ELECTROFORESIS EN GEL

Es una tcnica para separar molculas basndose en propiedades de las mismas tales como el
tamao, la forma o el punto isoelctrico.
Gel,se refiere a la matriz usada para separar las molculas. En muchos casos un gel es un
polmero entrelazado de porosidad controlable.
Cuando la separacin es de protenas, ADN o cidos nucleicos pequeos
(ADN, ARN o ribonucletidos), el gel est compuesto por diferentes concentraciones
de acrilamida/bis-acrilamida y un iniciador de la polimerizacin, para producir redes de
poliacrilamida de diferentes tamaos.
Para separar cidos nucleicos grandes (ms de unos centenares de bases), la matriz
empleada es agarosa purificada.
En ambos casos, el gel forma una matriz slida pero porosa. La acrilamida, en contraste con
la poliacrilamida, es una neurotoxina y debe ser manejada cuidadosamente para evitar
envenenamientos.
Electroforesis, se refiere a la fuerza electromotriz que es empleada para desplazar las
molculas a travs del gel.
Al situar las molculas en el gel y aplicar una diferencia de potencial elctrico, las molculas
se mueven a diferentes velocidades, hacia el ctodo, si estn cargadas positivamente, y hacia
elnodo, si estn cargadas negativamente.
Aplicaciones[editar]
cidos nucleicos[editar]
En los cidos nucleicos la direccin de migracin es del electrodo negativo al positivo, y esto
es debido a la carga negativa presente en el esqueleto azcar-fosfato.
En los fragmentos de ADN dobles (con estructura de doble hlice) la velocidad de migracin
es inversamente proporcional a su tamao.
En fragmentos simples de ADN y ARN (una sola cadena), dichas molculas tienden a
plegarse de forma compleja y a migrar de forma ms complicada, segn la estructura terciaria
formada tras el plegamiento. Sin embargo, compuestos que puedan romper los enlaces
de puente de hidrgeno, como el hidrxido de sodio o la formamida, son empleados para
'desplegar' las molculas plegadas y permitir que la velocidad de migracin dependa
nicamente y exclusivamente del tamao y no de la estructura formada tras el
plegamiento.

Protenas[editar]
Las protenas no tienen una estructura predecible como los cidos nucleicos, y por tanto sus
velocidades de migracin no son similares entre las protenas. Incluso puede que no migren ni
al aplicar una fuerza electromotriz . En estos casos, las protenas se desnaturalizan
mediante la adicin de un detergente como eldodecilsulfato sdico/dodecilfosfato
sdico (SDS/SDP) y un agente reductor como el 2-mercaptoetanol.
Los detergentes otorgan una carga neta negativa a la protena que les permite migrar a
travs del gel de poliacrilamida en relacin directa a su masa, ya que la cantidad de cargas
negativas que se unen a la protena depende del tamao de sta, existiendo una relacin
carga/masa similar. Adems, la desnaturalizacin hace que pierdan su estructura terciaria
y cuaternaria por tanto su velocidad de migracin es proporcional al tamao y no a su
estructura terciaria ni a su interaccin con otras macromoleculas.
As, los ms grandes se desplazan ms lentamente.

Revelado y visualizacin[editar]
Cuando se ha completado la electroforesis, las molculas ms pequeas han llegado al
nodo. Entonces se pueden 'revelar' mediante la adicin de un colorante especfico para
hacerlas visibles. Se emplean compuestos como el bromuro de etidio, para los cidos
nucleicos, o tincin de plata, azul de coomassie o tincin fluorescente, para las
protenas.
Asimismo se emplean otros mtodos para visualizar la separacin de la mezcla en el gel. Si el
reactivo es fluorescente bajo la luz UV, se puede simplemente hacer una fotografa de la placa
bajo dicha luz. Tambin, si las molculas contienen tomos radiactivos se puede efectuar una
autorradiografa.
Si se han inyectado varias mezclas una junto a otra en la placa, se producirn separaciones
paralelas (calles). Cada calle mostrar distintas bandas correspondientes a cada componente
de la mezcla. Si dos componentes poseen la misma masa las separaciones sern
incompletas, por lo cual ambas bandas se vern solapadas.



Tipos[editar]
La electroforesis en gel se utiliza en biologa molecular, gentica y bioqumica:
La electroforesis en gel de muestras grandes de ADN y ARN se efecta en geles
de agarosa.
La electroforesis de protenas se lleva a cabo en geles de poliacrilamida-SDS (SDS-
PAGE), isoelectroenfoque, geles nativos o electroforesis bidimensional.
Electroforesis capilar.
Electroforesis de ADN.
Zimografa o zimogramas
Extraccin en gel.
Electroforesis en gel de campo pulsado.

