El diagnstico citolgico es un mtodo ampliamente utilizado en la prctica
de animales pequeos. La gran difusin de su utilizacin se debe a su practicidad ya que las muestras pueden tomarse en forma sencilla y rpida no siendo necesaria la preparacin del paciente ni tampoco la utilizacin de anestesia. Por otro lado, la tcnica para la toma de muestra no implica riesgos para el paciente. Por ltimo, la citologa es una tcnica econmica ya que los insumos utilizados para su realizacin son fcilmente hallados en el mercado y no son costosos. Utilizando esta tcnica diagnstica es posible realizar una orientacin en el diagnstico y establecer as en forma rpida una planificacin teraputica. Toma de muestra Todo diagnostico comienza con una buena toma de muestra si la muestra no es adecuada no se puede realizar el examen microscpico. Por lo tanto es necesario asegurarse de: . Tomar una muestra representativa de la lesin. . Asegurarse de identificar claramente la muestra y acondicionarla para el envo al laboratorio. . Llenar el protocolo con los datos completos del animal y el sitio donde fue obtenida la muestra. Existen diferentes formas de tomar las muestras para evaluacin citolgica. A continuacin se describen las ms utilizadas. 1. Biopsia por aspiracin con aguja delgada ( BAAD)
Es la tcnica ms utilizada para la obtencin de muestras para evaluacin citolgica. Esta tcnica es muy sencilla, no requiere instrumental ni preparacin previa del paciente. Mediante esta tcnica se pueden tomar muestras de tumores subcutneos, tumores de mama, realizar punciones de masas alojadas en cavidades guindose por una radiografa, ecografa o bien por palpacin. Con esta tcnica tambin pueden realizarse biopsias de rganos internos como rin, pulmn, hgado, bazo. Para realizar la puncin se emplea una jeringa de 5cc nueva y una aguja tipo 23G. El material obtenido se coloca sobre un portaobjetos y se realiza un extendido de manera tal que formar una monocapa celular en el frotis. Se seca al aire y no se emplean fijadores qumicos
Figura 1: a) Se introduce la aguja. b) Se realiza presin negativa con el mbolo de la jeringa. c) Se deja suavemente, que el mbolo regrese a su lugar. Luego se reorienta la aguja y se vuelve a repetir la aspiracin varias veces. La muestra obtenida queda dentro de la aguja. Se desacopla la aguja de la jeringa y se carga la jeringa de aire. Se vuelven a acoplar y se descarga la muestra sobre un porta objetos limpio y desengrasado. Figura 2: Una vez que se descarga la muestra en el portaobjetos, se toma otro portaobjetos y se realiza un extendido usando la tcnica de los extendidos de frotis sanguneos. EI objetivo es lograr que las clulas se dispongan en una monocapa. Se deja secar al aire sin agregar fijadores qumicos.
2. Hisopados Los hisopados estn indicados para tomar muestras de lesiones ulceradas y fstulas; tambin son muy utilizados para tomar muestras de epitelios de los tractos digestivo, reproductor o de conducto auditivo. Los hisopados vaginales son el mtodo de eleccin para la determinacin del celo en las hembras. En este caso resulta conveniente tomar dos muestras. Una con hisopo con estril que se coloca en medio de transporte hasta obtener los resultados de la evaluacin citolgica. La otra muestra se toma con hisopo estril y se la extiende sobre un portaobjetos haciendo girar suavemente el hisopo sobre el porta de manera tal de no daar las clulas. Si el resultado de la citologa muestra inflamacin sptica o mictica se puede realizar el aislamiento e identificacin del agente en la muestra que qued de reserva en el medio de transporte. 3. Improntas Se pueden realizar improntas de rganos o de tumores luego de una extirpacin quirrgica. Es conveniente, antes de realizar la impronta, secar el exceso de lquido con un papel absorbente de la superficie de la masa a muestrear. Las improntas son muy importantes para la evaluacin de los ganglios linfticos. Si se extrae un ganglio linftico, antes de colocarlo en formol para la evaluacin histopatolgica. Es conveniente realizar una impronta y se remiten ambas muestras (impronta y ganglio en formol) al laboratorio. En el caso de otros rganos o masas tambin es conveniente remitir la muestra para histopatologa junto con su impronta a los fines de que el patlogo pueda realizar un acercamiento diagnstico rpido. 4. Colectas Se pueden tomar muestras de colectas en cavidades. Esas son muy tiles y en muchos casos se puede realizar el diagnstico con slo una muestra de lquido. Se realiza una evaluacin fsico qumica del lquido y una evaluacin citolgica del sedimento. Para la puncin de cavidades es conveniente utilizar un abocath para no ocasionar laceraciones en los rganos internos de las cavidades. Las muestras de colectas deben tomarse con jeringa estril. Es conveniente tomar dos muestras, una reservarla para cultivo y a la otra se le debe agregar 1 gota de EDTA por cada 9 cc de lquido y se la remite para evaluacin citolgica. Puncin de trax se realiza e n el sptimo espacio intercostal a 1/3 hacia dorsal de la unin costocondral. Puncin de abdomen: Se realiza la puncin en lateral a la altura del ombligo. Puncin de la cavidad articular: El lquido sinovial es abundante en las alteraciones de -las articulaciones. La puncin est indicada para evaluar reacciones inflamatorias spticas y aspticas. Buena calidad de la preparacin. Slo es posible realizar una adecuada interpretacin citolgica en una muestra si esta cumple con dos requisitos. 1. La preparacin a evaluar debe contener una adecuada cantidad de clulas, la mayora de las clulas deben estar intactas y buen distribuidas formando una monocapa. 2. Los colorantes utilizados para teir la muestra deben ser de buena calidad. Es recomendable gastar un poco ms en colorantes de marcas reconocidas. Si estas pautas no se cumplen, la toma de la muestra y la coloracin deben ser repetidas ya que intentar realizar un diagnstico en un frotis de mala calidad, es frustrante y puede llevar a errores de interpretacin o brindar informacin insuficiente. EVALUACIN MICROSCPICA Examen en 10X: La evaluacin inicial se realiza con bajo aumento (objetivo de 10X). La observacin con este aumento se realiza recorriendo TODO el frotis para : Seleccionar reas que luego se observarn con mayor aumento. Evaluar la distribucin celular y el tipo de clulas presentes.
