UNIDAD 3

REACCIONES DE AGLUTINACIN.


GENERALIDADES:
Cuando un anticuerpo es puesto en contacto con su antgeno especifico y este se
encuentra en estado particulado o forme (p.ej. bacterias, eritrocitos, levaduras,
clulas) reaccionan formando grumos o aglutinados. Los principios que regulan
esta reaccin son los mismos de la reaccin de precipitacin.

Por lo tanto la aglutinacin ocurre en dos fases:
La primera fase es conocida como sensibilizacin. Proceso mediante el cual el
anticuerpo se une al antgeno de la superficie de la partcula. En esta fase puede
haber activacin del complemento, donde se observa lisis. Esta unin del
anticuerpo y el antgeno se logra por la formacin de mltiples uniones no
covalentes, como puentes de hidrogeno, electrostticas, van der Waals e
hidrofbicas.

La segunda fase es el resultado de la unin de las partculas mediante puentes de
anticuerpo, formando grumos o aglutinados que pueden ser visibles a simple vista
o en microscopio. Para que tenga lugar este fenmeno visible, se deben vencer
las fuerzas de repulsin que mantienen normalmente separadas a las partculas,
lo que se denomina potencial zeta.

Por lo tanto se requieren un numero razonable de enlaces con el anticuerpo entre
las clulas antes de superar la repulsin mutua.

La IgM es superior a la IgG como aglutinante, debido a su enlace multivalente,
superando la distancia entre partculas, en un medio salino. Mientras que la IgG
requiere de medios proteicos como albmina, o la utilizacin de enzimas
proteolticas como la bromelina para disminuir el potencial zeta y llegar a la
segunda fase de la reaccin.

Otro medio para que la IgG pueda aglutinar es la utilizacin de una
antigammaglobulina humana denominada suero de Coombs, la cual se une a la
IgG unida al Ag formando puentes para poder vencer la distancia entre dos
partculas y aglutinarlas.

Esta reaccin se ha utilizado ampliamente debido a la facilidad con que se lleva a
cabo y su alta sensibilidad, comparada con las reacciones de precipitacin.

Sin embargo no permite la cuantificacin exacta de anticuerpos y los resultados
solo pueden expresarse en funcin de la dilucin mayor del suero donde se
observa el aglutinado, que corresponde al ttulo de anticuerpos en el suero.

Las reacciones de aglutinacin pueden ser:
Aglutinacin directa o activa, donde los antgenos que intervienen son
componentes naturales de la partcula.

Y la aglutinacin indirecta o pasiva, en donde los antgenos solubles se adsorben
en forma artificial a partculas que funcionan como soporte, por ejemplo eritrocitos
de carnero, eritrocitos humanos tipo O, bacterias como M. tuberculosis,
levaduras como S. cervicieae, S. marcenses o partculas inertes como ltex. , Esto
les da la caracterstica de ser particulados y poder aglutinar.

Las reacciones de aglutinacin en el laboratorio se pueden realizar de tres
formas: en placa, tubo y en placa de microtitulacin.

En la reaccin en placa se utiliza un portaobjetos o vidrio plano donde una gota del
anticuerpo y otra del antgeno se mezclan y se observa aglutinacin en los 3
minutos siguientes.
En la tcnica en tubo tambin se ponen una gota de anticuerpo y una de antgeno,
se mezclan y centrifugan alrededor de 15-20 segundos y se lee aglutinacin.
En la de placa de microtitulacin se utiliza una placa con pozas en las que se
depositan de 25 a 50 l de Ag y Ac, se mezclan y se requiere hasta de dos horas
para leer los resultados.


PRCTICA No. 10
AGLUTINACIN EN PLACA
Titulacin de sueros anti-bacterianos


MARCO TERICO
La aglutinacin de una bacteria por un suero inmune especfico resulta de la
presencia de anticuerpos dirigidos contra los antgenos de la superficie bacteriana,
presentes en la cpsula, flagelos o pared .

