Enfermedades Asociadas A Retrovirus

I nstituto Superior de Ciencias de la Salud Carrera de Tcnico de Laboratorio
I nmunologa I I 2do. Ao 4to. Cuatrimestre

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ENFERMEDADES ASOCIADAS A RETROVIRUS.

Se clasifican como retrovirus porque tienen la particularidad de integrar su material gentico en el
DNA nuclear de la clula que infectan transcribiendo primero su genoma de RNA a DNA por
accin de una transcriptasa reversa. Los retrovirus patgenos en el hombre pertenecen a las
subfamilias lentivirus y oncornavirus. La diferenciacin reside en su mecanismo patognico, los
lentivirus matan a las clulas que infectan, mientras que los oncornavirus transforman y tienden a
inmortalizar a las clulas infectadas. Su ciclo vital comienza cuando una partcula viral libre en el
medio extracelular se une a un receptor de una clula permisiva. Se fusiona con su membrana,
pierde su envoltura y su contenido es liberado al citoplasma de la clula infectada. Por accin de la
retrotranscriptasa el RNA se copia en DNA, el DNA viral ingresa al ncleo y se incorpora al
genoma celular. All puede permanecer como provirus en forma latente por largos perodos hasta
expresarse. Las protenas virales sintetizadas por la clula infectada reconstituyen, a nivel de la
membrana celular, la nucleocpside y la envoltura dando origen a una partcula infectiva o virin
que brota hacia el exterior disponible para la infeccin de nuevas clulas. El genoma de los
retrovirus est formado por dos cadenas idnticas de RNA no complementarias. Posee tres genes
bsicos para su replicacin: gag, env y pol. Son secuencias que codifican para la sntesis de las
protenas estructurales de la cpside y de la envoltura (gag y env) y para la transcriptasa inversa
(pol).

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Sndrome de Inmunodeficiencia Adquirida.
El virus de la inmunodeficiencia humana o VIH es un retrovirus perteneciente a la subfamilia de los
lentivirus. Los lentivirus son virus exgenos, es decir infecciosos, que se caracterizan
principalmente por tener una organizacin genmica compleja,
afectar al sistema nervioso, producir viremia persistente,
inmunodeficiencia y largos perodos de infeccin
asintomtica. Son virus citolticos y no oncognicos. Se
transmiten en forma horizontal de un individuo a otro.
El VIH es un virus a RNA formado por dos molculas
de cido nucleico de cadena simple. Existen dos tipos
principales de VIH denominados VIH1 y VIH 2, a su
vez dentro de cada uno de ellos se diferencian varios
subgrupos y subtipos. El VIH1 se encuentra ampliamente
distribuido en el
mundo mientras que el
VIH2 es prevalente en
frica Occidental y raro en otras zonas geogrficas.
Si bien VIH1 y VIH2 difieren levemente en su
estructura gentica, ambos son citopticos sobre los
linfocitos T y sus caracteres morfolgicos son muy
similares. El virus VIH es esfrico y mide alrededor
de 110 nm, posee una envoltura externa
glucoproteica, proveniente de la membrana de la
clula husped, y una parte central llamada
nucleocpside o core que contiene las dos copias de
su ARN genmico asociado a las enzimas virales
transcriptasa reversa, proteasa e integrasa. Su genoma
est constituido por los tres genes, comunes a todos
los retrovirus, que codifican para la sntesis de
protenas de la nucleocpside y de la envoltura viral (genes estructurales gag, pol y env) y por otros
responsables de la formacin de protenas con funciones reguladoras capaces de controlar la
proliferacin, la replicacin, la liberacin y el grado de infectividad del virus (genes reguladores tat,
nef, vpu, vif, rev). Estas protenas son inmunognicas en el husped y permiten distinguir los
diferentes antgenos del VIH en tres grupos principales: Protenas gag (antgenos de grupo): las
ms importantes son p55, p24 y p17; el nmero hace referencia a los pesos moleculares de 55000,
24000 y 17000 respectivamente (que difieren levemente para VIH2). p55 es un precursor que da
origen a otras protenas menores. p24 es el componente principal de la cpside interna que rodea al
ARN central. p17: integra la cpside externa, entre el ncleo y la envoltura. Son integrantes de la
nucleocpside del virus. Glicoprotenas env (envoltura): son las glicoprotenas gp160, gp120 y
gp41. gp160: no es un componente estructural sino una molcula precursora. gp120 y gp41: son los
integrantes de la envoltura y se forman por degradacin de gp160 por accin de la proteasa. gp120
es ms externo y tiene la propiedad de unirse al antgeno CD4 de la membrana de los linfocitos y
clulas mononucleares fagocticas. gp41 se conoce como glicoprotena de transmembrana; contiene
secuencias variables que hacen que pueda ser muy especfico para cada tipo de virus (gp36 en el
VIH2). Forman parte de la envoltura externa del virus junto a componentes de la membrana de la
clula originalmente infectada. Anticuerpos contra las protenas de envoltura del VIH1 no dan
reacciones cruzadas con las protenas de la misma regin del VIH2. S existe reactividad cruzada
entre anticuerpos hacia las protenas gag y pol de ambos tipos de virus. Protenas pol (polimerasa):
incluyen las protenas p66 (la enzima transcriptasa reversa), p51 (proteasa) y p31 (la integrasa o
endonucleasa). Se encuentran situados dentro del ncleo y asociados a los cidos nucleicos y son
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los que efectan la conversin del ARN en ADN, la integracin del ADN viral al ADN celular y el
desdoblamiento de molculas precursoras a componentes activos menores.
La va de transmisin preponderante del VIH es la sexual. Sin embargo la diseminacin tambin
puede ocurrir por agujas o jeringas compartidas por adictos a drogas intravenosas, por transfusin
de sangre o sus derivados contaminados y por va materno fetal, ya sea intratero o perinatal (parto
y lactancia). La transmisin sexual y vertical del VIH se da a travs de las mucosas y la piel
mientras que en las otras es secundaria al contacto directo con la sangre.

