando como blanco
1
2
2 destilada,
La intensidad del color esta calculada sobre la base de absorcin m=:ima a &5>?nm(, en
donde se encuentran todas las sustancias colorantes ro@as,
Betanina &A( B *
5>?
: V : -9
E
1A
1cm
: L : C
Donde: * : %a:ima *bsorbancia,
V : Volumen de la solucion del ensayo medido en ml,
-9 : -actor de dilucion,
L : Lon$itud de cela medida en cm &1cm(,
E
1A
1cm
: 1120 &Piatelli y col., 16<6 citado por #ai y #orke, 2000(,
C : Peso de la muestra tomada en el ensayo en $r,
Para expresar en base seca:
Betanina &A, bs(: Betanina &A( : 1Dms,
9onde:ms: %ateria seca en $r,
ANTCIANINAS TTA!ES "ACNs#
Extraccin $ c%anti&icacin de antocianinas en medios alco'licos(
La e:traccin y cuanti.icacin en medios alco!licos se reali)o si$uiendo la
metodolo$+a reportada por -uleki y -rancis &16<7(, El procedimiento es el si$uiente:
1, /e pesa 25$r, de c=scara de camote &P( .resca y se licua con 50mL de una
solucin de e:traccin Eue consiste en 1#L 1,5 0 : Etanol 6<A &15:75(,
2, /e trasvasa el licuado a un erlenmeyer, se lava el vaso de la licuadora con 50mL
de la solucin de e:traccin, se trasvasa al mismos erlenmeyer y se de@a macerar
por 17 ' 23 !oras, En oscuridad de 3 ' 7 "# ,
>, Lue$o se .iltra la muestra con papel de paso r=pido, se en@u$a el erlenmeter y el
.iltro con la solucin de e:traccin y se enrasa a 200mL &V1(,
3, /e e:trae una al+cuota &.1( y se enrasa con la solucin de e:traccin a un
volumen conocido &.2(,
5, /e !ace un blanco en el espectro.otmetro con la solucin de e:traccin como
blanco,
<, /e $uarda en oscuridad durante >0 minutos y lue$o se lee la absorbancia a 5>5
nm y a ?00nm, /e determina la di.erencia entre las dos absorbancias,
* B *
5>5nm
F *
?00nm
?, Las absorbancias obtenidas no debe ser superiores a 0,?,
El contenido de Antocianinas Totales se expresa de la si)%iente manera:
*#0s &m$D100$ b!( B * : P% : V1 : .2 : 100
.1 : P : G : L
9onde G es la absortividad molar para la cianidina >F$lucsido en medio
alco!licoFacido &GB20631 Lmol
1
cm
F1
(, y P% es el peso molecular de la
cianidina >F$lucsido &P% B 336,2 $rDmol(
L: Lon$itud de cela medida en cm &1cm(,
Para productos secos pesar 2,5$r,
DETERMINACIN DE ANTCIANINAS MNMERICAS
&Hiusti, %,I Crolstad, J,, #urrent Protocols in -ood *nalytical #!emistry, 2001(
Materiales $ Reactivos:
E:tractos de muestra
Bu..er #loruro de Potasio 0,025% p1 1,0
Bu..er *cetato de /odio 0,3 % p1 3
*$ua destilada
E*%ipos:
Balan)a *nal+tica
%icropipetas
Espectro.otometro
Procedimiento experimental:
1, Preparar las soluciones tampon:
a, Para el bu..er cloruro de potasio &p1( me)clar 1,7< $r de K#l y 670 mL
de a$ua destilada en un vaso de precipitado, %edir el p1 y a@ustar a 1
con 1#l concentrado, Trans.erir a una .iola de 1 L y enrasar con a$ua
destilada !asta completar,
b, Para el bu..er acetato de sodio &p1 3(, me)clar 53,3> $r de
#1
>
#2
2
0a,>,1
2
2 y 6<0 mL de a$ua destilada en un vaso de precipitado
y a@ustar a p1 3,5 con 1#l, Trans.erir a una .iola de 1 L y enrasar con
a$ua destilada,
