Determinao do Carbono

da Biomassa Microbiana do
Solo (BMS-C)
Edmilson Evangelista da Silva
1
Pedro Henrique Sabadin de Azevedo
2
Helvcio De-Polli
3

1
Doutorando em Fitotecnia, UFRRJ BR 465, km 07, Caixa Postal 74505, CEP 23890-000, Seropdica, RJ. E-mail: edmilson@cnpab.embrapa.br
2
Graduando em Qumica, UFRRJ. E-mail: pedrosabadin@hotmail.com
3
Pesquisador Embrapa Agrobiologia, BR 465, km 07, Caixa Postal 74505, CEP 23890-000, Seropdica, RJ. E-mail: depolli@cnpab.embrapa.br
Introduo
As metodologias para a estimativa da BMS-C tem
sido objeto de ajustes e crticas, entretanto as
propostas descritas por VANCE et al. (1987) e
TATE et al. (1988) proporcionaram avanos
significativos na quantificao dessa biomassa
viva dos microrganismos do solo (DE-POLLI &
GUERRA, 1999). Em trabalho realizado por
(ANDREA & HOLLWEG, 2004) confirmaram que a
fumigao-extrao, com base no trabalho
realizado por VANCE et al. (1987), o mais
adequado determinao da BMS-C. O mtodo
mais rpido sendo empregado sem maiores
limitaes em solos cidos e com adio recente
de matria orgnica, porm devendo-se evitar
solos com teores de carbono muito elevados,
sendo aplicvel para solos com teores inferiores a
100g de C kg
-1
de solo (SPARLING & WEST,
1988).
O conhecimento dos nveis de BMS-C no solo se
tornam importantes para conservao da matria
orgnica do solo, monitoramento de reas sob
influncia antrpica, servindo como sensvel
indicador de alteraes provocadas no ambiente.
Objetivou-se com este documento apresentar de
forma sucinta, adaptaes na metodologia
originalmente proposta por VANCE et al. (1987),
com algumas modificaes obtidas em trabalhos
de outros autores, criando desta forma uma
metodologia simplificada e de mais fcil uso na
determinao do BMS-C.
Mtodo
Fumigao-extrao segundo VANCE et al.
(1987), sendo a relao solo extrator 1:2,5
segundo TATE et al. (1988) e k
C
=0,33
preconizado por SPARLING & WEST (1988),
realizando fumigao com adio de clorofrmio
(isento de etanol) diretamente na amostra, como
descrito por BROOKES et al. (1982) e WITT et al.
(2000), mantendo-as em local escuro por 24
horas, procedendo-se a extrao e quantificao
do carbono microbiano pelo mtodo (WALKLEY &
BLACK, 1934) modificado segundo TEDESCO et
al. (1995), sem aquecimento externo em chapa.
Vale ressaltar que a fumigao tambm pode ser
feita sob vcuo com uso de dessecador conforme
metodologia original de VANCE et al. (1987).
Materiais e equipamentos necessrios
Para fumigao
- Frascos de vidro de 100 mL com tampa;
- Pipeta com graduao de 1 mL;
- Clorofrmio P.A. (CHCl
3
) isento de etanol;
ISSN 1517-8862
Agosto/2007
Seropdica/RJ
Comunicado98
Tcnico
Determinao do Carbono da Biomassa Microbiana do Solo (BMS-C)
2
Para extrao
- Balana analtica com preciso de 0,1 mg;
- Frascos de vidro de 100 mL com tampa;
- pHmetro;
- Balo volumtrico de 100 e 1000 mL;
- Becher de 100 e 1000 mL;
- Soluo de hidrxido de potssio (KOH) 0,5 M:
pesar 28,0528 g de hidrxido de potssio.