Estas reacciones son usadas para estudios de composicin de antgenos
bacterianos, para diagnosticar enfermedades infecciosas buscando al agente
causal, y para taxonoma en la clasificacin de microorganismos aislados de
diversas fuentes, como exudados, heridas, alimentos, aguas negras, etc.

Tambin el diagnstico de cuadros infecciosos se puede realizar mediante el
hallazgo de anticuerpos especficos en el suero de los pacientes contra una
determinada bacteria, as como seguir la evolucin del proceso en casos en que
tenga correlacin el ttulo de anticuerpos con el cuadro clnico; las mejores
aplicaciones de este caso son las reacciones febriles, utilizadas para el
diagnstico y pronstico de enfermedades causadas por bacterias de diversas
especies en donde el proceso infeccioso cursa con una elevacin marcada en la
temperatura, entre otros sntomas inespecficos. Estos grmenes inducen una
respuesta humoral con la produccin de anticuerpos que fcilmente se identifican
en el laboratorio utilizando los antgenos especficos, como sucede en la fiebre
tifoidea causada por S. tiphy O y S. tiphy H (reaccin de Widal), la fiebre
paratifoidea causada por S. paratiphy A y B, la fiebre de malta causada por B.
melitensis (reaccin de Huddlesson) y la fiebre de tifo causada por Rickettsia
prowaseki (reaccin de Weil-Flix), en esta ltima se utiliza como Ag a Proteus
OX-19, OX-2 u OX-K ya que poseen determinantes antignicos glucolpidos
comunes con Rickettsia.

Otra aplicacin es la titulacin de anticuerpos en el suero de animales
inmunizados con antgenos de bacterias (sueros antibacterianos).

OBJETIVO
Al finalizar la prctica el alumno ser capaz de titular sueros inmunes obtenidos de
conejos inmunizados contra antgenos bacterianos como O y H de S. tiphy,
antgenos totales de E. coli, B. abortus o Sh. dysenteriae.

MATERIAL
1 ml Suero de conejos inmunizados
Suspensiones bacterianas de S. tiphy O, S. tiphy H, E. coli, B. abortus o
Sh. dysenteriae, ajustadas a 15 x 10
9
/ml
4 Tubos de 12 por 100 mm
1 Pipeta de 0.2 ml
1 Pipeta de 1 ml
1 Placa de vidrio de 25 por 20 cm
1 Lmpara de iluminacin indirecta
Aplicadores de madera o plstico
Solucin salina isotnica

TCNICA:
1. Dividir la placa de vidrio en cuadros de 4 columnas por 5 filas, con un lpiz
de cera para evitar que las reacciones se mezclen.
2. Utilizando la pipeta de 0.2 ml en la primera columna de 5 cuadros
adicionar 0.08 ml en el primer cuadro, en el segundo 0.04 ml, en el tercero
0.02 ml, en el cuarto 0.01 ml y en el quinto 0.005 ml del suero problema.
3. Agregar inmediatamente para evitar desecacin, una gota de la
suspensin bacteriana previamente homogeneizada a cada cuadro donde
se puso antisuero y mezclar utilizando un aplicador de madera o plstico
perfectamente formando un crculo.
4. Dar a las reacciones movimientos de rotacin suave durante 2 minutos y
leer el resultado con iluminacin indirecta y sobre fondo obscuro. Las
reacciones positivas dan acmulos gruesos de bacterias sobre un fondo
claro, mientras que las negativas quedan homogneas.
Trabajando con los volmenes anteriores se tienen las siguientes ttulos:
0.08 ml de 1:20, 0.04 ml de 1:40, 0.02 ml de 1:80, 0.01 ml de 1:160 y de
0.005 ml de 1:320.
5. Si con las diluciones anteriores se obtuvieron reacciones positivas significa
que el ttulo de anticuerpos es igual o mayor de 1:320, por lo que se
procede a diluir el suero 1:10 con SSI (0.1 ml de antisuero y 0.9 de SSI) y
en la segunda columna se agregan los volmenes 0.04, 0.02, 0.01 y 0.005
ml en los cuadros correspondientes, y se repiten los pasos 3 y 4.
Los ttulos correspondientes seran: 0.04 de 1:400, 0.02 de 1:800, 0.01 de
1:1600 y 0.005 de 1:3200. Si todas las reacciones son positivas tendremos
que el ttulo es igual o mayor a1:3200.
7. Se procede a realizar una dilucin 1:50 del suero (0.1 ml de antisuero
diludo 1:10 y 0.4 ml de SSI) y se agregan a los cuadros de la tercera
columna 0.02 ml, 0.01 ml y 0.005 ml; dando ttulos de 1:4000, 1:8000 y
1:16000 respectivamente, si dan reacciones positivas con la suspensin
bacteriana repitiendo los pasos 3 y 4.
8. Si todas las reacciones anteriores fueron positivas significa que el ttulo de
anticuerpos es igual o mayor de 1:16000 y por tanto procedemos a realizar
la ltima dilucin del suero 1:100 (haciendo una dilucin 1:2 de la dilucin
1:50 o si se prefiere hacer una dilucin 1:10 de la de 1:10 para obtener en
cualquier caso 1:100). Agregando de esta solamente en un cuadro de la
cuarta columna la cantidad de 0.005 que corresponde a un ttulo
1:32,0000, si despus de repetir los pasas 3 y 4 da positiva.
9. El ttulo del antisuero ser la mxima dilucin del suero en donde se
observe aglutinacin franca.