Es muy importante recorrer toda la preparacin porque de otro modo, se corre el riesgo realizar una evaluacin incompleta. Con este aumento se puede identificar la presencia de estructuras micticas y clulas neoplsicas. En este punto se realiza la clasificacin inicial de la muestra verificando si la muestra corresponde a una lesin de tipo inflamatorio o de tipo tumoral. Siguiendo el algoritmo que se muestra en la figura 3.
Si en la muestra hay slo clulas inflamatorias o bien no hay clulas la clasificacin resulta ms fcil seguir con la evaluacin. Lo mismo ocurre cuando se encuentran slo clulas tisulares. Pero en algunos casos la poblacin celular es mixta y est compuesta por infiltrado inflamatorio y otras clulas, esto ocurre porque las lesiones neoplsicas atraen gran cantidad de clulas inflamatorias especialmente cuando existe necrosis en la masa tumoral.
2. PATRONES CITOLGICOS DE INFLAMACIN. Las clulas inflamatorias que se pueden hallar en una preparacin son: neutrfilos, macrfagos, linfocitos, clulas plasmticas, eosinfilos y en forma ocasional pueden encontrarse clulas gigantes multinucleadas. En cualquier proceso inflamatorio, los neutrfilos son las clulas ms abundantes Si la muestra es compatible con una lesin de tipo inflamatoria, el prximo paso es determinar las proporciones relativas de los distintos tipos de clulares, esto se hace para establecer el tipo de inflamacin y la duracin del proceso. 1. Inflamacin aguda neutroflica Las preparaciones en las cuales se observa que la mayora de las clulas son neutrfilos, indican una inflamacin supurativa. La causa ms comn de este tipo de lesin es la infeccin bacteriana, pero puede haber otras causas. El paso siguiente es establecer si el proceso inflamatorio supurativo es o no bacteriano. La clave para diferenciar entre inflamacin supurativa sptica de no sptica es reconocer neutrfilos con cambios degenerativos, que indican sepsis, de neutrfilos sin cambios degenerativos que indican inflamacin no sptica. Los cambios degenerativos son inducidos por las bacterias y por las sustancias citotxicas producidos por los mismos neutrfilos. Los cambios degenerativos consisten en: Ncleos ms claros y tumefactos y citoplasma vacuolizado. Hay evidencias directas e indirectas de sepsis: * Indirectas: cambios degenerativos en los neutrfilos. * Directas: Visualizar bacterias intracelulares. Cuando se ven neutrfilos con degeneracin se debe sospechar de la presencia de bacterias y el paso siguiente es buscarlas con el objetivo de 100x se observa cuidadosamente dentro del citoplasma de los neutrfilos para hallarlas. Las bacterias extracelulares pueden ser contaminantes. Con los colorantes hematolgicos todas las bacterias se tien de color azul. Una excepcin son las especies de Micobacterium.
Figura 4 Clulas inflamatorias con predominio de neutrfilos ( 10X)
Figura 5. Imagen con objetivo de 100X de la figura 4. Se observa la presencia de bacterias intracitoplasmticas. 2. Inflamacin eosinoflica Cuando un frotis tiene una elevada ms del 20% de eosinfilos, est indicando que la muestra es compatible con una inflamacin eosinoflica. La interpretacin vara segn el tipo de muestra, pero este tipo de infiltrado es indicativo de procesos inmunoalrgicos o parasitarios. Este tipo de infiltrado se aprecia tambin en los granulomas eosinofilicos, reacciones a cuerpo extrao e infecciones micticas. Tambin es posible hallarlos junto a mastocitos en muestras provenientes de mastocitomas. 3. Infeccin granulomatosa En este tipo de infiltrado, se observan tanto neutrfilos como fagocitos mononucleares, aproximadamente el 25 % de las clulas son fagocitos mononucleares. Este tipo de preparado indica una respuesta crnica que puede ser ocasinada por distintas causas. Los mononucleares son clulas grandes que pueden confundirse con clulas neoplsicas. Se observan tambin fibroblastos reactivos pero estn presentes en poca cantidad. Este tipo de respuesta celular es ocasionada en general por hongos, micobacterias y cuerpos extraos. Los neutrfilos en este tipo de infiltrado, no muestran cambios degenerativos. Si se observan clulas gigantes multinucleadas, el siguiente paso es buscar estructuras micticas y cuerpos extraos. Los hongos muchas veces no se tien bien y se visualizan como fantasmas o finas columnas que no se tien.
