PCR

Reao em Cadeia de Polimerase

IV CURSO DE VERO EM BIOLOGIA MOLECULAR E GENMICA
MsC. Ingrid Thas Beltrame Botelho doutoranda
ingridthaisbb@hotmail.com

O que PCR?
Amplificao de um segmento especfico de
DNA dentro de um genoma (gene ou parte
dele, regies supervariveis, Junk DNA, etc.)


Fotocopiadora molecular
PCR
Fonte: www.genomics.agilent.com
Cpias in vitro usando elementos bsicos
do processo de replicao natural do DNA.

nucleotdeos
Inventada* por Kary
Mullis em 1983.
Primeira publicao em
1985 (Methods in Enzymology)
Recebeu o Prmio Nobel de
Qumica em 1993.
PCR
Atualmente...
PCR
Em 2004...
14983
2013: 3667
Ambiente adequado
gua
Tampo
DNA molde
Iniciadores*
Nucleotdeos
Mg++
DNA Polimerase (Taq)*
Reagentes Necessrios para a Reao
PCR
1989 - DNA Thermal Cycler, primeiro termociclador
automtico
PCR
Ciclos de Temperatura
1. Temperatura de desnaturao do DNA
2. Temperatura de ligao dos iniciadores
3. Temperatura de extenso da fita de DNA
PCR
http://passel.unl.edu/pages/animation.php?a=PCR.swf
Final: Programa-se o termociclador para um hold, de 0 a 4C, para manter
as amostras conservadas at o momento de estocagem
Desnaturao inicial: 4 minutos a 94C suficiente para a
grande maioria dos casos.
Desnaturao: 1 minuto a 94C
Ligao: 1 minuto operando na temperatura de ligao
especfica do primer, podendo ser aumentada at 90
segundos.
Extenso: Temperatura tima da enzima. Para a Taq, utiliza-se 1
minuto a 72C, podendo ser aumentada at 2 minutos de acordo
com a quantidade utilizada, o nmero de ciclos e o tamanho do
produto desejado
Extenso Final: Aps o trmino dos ciclos, costuma-se
acrescentar um passo de 4 minutos a 72C, como
oportunidade adicional para a polimerase agir
PCR
gua
DNA molde
Nucleotdeos
Iniciadores*
DNA Polimerase (Taq)*
Tampo
Mg++
Reagentes Necessrios para a Reao
Quantidade mnima de DNA

Complexidade do DNA
De plasmdeos a genomas completos
Pureza
Protenas, lipdeos, outro DNA, reagentes extrao

Degradao

Inibidores
- EDTA, heparina

Contaminao
Produtos amplificados
DNA molde


Reagentes Necessrios para a Reao
Dissolvido em gua (deionizada estril)

tampo (TE = Tris-EDTA; HEPES;
NaOH 0,8M em gua, etc.)
estoc-lo por longos perodos de tempo
20C - por at 2 anos em tampo apropriado.
PCR
Desoxinucleotdeos dNTPs
(dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
!Soluo estoque de 10mM em
gua e pH 8,1* sem pirofosfato
! Em concentraes iguais*
! Concentrao final entre 20 e
200!M, dependendo do
tamanho do segmento e
durao da reao
! Altas concentraes afetam
especificidade dos iniciadores
PCR
Inciadores / oligonucleotdeos/
primers
Reagentes Necessrios para a Reao
Complementar a seqncia
do DNA molde
15 a 30 pares de base*
Contedo de C/G 45 a 55%*
Normalmente sense e antisense/
Foward e reverse