SUERO CONC. SUERO 1:10 SUERO 1:50 SUERO 1:100
0.08 1:20



0.04 1:40


0.04 1:400



0.02 1:80


0.02 1:800


0.02 1:4000



0.01 1:160


0.01 1:1600


0.01 1:8000



0.005 1:320


0.005 1:3200


0.005 1:16000


0.005 1:32000


PRCTICA No. 11
AGLUTINACIN EN TUBO
Tipificacin de Grupo Sanguneo ABO Y RH.


MARCO TERICO
Los eritrocitos poseen en su membrana sustancias antignicas determinadas
genticamente las cuales pueden identificarse mediante anticuerpos especficos.

SISTEMA ABO:
El primer grupo de estas sustancias fue identificado por Landsteiner en 1901, que
se conoce como sistema ABO, el cual consta de tres antgenos denominados A, B
y H que dan los cuatro diferentes grupos de este sistema : A , B, AB y O.

Estos antgenos son glucoprotenas que se forman por accin de diferentes
enzimas codificadas por los genes A, B y H y modifican una sustancia precursora.
La sustancia precursora es una cadena de N-acetilglucosamina, D-galactosa, N-
acetilglucosamina y D-galactosa, que es modificada por la enzima 1,2 fucosil-
transferasa codificada por el gen H y que adiciona una fucosa en la parte terminal
de la sustancia precursora que es la D-galactosa terminal con lo que se convierte
en la sustancia H.

La sustancia H es modificada por las enzimas codificadas por el gen A y/o el gen
B que son una 1-3 N-acetilgalactosaminil-transferasa y 1-3 galactosidil-transferasa
respectivamente.

Si la sustancia H es modificada por 1-3 N-acetilgalactosaminil-transferasa esta le
adiciona una N-acetilgalatosamina en su parte terminal donde esta la D-galactosa
dando lugar a la sustancia A.

Si lo que modifica la sustancia H es la 1-3 galacosidiltransferasa esta le adiciona
una galactosa en la parte terminal donde esta la D-galactosa dando lugar a la
sustancia B.

El denominado grupo O, no es otra cosa que la sustancia H, por lo tanto no heredo
los genes A y B , y su sustancia H no es modificada.

Si se heredan los dos genes A y B estos son codominantes por lo tanto tendrn
sustancia A y sustancia B en sus eritrocitos y se les denomina grupos AB.

Como las sustancias del sistema ABO son qumicamente similares a antgenos
bacterianos y de alimentos, los que estimulan al sistema inmune a producir
anticuerpos a partir del nacimiento y siendo detectables a los 6 meses de vida, a
estos anticuerpos as formados se les denomina naturales.