Ciclo de replicacin
La infeccin por el VIH comienza cuando la partcula viral se une a la clula blanco a travs de la
interaccin de la protena de envoltura gp 120 y el receptor celular CD4. El CD4 es una
glipoprotena de superficie que se expresa en una variedad de clulas del sistema hematopoytico.
Los linfocitos T CD4(+) constituyen el blanco principal del VIH ya que expresan la molcula CD4
en muy alta concentracin. Los monocitos, macrfagos y clulas dendrticas tambin expresan el
CD4 en la superficie pero en menor concentracin que los linfocitos T y constituyen un blanco
alternativo en la infeccin. Luego de la unin virus-clula, comienza el proceso de fusin de
membranas el cual es facilitado por la glicoprotena de envoltura gp41 y por las protenas celulares
recientemente identificadas fusina (CXCR4) y/o CCR5 que participan como correceptores celulares
para el virus. Como resultado de la fusin, el genoma viral ingresa al citoplasma celular como parte
de un complejo nucleoproteico. En el citoplasma, se inicia el proceso de transcripcin dirigido por
la transcriptasa inversa con la sntesis de la primera cadena de ADN utilizando como molde el ARN
viral. A medida que el ARN se retrotranscribe es degradado por la ARNasa H (endonucleasa) y
reemplazado por una segunda cadena de ADN. El resultado final de este proceso es la obtencin de
un ADN de doble cadena con duplicaciones terminales repetitivas (LTR) que no estn presentes en
el ARN viral y que se originan durante el proceso de retrotranscripcin del VIH-1. El siguiente paso
en el ciclo, es la incorporacin de la molcula de
ADN lineal en un complejo de pre-integracin y la
subsiguiente migracin al ncleo celular. Una vez
dentro del ncleo, la mayor parte del ADN viral se
circulariza y permanece no integrado, aunque
tambin puede integrarse en forma precisa dentro del
genoma celular. El proceso de integracin est
mediado por la endonucleasa y la integrasa viral que
utilizan dos repeticiones invertidas de ADN ubicadas
en los extremos de los LTR como sitios de
integracin. Por el contrario, con respecto a las
secuencias del ADN del husped, la integracin
parecera ser totalmente al azar. Una caracterstica
interesante de la transcripcin inversa y la
integracin viral, es que son procesos muy poco eficientes en clulas quiescentes como los
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linfocitos T. En cambio, los macrfagos que son clulas sin divisin pero no quiescentes, son
totalmente capaces de realizar estos procesos.
La transcripcin del provirus es regulada por factores celulares y virales. Luego de la sntesis de un
ARN viral completo se pueden producir varios tipos de ARN mensajeros (ARNm) como resultado
de splicing alternativos. La expresin de los distintos tipos de ARNm es controlada por la protena
rev. La cantidad de rev determina si se producen ARN de cadena completa (unspliced) o ARNm
procesados (multiply spliced). Todos los transcriptos virales son exportados al citoplasma donde
ocurre la sntesis de las protenas virales. Los ARN de cadena completa van a originar el ARN
genmico viral y los ARNm que codifican para las protenas estructurales y enzimticas (gag, pol, y
env), mientras que los ARNm procesados codifican para las protenas accesorias (tat, rev y nef).
Luego de la sntesis proteica cerca de la membrana celular se produce el ensamblaje del ARN
genmico en la cpside. Finalmente, a medida que los viriones son liberados por brotacin a travs
de la membrana celular adquieren la envoltura con la incorporacin de las glicoprotenas virales. El
procesamiento de las poliprotenas gag y gag/pol por la proteasa viral puede ocurrir durante o
despus de la brotacin generando viriones infecciosos maduros. La liberacin de los viriones
puede producirse rpidamente provocando la lisis celular o bien en forma ms lenta manteniendo la
integridad de la clula.

