24/04/2014

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Engenharia Bioqumica
Prof. Marlia Magalhes Gonalves
Universidade Federal de So Joo Del Rei
Enzimas e Cintica
Enzimtica
Enzimas
As enzimas so protenas globulares que
funcionamcomo catalisadores biolgicos
Encontradas em animais, vegetais e nos
microrganismos
Viabilizam as atividades das clulas,
quebrando molculas e juntando-as para
formar novos compostos
Enzimas
Apresentam elevado grau de especificidade
com o subtrato sobre o qual atuam
Algumas enzimas so especficas para
determinado tipo de ligao qumica, outras
para um tipo particular de ismero ptico
Toda enzima uma protena, mas nem toda
protena uma enzima
Enzimas
As enzimas possibilitam que as indstrias utilizem
processos mais econmicos e menos
poluentes, alm de serem extremamente
eficientes
Atualmente, podem substituir muitos produtos
qumicos nocivos ou at perigosos e permitem
uma produo segura e ambientalmente
correta, decorrente de uma tecnologia limpa
Enzimas
O uso de enzimas para fins tecnolgicos consiste
em fazer destes catalisadores biolgicos,
catalisadores de processo, capazes de transformar
matrias-primas em produtos com valor agregado
Entretanto, esse um grande desafio tecnolgico
devido instabilidade da estrutura proteica da
enzima
Ainda so poucos os processos enzimticos
operados em escala industrial
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CARACTERSTICA ENZIMAS CATALISADORES
QUMICOS
1 Especificidade ao substrato Alta Baixa
2 Natureza da estrutura Complexa Simples
3 Sensibilidade temperatura Alta Baixa
4 Condies de reao(T, P e pH) Suaves Drsticas (geralmente)
5 Custo de obteno(isolamentoe
purificao)
Alto Moderado
6 Natureza do processo Batelada/contnuo Batelada/contnuo
7 Consumode energia Baixo Alto
8 Formaode subprodutos Baixa Alta
9 Reutilizaodo catalisador Simples/cara Simples
10 Atividade cataltica (temperatura
Ambiente)
Alta Baixa
11- Presena de cofatores Sim No
12 Energia de ativao Baixa Alta
13 Velocidade de reao Alta Baixa
Enzimas
So divididas em seis classes conforme a
reao que catalizam
Oxirredutases, transferases, hidrolases, liases,
isomerases, ligases
Enzimas
Classe da Enzima Tipo de reao catalizada
Oxirredutases Catalisam reaes de
oxirreduo. Transferncia
de H, O ou eltrons
Transferases Catalisam a transferncia
de grupos entre molculas
Hidrolases Catalisam reaes de
hidrlise
Liases Catalisam a adio de
grupos a ligaes duplas e
vice- versa
Isomerases Catalisam reaes de
isomerizao
Ligases Catalisam a unio de duas
molculas, associadas
ruptura da ligao trifosfato
do ATP
Enzimas
Aps os antibiticos, as enzimas so os produtos
mais explorados na indstria biotecnolgica
Muitas das enzimas obtidas de vrios tipos de
microrganismos podem ter um uso comercial
Atualmente comercializam-se em todo o mundo
mais de 1500 toneladas de enzimas por ano,
correspondendo a um mercado mundial estimado
em mais de US$ 2 bilhes
Enzimas
A obteno de enzimas comerciais pode ser feita
a partir de fontes animais, vegetais e microbianas
Sua produo pode ser aumentada pela
transferncia das informaes genticas para um
microrganismo hospedeiro
Esses microrganismos geneticamente modificados
(OGMs) podem, ento, ser cultivados sob as
melhores condies
Enzimas
Mercado
Enzimas Tcnicas: formulao de detergentes,
produo de papel e celulose, manufatura de couros e
produo de frmacos (50% do mercado de enzimas)
Alimentos: xarope de acar invertido (frutose),
aromas, produo de pes, processamento de carnes
e embutidos, queijos, cerveja, sucos e lipdeos
estruturados isentos de ismeros trans
Rao animal: engorda de animais (celulases, xilanases,
fitase desdobramento do cido fosfrico do inositol em
fosfato livre para ser absorvido)
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Enzimas
Em 2008 haviam cerca de 3000 enzimas
identificadas e integrantes da lista de
Comisso Internacional de Enzimas (E.C.)