Por tanto, la tipificacin del sistema ABO se realiza de dos maneras:

Tipificacin directa: Se pone de manifiesto los antgenos presentes en la
membrana del eritrocito, cuando se les hace reaccionar con anticuerpos
especficos.

Tipificacin inversa: Se ponen de manifiesto los anticuerpos presentes en el
suero del individuo cuando se les hace reaccionar con eritrocitos tipificados para el
sistema ABO.

SISTEMA Rh:
Por otro lado el sistema Rh esta constituido por mas de 40 antgenos proteicos
distintos, cinco de los cuales son importantes por su inmunogenicidad y
frecuencia.

Los genes que codifican a este sistema se designan con smbolos: D y d, C y c , E
y e, cada gen (con excepcin de d) codifica para un antgeno especfico, que
puede ser detectado en la membrana del hematie.

La presencia o ausencia del antgeno D es lo que determina que un individuo sea
Rh positivo o negativo.

Los anticuerpos del sistema Rh son de clase IgG, siendo estimulados por
transfusin o por embarazo, ya que el individuo Rh negativo esta recibiendo
hemates Rh positivos, no son naturales.

Los anticuerpos que se forman despus de recibir sangre o sus derivados se
denominas aloanticuerpos inmunes o adquiridos.

OBJETIVOS
Realizar la tipificacin directa e inversa del sistema ABO, as como la
determinacin del Rh, logrando la identificacin de los grupos, as como su
importancia en la prctica transfusional y medico legal.

MATERIAL
3 ml Sangre total
3 mL Solucin salina isotnica (SSI)
2 gotas Suero anti-A
2 gotas Suero anti-B
2 gotas Suero anti-AB
2 gotas Suero anti-D
1 gota Suspensin de GR A al 5%
1 gota Suspensin de GR B al 5%
2 Pipetas Pasteur con bulbo
1 Gradilla
8 Tubos de 12 x 75 mm



TCNICA
1. Centrifugar la muestra sangunea 5 min a 2000 rpm y separar el plasma
(para la prueba inversa) y el paquete celular (para la prueba directa) en
diferentes tubos, previamente marcados.
2. Preparar una suspensin al 5% del paquete celular de la muestra,
adicionando a un tubo una gota de pipeta Pasteur del paquete celular y
adicionando 19 gotas de SSI.
3. Rotular cuatro tubos con A, B, AB y D respectivamente, a los cuales se
les agrega una gota de suspensin al 5% del paquete celular a cada tubo.
4. Adicionar al tubo A dos gotas de suero anti-A, al tubo B dos gotas de
suero anti-B, al tubo AB dos gotas de suero anti-AB y por ltimo al tubo
rotulado D agregar dos gotas de suero anti-D.
5. Mezclar el contenido de los tubos y centrifugar 30 seg a 2000 rpm.
6. Realizar la lectura agitando suavemente el tubo para resuspender el botn
formado. La presencia de cmulos celulares indica la presencia del
antgeno en la superficie del eritrocito.
7. Para la prueba inversa se toma el plasma de la muestra y se agregan dos
gotas a cada tubo rotulado previamente con anti-A y anti-B, mas una gota
de suspensin de G.R. A al 5% al tubo rotulado anti-A y una gota de
suspensin de G.R. B al 5% al tubo marcado anti-B.
8. Centrifugar 30 seg a 2000 rpm.
9. Resuspender el botn agitando suavemente, la reaccin de aglutinacin
positiva indicara la presencia de los anticuerpos contra los antgenos de
los G.R. utilizados como reactivo.