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LTR GAG POL SOR TAT TRS ENV 3ORF LTR
Estructura del genoma del virus VIH

Latencia del virus: Los linfocitos T son invadidos por HIV pero no se replica dentro de las clulas
si ellas estn en reposo. La activacin por determinantes antignicos (sobresale el VHS-6, CMV,
mycoplasma) al activar a los linfocitos T inducen a la replicacin del virus HIV. Al replicarse el
virus protuye de la membrana del linfocito T y sale a invadir otros linfocitos o macrfagos. Dentro
del macrfago el HIV se replica y se almacena, pero no sale sino cuando muere el macrfago
(reservorio del virus). Las clulas dendrticas quedan comprometidas en su funcionalidad.

Aspectos clnicos
Enfermedad inicial: Corresponde a la infeccin aguda (perodo de seroconversin) que puede
presentarse con manifestaciones clnicas o ser asintomtico. De presentar manifestaciones estas se
caracterizan por un cuadro tipo mononuclesico, hasta en un 30-70% de los casos, aunque a
menudo pasan desapercibidas. Las manifestaciones son mltiples e incluyen: fiebre, sudoracin,
artralgias, mialgias, linfadenopatas, odinofagia, anorexia, nauseas, vmitos, cefalea, erupcin
cutnea, diarrea, meningoencefalitis aguda, mielopata aguda,
hepatoesplenomegalia, ulceras orales, trombocitopenia,
leucopenia, aumento de las transaminasas. Nefritis, vasculitis,
rabdomiolisis, neumonitis, anemia aplsica, son
excepcionales. La duracin de este cuadro es de 5-14 das. A
lo largo de este proceso agudo puede haber un perodo
transitorio de inmunodepresin, capaz de facilitar la aparicin
o reactivacin de enfermedades oportunistas, describindose
candidiasis oral y aun complicaciones mayores como
candidiasis esofgica, enfermedad por CMV y aun
neumonitis por P. carinii. La presencia de sntomas y la
mayor intensidad de los mismos durante esta etapa se asocia
a una progresin ms rpida, en relacin a caractersticas
virolgicos e inmunolgicos propias de este perodo. La
misma es relativamente independiente del mecanismo de
transmisin de la infeccin (sexual, sangunea, vertical). A
los 10-20 das de la infeccin y pocos das despus del inicio
de los sntomas se pueden detectar antgenos virales, luego de
1-3 meses irn apareciendo los diferentes anticuerpos contra
estos antgenos.
Enfermedad temprana: Incluye el perodo de infectado
asintomtico y la linfadenopata generalizada persistente
(simtricas, elsticas, indoloras y no adheridas). Esta etapa
dura varios aos, y si bien persiste la actividad proliferativa
viral, se alcanza un equilibrio dinmico y el paciente se
encuentra asintomtico, en latencia clnica. El sistema inmune se encuentra sometido a una
presin que de no revertirse lo llevar al agotamiento y el paciente progresar a etapas ms
avanzadas, con aparicin de manifestaciones que evidencian el compromiso. La viremia en este
perodo determina la velocidad de descenso de CD4, en promedio 40-80/ao (0-200). Por ello, de
no revertirse esta situacin natural, en 10 aos, aproximadamente 50% de los infectados habrn
evolucionado a SIDA. Un 10%, no habr progresado, aun conservando un nmero normal de CD4,
y con ello una funcin inmune adecuada, a estos pacientes se los denomina no progresores a largo
plazo. Estas dos etapas corresponden a la Categora Clnica A (CDC-93).
Enfermedad moderada: Comprende a los complejos relacionados y las infecciones menores no
marcadoras de SIDA. El sistema inmune esta agotando su capacidad de aclaramiento viral y de
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reponer los linfocitos CD4 destruidos; los ganglios linfticos ya no atrapan en forma eficiente al
virus. Hay entonces un nuevo equilibrio dinmico, pero ahora con una carga viral alta y una reserva
de CD4 baja, con tendencia al deterioro y mayor progresin. El paciente presenta enfermedades
relacionadas con el VIH o cuya evolucin, manejo o tratamiento puede verse complicado debido a
la presencia de este virus. Se incluye al Herpes Zoster monometamrico en los ltimos 5 aos,
candidiasis oral o vaginal de ms de un mes de duracin o recurrente, leucoplasia oral vellosa,