HIBRIDACION

La hibridacin de cidos nucleicos (ADN o ARN) es un proceso por el cual se combinan
dos cadenas de cidos nucleicos antiparalelas y con secuencias de bases
complementarias en una nica molcula de doble cadena, que toma la estructura de
doble hlice, donde las bases nitrogenadas quedan ocultas en el interior.
Los nucletidos se unirn con sus complementarios bajo condiciones normales: A=T; A=U;
CG; GC; T=A o U=A
As que dos cadenas perfectamente complementarias se unirn la una a la otra rpidamente.
Por el contrario, debido a las diferentes geometras de los nucletidos, una simple variacin de
las parejas anteriores lleva a inconsistencias entre las cadenas y dificultar la unin.
El proceso de hibridacin se puede revertir simplemente calentando la disolucin que
contiene la molcula.
El porcentaje de GC dentro de la cadena condiciona la temperatura de alineamiento y de
desnaturalizacin ya que G se une a C mediante tres puentes de hidrgeno y A se une a U o T
mediante dos puentes de hidrgeno; por tanto, y dado que se requiere ms energa para
romper tres enlaces que para romper dos, dicha energa se traduce en una mayor
temperatura.
El %GC no es igual para todas las especies, es ms, el %GC es distinto incluso entre el ADN
nuclear y el ADN mitocondrial, lo que nos da bastante juego en los protocolos de extraccin de
ADN, segn qu tipo vamos a estudiar y esto es importante, entre otros motivos porque
existen enfermedades genticas debidas a mutaciones en el ADN mitocondrial.
En biologa molecular experimentalmente se llevan a cabo dos tipos diferentes de
hibridacin: Tipo Southern, para uniones ADN-ADN y tipo Northern blot, para uniones
ADN-ARN.
Procedimiento experimental
1. La hlice de doble cadena (ADN) se separa mediante un proceso fsico (calor) o
qumico (con una base fuerte, como la sosa custica). Esto rompe los enlaces
por puente de hidrgeno que mantienen unidas las dos hebras del ADN.
2. Las dos hebras complementarias se separan, el ADN se desnaturaliza.
3. Una muestra de cadenas simples (o desnaturalizadas) se mezcla con otra muestra de
cadenas simples.
4. La muestra combinada se enfra lentamente, las molculas sencillas se van
emparejando por las zonas complementarias (ms estables termodinmicamente) y
se va formando una nueva molcula hibridada
La velocidad de hibridacin es un indicativo de la similaridad gentica entre las dos
muestras. El porcentaje de similaridad genmica y la velocidad de hibridacin es
directamente proporcional.
Mtodos de laboratorio[editar]
Existen dos tipos de hibridaciones de cidos nucleicos que se usan frecuentemente en los
laboratorios que utilizan tcnicas de biologa molecular.
Ambos mtodos utilizan una cadena sencilla de ADN marcada por un mtodo fsico-
qumico, bien sea con radiactividad o bien con un fluorocromo. Esta cadena tiene
una secuencia de nucletidos conocida y se utiliza como sonda para detectar otras
molculas de ARN o ADN de cadena sencilla de secuencia parecida.

Southern
El mtodo tipo Southern o Southern blot fue desarrollado para la deteccin de genes
especficos en el ADN celular.
El ADN es digerido con una enzima de restriccin y los fragmentos son separados por
tamaos mediante electroforesis en un gel. A continuacin los fragmentos de ADN de doble
cadena son desnaturalizados mediante un proceso qumico separando las dos hebras
componentes del ADN en sus cadenas sencillas.
Posteriormente, el ADN inserto en el gel es transferido a un filtro de nitrocelulosa, con lo que
en el filtro queda representada una rplica de la disposicin de los fragmentos de ADN
presentes en el gel.
A continuacin el filtro se incuba durante un tiempo con la sonda marcada (radiactivamente o
con un fluorocromo); durante la incubacin la sonda se va hibridando con las molculas de
ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy parecida).
La sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar en el filtro de una
forma sencilla mediante una exposicin a una pelcula de rayos X para el caso de sondas
radiactivas o con una pelcula sensible a la luz, para el caso de sondas con fluorocromo

Northern
El segundo mtodo, tipo Northern blot o Northern, se utiliza para identificar las cadenas
de ARN de secuencia semejante al ADN que se usa como sonda; a diferencia del tipo
Southern que se utiliza para identificar ADN, el mtodo Northern sirve para identificar ARN.
El ARN se extrae y se fracciona en tamaos variables mediante una electroforesis en gel de
poliacrilamida en unas condiciones que mantengan las cadenas de ARN en estado
desnaturalizado. El proceso contina de forma semejante a la hibridacin de tipo Southern. El
mtodo del Northern se utiliza muy frecuentemente para realizar estudios de expresin
gnica; para conocer qu genes estn activos formando ARN mensajero en qu
condiciones, en qu tejidos o tipos celulares.

