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PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS


BIO 226E
AO 2013




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TRABAJO PRCTICO N2:
TCNICAS DE DIAGNOSTICO MOLECULAR DE ENFERMEDADES HEREDITARIAS


INTRODUCCIN

Las tcnicas de diagnstico molecular para la deteccin de mutaciones o
polimorfismos, se basan en los cambios que genera un cambio nucleotdico en las
propiedades fsico qumicas de la molcula de DNA. Los cambios nucleotdicos,
deleciones e inserciones alteran la estructura primaria del DNA. Estos cambios pueden
alterar las propiedades de apareamiento complementario, su tamao, generar o eliminar
sitios de corte de enzimas de restriccin, siendo todas estas alteraciones reflejadas
finalmente en su movilidad electrofortica.

OBJETIVO GENERAL

Familiarizar a los alumnos con tcnicas bsicas de diagnstico gentico, como son el
PCR, el uso de enzimas de restriccin y la tcnica de Heterodobletes (HDX), en conjunto
con electroforesis.

Muestras problema: se analizarn muestras de pacientes con cncer de mama
hereditario (genes BRCA1, BRCA2) y pacientes con Distrofia Muscular de Duchenne
(gen Distrofina). Mediante el uso de electroforesis, se detectarn deleciones en el gen de
la distrofina y se analizarn mutaciones puntuales y polimorfismos, en los genes BRCA1,
BRCA2 y ATM mediante el uso de enzimas de restriccin y la tcnica de Heterodobletes.


I. DETECCIN DE DELECIONES POR ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA.

La Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), se caracteriza por una atrofia
muscular en las piernas y pelvis, la cual se asocia con una prdida de la masa muscular,
que progresa rpidamente. Los sntomas generalmente aparecen antes de los 6 aos de
edad. Es una enfermedad recesiva, ligada al cromosoma X, que se genera como resultado
de mutaciones heterogneas, principalmente deleciones, en el gen de la Distrofina. El
gen de la Distrofina presenta un tamao de 2,4 Mb, tiene 79 exones, y codifica un mRNA
de 14 Mb, siendo las deleciones de 18 exones especficos las responsables de un 60% de
los casos.
La deteccin de deleciones en el gen de la Distrofina se realiza usando la tcnica
de PCR mltiple, en el cual se combinan 9 parejas de partidores en dos juegos diferentes
llamados Chamberlain (descrito por J. S. Chamberlain) y Beggs (descrito por A.H.
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Beggs). Estos 2 juegos de partidores amplifican los 18 exones ms frecuentemente
delecionados en la DMD, y que se muestran en la figura superior.


OBJETIVO: Detectar delecin de exones en el gen de la Distrofina, mediante el uso de PCR
mltiple, usando mezclas de partidores Chamberlain o Beggs.

1. AMPLIFICACIN DE GENES EN ESTUDIO MEDIANTE LA TCNICA DE PCR. La
amplificacin por PCR de los 18 exones se realizar previo al TP y a los alumnos se les
entregarn los productos ya amplificados.
La mezcla de amplificacin por PCR contiene los siguientes reactivos.
H2O 31,8 ul
Amortiguador Taq 10X 5
dNTPs 10 mM 4
MgCl2 25 mM 3
Mezcla partidores 5
Taq DNA Polimerasa (5 U/l) 0,2
DNA (100 ng/ul) 1
Volumen total 50


2. SEPARACIN DE LOS PRODUCTOS DE PCR POR ELECTROFORESIS EN GEL DE
NuSieve-AGAROSA 2,5%. (2:0,5)

El gel de agarosa a utilizar est previamente preparado de la siguiente forma:
Pese 0,5 g de agarosa y 2 g De NuSieve agarosa y agregue amortiguador TBE 1X hasta completar 100 ml.
Enfre con agitacin a una temperatura de alrededor de 60C. Agregue GelRed, para teir el DNA, a una
concentracin final de 1X. Selle los lados del portagel con cinta adhesiva e inserte la peineta. Suavemente
vierta la cantidad adecuada de agarosa en el portagel, asegurndose de que no queden burbujas.
Deje que la agarosa polimerice.
Remueva la peineta y la cinta adhesiva del portagel y deposite ste en la cmara de electroforesis.
Agregue suficiente amortiguador de electroforesis TBE 1X a la cmara para sumergir el gel alrededor de
2mm (aprox. 900 ml)