2, 1acer autocero con a$ua destilada a lon$itudes de onda en las Eue se leer=,
&LB 520 ' ?00nm,(,
>, Preparas diluciones &m=:imo 1D10( de la muestra con un p1 1 y otra con p1 3,5I
considerando las repeticiones convenientes con la precisin deseada, *$itar,
3, 9e@ar eEuilibrar las soluciones por 15 minutos, Todas la diluciones deben
medirse lue$o de 15 ' <0 minutos de e.ectuada la me)cla, periodos de tiempo
m=s lar$os producen un incremento en la absorbancia,
5, Las muestras deben estar limpias, no turbias, no contener sedimentos o
part+culas en suspensin,
<, %edir la absorbancia de las diluciones a lon$itud de onda m=:ima de absorcin
LB 520nm y ?00nm para corre$ir el contenido de inter.erencias o nubosidad,
Calc%lo:
La absorbancia de la muestra se calcula se$Mn la ecuacin:
A + "A
, -./nm
0 A
, 1//nm
#
p23(/
4 "A
, -./nm
0 A
, 1//nm
#
p25(-
#alcular el contenido de antocianinas se$Mn la si$uiente relacin:
#ontenido de antocianinas &m$DL( B "A6PM67D63///#
"G 63#
NNN El P% y el G corresponden a la antocianina predominante en la muestra, El G debe
corresponder al coe.iciente de e:tincin de la antocianina en solucin acuosa
acidi.icada, /i no est= disponible o la composicin de la muestra es desconoc+a calcular
considerando la cianidinaF>F$lucosido como pi$mento predominante, con un P% B
336,2 y un G B 2<,6000,
DETERMINACIN DE !A ACTI8IDAD ANTI9IDANTE TEAC
"ABTS#
Reactivos:
/olucin madre: %e)clar en cantidades eEuivalentes * y B, 12 !oras antes de su
empleo,
o Para preparar el reactivo *: 9isolver ?7,3 m$ de *BT/ en una .iola de
10 mL y enrasar con a$ua destilada, *lmacenar en oscuridad y
temperatura ambiente, Vi$encia 5 d+as,
o Para preparar el reactivo B: 9isolver 1>,2 m$ de Persul.ato de potasio en
una .iola de 10 mL y enrasar con a$ua destilada, *lmacenar en oscuridad
y temperatura ambiente,
/olucin diluida de *BT/: 9isolver la solucin madre de *BT/ con
metanolDetanol !asta una absorbancia de 1,1 O 0,02, &Vi$encia 3 !oras(,
%etanol,
E*%ipos:
Balan)a analitica
%icropipetas
Espectro.otometro
Procedimiento Experimental
1, Psar tubo prote$idos de lu) y con tapas !erm5tica, #olocar una al+cuota de 150
QL del e:tracto y me)clar con 2750 QL de la solucin diluida de *BT/,
2, 9e@ar reaccionar la muestra y el blanco por el tiempo de reaccin determinado
e:perimentalmente para cada muestra,
>, #olocar el espectro.otmetro en cero utili)ando metanol a ?>3 nm,
3, Leer la absorbancia de las muestras y el blanco,
Calc%lo:
#alcular la disminucin de la absorbancia de la si$uiente manera:
: ABTS + ABTS
b
0 "A
, 11;5nm
m%estra#
Donde:
: ABTS + 8ariacin de la absorbancia debido a los antio:idantes,
ABTS
b
+ *bsorbancia del blanco,
66 El blanco se prepara reemplan)ando la muestra por metanolDetanol,
666 Estimar la actividad antio:idante como eEuivalente Trolo: usando la curva
est=ndar del espectro en uso,
#urva Est=ndar *BT/ &Trolo:(
Concentracin (mol
de Trolox/ml)
Abs 1 Abs 2 Promedio
0.599 0.108 0.09 0.8!2
0."99 0."9" 0."81 0.5
0.200 0.!5 0.!! 0.289
0.100 0.8"0 0.82! 0.1"!
0.050 0.902 0.90# 0.0!1
0.025 0.9"8 0.9"9 0.02!