Apenas 60 dessas enzimas com aplicao
industrial, devido ao alto custo de
produo
Mais de 75% das enzimas comerciais so
hidrolases
Enzimas
Proteases constituem quase 40% das vendas
de enzimas, seu uso em detergentes o seu
principal mercado
Principais mercados: detergentes (37%),
setor txtil (12%), amido (11%), panificao
(8%), rao animal (6%)
Enzimas
Obteno Industrial
Fonte Origens Mtodo de Obteno
Vegetais Sementes
Sucos
Polpas
Razes
Triturao de tecidos
Animais Mucosas
Pncreas
Fgado
Sangue
Triturao de tecidos
Microrganismos Bactrias
Fungos
Leveduras
Cultura submersa ou
semi-slida
Aplicao das Enzimas
90% so extracelulares e de origem microbiana
Proteases: 50% do mercado de enzimas
microbianas
Protease alcalina de Bacillus licheniformis em
detergentes
Coalho de Mucor miehei (enzima quimosina) na
produo de queijos
Utilizao em massa de pes e biscoitos
Amilases: converso de amido em xaropes,
produo de acares fermentveis (cerveja)
Aplicao das Enzimas
Pectinases de Aspergillus niger: processos de
extrao de suco e elaborao de vinhos
aumentam o rendimento, reduzem a
viscosidade e melhoram a extrao da cor das
cascas de frutas e vegetais macerados
Celulases: processamento de alimentos,
indstria txtil, tratamento de despejos
Glicose isomerase: converso de glicose em
frutose
Aplicao das Enzimas
Papana (extrada do ltex de mamo):
cervejaria e processamento de alimentos
Quimosina (ou renina): extrada do 4
estmago de novilhos em aleitamento -
produo de queijo
Atualmente a quimosina animal foi
substituda por enzimas microbianas
(bactrias geneticamente modificadas)
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Caractersticas das Enzimas
Molculas de protenas com funo de
reconhecer e se ligar a reagentes especficos,
catalisando sua converso em produtos
Responsveis pelo aumento da velocidade de
todas as reaes que ocorrem no interior das
clulas
Sua atividade cataltica depende da
integridade da sua conformao proteica
nativa
Caractersticas das Enzimas
Combinam-se temporariamente com os
substratos (ou reagentes) durante a reao
So liberadas sem alterao em sua
estrutura
Especficas em sua atividade (um nico tipo
de molcula ou grupo de molculas
relacionadas)
Caractersticas das Enzimas
Saturadas por altas concentraes de
substrato
Podem conter grupos no-proticos
(Cofatores) que contribuem para sua atividade
- inorgnicos: ons metlicos (Mg, Zn, Mn, Fe)
- orgnicos (coenzimas): grupos complexos
derivados de vitaminas (NAD, FAD, coenzima A
ou algumas vitaminas)
Caractersticas das Enzimas
Apoenzima: estado inativo da enzima na
ausncia de cofator
Mecanismo de catlise
Enzimas aumentam a velocidade de reaes
espontneas por reduo da energia de
ativao
Energia de ativao barreira de energia
entre subtratos e produtos que deve ser
transposta pelas molculas para que a reao
ocorra
No so consumidas nem alteradas no
processo e no afetam o equilbrio da reao
Energia de Ativao
Figura 1: Grfico de energia de ativao de uma reao qumica e a mesma
reao catalisada por uma enzima.