Los alumnos realizarn la colocacin de las muestras en el gel de agarosa.
Agregue 1 ul de amortiguador de carga 10X a 9 l de producto de PCR.
Cuidadosamente cargue los 10 l de cada muestra en los bolsillos utilizando una
micropipeta.
Conecte los polos de la cmara de electroforesis a la fuente de poder y realice la
electroforesis a aproximadamente 90 volts. Cuando el colorante haya migrado
hasta un cm antes del final del gel, apague la fuente de poder y desconecte los
cables. Cuidadosamente remueva el gel, colquelo sobre el transiluminador UV
para visualizar las bandas de DNA. El ayudante tomar una fotografa para subir
al sitio Web, con la cual usted realizar su informe.

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Figura 1: Gel de agarosa donde se muestran los exones del gen de la Distrofina
amplificados por PCR
a
tamao de producto de PCR (en pares de bases).
b
exn del gen de la Distrofina presente en el fragmento de PCR.













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II. DIGESTIN CON ENZIMA DE RESTRICCIN: DETECCION DIRECTA DE UNA
MUTACIN QUE ALTERA UN SITIO DE RESTRICCIN.

Las enzimas de restriccin (ER) son endonucleasas que reconocen secuencias
especficas del DNA. Existen distintos tipos de ER, segn sea el tipo de secuencia
conocida y el lugar de corte. El uso de ER en la deteccin de mutaciones ha sido
ampliamente difundido en el diagnstico molecular. Es importante destacar que para
utilizar esta metodologa el cambio en el DNA debe ser conocido previamente al igual
que el patrn de digestin que se obtendr. La figura adjunta muestra a la izquierda el
patrn de digestin del fragmento del gen que contiene la mutacin y del alelo normal. A
la derecha se muestra una foto del gel de agarosa con la migracin de las bandas de
DNA, para una de las mutaciones a analizar c.3936C>T.


OBJETIVO: Detectar mutaciones y polimorfismos conocidos que hacen perder o ganar
sitios de restriccin.
PROCEDIMIENTO: Usando la tcnica de PCR se amplifica el fragmento seleccionado,
luego el producto de PCR se incuba en presencia del enzima de inters y finalmente se
resuelve mediante electroforesis en gel de agarosa.
En esta parte del trabajo prctico se analizarn muestras de pacientes con cncer de
mama que presentan mutaciones y/o polimorfismos en los genes BRCA1 y BRCA2, o
ATM todos detectables por enzimas de restriccin.

Se les entregarn tubos de diferentes miembros de una familia cuyo DNA ha sido
tratado con ER segn los siguientes protocolos:

A. Deteccin de una mutacin presente en el gen BRCA1 denominada c.3936C>T
con enzima BstNI.
Amortiguador 10X (enzima restriccin BstNI) 6 ul
BSA (100 mg/ml) 0,5 ul
Enzima BstNI (10.000 U/ ml) 0,5 ul
H2O 33 ul
producto de PCR 20 ul
Volumen total. 60 ul

Incubar en bao termorregulado a 60C por 120 minutos.
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B. Deteccin de la variante allica presente en el gen BRCA1 denominada
c.3238G>A con enzima AluI.

Amortiguador 10X (enzima restriccin AluI) 5 ul
Enzima AluI (10.000 U / ml) 0,1 ul
H2O 24,9 ul
Producto de PCR 20 ul
Volumen total. 50 ul

Incubar en bao termorregulado a 37C por 120 minutos.

C. Deteccin de la variante allica presente en el gen ATM denominada c.2082T>C
con enzima Alw26I.

Amortiguador 10X (enzima restriccin Alw26I) 5 ul
Enzima Alw26I (10.000 U / ml) 0,1 ul
H2O 24,9 ul
Producto de PCR 20 ul
Volumen total. 50 ul
Incubar en bao termorregulado a 37C por 120 minutos.