0.010 0.955 0.955 0.009
DETERMINACIN DE A<=CARES RED=CTRES: M>todo de
Miller "3?-?#(
Extraccin: &usar el m5todo de e:traccin de -2/, traba@ar con 1$r de muestra seca o
10 $r de muestra .resca,
/e pesa 10$r, de muestra .resca, adicionan 100 mL de 21 ?0A y se a$ita
durante 10 minutos a temperatura de ambiente, centri.u$ar a 3000rpm por 15
minutos, Jecuperar /obrenadante &/1(,
*l Pellet a$re$arle 100 mL de 21 ?0A y se a$ita durante 10 minutos a
temperatura de ambiente, centri.u$ar a 3000rpm por 15 minutos, Jecuperar de la
misma manera !asta obtener /obrenadante &/2 y />(,
/1 R /2 R /> -iltrarlos y concentrarlos a una temperatura de <0S# o <5S#,
Jecuperar a 25 mL y con$elar,
Preparacin de sol%cin de acido dinitrosalicilico "DNS#:
1, En un vaso adicionar 70 mL de a$ua destilada,
2, *dicionar 1,1 $r de 0a21 y disolver con la ayuda de un a$itador ma$n5tico,
>, *dicionar 1$r de 90/,
3, *dicionar 0,2$r de .enol,
5, Enrasar a 100 mL en .iola,
<, %antener la solucin en .rio m=:imo 15 d+as,
Preparacin de sol%cin de sal de Roc'elle:
1, En un vaso con 30mL de a$ua destilada,
2, *dicionar 20$r de sal de Joc!elle,
>, 9isolver y enrasar a 50 mL en .iola,
3, %antener la solucin en re.ri$eracin &dura m=s de dos meses(,
Reaccion: &antes de usa la solucin de 90/ se le a$re$a una peEueTa cantidad de
bisul.ito con ayuda de una punta de esp=tula muy .ina(
1, * > mL de acido dinitrosalicilico &90/( conteniendo bisul.ito de socio se le
aTade 0,5 mL de solucin a anali)ar,
2, /e lleva la solucin a 100S# por 5 minutos,
>, La reaccin es detenida adicionando 1 mL de sal de Joc!elle y 10 mL de a$ua
destilada,
3, %e)clar intensamente,
5, Las mediciones son reali)adas a una densidad ptica de 550nm,
La cantidad de a)ucares reductores ser= determinada sobre una curva est=ndar de 9F
$lucosa 9F.ructosa de 2 a 20 m% &50, 100, 150, 200, >00 m$D100 mL(

ANA!ISIS DE A<=CARES PR T!C "CRMAT@RADIA DE
CAPA 7INA#
"Toba A Adac'iB Co%rnal o& C'romato)rap'$B 3?1D#
Permite la deteccin de mono y oli$osacaridos,
2tor$a un amplio ran$o de colores se$Mn la estructura,
Permite distin$ue entre enlaces 1F3 y 1F< en los disac=ridos, Tambi5n reconoce los 1F2
en disac=ridos reductores,
Reactivos $ materiales:
9**P &dip!eniylamineFp!osporic acid(: 9isolver 3 $r de dip!eylamine en 3 mL
de anilina en 200 mL de acetona, %e)clar la solucin con 20 mL de acido
.os.rico,
/oluciones de a)ucares al 2A
-ase movil: PJopanol:*$ua &75:15, vDv(
Placas de silica $el
E*%ipos
%icropipetas o pipeta pasteur
#uba cromato$ra.ica
Estu.a
Pulveri)ador
Procedimiento Experimental
1, 9ibu@ar una l+nea base a 1,5cm del e:tremo in.erior de la placa, /embrar
al+cuotas de las soluciones est=ndar y muestras,
2, introducir en la cuba !erm5tica con el solvente a 0,5cm de la l+nea base,
>, cuando alcan)a la altura deseada, sacar el cromato$rama de la cuba,
3, de@ar seca a temperatura ambiente, /e es necesario reali)ar doble recorrido
5, para revelar el cromato$rama aplicar el reactivo 9**P con un pulveri)ador o
sumer$i5ndolo en una bande@a,
<, secar a 70"# en una estu.a por 15 minutos,
Identi&icacin
/e usa la constante conocida como Jelacin de .rente &J.( para identi.icar un
compuesto, ya Eue el despla)amiento de una sustancia respecto al disolvente es
constante y caracter+stico de ella, 9ebido a Eue las concentraciones e:perimentales
var+an considerablemente la J- es necesario reali)ar la cromato$ra.+a al patrn de
manera simult=neo,
DETERMINACIN DE CMP=ESTS 7EN!ITS TTA!ES
(Singleton, V.L. & Rosi, J.A. 1965, Am J. Enol. Vitic.)