Transferir para um becher de 1000 mL,
adicionar cuidadosamente 700 mL de gua
deionizada. Dissolver e transferir
quantitativamente para um balo volumtrico
de 1000 mL aferindo o volume com gua
deionizada aps resfriamento;
- Soluo de cido sulfrico 0,5 M: transferir
27,18 mL de cido sulfrico PA com auxlio de
dispensador automtico de 0 a 50 mL para um
becher de 1000 mL contendo 100 mL de gua
deionizada, em capela de exausto. Adicionar
mais 700 mL de gua deionizada,
homogeneizar a soluo no becher e transferir
quantitativamente para um balo volumtrico
de 1000 mL, aferindo o valor com gua
deionizada;
- Soluo de sulfato de potssio (K
2
SO
4
) 0,5 M:
pesar 87,1001 g do sal, transferir para becher
de 1000 mL e adicionar 800 mL de gua
deionizada. Dissolver e transferir
quantitativamente para um balo volumtrico
de 1000 mL. Antes da aferio final do volume
da soluo deve-se corrigir o pH para a faixa
entre 6,5-6,8, transferindo uma alquota da
soluo solubilizada para um becher e
realizando a leitura no pHmetro. Se necessria
correo do pH, adicionar no balo gotas de
soluo de hidrxido de potssio (KOH) 0,5 M
se o meio estiver cido e gotas de cido
sulfrico (H
2
SO
4
) 0,5 M se o meio estiver
bsico, sempre retornando a alquota origem
e realizando a leitura aps cada adio. Aps
correo do pH, aferir o volume 1000 mL
com gua deionizada;
- Dispensador automtico com capacidade de 0
a 50 mL;
- Agitador orbital;
- Funil;
- Papel de filtro (filtragem rpida) de 28 m;
- Tubos de 50 mL com tampa;
Para determinao do carbono microbiano
- Pipeta automtica de 10 mL;
- Erlenmeyer de 250 mL;
- Soluo de dicromato de potssio (K
2
Cr
2
O
7
)
0,066 M: pesar 19,4161 g do sal, previamente
seco em estufa 105C e transferir para um
becher de 1000 mL, adicionando 700 mL de
gua deionizada. Dissolver e transferir
quantitativamente para um balo volumtrico,
aferindo o volume 1000 mL com gua
deionizada;
- cido sulfrico (H
2
SO
4
) P.A.;
- cido orto-fosfrico (H
3
PO
4
) P.A.;
- Difenilamina ((C
6
H
5
)
2
NH) 1% (m/v) em H
2
SO
4
:
pesar 1,000 g de difenilamina, transferir para
um becher de 100 mL, adicionar 50 mL de
cido sulfrico concentrado, dissolver e
transferir quantitativamente para um balo
volumtrico de 100 mL, aferindo o volume
100 mL com o mesmo cido;
- Agitador magntico;
- Soluo de sulfato ferroso amoniacal
[(NH
4
)
2
Fe(SO
4
)
2
.6H
2
O] 0,033 M: pesar 13,000
g do sal, transferir para um becher de 1000 mL
e dissolver em 600 mL de gua deionizada,
adicionar 10 mL de cido sulfrico e transferir
quantitativamente para um balo volumtrico
de 1000 mL aferindo o volume a 1000 mL com
gua deionizada;
- Bureta ou titulador automtico com preciso
de 0,01 mL.
Amostra
As amostras devem ser coletadas em pontos e
profundidades previamente determinados,
conforme o planejamento da pesquisa. A umidade
do solo nas amostras para o processamento
poder ser em torno de 60% da capacidade de
campo ou conforme o objeto da pesquisa. As
amostras devem ser imediatamente armazenadas,
sendo mantidas o mais prximo das condies em
que foram coletadas at sua chegada ao
Determinao do Carbono da Biomassa Microbiana do Solo (BMS-C)
3
laboratrio, onde sero preparadas, procedendo
as anlises em at trs dias ou armazenadas em
geladeira a 4C por at dez dias.
Limitaes do mtodo
O mtodo possui limitaes quanto a
replicabilidade, pois sua utilizao se d em
amostras "frescas" de solo, com isso, posteriores
coletas podem divergir quanto aos resultados,
levando a alta variabilidade at mesmo em
replicas de laboratrio, sendo necessrio o uso de
triplicatas. Outro fator importante est na umidade
do solo, pois solos com alto teor de umidade so
de difcil manuseio no processo de tamisagem,
alm de influir negativamente na fumigao do
solo, interferindo na difuso do clorofrmio. Em
contrapartida solos muito secos so
desfavorveis, pois os microorganismos se
encontram em forma latente, e portanto sua
membrana celular menos susceptvel ao
rompimento no processo de fumigao,
subestimando o valor real da biomassa
microbiana. Para evitar tais inconvenientes
aconselha-se que a amostragem de campo seja a
mais prxima possvel de 60 % da capacidade de
campo do solo.