D. Electroforesis en gel de NuSieve agarosa 2,5%.

Agregue 1 ul de amortiguador de carga 10X a 9 l de producto de la digestin por
ER. Cuidadosamente cargue los 10 l de cada muestra en los bolsillos del gel
utilizando una micropipeta.


III. ANLISIS DE DETECCIN DE MUTACIONES PUNTUALES Y POLIMORFISMOS
MEDIANTE LA TCNICA DE HETERODOBLETES (HDX).

El anlisis de heterodobletes se basa en el retardo de la migracin electrofretica
del heterodoblete de DNA, en comparacin a su homodoblete correspondiente, en un gel
de poliacrilamida parcialmente desnaturante.
La tcnica de anlisis por heterodobletes permite analizar en forma ptima
fragmentos que tienen entre 500 y 700 pares de bases, y es ms efectivo cuando el DNA
tiene un bajo contenido de GC (Guanina y Citosina).
En esta tcnica, el producto de PCR del gen que se est analizando es desnaturado
a 95C y luego renaturado lentamente a temperatura ambiente. Durante el proceso de
enfriamiento, las hebras de DNA complementarias se aparean formando homodobletes
de DNA; las hebras parcialmente complementarias tambin se aparean formando
heterodobletes de DNA. Debido a que en el heterodoblete hay segmentos donde las
hebras de DNA no se aparean, presenta una conformacin diferente al homodoblete, y
como consecuencia se mueve ms lento durante la electroforesis.
La formacin del heterodoblete y su estabilidad dependen principalmente del
tipo de mutacin que presente el fragmento de DNA analizado. Inserciones y deleciones
de ms de un nucletido son ms sensibles a la temperatura, a los solventes y a la fuerza
inica del amortiguador.
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PROTOCOLO.

1. Se le entregarn tubos que contienen las muetras de pacientes con cncer mama,
en las cuales ya se ha amplificado partes de los genes a estudiar.

2. Prepare las muestras a cargar en cada gel, de la siguiente manera:
Alicuotar la cantidad que se le indique del producto de PCR de cada muestra por
separado.
Agregar 1,1 ul de amortiguador HMA 10X a cada muestra.
Desnaturar las muestras en bao Mara por 5 minutos a 95C.
Dejar enfriar lentamente sobre el mesn hasta que la temperatura del agua llegue
a 37C.
Agregar 5 ul de solucin de carga 10X y cargar como se indique.


3. Electroforesis en gel de poliacrilamida.

Los geles han sido preparados previamente por lo cual usted debe hacer lo siguiente:

Limpiar los bolsillos con amortiguador y cargar las muestras.
Tapar la cmara y conectar a la fuente de poder verificando la polaridad
Seleccionar el voltaje en 170 V y el tiempo de acuerdo al tamao del fragmento de
DNA que se est analizando (1 hora).

6. Tincin del gel.

En esta etapa pida ayuda a su ayudante:
Una vez terminada la electroforesis, desmontar los vidrios de la cmara.
Separar los vidrios con cuidado para no romper el gel.
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Depositar el gel en una cubeta forrada con papel aluminio y agregar una solucin
de tincin con el componente GelRed 3X, en TBE 1X.
Dejar incubando en la solucin por 10 minutos a oscuras y posteriormente
observar el gel en un transiluminador UV.



IV. Anlisis de secuencias de DNA


La secuenciacin de DNA consiste en la sntesis enzimtica de hebras de
DNA en presencia de didesoxinucletidos trifosfato (ddNTPs), los cuales actan como
terminadores de la elongacin de la cadena de DNA naciente. Los ddNTPs son
anlogos de los desoxinucletidos trifosfato (dNTPs) que participan normalmente
en la sntesis de DNA, pero se diferencian de stos en que carecen del grupo hidroxilo
en la posicin 3 (Figura 1). Un ddNTP puede ser incorporado a una cadena de DNA
naciente mediante la formacin de un enlace fosfodister entre su grupo hidroxilo-5
y el hidroxilo-3 del ltimo dNTP de la cadena, pero impide la unin del prximo
dNTP, provocando as la terminacin prematura de la sntesis de la nueva cadena de
DNA.