Reactivos
#arbonato de socio &?5$DL(
-olin #;ocateau 10 &Vi$encia: 1 dia(
*$ua destilada
/olucin bu..er p1 ?,0 &PB/(, Ptili)ar en caso de Eue las muestras sean
e:cesivamente acidas,
E*%ipos
Balan)a anal+tica
%icropipetas
Espectro.otmetro
Preparacin de la m%estra
La muestra ser= e:tra+da tomando en consideracin las me@ores condiciones de
e:traccin, Pn probable solvente a emplear es el %e21 al 70A, Los e:tractos se
$uardan ba@o nitr$eno y a F20"#,
Procedimiento experimental
1, Jeali)ar diluciones de los e:tractos brutos en el .actor necesario para Eue la
absorbancia se encuentre en el ran$o de la cura est=ndar
2, en tubos de prueba &prote$ido de la lu)( colocar 500UL de reactivo -olin
#iocalteau 10 y 1250 UL de la solucin de carbonato de sodio
>, !omo$eni)ar la me)cla en un vorte:
3, de@ar reposar por espacio de >0 minutos en oscuridad
5, leer absorbancia a la lon$itud de onda ?55nm, NN
<, la prueba se reali)a por triplicado
NN /e correr= un blanco empleando 500UL de a$ua destilada en lu$ar de
muestra,
Calc%lo
El contenido de .enolitos totales se calcula con la curva est=ndar del espectro en uso,
C%rva estEndar de &enolitos
Est=ndar: *cido Halico
#oncentracin de solucin madre: 1,15< m$DmL,
#oncentracin de soluciones de 0,03<2 ' 0,1736m$DL,
F + /(/;19 4 /(//3;
C%rva EstEndar de Comp%estos 7enolicos
Concentracin
(mg/ml)
Abs 1 Abs 2 Promedio
0.005 0.0!5 0.00 0.0!8
0.009 0.189 0.192 0.191
0.01# 0."2# 0."19 0."22
0.018 0.#5 0.#5! 0.#5
0.02" 0.590 0.589 0.590
0.028 0.1# 0.0! 0.10
0.0"2 0.8"5 0.8"0 0.8""
0.0" 0.955 0.95# 0.955
DETERMINACIN DE 7!A8AN!ES
Reactivos
9%#* &vi$encia ? dias en re.ri$eracin y oscuridad(, 9isolver 250 m$ de
9350< pFdymet!ylaminocinnamalde!yde en un me)cla previamente en.riada de
125 ml de 1#l concentrado y >50 ml de %e21, Pna ves disuelto enra)ar a 500
ml con %e21,
*$ua destilada 0,5A 1#l
E*%ipos
Balan)a anal+tica
%icropipeta
Espectro.otmetro
Preparacin de la m%estra
1, Pesar apro:imadamente 2 $ de muestra .resca a 0,5 $ de muestra lio.ili)ada o
seca, con una apro:imacin de 0,0001 $ y adicionar 10 ml de una solucin .r+a
de acetona:a$ua &?0:>0( o el solvente optimi)ado para la e:traccin,
2, 1omo$eni)ar r=pidamente en caso de tratarse de un material .resco &utili)ar el
ultraturra:( o me)clar en un vorte: en caso de tratarse de un material seco,
>, ;nyectar nitr$eno en el espaciod cabe)a por el espacio de >0 a <0 se$undos
lue$o cerrar y mantener en a$itacin por una !ora,
3, #entri.u$ar por 20 minutos a 3000rpm,
5, #onservar el sobrenadante en re.ri$eracin y en oscuridad,
<, E:traer la torta residual por se$unda ve) con 10 ml de solvente, /e repiten los
pasos > y 3,
?, %e)clar los sobrenadantes y concentrar al vacio a una temperatura no mayor de
30S#, El volumen .inal del e:tracto ser= apro:imadamente entre el 20 al >0A del
e:tracto puesto a concentrar,
7, Pesar los e:tractos obtenidos y almacenar en con$elacin !asta su an=lisis
respectivo,
Procedimiento experimental
1, Jeali)ar diluciones de los e:tractos brutos en el .actor necesario para Eue la
absorbancia se encuentre en el ran$o de la curva est=ndar,
2, En tubos de prueba &prote$idos de la lu)( colocar 200 QL de e:tracto de muestra
diluida y lue$o adicionar 1000 QL del reactivo de 9%#*
>, 1omo$eni)ar la me)cla en un vorte:,
3, La lectura es inmediata &<30nmNN(, *notar el valor m=:imo de la absorbancia
&el tiempo es de pr:imamente 2 minutos lue$o de reali)arse la me)cla pero
var+a se$Mn la muestra(,
5, La prueba se reali)a por triplicado,
<, NN/e correr= un blanco empleando 200 QL a$ua destilada acidulada con 1#l al
0,5A en lu$ar de la muestra,
Calc%lo
El contenido de .lavanoles se calcula con la curva est=ndar del espectro en uso &Limites
de absorbancia entre 0,1 y 0,6(
C%rva EstEndar de 7lavanoles
Concentra
cin
Abs 1 Abs 2 Abs 3 Promedio
0.00" 0.089 0.091 0.08 0.089
0.00! 0.218 0.210 0.205 0.211
0.012 0.#"5 0.#20 0.#2" 0.#2!