Como citado acima, por possuir uma alta
variabilidade e a anlise realizada em triplicata,
seu uso em larga escala pouco prtico,
dependendo da capacidade analtica do
laboratrio e a experincia dos envolvidos na
anlise.
Procedimento
Preparao da amostra
As amostras recm coletadas devem ser
peneiradas em malha de 2 mm, retirando-se os
fragmentos de animais e vegetais por meio de
catao, para que em seguida seja processada.
Determinao da umidade na capacidade de
campo do solo
A forma de determinao da umidade na
capacidade de campo do solo aqui descrita,
apesar de expedita, fornece preciso suficiente.
O mtodo baseia-se na determinao da umidade
do solo na capacidade mxima de reteno de
gua (capacidade de campo) e na determinao
da umidade do solo no momento da coleta das
amostras, para que se determine se a umidade do
solo na coleta correspondente desejada.
Realizar o preenchimento de proveta de 100 mL
com cerca de 80 mL de solo recm coletado e j
peneirado. Adicionar gua at que a frente de
molhao atinja cerca de 40 a 50 % do volume de
solo, recobrir a proveta com papel alumnio,
deixando o solo em repouso por 12 horas, ou at
que a frente de molhao estacione. A frente de
molhao no deve tocar o fundo da proveta, o
que invalidaria o procedimento, neste caso deve-
se repetir o teste com nova amostra com
quantidade menor de gua. Retirar uma poro de
solo da parte molhada, pesar e levar para estufa
105C por 24 horas ou at que o solo atinja peso
constante, obtendo o peso do solo seco
posteriormente. A determinao da umidade total
do solo na capacidade de campo e das amostras
oriundas do campo (para umidade total do solo)
obtida pela Equao 1:
U (g de gua g
-1
de solo) = (P
U
- P
S
)/P
S
Equao 1 Clculo para determinao da
umidade total do solo, onde: P
U
= peso do solo
mido ; P
S
= peso do solo seco, usado tanto para
a amostra de solo trazida do campo quanto a
retirada da proveta.
Para determinar a umidade percentual relativa
(U
R
) das amostra frescas de solo frente umidade
do solo na capacidade de campo utilizada a
Equao 2:
U
R
(%) = (U
A
/U
C
) . 100
Equao 2 Determinao da umidade percentual
relativa, onde: U
R
= umidade relativa do solo
fresco frente a capacidade de campo; U
A
=
umidade do solo amostrado (g de gua g
-1
de
solo); U
C
= umidade do solo na capacidade de
campo (g de gua g
-1
de solo).
Procedimento analtico
As amostras sero analisadas em triplicata, para
isto, cada amostra ser dividida em sete sub-
amostras de 20 g (trs fumigadas, trs no-
fumigadas e uma para obteno da umidade do
solo), devidamente pesadas e acondicionadas em
frascos de vidro de 100 mL.
Determinao do Carbono da Biomassa Microbiana do Solo (BMS-C)
4
Cabe ressaltar que podem ser utilizados os
mesmos extratos obtidos na fumigao-
extrao realizada para determinao da BMS-
N (nitrognio da biomassa microbiana do
solo), conforme descrito por SILVA et al.
(2007).
Determinao da umidade do solo
O frasco previamente destinado determinao
de umidade do solo deve ser seco em estufa a
105C por 24 horas ou at obter peso constante.
Aps seca, a amostra deve ser acondicionada em
dessecador at equilbrio de temperatura e em
seguida pesada.
Fumigao
Imediatamente aps a pesagem da amostra de
solo adicionar aproximadamente 1 mL de
clorofrmio isento de etanol com o auxlio de uma
pipeta com graduao de 1 mL, em todos os
frascos destinados a fumigao (Figura 1). Os
frascos so em seguida fechados e armazenados
em local isento de luminosidade por 24 horas, com
temperatura em torno de 25 a 28C. No dia
seguinte retirar a tampa dos frascos em capela de
exausto, deixando evaporar todo o clorofrmio
presente at eliminao completa, como
preconizado por BROOKES et al. (1982) e WITT
et al. (2000).