Hibridacin in situ
Un desarrollo de las tcnicas de preparacin y fijacin de materiales biolgicos para su
observacin al microscopio, junto con el desarrollo de tcnicas de hibridacin tipo Northern ha
llevado a poder realizar la hibridacin de las sondas directamente sobre tejidos de material
orgnico. Utilizando tcnicas inmunohistoqumicas se puede conocer la localizacin precisa de
los tejidos y clulas que estn expresando los genes de secuencia complementaria a las
sondas utilizadas. Tambin en esta categora destaca el FISH, tcnica de hibridacin in situ,
donde las sondas son secuencias de ADN marcadas que se unen a secuencias de ADN
conocidas dentro del cromosoma, con las que comparte un alto grado de similitud y que
podemos observar con un microscopio ptico de fluorescencia.



ELISA es una tcnica de inmunoensayo en cual un antgeno inmovilizado se detecta
mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable
como cambio de color o algn otro tipo en ocasiones, con el fin de reducir los costos del
ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antgeno y
que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima
anteriormente mencionada.
La aparicin de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometra el
antgeno en la muestra.
Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular est presente en la
muestra de sangre de un paciente..
La interaccin antgeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un
paciente tiene una infeccin o una enfermedad autoinmune.
Pero como prueba diagnstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer:
En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no
significa necesariamente que el paciente est enfermo. El cuerpo de una persona que ha
estado enferma y que ya se ha recuperado puede seguir produciendo anticuerpos. Esto
originara un falso positivo.
En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo
que estos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso
negativo. Sera el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o
que se encuentren en el periodo ventana de la infeccin en el momento de realizar la
prueba, o que estn infectadas por una cepa extraa.
En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre
antgeno-anticuerpo.
En estos casos de diagnstico de enfermedad, es recomendable la eliminacin (mediante
centrifugacin) de clulas de la sangre que puedan interferir con el ensayo y puedan ocasionar
un resultado falso positivo, careciendo aquel de especificidad.
Tambin, debemos tener en cuenta que cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que
posee un valor predictivo positivo bajo en una determinada poblacin es decir, que esa
enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha poblacin, es necesario volver a confirmar el
resultado positivo mediante otro mtodo de diagnstico independiente. Normalmente, se lleva
a cabo un western blot donde se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultneamente,
frente a la misma infeccin en una muestra. El resultado del western se considera positivo
cuando aparecen al menos 5 bandas, que indica que 5 anticuerpos diferentes estn presentes
en el sujeto frente a esa infeccin. Es entonces cuando se diagnostica como positivo a dicho
paciente.
Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es verstil, robusto
y simple en su realizacin, mediante el uso de la fase slida, una separacin fcil entre la
fraccin retenida y la fraccin libre.
Adems se han propuesto y desarrollado diferentes mtodos de amplificacin de la seal
(luminiscentes, cascadas enzimticas...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos
ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal.
Este mtodo ha tenido una enorme aplicacin en todos aquellos campos en los que se
precisaba la cuantificacin de productos mediante anticuerpos: diagnstico clnico, deteccin
viral, clasificacin de anticuerpos en isotipos, bsqueda de anticuerpos monoclonales, etc.
Dispositivos empleados en ELISA

Se han ensayado numerosas fases slidas, desde los tubos de cristal de los orgenes hasta
las actuales microplacas de 96 pocillos de plstico tratado, para aumentar su capacidad de
adsorcin (en su superficie) de molculas, y con fondos de pocillo pticamente claros que
permitan realizar las medidas de densidad ptica en instrumentos especficos,
espectrofotmetros de lectura de placas que han recibido el nombre de lectores ELISA.
Los lectores ELISA son espectrofotmetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno
de los pocillos de la placa ELISA.
A diferencia de un espectrofotmetro convencional, con capacidad de leer todas las
longitudes de onda del ultravioleta y el visible de manera continua, los lectores de ELISA
disponen de sistemas de filtros que solo permiten la lectura de una o pocas longitudes de
onda; son la que se corresponden con las necesarias para determinar la densidad ptica de
los cromgenos ms comnmente utilizados.
Las cuatro fases de un ensayo ELISA son las siguientes:
1. Conjugacin del anticuerpo o del antgeno con una enzima (peroxidasa, fosfatasa
alcalina...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e
indirectos, sandwich, etc.El antgeno marcado se emplea en ensayos de competicin
de antgeno.
Dicha unin anticuerpo-enzima o antgeno-enzima ha de producirse durante un
determinado perodo de tiempo en aras de producir una solucin coloreada y que
pueda ser valorada visualmente o cuantificada por medio de un espectrofotmetro .Si
no transcurre el tiempo adecuado para que se d la reaccin, no se evidenciar
ningn color, interpretndose este resultado como un falso negativo y disminuyendo la
sensibilidad de la tcnica.
2. Unin del antgeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unin de anticuerpos o
antgenos se realiza con facilidad a la superficie de plsticos tratados que tienen gran
afinidad por protenas. As, el procedimiento de recubrimiento de los pocillos debe
realizarse cuidadosamente. Si se usa mucho antgeno, se pueden obtener falsos
positivos. Por el contrario, si se usa poco antgeno, el exceso dar lugar a una
reaccin falsa negativa.
3. Formacin de una o ms capas de inmunocomplejos. En el caso del antgeno
unido a la placa, se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antgeno
marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antgeno y un
secundario anti-primario marcado (ELISA indirecto).
Este segundo mtodo permite la amplificacin de la seal al poderse unir uno o ms
anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario.