Concentrao tima 0,1 a 0,5M
Validade
Nmero de congelamentos e
descongelamentos
Contaminao
Quantidade
Pouco: pouca amplificao
Muito: pouca amplificao
Considerar:
PCR
Desenhando Iniciadores
Primer-Dimers (anelamentos Sense/Antisense),
(c) Evitar las secuencias repetidas
5
5
3
3
5
5
3
3
Dmero de primer
PCR
3 repetido
5-NNNNNNNNNNNNNTATA-3
5-NNNNNNNNNNNNNTATA-3
5-NNNNNNNNTATA-3
3-ATATNNNNNNNN-5
Facultad de Farmacia y Bioqumica, UBA
Self-Dimers (anelamentos Sense/Sense ou Antisense/Antisense)
(c) Evitar las secuencias repetidas
5
5
3
3
no hay extensin
PCR
5 repetido
5-TATANNNNNNNNNNNNN-3
5-TATANNNNNNNNNNNNN-3
5-TATANNNNNNNN-3
3-NNNNNNNNATAT-5
5
5
3
3
Facultad de Farmacia y Bioqumica, UBA
Hairpins (dobramentos da cadeia de um primer , fazendo com que
ela se pareie consigo mesma).
(c) Evitar las secuencias repetidas
5
5
3
3
Productos de PCR no deseados
PCR
Formacin de horquillas
5-NNNNNNNNNNNGCATGC-3
5-NNNNNNNNNNNNNNNNN-3
5-NNNNNNNNNNNGCA
3-CGT
5
3
Facultad de Farmacia y Bioqumica, UBA
Fonte: http://www.lgcm.icb.ufmg.br/software/cursoBionumerics/Confeccao_oligonucleotideos_iniciadores.pdf
Taq DNA polymerase
Thermus
aquaticus
Estvel at 117C
PCR
Thomas Brock - 1976
5 ! 3 / sem atividade corretiva!
Taq DNA Polimerase
" 0,4 a 1U da enzima para reaes de 25l finais.
" Para reaes longas usar mais enzima ou
escolher mais estvel
" Em geral so forenecidas conjuntamente com
soluo-tampo especfica, cuja composio
varia com o fabricante.
Non-Proofreading
!alguns erros na seqncia do fragmento final.
! adiciona uma adenina (A) extra s extremidades 3 do DNA **
Proofreading
! no adicionam nucleotdeos extras nas bordas das
cadeias-filhas

! Com atividade corretiva 3 ! 5
Pfu (de Pyrococcus furiosis) e a Tli (de Thermococcus litoralis) Promega, Gold da Perkin-
Elmer, Platinum da Life-Technologies, Vent da New England Biolabs, Pwo polimerase da
Boehring.
PCR
PCR
" Ao usar proofreads usar maior concentrao de dNTPs
(mnimo 200M de cada) para evitar destruio dos iniciadores.
Cuidar com Mg
2+
e dNTPs!
" A incorporao de bases erradas (mismatch)em
enzimas sem atividade corretiva reduz a
estabilidade da interao enzima com o DNA
molde, o que pode favorecer a interrupo da
polimerizao
Inibidores da enzima Taq DNA
polimerase
" Fenol
" Proteinase K
" Agentes quelantes em excesso (EDTA)
" Hemoglobina
" SDS
" Elevadas concentraes de sal
Soluo-tampo
* ons diversos (Na+, Cl-, K+, entre outros)
* Detergentes (Tween 20, Triton X-100, Nonidet P-40)
* Protenas estabilizantes (BSA)
* Substncias que agem na denaturao da cadeia
mol de de DNA ( DTT = Di t hi ot hr ei t ol , !-
mercaptanoethanol), quebrando as pontes de
hidrognio entre as bases.

PCR
37,5mL (750mM) 1750!L (35mM) 5mL (100mM) - - 12
12,5mL (250mM) 1750!L (35mM) 5mL (100mM) - - 11
37,5mL (750mM) 750!L (15mM) 5mL (100mM) - - 10
12,5mL (250mM) 750!L (15mM) 5mL (100mM) - - 9
37,5mL (750mM) 1750!L (35mM) - 5mL (100mM) - 8
12,5mL (250mM) 1750!L (35mM) - 5mL (100mM) - 7
37,5mL (750mM) 750!L (15mM) - 5mL (100mM) - 6
12,5mL (250mM) 750!L (15mM) - 5mL (100mM) - 5
37,5mL (750mM) 1750!L (35mM) - - 5mL (100mM) 4
12,5mL (250mM) 1750!L (35mM) - - 5mL (100mM) 3
37,5mL (750mM) 750!L (15mM) - - 5mL (100mM) 2
12,5mL (250mM) 750!L (15mM) - - 5mL (100mM) 1
KCl MgCl
2

Tris-HCl
pH 9,2
Tris- HCl
pH 8,8
Tris-HCl
pH 8,3
Tampo
Matriz dos 12 Tampes utilizados na otimizao das reaes de PCR
Adaptado do kit Opti-Primer - Stratagene (Califrnia)
Ateno!
Concentraes de KCl maiores que
50mM inibem a atividade das
polimerases)
PCR
Mg
2+
Co-fator essencial para a atividade
da Taq DNA polimerase
EDTA altera concentrao do
magnsio livre na reao

