1 TRABAJO PRCTICO N2: TCNICAS DE DIAGNOSTICO MOLECULAR DE ENFERMEDADES HEREDITARIAS
INTRODUCCIN
Las tcnicas de diagnstico molecular para la deteccin de mutaciones o polimorfismos, se basan en los cambios que genera un cambio nucleotdico en las propiedades fsico qumicas de la molcula de DNA. Los cambios nucleotdicos, deleciones e inserciones alteran la estructura primaria del DNA. Estos cambios pueden alterar las propiedades de apareamiento complementario, su tamao, generar o eliminar sitios de corte de enzimas de restriccin, siendo todas estas alteraciones reflejadas finalmente en su movilidad electrofortica.
OBJETIVO GENERAL
Familiarizar a los alumnos con tcnicas bsicas de diagnstico gentico, como son el PCR, el uso de enzimas de restriccin y la tcnica de Heterodobletes (HDX), en conjunto con electroforesis.
Muestras problema: se analizarn muestras de pacientes con cncer de mama hereditario (genes BRCA1, BRCA2) y pacientes con Distrofia Muscular de Duchenne (gen Distrofina). Mediante el uso de electroforesis, se detectarn deleciones en el gen de la distrofina y se analizarn mutaciones puntuales y polimorfismos, en los genes BRCA1, BRCA2 y ATM mediante el uso de enzimas de restriccin y la tcnica de Heterodobletes.
I. DETECCIN DE DELECIONES POR ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA.
La Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), se caracteriza por una atrofia muscular en las piernas y pelvis, la cual se asocia con una prdida de la masa muscular, que progresa rpidamente. Los sntomas generalmente aparecen antes de los 6 aos de edad. Es una enfermedad recesiva, ligada al cromosoma X, que se genera como resultado de mutaciones heterogneas, principalmente deleciones, en el gen de la Distrofina. El gen de la Distrofina presenta un tamao de 2,4 Mb, tiene 79 exones, y codifica un mRNA de 14 Mb, siendo las deleciones de 18 exones especficos las responsables de un 60% de los casos. La deteccin de deleciones en el gen de la Distrofina se realiza usando la tcnica de PCR mltiple, en el cual se combinan 9 parejas de partidores en dos juegos diferentes llamados Chamberlain (descrito por J. S. Chamberlain) y Beggs (descrito por A.H. PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS BIO 226E AO 2013
2 Beggs). Estos 2 juegos de partidores amplifican los 18 exones ms frecuentemente delecionados en la DMD, y que se muestran en la figura superior.
OBJETIVO: Detectar delecin de exones en el gen de la Distrofina, mediante el uso de PCR mltiple, usando mezclas de partidores Chamberlain o Beggs.
1. AMPLIFICACIN DE GENES EN ESTUDIO MEDIANTE LA TCNICA DE PCR. La amplificacin por PCR de los 18 exones se realizar previo al TP y a los alumnos se les entregarn los productos ya amplificados. La mezcla de amplificacin por PCR contiene los siguientes reactivos. H2O 31,8 ul Amortiguador Taq 10X 5 dNTPs 10 mM 4 MgCl2 25 mM 3 Mezcla partidores 5 Taq DNA Polimerasa (5 U/l) 0,2 DNA (100 ng/ul) 1 Volumen total 50
2. SEPARACIN DE LOS PRODUCTOS DE PCR POR ELECTROFORESIS EN GEL DE NuSieve-AGAROSA 2,5%. (2:0,5)
El gel de agarosa a utilizar est previamente preparado de la siguiente forma: Pese 0,5 g de agarosa y 2 g De NuSieve agarosa y agregue amortiguador TBE 1X hasta completar 100 ml. Enfre con agitacin a una temperatura de alrededor de 60C. Agregue GelRed, para teir el DNA, a una concentracin final de 1X. Selle los lados del portagel con cinta adhesiva e inserte la peineta. Suavemente vierta la cantidad adecuada de agarosa en el portagel, asegurndose de que no queden burbujas. Deje que la agarosa polimerice. Remueva la peineta y la cinta adhesiva del portagel y deposite ste en la cmara de electroforesis. Agregue suficiente amortiguador de electroforesis TBE 1X a la cmara para sumergir el gel alrededor de 2mm (aprox. 900 ml)
Los alumnos realizarn la colocacin de las muestras en el gel de agarosa. Agregue 1 ul de amortiguador de carga 10X a 9 l de producto de PCR. Cuidadosamente cargue los 10 l de cada muestra en los bolsillos utilizando una micropipeta. Conecte los polos de la cmara de electroforesis a la fuente de poder y realice la electroforesis a aproximadamente 90 volts. Cuando el colorante haya migrado hasta un cm antes del final del gel, apague la fuente de poder y desconecte los cables. Cuidadosamente remueva el gel, colquelo sobre el transiluminador UV para visualizar las bandas de DNA. El ayudante tomar una fotografa para subir al sitio Web, con la cual usted realizar su informe.