Figura 6. Inflamacin granulomatosa .25X 4. Inflamacin linfoctica/ plasmoctica Este es un patrn inflamatorio poco comn. Cuando un frotis que proviene de tejido no linftico, contiene gran cantidad de linfocitos y clulas plasmticas est indicando este tipo de inflamacin. Ejemplos de este tipo especial de inflamacin son: gingivitis y estomatitis felina, colangitis y gastroenteritis canina. El patrn citolgico en algunos casos es difcil de distinguir del linfosarcoma, pero este ltimo se caracteriza por la presencia de linfocitos inmaduros y ausencia de clulas plasmticas. Los cuerpos extraos y los tractos fistulosos en ocasiones estn asociados a infiltrado de clulas plamticas.
3. DIAGNOSTICO CITOLOGICO DE NEOPLASIA. La clave para el del diagnstico citolgico de neoplasia maligna es determinar que la lesin no es inflamatoria y adems que las clulas tisulares presentes en la muestra tienen caractersticas de anaplasia. El primer paso es determinar el tipo celular presente en la muestra. 1. Determinacin del tipo celular. La forma de las clulas y de los ncleos y la tendencia a formar grupos celulares son los criterios usados para clasificar el tipo celular de una neoplasia.
Tumores de origen Epitelial Las clulas epiteliales tienden a ser redondeadas, polidricas, grandes y el ncleo tiende a ser redondeado. Las clulas epiteliales, usualmente se exfolian con facilidad y por lo tanto se ve gran cantidad de clulas que tienden a desprenderse en grupos .Por su morfologa las clulas pueden orientar para establecer su origen: escamosas, cuboidal, columnar, pero estas caractersticas se pierden en los tumores poco diferenciados. Tumores de origen Mesenquimtico Las clulas mesenquimticas (Tejido Adiposo, seo, muscular, cartlago, conectivo) tienden a ser pobremente exfoliativas y se presentan solitarias, sin agruparse o en algunos casos, los grupos son pequeos. Son clulas de forma alargada y el ncleo es oval y alargado. Para lograr una mayor aproximacin al origen, en algunos casos, se puede observar que estn asociadas a sustancias producidas por ellas mismas: sustancia condroide u osteoide. La identificacin de pigmentos intracelulares, comnmente es especfico del diagnstico de tumores melanocticos. Tumores de clulas redondas Son tumores muy exfoliativos que desprenden clulas pequeas y redondas de escaso citoplasma que no se agrupan. No forman grupos en pelotas o mrulas como las epiteliales. En este grupo se encuentran distintos tipos de clulas tumorales : Linfoma, Histiocitoma, Tumor venreo transmisible, Tumor de clulas basales, Plasmocitomas.
Figura 7. Caractersticas de los tipos celulares. CRITERIOS CITOLGICOS DE MALIGNIDAD Una vez establecido el tipo celular (epitelial, redondas mesenquimtico). El paso siguiente es establecer si el tumor es maligno o benigno. El hallazgo ms importante y que caracteriza a la malignidad es el pleomorfismo. Es decir que en estas muestras se va a encontrar una gran variabilidad: Variabilidad en el tamao de las clulas, ncleos y nuclolos. Variabilidad en la forma de las clulas, ncleos y nuclolos. Cambios nucleares en las neoplasias malignas: Disminucin de la relacin ncleo/citoplasma Variacin en la forma y en el tamao nuclear Multinucleacin Presencia de ms de un nuclolo Nuclolo prominente Variacin en el tamao y la forma de los nuclolos; Figuras mitticas aberrantes. Cromatina irregular y gruesa.
Los cambios nucleares son de gran importancia en el diagnstico de una neoplasia maligna. Los tumores malignos con elevado grado de anaplasia, muestran ms de uno de estos cambios nucleares simultneamente. En general, al encontrar tres o cuatro de estos cambios en una elevada proporcin de las clulas que se estn observando, se puede realizar el diagnstico de neoplasia maligna.
Figura 8. Caractersticas de anaplasia. Sarcoma Bibliografa Cowell, R and Tyler, R. Diagnostic Cytology of the dog and cat. American Veterinary Publications. 1993. Morris J , Dobson J. Diagnstico y estadificacin tumoral en Oncologia en pequeos animales.Editorial Intermdica. 2002.
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