0.019 0.!2" 0.599 0.!20 0.!1#
0.025 0.80 0.5 0.#5 0.!1
0.0"1 0.9"8 0.9#9 0.951 0.9#!
DETERMINACIGN DE 7!A8N!ES
Reactivos
Etanol 70A
Etanol 6<A
#loruro de aluminio al 10A &vi$encia de 1 semana .rasco !erm5tico y .rio(
*cetato de potasio 1% &vi$encia de 1 semana, .rasco !erm5tico y .rio(
E*%ipos
Balan)a anal+tica
%icropipeta
Espectro.otometro
Preparacin de m%estra
1, Pesar apro:imadamente 1 $ de muestra .resca o entre 0,1 a 0,5 $, de estar
lio.ili)ada o seca con una apro:imacin de 0,0001 $ y adicionar 10 y 15 mL de
una solucin para la e:traccin,
2, 1omo$eni)ar r=pidamente en caso de tratarse de un material .resco &utili)ar el
ultraturra:( o me)clar en un vorte: en caso de tratarse de un material seco, Esta
operacin se !ar= en un tubo .alcn de capacidad adecuada,
>, ;nyectar nitr$eno en el espacio de cabe)a &por espacio de >0 a <0 se$undos(,
lue$o cerrar y mantener en a$itacin por una !ora,
3, #entri.u$ar por 20 minutos a 3000 rpm,
5, #onservar el sobrenadante en re.ri$eracin y oscuridad,
<, E:traer la torta residual por se$unda ve) con 10 a 15 mL de solvente, /e repiten
los pasos > y 3,
?, %e)clar los sobrenadantes y concentrar al vacio a una temperatura no mayor a
30S#, El volumen .inal del e:tracto ser= apro:imadamente entre el 20 al >0A del
e:tracto puesto a concentrar,
7, Pesar los e:tractos obtenidos y almacenar en con$elacin !asta su an=lisis
respectivo,
Procedimiento experimental
1, Jeali)ar diluciones de los e:tractos brutos en el .actor necesario para Eue la
absorbancia se encuentre en el ran$o de la curva est=ndar,
2, En tubos de prueba &prote$idos de la lu)( colocar 250 QL de e:tracto de muestra
diluida, ?50 QL de etanol al 6<A, 50 QL de cloruro de aluminio y 50 QL de
acetato de potasio y lue$o adicionar 1300 QL de a$ua destilada,
>, 1omo$eni)ar la me)cla en un vorte:,
3, Jeposar por espacio de >0 min en oscuridad,
5, La lectura se reali)a a 315nmNN y se anota el valor m=:imo de la absorbancia &el
tiempo es apro:imadamente 2 min lue$o de reali)arse la me)cla, paro varia
se$Mn a muestra(,
<, La prueba se reali)a por triplicado,
?, NN/e correra un blanco para cada muestra reempla)ando el cloruro de aluminio
por 50 QL de a$ua destilada, Las diluciones de las muestras se reali)an en etanol
al 70A,
Calc%lo
El contenido de .lavanoles se calcula con la curva est=ndar del espectro en uso &Limites
entre 0,1 y 0,?(
C%rva EstEndar de 7lavonoles
Concentraci
n
Abs 1 Abs 2 Abs 2
BLANC
O
Promedi
o
0.010 0.10! 0.109 0.0" 0.0" 0.02"
0.020 0.10 0.12 0.1# 0.1"# 0.0"8
0.0#1 0.292 0.298 0.298 0.1#2 0.15#
0.0!1 0.#1! 0.#19 0.#15 0.182 0.2"5
0.082 0.5#2 0.55 0.5!0 0.2"! 0."1
0.102 0.00 0.!99 0.!98 0.282 0.#1
0.122 0.80" 0.829 0.80# 0."28 0.#8#
0.1#" 0.9## 0.9!8 0.9!2 0."8 0.580
E9TRACCIN DE ANTCIANINAS PR 2P!C
Materiales:
Vaso precipitado
Erlenmeyer de 250mL
Tubos tapa rosca de 25mL
%icropipeta de 100F1000mL
Reactivos:
%etanol 70A1PL# 0,01A1#L
1#L&20(
Procedimiento
/,E, %e21 70A0,01A& materia prima:
solvente 1D10(
/
1 R
/
2
&concentrar 30"#(
#entri.u$ar 3000 por 20 min /
1
*$itar 11ora
Jecuperar 1
2
2 milli V
1PL#
Pellet e:traer 1D50 y a$itar >0 min
1idroli)ar N2! &1#L20(
*$itar >0 min
#entri.u$ar 3000 por 20 min /
2
E9TRACCIN DE CMP=ESTS 7EN!ICS PR 2P!C
Materiales:
Vaso precipitado
Erlenmeyer de 250mL
-alcon de 50 mL
%icropipeta de 100F1000mL
F
Reactivos:
%etanol 70A1PL#
Procedimiento
/,E, %e21 70A & materia prima:
solvente 1D10(
/
1 R
/
2
&concentrar 30"#(
#entri.u$ar 3000 por 20 min /
1
*$itar 11ora
Jecuperar %e21 100A
1PL#
Pellet e:traer 1D50 y a$itar >0 min
*$itar >0 min
#entri.u$ar 3000 por 20 min /
2
!ACTSA EN !EC2E
Preparacin de la m%estra
2,5mL de lec!e, enra)ar a 25 mL con a$ua milli V,
Tomar 5mL, enra)ar a 10mL con acetonitrilo al 100A, de@ar reposar
apro:imadamente por 30 min, a 3" #,
#entri.u$ar a 1>000rpm N 10 min,
-iltrar 1PL#,
Para 'plc:
#olumna J#%
Temperatura <5" #,
-lu@o 0,3mLDmin,
-ase mvil *$ua milli V
#urva est=ndar Lactosa *n!idra 0,01A,0,1A,0,2A &disuelta en acetonitrilo
50A(,
DETERMINACIGN DE ESTE8ISIDS
Materiales:
Vaso precipitado
Erlenmeyer de 500mL
Pipeta de 10 mL
%icropipeta de 100F1000mL
Procedimiento:
Pesar 1,5$r de !o@as de estevia &seca(
*dicionar 100mL de a$ua milliV,
*$itar por espacio de >0min a ?0" # y centri.u$ar a 3000rpm por 15 min &/
1
(,
JeFe:traer con 60mL de a$ua milli V
*$itar por espacio de >0 min a ?0 " # y centri.u$ar a 3000rpm por 15min&/2(,
-iltrar &/
1
R /
2
( y enra)ar a 200mL con a$ua milli V,
Para 2P!C:
#olumna /!ode:
Temperatura >0" #,
-lu@o 1mLDmin,
-ase mvil *cetonitrilo 70A P1 5 &*cido acetico(
#urva est=ndar JEbaudiosido, Esteviosido,
DETERMINACIGN DE @A!TATINS 2IDR!I<AB!ES CN
R2DANINE
Procedimiento:
Pesar 100$r de %uestra Lio.ili)ada, adicionar 1 mL de *cetona a ?0A y )oni.icar
por >0 min, * 3"#,
El e:tracto .iltrar al vac+o, lavar el .iltrado con 1
2
/2
3
20,
#on$elar la muestra con 0itr$eno LiEuido &iceFisopropanol(, sellar los tubos al
vac+o,
#alentar o !idroli)ar por un tiempo de 2< !oras a 100"#, pasado esto abrir los tubos
y tran.erir a una probeta $raduada, diluir !asta 50 mL con 1
2
2 destilada,
Tomar 1 mL de la muestra !idroli)ada y a$re$arle 1,5 mL de J!odanine al 0,<<?A
&%e21(, reposar 5 min, Lue$o a$re$ar 1 mL de K21 0,50 y reposar 2,5 min,
*$re$ar 1
2
2 destilada !asta 25 mL, despu5s de 5 ' 10 min leer a 520nm,
Jeali)ar el blanco usando el %e21 100A en lu$ar de la muestra,
Ec%acion de c%rva :
W B <,1<>1X ' 0,026
AHalotaninos B *bs R 0,026 : -9 : 50
<,1<>1
ANA!ISIS DE @!=CSIN!ATS
"M>todo descrito por 8erHerH et al( .//3 con li)eras modi&icaciones#
Extraccin
El producto .resco o seco debe ser sometido a un tratamiento con nitr$eno l+Euido
para evitar la !idrlisis de los $lucosinolatos por la en)ima mirosinasa, /i se trata de
muestra .resca, esta puede ser lio.ili)ada para su .=cil conservacin y mane@o,
Pesar dos $ramos de producto .resco con$elado y molido en nitr$eno l+Euido o un