alteraciones dermatolgicas (molusco contagioso, dermatitis seborreica), prpura trombocitopnica
idioptica, ulceras mucosas inespecficas, infecciones bacterianas recurrentes (sinusitis, bronquitis),
angiomatosis bacilar, enfermedad pelviana inflamatoria y neuropata perifrica. Corresponde a la
Categora Clnica B (CDC-93), de no mediar tratamiento antiviral la enfermedad progresa a estadios
ms avanzados.
Enfermedad avanzada: Son los pacientes que han presentado una complicacin mayor, un evento
definidor de SIDA, Categora Clnica C (CDC-93). Se incluyen: a) Sndrome de adelgazamiento:
prdida de peso involuntaria, superior al 10% del peso habitual, fiebre intermitente o continua de
ms de 1 mes de evolucin y sin causa aparente o sudores nocturnos, diarrea de ms de 1 mes de
evolucin sin causa que la justifique. b) Infecciones y neoplasias: Neumonitis por P. carinii.
Tuberculosis, pulmonar y extrapulmonar. Enfermedad diseminada o extrapulmonar por
Micobacterias Atpicas. Sepsis por Salmonela, recurrente. Candidiasis esofgica o traqueo-
bronco-pulmonar. Criptococosis extrapulmonar.
Histoplasmosis Diseminada. Infeccin por Herpes
Simple, muco-cutnea o visceral, crnica o recidivante.
Infeccin por CMV, retinitis u otra localizacin no
hepatoesplnica ni linftica. Coccidioidomicosis
Diseminada. Toxoplasmosis del SNC.
Leucoencefalopata Multifocal Progresiva.
Criptosporidiosis intestinal o extraintestinal.
Encefalopata subaguda o Complejo Demencial.
Neumona bacteriana recurrente (2 o ms episodios en un
ao). Linfoma inmunoblstico, de Burkitt o Primario del
SNC. Sarcoma de Kaposi. Carcinoma invasivo de cuello uterino. Enfermedad de Chagas, con
localizacin atpica.
La gran mayora de estas complicaciones tiene tratamiento, con curacin clnica, persistiendo en
general el agente en el organismo, por
lo cual se requiere terapia supresiva de
por vida en la gran mayora de los
casos. Es posible que a partir de algn
momento se llegue a una situacin de
no retroceso, en el que el sistema
inmunolgico es imposible que se
recupere, incluso ante la erradicacin
del virus. Sin embargo, la capacidad
de recuperacin de linfocitos y su
ndice de recambio es muy activo,
incluso en fases avanzadas. La
probabilidad de sobrevida, luego de un
evento definidor, en pacientes no
tratados es menor de 3 aos, pero en
quienes realizan terapia con esquemas
potentes, aun en pacientes muy
avanzados (menos de 50 CD4) se logra prolongar estos tiempos.
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Curso de la infeccin con el Virus de la I nmunodeficiencia Humana
La primera etapa de la infeccin por el VIH se caracteriza por una activa replicacin viral como
tambin por el surgimiento de una respuesta inmunolgica especfica contra el VIH-1 y el control
de la viremia. Esta infeccin aguda puede extenderse de cuatro a ocho semanas abarcando dos
etapas. Una primera etapa de diseminacin viral que ocurre durante las tres o cuatro primeras
semanas posteriores a la infeccin y culmina con el pico de viremia. En este perodo no se detectan
anticuerpos especficos contra el VIH-1 y por eso se denomina perodo "ventana". Durante las
primeras semanas se observa un descenso pronunciado del nmero absoluto de linfocitos T CD4(+)
en sangre perifrica y se producen niveles elevados de virus libre circulante en plasma que puede
ser cultivado y
cuantificado como
copias de ARN
viral/ml de plasma.
Estos ttulos
elevados de carga
viral plasmtica
estn asociados con
altos niveles de
antgeno p24.
La segunda etapa se
caracteriza por el descenso brusco de la viremia que se correspondera con la eliminacin parcial
del virus en sangre, concomitantemente con la deteccin de anticuerpos especficos contra el virus,
o sea con el perodo de seroconversin. La respuesta humoral especfica aparece entre las 2 semanas
y 3 meses postinfeccin. Como en otras infecciones virales la elevacin del nmero de linfocitos T
CD8(+) en sangre perifrica es un evento temprano que puede preceder a la seroconversin, pero
siempre es posterior a la deteccin del provirus en clulas circulantes.
8