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Mecanismo de catlise
Stio ativo: cavidade com forma definida,
aberta na superfcie da molcula globular da
enzima, constituda por grupos R de
aminocidos
Para ser reconhecida como substrato, uma
molcula deve ter a forma adequada para
acomodar-se no stio ativo e os grupos
qumicos capazes de se ligar com os grupos R
Enzimas podem possuir mais de um stio ativo
Stio ativo
Figura 2: Esquema representativo da atuao de uma enzima num processo
bioqumico
Regulao da atividade
enzimtica
Alguns compostos do metabolismo tm a
propriedade de se ligarem com alta
especificidade a uma regio de determinadas
enzimas chamada stio alostrico
Este diferente do stio ativo
Modificao da estrutura terciria da enzima
Nova conformao pode auxiliar ou prejudicar
a ao cataltica
Enzima chamada alostrica
Figura 3: Ativao (a) e inibio alostrica (b) de uma enzima
Regulao da atividade
enzimtica
Tipo de regulao largamente empregada
pelas clulas, praticamente em todas as
vias metablicas
Normalmente a inibio da atividade
alostrica feita por produtos finais da via
Mecanismo de feedback
Medida da atividade
enzimtica
Para enzimas, mais importante do que a
quantificao em massa a medida de sua
atividade
Atividade da enzima avaliada pela
velocidade da reao que a enzima catalisa
Para essa medida uma amostra de soluo
contendo a enzima incubada com
concentraes altas de substratos
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Medida da atividade
enzimtica
A velocidade da reao medida e
expressa em Unidades Internacionais
Uma Unidade Internacional (U) a
quantidade de enzima capaz de formar um
mol de produto por minuto em condies
timas de medida
Medida da atividade da enzima
importante em processos de purificao
Fatores que afetam a atividade
enzimtica
Temperatura
De maneira geral, aumento da temperatura
leva a aumento da atividade enzimtica
(maior nmero de colises entre enzima e
subtrato)
Entretanto, acima de determinado valor de
temperatura, ocorre desnaturao da enzima
com declnio rpido de sua atividade
Fatores que afetam a atividade
enzimtica
pH
Cada enzima tem uma faixa de pH tima, na
qual mantm sua configurao normal no
meio em que atua
Variao no pH pode alterar a ionizao de
cadeias de aminocidos no stio ativo da
enzima, causando mudana de configurao
e ou desnaturao, impedindo a de se
combinar com o substrato
Fatores que afetam a atividade
enzimtica
pH
A alterao do pH tem efeitos na atividade
enzimtica e, como consequncia,
necessrio selecionar e controlar o pH do
meio
Efeitos do pH
Aumento do pH
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Efeitos do pH
Cintica das reaes
enzimticas
Objetivos
Medir a velocidade das transformaes
Verificar influncia das condies de trabalho
Correlacionar (equaes ou modelos
matemticos) as velocidades das reaes com os
fatores que as afetam
Otimizar processo
Estabelecer parmetros para controle de processo
Projeto de reator
Cintica das reaes
enzimticas
A velocidade de consumo do subtrato ou
formao do produto varia com o tempo
Com o desenvolvimento da reao as condies
em que se encontra o sistema variam
A concentrao de substrato decresce e da
enzima pode diminuir tambm (instabilidade),
alguns produtos podem inibir ao cataltica da
enzima
Instante inicial condies experimentais so
conhecidas
Cintica de Michaelis-Menten
Baseado no conceito de formao do complexo
Enzima - Substrato (ES) como intermedirio no
mecanismo de formao de produtos
Primeiro a enzima combina-se com o substrato,
formando o complexo ES, em um passo reversvel e
rpido
A seguir, num passo mais lento, o complexo se
desfaz, com reaparecimento da enzima livre e