A
_
B



_















Figura 1: A. Estructura de un desoxinucletido trifosfato (dNTP). B. Estructura
de un didesoxinucletido trifosfato (ddNTP).
En esta tcnica se utiliza un partidor marcado en su extremo 5 el cual se une a la
hebra de DNA que se desea secuenciar. El partidor es elongado por la DNA
Polimerasa en cuatro reacciones separadas que contienen los cuatro dNTPs
normales y, adems uno de los cuatro ddNTPs en una menor concentracin.
Una molcula de ddNTP puede ser incorporada al azar en cualquiera de
las posiciones correspondientes a su dNTP anlogo, y cuando esto ocurre, se
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detiene la elongacin de la cadena. De esta forma, cada una de las cuatro
reacciones produce una mezcla de cadenas de DNA terminadas prematuramente y
de distinta longitud, con un extremo 5 comn (determinado por la unin del
partidor a una regin especfica de la hebra de DNA molde) y un extremo 3
variable, que depende de la posicin en la que fue incorporado el ddNTP. Los
fragmentos resultantes que pueden variar en solo un nucletido, pueden ser
separados mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida desnaturante y la
secuencia puede ser leda luego de exponer el gel a una pelcula
autorradiogrfica.
A. Las 4 reacciones de terminacin de la cadena se realizan en un mismo tubo, con
cada uno de los 4 ddNTPs marcados con distintos fluorforos. En el secuenciador
automtico, las bandas del gel de electroforesis son atravesadas por un lser que
excita la marca fluorescente, la luz emitida es detectada por un fotomultiplicador,
el cual est conectado a un computador que colecta y analiza los datos.
B. Electroferograma de una secuencia automtica. La secuencia es representada por
una serie de picos de distintos colores, cada uno correspondiente a la
posicin de un nucletido.


























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ACTIVIDAD:

1. Lea cuidadosamente los electroferogramas con las secuencias de DNA.
2. Anote los cambios nucleotdicos encontrados, comparando con la secuencia
patrn.
3. Indique el efecto que puede predecir o sugerir del cambio nucleotdico en
la secuencia y/o estructura de la protena o del mRNA.


ANALISIS DE SECUENCIAS DE DNA
Describa los resultados encontrados luego de realizar los puntos 2 y 3 de
esta actividad, y haga una discusin sobre stos.

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REFERENCIAS:
Secuencias de partidores Chamberlain/Beggs: http://www.dmd.nl/exonprim.html#top
Chamberlain, J.S., Chamberlain, J.R., Fenwick, R.G., Ward, P.A., Caskey, C.T., Dimnik,
L.S., Bech-Hansen, N.T., Tantravahi, U., Richards, S., Covone, A.E., Romeo, G., Abbs, S.,
Bentley, D.R., Bobrow, M., Rysiecki, G., Ray, P., Boileau, C., Junien, C., Boehm, C., Venne,
V.L., Fujimura, F.K., Spiga, I., Ferrari, M., Tedeschi, S., Bakker, E., Kneppers, A.L.J., Van
Ommen, G.J.B., Jain, K., Spector, E., Crandall, B., Kiuru, A., and Savontaus, M.L. (1992).
Diagnosis of Duchenne's and Becker's muscular dystro phies by polymerase chain reaction: a
multicenter study. J. Am. Med. Assoc. 267:2609-2615.
Chamberlain, J.S., Gibbs, R.A., Ranier, J.E., and Caskey, C.T. (1990). Multiplex PCR for the
diagnosis of Duchenne muscular dystrophy. In: PCR protocols: a guide to methods and
applications. (M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky, and T.J. White, Eds). San Diego:
Academic Press, pp. 272-281.
Chamberlain, J.S., Gibbs, R.A., Ranier, J.E., Nga Nguyen, P.N., and Caskey, C.T. (1988).
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Beggs, A.H. (1994). Multiplex PCR for identifying dystrophin gene deletions. In: Current
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Beggs, A.H., Koenig, M., Boyce, F.M., and Kunkel, L.M. (1990). Detection of 98-percent
DMD/BMD gene deletions by polymerase chain reaction. Hum. Genet. 86:45-48


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