Curso tpico de la infeccin por el VIH-1

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El nivel de anticuerpos se mantiene durante el perodo de latencia clnica o sea mientras el paciente
permanece libre de sntomas y signos de enfermedad. Con el avance de la enfermedad, el ttulo de
anticuerpos puede disminuir y llegar a valores no detectables en el estadio final del SIDA. Durante
la primoinfeccin se produce una reduccin moderada
del nmero de linfocitos T CD4(+), la cual continua en
forma lenta y progresiva durante el perodo asintomtico
la cual puede prolongarse por aos. Cuando la deplecin
de los linfocitos CD4(+) ocurre en forma acelerada
conduce a la aparicin de SIDA temprano. Las etapas
finales de la enfermedad se caracterizan por presentar
una inmunosupresin severa con recuentos de linfocitos
T CD4(+) muy bajos y altos niveles de viremia
plasmtica los cuales aumentan con las infecciones
oportunistas concomitantes que conducen finalmente a la
muerte.
Comportamiento de los Ls CD4+, los de memoria y de la
Reactividad de los LT-A durante la infeccin por HIV.
Linfocitos CD4: Las clulas que presentan este receptor son infectadas por el virus, oscilando sus
valores normales en sangre entre 600 y 1400/mm
3
. Evolucionando en forma natural la infeccin, sus
niveles descienden en forma progresiva en el tiempo. Es un marcador que predice progresin a
SIDA y supervivencia, evidenciando las consecuencias de la infeccin. Su valor se reduce al ser
tardo, respecto al que tiene la Carga Viral. Su mayor utilidad actual radica en: a) orientar la toma
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de decisiones para instituir terapias de profilaxis primaria, b) suspenderla (tanto primaria como
secundaria) al recuperarse sus niveles con el tratamiento, c) decidir la terapia antirretroviral y d)
para estadificar al paciente. Tiene como utilidad ser orientadora de diagnstico ante complicaciones,
ya que de su nivel depende la posibilidad de desarrollarse o no una determinada enfermedad. El
sistema de estadificacin utilizado actualmente incluye parmetros clnicos (A, B y C) y nivel de
Linfocitos CD4 (1, 2 y 3) aprobada por los CDC en 1993 y aplicados en nuestro pas desde 1996.
La estadificacin tiene un valor epidemiolgico, para conocer la marcha de la epidemia y de esta
forma realizar una adecuada planificacin sanitaria y un valor pronstico individual.