RESULTADOS:
Con las observaciones realizadas complete el siguiente cuadro y determine el
grupo sanguneo de la muestra problema

TIPIFICACION DIRECTA TIPIFICACION
INVERSA
GRUPO
SANGUINEO
A B AB D ANTI-A ANTI-B ABO D




PRCTICA No. 12
HEMAGLUTINACIN INDIRECTA
Titulacin de Anticuerpos frente a Tiroglobulina


MARCO TERICO
En la hemaglutinacin indirecta o pasiva, los eritrocitos de carnero o humano tipo
O, se utilizan como soporte de antgenos debido a que son fciles de obtener y
de conservar en el laboratorio bajo ciertas condiciones durante 15 a 30 das. Fijan
espontneamente a su superficie casi todos los polisacridos y ciertas protenas,
cualidad que se incrementa cuando los eritrocitos son tratados con sustancias
tales como el cido tnico que favorece la unin por atraccin electrosttica.
Tambin se les puede unir covalentemente el antgeno proteico, usando reactivos
como el glutaraldehido. Una vez que los eritrocitos han sido sensibilizados
(recubiertos) con el antgeno producen aglutinacin cuando se ponen en contacto
con anticuerpos especficos.

La tcnica de Boyden es altamente sensible y fcil de realizar, por lo que se
emplea para la cuantificacin de anticuerpos presentes an en cantidades
pequeas en el diagnstico de un gran nmero de enfermedades.

Para conocer la cantidad de Ac presentes, se hacen reaccionar dilaciones
seriadas del suero, con cantidades constantes de una suspensin de eritrocitos
sensibilizados con un Ag especfico, la dilucin ms alta del suero que determina
una clara hemaglutinacin, se considera como punto final de la reaccin y
representa el ttulo de anticuerpos. La prueba puede realizarse mediante una
macrotcnica (en tubo) o una microtcnica (placa).

As, por ejemplo protenas tales como la tiroglobulina son adsorbidas rpidamente
a la superficie de glbulos rojos tratados previamente con cido tnico.

La tiroglobulina, extrada de glndula tiroides humana por las tcnicas de
precipitacin con sales neutras y adsorbida a eritrocitos de carnero tanados,
proveen una prueba de hemaglutinacin indirecta para la deteccin de anticuerpos
frente a tiroglobulina.

La estabilidad durante el almacenamiento de las clulas tanadas y recubiertas con
el antgeno (sensibilizadas), se logra por tratamiento de la suspensin final con
formalina.

Como algunos sueros humanos contienen anticuerpos heterfilos capaces de
aglutinar eritrocitos de carnero, se debe incluir un control de eritrocitos tanados sin
sensibilizar (testigo negativo). Si en ste existe aglutinacin, la prueba se repite
con el suero previamente adsorbido con eritrocitos de carnero tanados.

La prueba de hemaglutinacin fue inicialmente usada por Witebsky y Rose para la
cuantificacin de autoanticuerpos frente a tiroglobulina.

La glndula tiroides tiene ciertas propiedades funcionales y estructurales
exclusivas que la predisponen para el desarrollo de respuestas autoinmunes. El
constituyente principal de los folculos tiroideos es la tiroglobulina (glucoproteina
de PM 660 Kd), que representa la forma de almacenamiento de las hormonas
tiroideas, tiroxina y triyodotironina, que afectan la velocidad del metabolismo en
todas las clulas del cuerpo.

El diagnstico de patologa autoinmune de la glndula tiroides, consiste
principalmente en la demostracin de autoanticuerpos contra la tiroglobulina, y en
menor grado frente al antgeno microsomal. Se pueden encontrar autoanticuerpos
frente a estos constituyentes en: tiroiditis aguda, subaguda, fibrtica, crnica
(enfermedad de Hashimoto), hipotiroidismo primario (mixedema en el adulto),
hipertiroidismo (tirotoxicosis o enfermedad de Graves), y en carcinoma de tiroides;
la diferencia de estos padecimientos se hace de acuerdo a su manifestacin
clnica, el estudio histolgico y algunas otras pruebas de laboratorio.

Los autoanticuerpos anti-tiroglobulina tambin pueden presentarse en otros
padecimientos como: anemia perniciosa, gastroenteritis atrfica, insuficiencia
suprarrenal idioptica, insuficiencia paratiroidea y en el sndrome de Sjogren.
Adems de la hemaglutinacin pasiva, se han utilizado otras pruebas para la
deteccin de estos autoanticuerpos como la fijacin de complemento, la
inmunofluorescencia y el radioinmunoensayo.