formao do produto
Efeito da concentrao inicial
da enzima
[E]
Efeito da concentrao de
substrato
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Curvas cinticas para os componentes da
reao enzimtica: Estado Estacionrio
Equilbrio qumico
k1
k2
A velocidade de reao entre A e B proporcional s
concentraes de A e B, logo:
No equilbrio:
Reao catalisada por enzima
(k4 muito baixo)
(aps a mistura de E e S,
ES permanece constante)
Reao catalisada por enzima
Isolando as constantes:
k3 < k2
Como k3 < k2 e k1, ES P
a etapa limitante do processo
Definindo a velocidade relativa
v/vMax:
Reao catalisada por enzima
O valor mximo de velocidade ser obtido quando
toda a enzima se encontrar na forma de complexo
enzima substrato
A equao de Michaelis Menten expressa a relao
quantitativa entre a velocidade inicial, a velocidade
mxima e a concentrao de substrato, por meio de K
m
K
m
a constante de de Michaelis da enzima (ou do
substrato, ou do complexo) concentrao de
substrato qual corresponde uma velocidade igual
metade da mxima
Efeito da concentrao de
substrato
V = Vmax
- Parte A: v depende da [S]
- Parte B: v no aumenta
proporcionalmente com
aumento de [S]
- Parte C: v no depende da
[S], tendendo a um valor
mximo (V
max
)
Cintica de ordem varivel
Cintica de 1 ordem (Km >> [S]) V = Vmax [S]/km = K[S]
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Efeito da concentrao de
substrato
A velocidade proporcional
concentrao de substrato (primeira
ordem) para baixos valores de S (K
m
>> S)
Para valores maiores de S (S >> K
m
), a
velocidade torna-se constante, de ordem
zero e igual a V
max
Quanto menor o valor de K
m
maior ser a
afinidade da enzima pelo substrato
Mtodo Lineweaver - Burk
A determinao de V e K
m
a partir de valores
experimentais pode ser feita pela linearizao da
equao de Michaelis Menten
O mtodo Lineweaver Burk bastante utilizado e
consiste em inverter ambos os membros da
equao
Mtodo Lineweaver - Burk
Percebemos que 1/V varia linearmente com 1/S
Os coeficientes angular e linear dessa reta so K
m
/V
max
e
1/V
max
Com os valores experimentais de S e correspondentes valores
de V, os coeficientes so determinados por regresso linear
Exemplo
Determine os valores de K
m
e V
max
para os
resultados da seguinte reao enzimtica
catalisada por uma protease
Glicilglicina + H2O 2 Glicina
[S] (mmol L
-1
) Velocidade (mol L
-1
s
-1
)
1,5 0,21
2 0,24
3 0,28
4 0,3
8 0,40
16 0,45
Exemplo
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0 5 10 15 20
0
1
2
3
4
5
6
0 0,2 0,4 0,6 0,8
Isoenzimas: apresentam atividade sobre um mesmo substrato, porm apresentam
caractersticas como sequncia de aminocidos, massa molecular, KM, VMax diferentes
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Inibio da atividade
enzimtica
Processos pelos quais a atividade normal da
enzima reduzida ou eliminada
completamente
Compostos que reduzem a velocidade da
reao, por qualquer mecanismo, so
chamados inibidores e podem se combinar
com a enzima alterando sua atividade
cataltica
Inibio da atividade
enzimtica
As enzimas esto sujeitas a inibies reversveis ou
irreversveis
Inibidores irreversveis se ligam a um grupo funcional
na molcula de enzima para formar ligaes
covalentes e cineticamente estveis, podendo
levar a destruio desse grupo
Inibidores reversveis se ligam enzima por ligaes
fracas, de forma reversvel
Inibio da atividade
enzimtica
O inibidor pode ser uma das substncias que
participa da reao (substrato ou produto)
- Inibio da invertase por concentraes elevadas
de sacarose
- Inibio da alfaamilase por dextrinas e pela
maltose
A inibio reversvel que apresenta interesse
prtico e os dois tipos mais importantes so a