$ramo de producto seco con$elado en nitr$eno l+Euido y molido o un $ramo de
muestra lio.ili)ada en tubo -alcon de 50 ml,, a$re$ar 25 ml, de metanol caliente al
?0A a ?5
0
#, me)clar cuidadosamente e incubar en baTo mar+a a ?5
0
# por >0
minutos, durante este tiempo re$ularmente me)clar varias veces, #entri.u$ar a 3000
rpm por 10 minutos y colocar el sobrenadante en otro tubo -alcon, *l sedimentado
a$re$arle nuevamente 15 de metanol caliente al ?0A a ?5
0
# e incubarla por >0
minutos y nuevamente re$ularmente me)clar durante este tiempo, #entri.u$ar a
3000 rpm por 10 minutos y colocar el sobrenadante en el tubo -alcon Eue contiene
el anterior sobrenadanteI me)clar los sobrenadantes,
P%ri&icacin $ des%l&atacin
Preparar una mini columna con 9E*E /ep!ade: *F25 20 m$D25 m$ !asta
apro:imadamente una altura de 1,5 cm,, evitar la .ormacin de burbu@as, La
velocidad de .lu@o de los .luidos a a$re$ar deben ser los m=s lentos posibles y por
simple $ravedad, Lavar la columna dos veces con un ml, de a$ua millipore, lue$o
adicionar dos ml, del e:tracto de $lucosinolatos, se$uidamente lavar dos veces con
un ml, de 20 m% de acetato de sodio a p1 5,5 y a$re$ar 100 Ql de la en)ima
sul.atasa previamente preparada, ;ncubar durante una noc!e a temperatura ambiente
&por lo menos 1< !oras(, *l d+a si$uiente proceder a la elusin de los
desul.o$lucosinolatos con a$ua millipore, recepcionar el elu+do en un -alcon
$raduado en una cantidad de 3 ml, -iltrar el elu+do, utili)ando un .iltro de 0,35Qm
&1> mm,(,
AnElisis De 2P!C
1PL# 0ova Pak #17 &5Qm( .ase reversa columna &>,6 mm:156 mmICaters
#orpn,%il.ord,%*,P/* detector PV a L de 226 nm, velocidad de .lu@o de 1
mlDmin, La elusin de los desul.o$lucosinolatos se reali)a en una .ase de *$ua y
*cetonitrilo con un sistema $radiente de *$ua &*( y *cetonitrilo&20(D*$ua&70(,
vDv&B(, Tiempo total de corrida >1 minutos y cambios en la $radiente de la .ase
mvil: 1 minuto 100A *$ua &*(D 0A *cetonitriloD*$ua &B(, 20 minutos 0A *$ua
&*(D100A *cetonitriloD*$ua &B(, 5 minutos 100A *$ua &*(D 0A *cetonitriloD*$ua
&B(, despu5s de Eue la columna .ue eEuilibrada con 100A * y 0A B por 5 minutos,
Ptili)ar un detector PV de lon$itud de onda de 226 nm
P=RI7ICACIGN DE !A EN<IMA S=!7ATASA
In&ormacin: /ul.atasa type 1F1 .rom 1eli: pomatia &si$maFs6<2< ' 10,000 P(
Pesar ?00 m$, 9e /ul.atasa
cruda tipo 1F1,
Disolver en >0 ml, 9e a$ua desioni)ada,
evitar .ormacin de espuma,
MeIclar con >0 ml, de
etanol absoluto,
Centri&%)ar a 3000 JP%
por 20 min,
/obrenadante Precipitado
Adicionar 60 ml, de etanol
absoluto
Centri&%)ar a >500 JP%
por 15 min,
/obrenadante
Precipitado
Disolver el pptdo en 25 ml,
de a$ua desioni)ada
Dividir la en)ima precipitada en viales de
pl=stico de 1 ml, con tapa,
DETERMINACIN DE INDICE DE PER9ID
Preparacin de la m%estra
En un vaso de 250mL colocar 200mL de aceite lue$o adicionar el antio:idante,
natural &compuestos .enolitos( o sint5ticos &B1T !idro:itolueno butirato( a una