PRIMERA PARTE
TANADO Y SENSIBILIZACIN DE LOS GLBULOS ROJOS:

MATERIAL:
2 Tubos de ensayo de 13 x 100 mm
3 Pipetas de 5 ml (1/10)
2 Pipetas de 1 ml (1/100)
1 Gradilla
2 Pipetas capilares con bulbo
Bao de agua a 37
0
c
Bao de agua a 56
0
c
Centrifuga clnica
Papel Parafilm

REACTIVOS:
Solucin de Alsever o citrato de sodio al 3.8%
Amortiguador salino de fosfatos (PBS) pH = 7.2, = 0.15
Amortiguador salino de fosfatos (PBS) pH= 6.4 = 0.15
Amortiguador salino de fosfatos (PBS) pH = 7.2, = 0.15, adicionado de
suero normal de conejo al 1%.
Acido tnico diluido 1:20 000
Formaldehdo al 40%
Antgeno: Tiroglobulina humana purificada (HTG)
Sangre de carnero en solucin de Alsever

TCNICA:
TANADO DE LOS GLBULOS ROJOS:
1. Los glbulos rojos (G.R.), suspendidos en solucin de Alsever o citrato de
sodio 3.8%, lavarlos 3 veces con PBS pH = 7.2, centrifugando a 2 000
rpm durante 5 min.

2. Con el paquete celular preparar una suspensin al 2.5% V/V en PBS pH =
7.2.
3. Rotular 2 tubos de ensayo, uno S (sensibilizados) y otro NS (no
sensibilizados).
4. En cada tubo, pipetear 2 ml de la suspensin de eritrocitos de carnero al
2.5% (procurando que la suspensin este perfectamente homogeneizada).
5. Agregar un volumen igual de cido tnico 1:20 000 a cada tubo.
Inmediatamente tapar con papel parafilm y mezclar por inversin.
6. Incubar ambos tubos en bao Mara a 37 C durante 15 min. Agitar
eventualmente.
7. Centrifugar los dos tubos a 2 000 rpm durante 5 min, retirarles el
sobrenadante con pipeta Pasteur o por decantacin cuidadosa y
resuspender los paquetes de G.R. en 2 ml de PBS pH = 7.2 y volver a
centrifugar 5 min.
8. Retirar el sobrenadante y resuspender el paquete de G.R. de cada tubo en
2 ml de PBS pH= 6.4 para tener nuevamente la suspensin al 2.5%.

SENSIBILIZACIN DE LOS GLBULOS ROJOS CON ANTGENO:
1. Los G.R. tanados se sensibilizan agregando un volumen igual de la
dilucin ptima de antgeno en PBS pH= 6.4. Para ello al tubo rotulado S
agregarle 2 ml de la dilucin ptima de antgeno (tiroglobulina humana).
2. Tapar con papel parafilm e incubar la mezcla en bao de agua a 37 C
durante 15 min. Agitar eventualmente.
4. Retirar las clulas del bao de agua y centrifugar 5 min a 2000 rpm.
5. Decantar el sobrenadante y lavar las clulas dos veces por centrifugacin
a 2000 rpm por 5 min con PBS pH = 7.2, adicionado de suero normal de
conejo al 1%.
6. Ajustar el paquete de clulas al 1.5% resuspendiendo en 3.3 ml de PBS
pH= 7.2 adicionado de suero normal de conejo al 1%.
7. Al tubo rotulado NS que contiene los 2 ml de eritrocitos tanados sin
sensibilizar, ajustarlos al 1.5% en el mismo amortiguador. Para ello
centrifugar, retirar el sobrenadante y agregar 3.3 ml de PBS pH = 7.2
adicionado de suero normal de conejo al 1%.