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3 Figura 1: Gel de agarosa donde se muestran los exones del gen de la Distrofina amplificados por PCR a tamao de producto de PCR (en pares de bases). b exn del gen de la Distrofina presente en el fragmento de PCR.
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4 II. DIGESTIN CON ENZIMA DE RESTRICCIN: DETECCION DIRECTA DE UNA MUTACIN QUE ALTERA UN SITIO DE RESTRICCIN.
Las enzimas de restriccin (ER) son endonucleasas que reconocen secuencias especficas del DNA. Existen distintos tipos de ER, segn sea el tipo de secuencia conocida y el lugar de corte. El uso de ER en la deteccin de mutaciones ha sido ampliamente difundido en el diagnstico molecular. Es importante destacar que para utilizar esta metodologa el cambio en el DNA debe ser conocido previamente al igual que el patrn de digestin que se obtendr. La figura adjunta muestra a la izquierda el patrn de digestin del fragmento del gen que contiene la mutacin y del alelo normal. A la derecha se muestra una foto del gel de agarosa con la migracin de las bandas de DNA, para una de las mutaciones a analizar c.3936C>T.
OBJETIVO: Detectar mutaciones y polimorfismos conocidos que hacen perder o ganar sitios de restriccin. PROCEDIMIENTO: Usando la tcnica de PCR se amplifica el fragmento seleccionado, luego el producto de PCR se incuba en presencia del enzima de inters y finalmente se resuelve mediante electroforesis en gel de agarosa. En esta parte del trabajo prctico se analizarn muestras de pacientes con cncer de mama que presentan mutaciones y/o polimorfismos en los genes BRCA1 y BRCA2, o ATM todos detectables por enzimas de restriccin.
Se les entregarn tubos de diferentes miembros de una familia cuyo DNA ha sido tratado con ER segn los siguientes protocolos:
A. Deteccin de una mutacin presente en el gen BRCA1 denominada c.3936C>T con enzima BstNI. Amortiguador 10X (enzima restriccin BstNI) 6 ul BSA (100 mg/ml) 0,5 ul Enzima BstNI (10.000 U/ ml) 0,5 ul H2O 33 ul producto de PCR 20 ul Volumen total. 60 ul
Incubar en bao termorregulado a 60C por 120 minutos. PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS BIO 226E AO 2013
5 B. Deteccin de la variante allica presente en el gen BRCA1 denominada c.3238G>A con enzima AluI.
Amortiguador 10X (enzima restriccin AluI) 5 ul Enzima AluI (10.000 U / ml) 0,1 ul H2O 24,9 ul Producto de PCR 20 ul Volumen total. 50 ul
Incubar en bao termorregulado a 37C por 120 minutos.
C. Deteccin de la variante allica presente en el gen ATM denominada c.2082T>C con enzima Alw26I.
Amortiguador 10X (enzima restriccin Alw26I) 5 ul Enzima Alw26I (10.000 U / ml) 0,1 ul H2O 24,9 ul Producto de PCR 20 ul Volumen total. 50 ul Incubar en bao termorregulado a 37C por 120 minutos.
D. Electroforesis en gel de NuSieve agarosa 2,5%.
Agregue 1 ul de amortiguador de carga 10X a 9 l de producto de la digestin por ER. Cuidadosamente cargue los 10 l de cada muestra en los bolsillos del gel utilizando una micropipeta.