Figura 1 Adio direta de clorofrmio na amostra
Extrao
A extrao se d nas amostras fumigadas, aps
tempo de fumigao de 24h, seguida de
eliminao dos resduos de clorofrmio, e nas
no-fumigadas, realizado imediatamente aps
pesagem, procedendo da seguinte forma:
Adicionar 50 mL de soluo 0,5 M de sulfato de
potssio (K
2
SO
4
), com o auxlio de um
dispensador de 0 a 50 mL.
Agitar por 30 minutos em agitador orbital a 220
RPM, esperar decantar por 30 minutos e transferir
o sobrenadante com o auxlio de uma pipeta para
um filtro de papel acoplado a funil e tubo de
50 mL, evitando resuspenso e recuperao de
material decantado (Figura 2). Ao final da filtragem
obtido o extrato de cada sub-amostra (fumigada
ou no-fumigada), que devem ser direcionadas
para quantificao do carbono microbiano ou
armazenados em geladeira a 4C por no mximo
10 dias.
Figura 2 Fitrao do material extrado
Determinao do carbono microbiano
Transferir 8 mL do extrato previamente filtrado
para um Erlenmeyer de 250 mL. Adicionar 2 mL
de soluo 0,066 M de dicromato de potssio, 10
mL de cido sulfrico P.A. e 5 mL de cido orto-
fosfrico P.A., todos com o auxlio de dispensador,
e em ordem cronolgica. Esperar esfriar e
adicionar cerca de 70 mL de gua deionizada,
esperar esfriar novamente, adicionar
aproximadamente 4 gotas de difenilamina e titular
sob agitao magntica com uma soluo 0,033 M
de sulfato ferroso amoniacal. Ao final da titulao,
a colorao da soluo ir do prpura (A) para
verde (B) (Figura 3).
Determinao do Carbono da Biomassa Microbiana do Solo (BMS-C)
5
Figura 3 Ponto estequiomtrico da volumetria de oxi-reduo
Clculo da molaridade exata da soluo
de sulfato ferroso amoniacal
[(NH
4
)
2
Fe(SO
4
)
2
.6H
2
O] 0,033 M
Para a realizao da padronizao (molaridade
exata) da soluo de sulfato ferroso amoniacal
utilizar a Equao 3, posteriormente a
quantificao do carbono microbiano pois
necessitam-se dos valores das amostras controle
(branco):
M
1
= [(M
2 .
V
2
). 6] / V
1
Equao 3 Determinao da molaridade exata
do sulfato ferroso amoniacal, onde: M
1
-
Molaridade exata padronizada do sulfato ferroso
amoniacal; M
2
- Molaridade exata do dicromato de
potssio (0,066 M); 6 Razo estequiomtrica
(K
2
Cr
2
O
7
); V
1
- volume de sulfato ferroso
amoniacal gasto na titulao da amostra controle
(branco); V
2
- Volume da alquota de dicromato de
potssio utilizada.
Clculo do teor de C nos extratos
(Equao 4)
2
6
1 1
V . Ps
10 . V . 003 , 0 . M . ) Va Vb (
) solo kg C mg ( C

=

Equao 4 Determinao do carbono nos

extratos fumigado e no-fumigado do solo, onde:
C - carbono extrado do solo; Vb (mL) - volume do
sulfato ferroso amoniacal gasto na titulao da
soluo controle (branco); Va (mL) - volume de
sulfato ferroso amoniacal gasto na titulao da
amostra; M - Molaridade exata do sulfato ferroso
amoniacal; V
1
- volume do extrator (K
2
SO
4
)
utilizado; V
2
alquota pipetada do extrato para a
titulao; 0,003 - miliequivalente do carbono; Ps
(g) - massa de solo seco.
Clculo da BMS-C
O clculo da BMS-C dado pela Equao 5,
utilizando k
C
=0,33 descrito por SPARLING &
WEST (1988):
BMS-C (mg C microbiano kg
-1
solo) = FC . k
C
-1
Equao 5 Clculo da biomassa microbiana do
solo, onde: BMS-C carbono da biomassa
microbiana do solo em mg de C por kg de solo (ou
g g
-1
); FC - fluxo obtido da diferena entre a
quantidade de C (mg kg
-1
), da Equao 4,
recuperada no extrato da amostra fumigada e a
recuperada na amostra no fumigada e k
C
- fator
de correo.
Determinao do Carbono da Biomassa Microbiana do Solo (BMS-C)
6
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Comunicado
Tcnico, 98
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