concentracin de 0,02A &30m$(,
9ividir el aceito con el antio:idante en vasos de precipitado de 50mL, someter los
vasos a di.erentes .actores como lu), calor, catali)adores inor$=nico, se estima los
e.ectos de cada uno de los .actores aplicado y del testi$o mediante la medicion de
indice de pero:ido, &*2*# 2.icial meted 1660(,
Procedimiento de anElisis
Pesar 5$r de muestra en un erlenmeyer de 250mL con tapn esmerilado, aTadirle
>0mL de solucin de acido ac5tico ' cloro.ormo lo cual debe prepararse en relacin
>,2, a$itar para disolver la muestra,
*Tadir 0,5mL de solucin saturada de K; &yoduro de potasio( a$itar la solucin por
espacio de 1 min lue$o aTadir >0mL de a$ua destilada, titular el yodo liberado con
0a
2
/
2
2
>
&tiosul.ato de sodio( 0,1 0 a$itando vi$orosamente !asta la total
desaparicin del color amarillo de la solucin causada por la liberacin del yodo,
lue$o adicionar 1 mL de almidn soluble al 0,1A continuar con la titilacin,
a$itando !asta Eue desapare)ca el color a)ul de la solucin causado por el indicador,
9el mismo modo Eue se traba@o con las muestras, llevamos a cabo una
determinacin de blanco en ausencia de muestra y utili)ando todo los reactivos antes
mencionados el $asto no debe pasar de 0,1mL de 0a
2
/
2
2
>
0,1 0,
El c=lculo se reali)a utili)ando la si$uiente ecuacin,
ndice de peroxido = (G-B) x N x 1000
W
Donde:
@ + mL de 0a
2
/
2
2
>
$astados para titular la muestra
B + mL de 0a
2
/
2
2
>
$astados para titular el blanco
N + 0ormalidad de la solucion de 0a
2
/
2
2
>
utili)ado
J + Peso de la muestra
Almacenar a F20S#
DETERMINACIGN F C=ANTI7ICACIGN DE 7S
Reactivos:
*cetato de sodio
*cido ac5tico
21 ?0 A
Materiales:
Erlenmeyer de 250 mL
Pipetas de 5 mL
-alcn de 50 mL
Vaso precipitado
Tubos de ensayo de 15 mL #Dtapa
-rascos
Hradilla
E*%ipos
#ocina
#entri.u$a
P1Fmetro
BaTo %ar+a
Extraccin de m%estra para 7os
Pesar 5 $r, de muestra, diluir con 100 m L &/, E,(, re$ular P1 entre <F? con 0a
21 0,10,
/ometer a un primer tratamiento termico 100"# por 10 min, lue$o centri.u$ar la
muestra a 3000rpm por 15 min,&/
1
( , lavar la torta restante con ?5 m L del /, E:,
/ometer a un se$undo tratamiento termico a 100" # por 10 min, #entri.u$ar a
3000rpm por 15 min, &/
2
(, Lavar la torta restante con ?5 mL del /,E,
/ometer a un tercer tratamiento t5rmico a 100" # por 10 min, #entri.u$ar a
3000 rpm por 15 min, &/
>
(,
Yuntar & /
1
/
2
/
>
(, concentrar a <0" #, enra)ar a 50mL,
Preparacin de enIimas
En)ima activada: 200ul en)ima inulinasaR6,7 mL ba..er *cetato de sadio
En)ima inactivada: #o$er 5mL de en)ima activada y someter a 100"# por 5
min,
Preparacin par los e:tractos para 1PL#
1,FE:tracto 1idroli)ado: 2,6mL de e:tracto R 0,1mL de en)ima activada,
2,FE:tracto no 1idroli)ado: 2,6mL de e:tracto R 0,1mL de en)ima inactivada,
>,FBlanco: 2,6mL de 1
2
2 destilada R 0,1mL de en)ima activada,
Llevar 1, 2 , > a <0"# por > !oras,
#alculos:
HT B &H1FHiF/ (N&50DZmtra(
0,6 0,6 1,6