4. Revelado de la reaccin enzimtica. Despus de un lavado para eliminar todas las
molculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos, se aade el sustrato
enzimtico en solucin. Se deja reaccionar y se lee la densidad ptica mediante
espectrofotometra.
Tipos de ensayos ELISA
Se han desarrollado mltiples variantes de ensayos ELISA que permiten la cuantificacin de
un antgeno en solucin, la deteccin de un anticuerpo en una solucin (por ejemplo en el
clonaje de anticuerpos monoclonales) o la determinacin de la subclase (idiotipo) de un
anticuerpo. A continuacin se describen los ms comunes.
ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan
recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el
antgeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antgeno en la
solucin analizada. Es necesario incluir controles negativos que sern muestras del
mismo tipo que las analizadas (sangre, orina...), pero en las que se tenga la certeza de la
ausencia del antgeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones
donde se encuentra el antgeno buscado).
ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de la misma forma a la anterior. Los
controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de deteccin emplea dos
anticuerpos: uno primario contra el antgeno y uno secundario marcado contra el
primario. La deteccin tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificacin de seal
debida a la unin de dos o ms anticuerpos secundarios por cada primario.
Es el ensayo ms popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo
secundario marcado y un mismo sistema enzimtico permiten cuantificar una gran
variedad de antgenos; por eso es un mtodo ms polivalente y barato, aunque se pierda
algo de precisin por tener un eslabn ms con respecto al mtodo directo.
El ELISA indirecto es el mtodo de eleccin para detectar la presencia de anticuerpos
sricos contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), agente causante del
sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Segn esta tcnica, protenas
recombinantes de la envoltura y el ncleo del VIH se absorben como antgenos en
fase slida a los pocillos. Las personas afectadas de VIH producen anticuerpos sricos
contra eptopos en estas protenas vricas. En general, el ELISA indirecto permite
detectar anticuepos sricos contra VIH desde las primeras seis semanas de una
infeccin.
ELISA sndwich (Ensayo de captura de antgeno y deteccin mediante
inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el
pocillo con un primer anticuerpo anti-antgeno. Despus de lavar el exceso de
anticuerpo, se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antgeno, que
ser retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Despus de un
segundo lavado que elimina el material no retenido, se aplica una solucin con un
segundo anticuerpo anti-antgeno marcado. As, pues, cada molcula de antgeno
estar unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al
menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido
a la amplificacin de seal que permite el segundo anticuerpo.


Quimioluminiscencia

Durante determinadas reacciones qumicas, la luz generada por este fenmeno
constituye una alternativa conveniente y muy sensible para las mediciones de
absorbancia en ELISA. Los tipos de ELISA que recurren a la quimioluminiscencia utilizan
un sustrato que genera luz, en lugar del sustrato cromgeno de las reacciones ELISA
ordinarias. Tales son los casos de la oxidacin del compuesto luminol por perxido de
hidrgeno y la enzima peroxidasa de rbano (HRP), que producen luz. La medicin
cuantitativa de la emisin de luz puede hacerse mediante el uso de un luminmetro.
Prueba ELISPOT
Una variante de la prueba ELISA, llamada ELISPOT, es capaz de detectar
cuantitativamente el nmero de clulas en una poblacin productora de anticuerpos
especficos contra un antgeno determinado o un antgeno contra el que se dispone de un
anticuerpo especfico. Aqu, las placas se recubren con el antgeno reconocido por el
anticuerpo de inters o con el anticuerpo especfico para el antgeno cuya produccin se
valora.