FORMALINIZACIN DE LOS GLBULOS ROJOS:
Este procedimiento se realiza para preservar los GR cuando se preparan grandes
cantidades, para utilizarse durante mucho tiempo (duran hasta 6 meses sin
disminuir su actividad antignica).
1. A los G.R. sensibilizados y sin sensibilizar se les adiciona lentamente 1 ml
gota a gota de formaldehdo al 40% por cada 10 ml de suspensin (a cada
tubo agregar 0.2 ml de formaldehdo al 40%).
2. Dejar reposar 18 h a 4

C.
3. Agregar otros 0.2 ml de formaldehdo al 40% a cada uno de los tubos.
4. Cuando las clulas han sedimentado (despus de 2 3 das) se retira el
sobrenadante y se resuspenden las clulas en su volumen original de PBS
pH = 7.2 adicionado de suero normal de conejo al 1%.
5. Se agitan nuevamente las clulas y se aade 1 gota (0.05 ml) de
formaldehdo al 4%.

DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN PTIMA DE ANTGENO:
1. Preparar 4 diluciones del antgeno HTG en PBS pH= 6.4: por ejemplo
1:20, 1:40, 1:80 y 1:160.
2. Sensibilizar los G.R. con cada dilucin de antgeno como se indic
anteriormente.
3. Probar con un suero positivo y otro negativo, cada una de las diluciones.
La mas baja dilucin de antgeno, que de el ttulo ms elevado con el
suero inmune y no reaccione con el suero negativo se considerar el
ptimo.


SEGUNDA PARTE:
DESARROLLO DE LA PRUEBA

MATERIAL:
1 Micropipeta de 25 l
1 Placa de microtitulacin fondo en U
1 Microdilutor
Bao de agua a 56
o
c.
Rotor


REACTIVOS:
Suspensin de G.R. al 1.5% sensibilizados con el Ag
Suspensin de G.R. al 1.5% no sensibilizados
Suero control positivo
Suero control negativo
Suero problema diludo 1:8
Amortiguador de fosfatos PBS pH = 7.2 adicionado de suero normal de
conejo al 1%.

TCNICA:
1. Inactivar los sueros problema a 56

C durante 30 min o a 63

C por 3 min.
2. A todas los pozos de las filas A, B, C, D y E de la placa de microtitulacin
agregar con una micropipeta 25 l de suero normal de conejo al 1% diluido
en PBS pH= 7.2.
3. Cargar el microdilutor con 25 l de suero problema y colocarlos en la
primera poza de la fila A; mezclar completamente y transferir 25 l a la
poza siguiente, repitiendo este proceso hasta la ultima poza de la hilera de
donde se descartan 25 l.
4. A cada dilacin del suero, agregar con una micropipeta 25 l de la
suspensin de glbulos rojos al 1.5% sensibilizados.
5. Colocar la placa en el rotor y agitar de 1 min.
6. Dejar reposar la placa a temperatura ambiente durante 2 a 3 horas
cubrindola; hacer la lectura.

Al mismo tiempo se corren los siguientes controles:
Control para Ac heterfilos: Probar las mismas diluciones del suero problema con
eritrocitos sin sensibilizar (fila B).
Control positivo: Hacer las mismas diluciones del suero control positivo y agregar
25 l de eritrocitos sensibilizados a cada una de las pozas (fila C).
Control negativo: Realizar la misma operacin con un suero negativo conocido (fila
D).
Control del diluente: Depositar 25 l de PBS pH = 7.2 adicionado de suero normal
de conejo al 1% en una hilera de pozas (fila E) y agregar 25 l de la suspensin
de clulas sensibilizadas al 1.5%. Esta reaccin deber ser negativa.


BIBLIOGRAFA
Boyden, S:U: 1951. The adsorption of proteins on erithrocytes treated with
tannic acid and subsequent hemagglutination by antiprotein sera. J. Exp. Med.
93: 107-120.
Tcnica modificada por el Centro de Control de Enfermedades de los Estados
Unidos.
Weir D. Handbook of experimental Inmunology. 2. Ed. Blackwell Sci. Pub.
Oxfortd 1973. Cap. 20: Passive haemaglutination with special reference to the
tanned cell technique.
Fudenberg H:H:, Daniel P: S:, Joseph D: C: & J. Vivian W. Manual de
Inmunologa Clnica. Edit. El Manual Moderno S:A:, Mxico 1978.