III. ANLISIS DE DETECCIN DE MUTACIONES PUNTUALES Y POLIMORFISMOS MEDIANTE LA TCNICA DE HETERODOBLETES (HDX).
El anlisis de heterodobletes se basa en el retardo de la migracin electrofretica del heterodoblete de DNA, en comparacin a su homodoblete correspondiente, en un gel de poliacrilamida parcialmente desnaturante. La tcnica de anlisis por heterodobletes permite analizar en forma ptima fragmentos que tienen entre 500 y 700 pares de bases, y es ms efectivo cuando el DNA tiene un bajo contenido de GC (Guanina y Citosina). En esta tcnica, el producto de PCR del gen que se est analizando es desnaturado a 95C y luego renaturado lentamente a temperatura ambiente. Durante el proceso de enfriamiento, las hebras de DNA complementarias se aparean formando homodobletes de DNA; las hebras parcialmente complementarias tambin se aparean formando heterodobletes de DNA. Debido a que en el heterodoblete hay segmentos donde las hebras de DNA no se aparean, presenta una conformacin diferente al homodoblete, y como consecuencia se mueve ms lento durante la electroforesis. La formacin del heterodoblete y su estabilidad dependen principalmente del tipo de mutacin que presente el fragmento de DNA analizado. Inserciones y deleciones de ms de un nucletido son ms sensibles a la temperatura, a los solventes y a la fuerza inica del amortiguador. PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS BIO 226E AO 2013
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PROTOCOLO.
1. Se le entregarn tubos que contienen las muetras de pacientes con cncer mama, en las cuales ya se ha amplificado partes de los genes a estudiar.
2. Prepare las muestras a cargar en cada gel, de la siguiente manera: Alicuotar la cantidad que se le indique del producto de PCR de cada muestra por separado. Agregar 1,1 ul de amortiguador HMA 10X a cada muestra. Desnaturar las muestras en bao Mara por 5 minutos a 95C. Dejar enfriar lentamente sobre el mesn hasta que la temperatura del agua llegue a 37C. Agregar 5 ul de solucin de carga 10X y cargar como se indique.
3. Electroforesis en gel de poliacrilamida.
Los geles han sido preparados previamente por lo cual usted debe hacer lo siguiente:
Limpiar los bolsillos con amortiguador y cargar las muestras. Tapar la cmara y conectar a la fuente de poder verificando la polaridad Seleccionar el voltaje en 170 V y el tiempo de acuerdo al tamao del fragmento de DNA que se est analizando (1 hora).
6. Tincin del gel.
En esta etapa pida ayuda a su ayudante: Una vez terminada la electroforesis, desmontar los vidrios de la cmara. Separar los vidrios con cuidado para no romper el gel. PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS BIO 226E AO 2013
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Depositar el gel en una cubeta forrada con papel aluminio y agregar una solucin de tincin con el componente GelRed 3X, en TBE 1X. Dejar incubando en la solucin por 10 minutos a oscuras y posteriormente observar el gel en un transiluminador UV.
IV. Anlisis de secuencias de DNA
La secuenciacin de DNA consiste en la sntesis enzimtica de hebras de DNA en presencia de didesoxinucletidos trifosfato (ddNTPs), los cuales actan como terminadores de la elongacin de la cadena de DNA naciente. Los ddNTPs son anlogos de los desoxinucletidos trifosfato (dNTPs) que participan normalmente en la sntesis de DNA, pero se diferencian de stos en que carecen del grupo hidroxilo en la posicin 3 (Figura 1). Un ddNTP puede ser incorporado a una cadena de DNA naciente mediante la formacin de un enlace fosfodister entre su grupo hidroxilo-5 y el hidroxilo-3 del ltimo dNTP de la cadena, pero impide la unin del prximo dNTP, provocando as la terminacin prematura de la sntesis de la nueva cadena de DNA.