Quantidade pode variar:
0.5 a 3.0 M sugerido
Muito pouco: Taq no trabalha
Muito: mispriming, primers-
dimers
PCR
Extras
Glicerol, DMSO (Dimetilsulfxido)

0,1 a 10% na reao
- Estabiliza Taq,
- Ajuda na denaturao das
fitas DNA
Algumas Taq j vem
adicionadas com ele

BSA
Reagentes Necessrios para a Reao
Curso UNIVILLE
PCR
Parmetros a serem avaliados
se algo der errado
Quantos ciclos?
Desnaturao a que temperatura?
Quanto tempo?
Taq perde atividade em altas T
C:
Meia-vida a 95C: 40 min
Meia-vida a 97.5C: 5 min
Curso UNIVILLE
PCR
Temperatura de Ligao dos Iniciadores
Baseia-se na Tm padro
Tentativa e erro
Muito alta: nenhum produto
Muito baixa: produtos
inespecficos
Gradiente de temperatura
Necessrio principalmente nos
primeiros ciclos
PCR
Caneleta

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12
TC

45,9

46,7

48

49,9

52,1

54,4

56,9

59,3

61,4

63

64,2

65

Gradiente de Temperatura
SC61 SC58
Macias Choachi
H8GS D3493
Palma 2 H14
TM
Macias
Palma 2
PCR
O que fazer?
Hot-Start PCR
Taq adicionada somente aps passo de
desnaturao inicial

Touchdown PCR
Temperatura de ligao dos iniciadores
reduzida progressivamente
PCR
Mais Ciclos = Mais DNA
Number of cycles
0 10 15 20 25 30
Size
Marker
PCR
Tipos de reao
de PCR
PCR
PCR Multiplex
Mais de um segmento genmico
amplificado numa nica reao,
cada um com seu par de primers
especfico.
Onde usar? Investigao de paternidade
Diagnstico de doenas
Identificao de transgnicos
PCR
Multiplex PCR:
Detecta vrios genes de uma s vez
Identificao de trnasgnicos

Controle interno
PCR
PCR Multiplex : Exemplo
Trs pares de iniciadores
Qual o transgnico?
Effect Gene
Marker Gene
Control Gene
PCR
Melhorar especificidade e eficincia da reao
Nested PCR
Duas etapas (rounds) de amplificao
concomitantemente ou em duas reaes separadas
Semi-Nested PCR
PCR
PCR
RNA, que convertido em cDNA (DNA complementar)
RT-PCR
(Reverse Transcriptase Chain Reaction):
Ferramenta til em estudos de expresso gnica
PCR
PCR
Por que usar PCR?
PCR pode amplificar quantidade incrvel de DNA
(visvel em gel de eletroforese) em ~2 horas.
Trabalha com amostras mnimas de DNA,
extradas de pequenas quantidades de sangue,
pele, folculos pilosos, esperma, culturas ou at
mesmo de fragmentos de fsseis
O produto de PCR pode ser digerido com
enzimas de restrio, sequenciado ou clonado.

PCR
Aplicaes
Diagnstico de infeces: bactrias, vrus, fungos, protozorios
Diagnstico de mutaes gnicas
Diagnstico de doenas genticas
Estudo da expresso gnica: deteco e quantificao de RNA
em: diferentes tipos celulares
ao longo do desenvolvimento
Quantificao de DNA ou RNA viral/clula hospedeira
PCR
Aplicaes
Engenharia Gentica
Seqenciamento de DNA
Diagnstico de paternidade
Medicina Forense
PCR
M
W

L
a

L
b

L
c

H
-
1

H
-
2

H
-
3

H
-
4

N
C

bp
587 -
458 -
298 -
236 -
Amplificao do gene do spliced-leader de
diferentes cepas de Leishmania spp.
Grisard et al., 2000
PCR
PCR
Identificao de mutaes pontuais atravs da eliminao/criao de stios de
restrio e gerao de fragmentos de digesto com polimorfismo de
comprimento a partir de produtos de PCR (PCR/RFLP).
PCR
Uma PCR com um primer s...e amplificando qualquer
DNA
Primer (10 a 15 bases)
Temperatura de pareamento ou annealing < 45C
Nmero de bandas superior a 4 e polimrficas (isto ,
com diferentes migraes) para indivduos diferentes
RAPD PCR
Randomly Amplified Polymorphic DNA
PCR
PCR
O RAPD permite no apenas discriminar
ent r e popul aes di f er ent es de
organismos, mas inferir sua correlao
filogentica

PCR