inibio competitiva e no - competitiva
Inibio competitiva
Inibidor competitivo tem grande semelhana
estrutural com o substrato e ambos competem
pelo mesmo stio ativo da enzima
A formao do complexo enzima inibidor
reduz a quantidade de enzima disponvel para
interao com o substrato com reduo da
velocidade da reao
Inibio competitiva
Inibio competitiva
Como o inibidor se liga enzima de forma
reversvel, a competio pode se tornar
favorvel ao substrato se for adicionado mais
substrato ao meio
Com altas concentraes de substrato no
meio, ser mnima a probabilidade de uma
molcula de inibidor se ligar enzima e a
reao ter velocidade mxima normal
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Inibio competitiva
Entretanto, a concentrao de substrato na
qual v = v
max
/2 ( valor de K
m
) estar
aumentada na presena do inibidor
O efeito no valor de K
m
e a ausncia de um
efeito em v
max
so indicadores da inibio
competitiva
Inibio competitiva
KM aumenta menor
afinidade da enzima
pelo substrato
Inibio no - competitiva
O inibidor no competitivo interage com a
enzima, ligando-se a um stio ativo diferente
daquele no qual se liga o substrato e no
altera a conformao deste
Todas as formaes de complexos so
possveis: enzima substrato, enzima - inibidor,
enzima substrato - inibidor
Inibio no - competitiva
Inibio no - competitiva
A enzima inativada quando o inibidor est
ligado, estando o substrato presente ou no
Em qualquer caso, o complexo resultante
inativo, no formando produto
O inibidor reduz efetivamente a concentrao
da enzima ativa e, consequentemente, diminui
v
max
O efeito sobre k
M
pequeno ou nenhum
Inibio no - competitiva
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Inibio No-Competitiva:
Recprocos de Lineweaver-Burk
Vmax diminui
KM inalterado
Inibio Irreversvel
Ligao covalente ou no covalente
particularmente estvel
No h modelo cintico
Destruio de um grupo funcional essencial ao
funcionamento da enzima
Enzima no pode ser regenerada
Inibidores irreversveis podem ser teis para
preparaes enzimticas comerciais
Inibio Irreversvel
Exemplo: Presena de ons Fe
2+
em caldo de cana Inibio da invertase
(Complexos estveis com ons S
2-
da cistena e metionina)
Exerccio
Uma enzima com K
M
de 2,6 x 10
-5
mol L
-1
foi
testada para uma concentrao inicial de
substrato de 0,3 mol L
-1
. A velocidade
observada foi de 5,9 x 10
-5
mol L
-1
min
-1
. Se a
concentrao inicial de substrato fosse 2 x 10
-5
mol L
-1
,e admitindo-se estequiometria 1:1, qual
seria o tempo necessrio para a concentrao
do produto atingir 1,1 x 10
-5
mol L
-1
.
Exerccio
A reao de converso do citrato oxaloacetato + acetato por
uma enzima exige a presena de ons Mg
2+
. Os seguintes dados de
velocidade enzimtica foram obtidos onde se investigou o efeito do
inibidor Ca
2+
. Determine K
M
, V
max
, K
I
e o tipo de inibio
[Mg
2+
] mmol L
-1
V sem Ca
2+
(mmol L
-1
s
-1
)
V com Ca
2+
(2,5 mmol L
-1
s
-1
)
V com Ca
2+
(5 mmol L
-1
s
-1
)
8,35 11,75 9,65 7,25
2,99 8,5 5,6 4
0,96 4,8 2,33 1,58
0,32 2,8 1,04 0,62
Referncias Bibliogrficas
GALLO, L. A. BASSO, L. C. Fundamentos de Bioqumicapara Cincias
Biolgicas, Cincias dos Alimentos, Agronmicas e Florestais (apostila)
ESALQ USP, 2012
LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. - Princpios de Bioqumica.
So Paulo, Sarvier, 2006
SERPA, G.; PORTO, L. Introduo Engenharia Genmica (apostila).
UniversidadeFederal de Santa Catarina, 2005
Schmidell, W. et al. Biotecnologia Industrial. So Paulo: Edgard Blucher,
vol. 1 EngenhariaBioqumica, 2001.
Tortora, G.R. Microbiologia. 8 Ed. Porto Alegre: Artmed, 2005.
Notas de aula do professor Andr Aguiar. Engenharia Bioqumica, UFSJ
CAP