A _ B
_
Figura 1: A. Estructura de un desoxinucletido trifosfato (dNTP). B. Estructura de un didesoxinucletido trifosfato (ddNTP). En esta tcnica se utiliza un partidor marcado en su extremo 5 el cual se une a la hebra de DNA que se desea secuenciar. El partidor es elongado por la DNA Polimerasa en cuatro reacciones separadas que contienen los cuatro dNTPs normales y, adems uno de los cuatro ddNTPs en una menor concentracin. Una molcula de ddNTP puede ser incorporada al azar en cualquiera de las posiciones correspondientes a su dNTP anlogo, y cuando esto ocurre, se PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS BIO 226E AO 2013
8 detiene la elongacin de la cadena. De esta forma, cada una de las cuatro reacciones produce una mezcla de cadenas de DNA terminadas prematuramente y de distinta longitud, con un extremo 5 comn (determinado por la unin del partidor a una regin especfica de la hebra de DNA molde) y un extremo 3 variable, que depende de la posicin en la que fue incorporado el ddNTP. Los fragmentos resultantes que pueden variar en solo un nucletido, pueden ser separados mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida desnaturante y la secuencia puede ser leda luego de exponer el gel a una pelcula autorradiogrfica. A. Las 4 reacciones de terminacin de la cadena se realizan en un mismo tubo, con cada uno de los 4 ddNTPs marcados con distintos fluorforos. En el secuenciador automtico, las bandas del gel de electroforesis son atravesadas por un lser que excita la marca fluorescente, la luz emitida es detectada por un fotomultiplicador, el cual est conectado a un computador que colecta y analiza los datos. B. Electroferograma de una secuencia automtica. La secuencia es representada por una serie de picos de distintos colores, cada uno correspondiente a la posicin de un nucletido.
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9 ACTIVIDAD:
1. Lea cuidadosamente los electroferogramas con las secuencias de DNA. 2. Anote los cambios nucleotdicos encontrados, comparando con la secuencia patrn. 3. Indique el efecto que puede predecir o sugerir del cambio nucleotdico en la secuencia y/o estructura de la protena o del mRNA.
ANALISIS DE SECUENCIAS DE DNA Describa los resultados encontrados luego de realizar los puntos 2 y 3 de esta actividad, y haga una discusin sobre stos.
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10 REFERENCIAS: Secuencias de partidores Chamberlain/Beggs: http://www.dmd.nl/exonprim.html#top Chamberlain, J.S., Chamberlain, J.R., Fenwick, R.G., Ward, P.A., Caskey, C.T., Dimnik, L.S., Bech-Hansen, N.T., Tantravahi, U., Richards, S., Covone, A.E., Romeo, G., Abbs, S., Bentley, D.R., Bobrow, M., Rysiecki, G., Ray, P., Boileau, C., Junien, C., Boehm, C., Venne, V.L., Fujimura, F.K., Spiga, I., Ferrari, M., Tedeschi, S., Bakker, E., Kneppers, A.L.J., Van Ommen, G.J.B., Jain, K., Spector, E., Crandall, B., Kiuru, A., and Savontaus, M.L. (1992). Diagnosis of Duchenne's and Becker's muscular dystro phies by polymerase chain reaction: a multicenter study. J. Am. Med. Assoc. 267:2609-2615. Chamberlain, J.S., Gibbs, R.A., Ranier, J.E., and Caskey, C.T. (1990). Multiplex PCR for the diagnosis of Duchenne muscular dystrophy. In: PCR protocols: a guide to methods and applications. (M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky, and T.J. White, Eds). San Diego: Academic Press, pp. 272-281. Chamberlain, J.S., Gibbs, R.A., Ranier, J.E., Nga Nguyen, P.N., and Caskey, C.T. (1988). Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification. Nucl. Acids Res. 23:11141-11156. Beggs, A.H. (1994). Multiplex PCR for identifying dystrophin gene deletions. In: Current protocols in Human Genetics. Anonymouspp. 9.3.1-9.3.17
Beggs, A.H., Koenig, M., Boyce, F.M., and Kunkel, L.M. (1990). Detection of 98-percent DMD/BMD gene deletions by polymerase chain reaction. Hum. Genet. 86:45-48
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