Infeccin de las clulas T CD4 por VIH
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Sistema de clasificacin

Categora Clnica

Carga Viral (CV)
Mide la cantidad de partculas virales en sangre, molculas que son fracciones del material gentico
viral, equivalente a la cantidad de virus circulante y reflejo de la magnitud de la replicacin viral.
Constituye el parmetro ms sensible para indicar el xito de la terapia antirretroviral y tambin
participar en la decisin del inicio, ya que sus niveles tienen un gran valor predictivo de progresin
e independiente de los CD4, cuando los valores son superiores a 100000 copias/ml. A mayor nivel
en sangre, mayor induccin de destruccin de linfocitos CD4, deterioro de la inmunidad y
progresin a SIDA. Reduciendo sus niveles con la terapia se preserva la integridad del sistema
inmune. La determinacin de sus niveles en sangre son de utilidad para indicar el inicio de la terapia
y controles posteriores permiten conocer la eficacia y duracin de esta. Se realiza la cuantificacin
de cidos nucleicos ARN viral. Existen distintas tcnicas de medicin, la muestra que se utiliza es
plasma (sangre anticoagulada con EDTA). Los mtodos utilizados son RT_PCR cuantitativa
(amplifica ARN viral con ciclos trmicos con un lmite de deteccin de 400 copias ARN/ml plasma
o 50 copias ARN/ml plasma si es el ultrasensible) y NASBA (amplifica ARN viral en forma
isotrmica con un lmite de deteccin de 50 copias ARN/ml plasma). Su utilidad es como marcador
subrrogante de progresin de la enfermedad y para la evaluacin y monitoreo de la respuesta a la
terapia antirretroviral, permitiendo decidir conductas teraputicas.

Estadificacin: Tres categora clnicas y tres por el nivel de linfocitos CD4:
Categora clnicas:
A: documentada infeccin, asintomtica, o infeccin aguda.
B: enfermedad sintomtica, condiciones no listadas en la categora C, incluyendo las siguientes:
atribuido al VIH o indicativo de un defecto en la inmunidad mediada por clulas; o, el curso
clnico o el manejo est complicado por el VIH.
C: condicin indicadora de SIDA.

Diagnstico de laboratorio

El diagnstico de la infeccin por VIH se basa en el aislamiento del virus, la deteccin de sus
antgenos o cidos nucleicos circulantes, o en la identificacin de sus anticuerpos especficos.

Mtodos directos
Comprenden el aislamiento del virus por cultivo, la deteccin de antgenos virales especficos o de
su material gentico. De la vasta extensin y variedad de las pruebas directas se describirn
solamente aquellas de mayor utilidad actual.

Antigenemia: mtodo de deteccin del antgeno viral p24. Su mayor problema radica en que
se encuentra normalmente formando parte de inmunocomplejos con su anticuerpo, lo que
dificulta su visualizacin y disminuye la sensibilidad de las tcnicas. Se usan
enzimoinmunoensayos alternativos con sistemas que permiten aumentar la sensibilidad de
las pruebas convencionales. Su utilizacin procura el acortamiento del perodo de ventana
serolgica en la infeccin aguda.
Categora cl. CD4 A B C
(1) > 500/mm
3
A1 B1 C1
(2) 200 499/mm
3
A2 B2 C2
(3) < 200/mm
3
A3 B3 C3
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Reaccin de la Polimerasa en Cadena (PCR): tcnica de amplificacin de secuencias
genticas del virus. Se usa en aquellas situaciones en que la deteccin de anticuerpos no
arroja resultados concluyentes en el diagnstico de la infeccin. Permite tambin el
diagnstico en el perodo ventana, la deteccin precoz de la infeccin en recin nacidos
hijos de madres VIH positivas, la identificacin de subtipos virales y el seguimiento de la
terapia antirretroviral. Detecta ADN pro viral y ARN viral. Su utilidad es en infeccin
reciente (perodo de ventana), resolucin de Western blot indeterminados y diagnstico
peditrico.

Mtodos indirectos o serolgicos
T
4
/T
8

Se usa el cociente entre el nmero absoluto de linfocito T
4
y el nmero absoluto de linfocito
T
8
como indicador de alteracin. Su valor normal es T
4
/T
8
1. (Linfocito T
8
: funcin
supresora de la fisiologa inmunitaria). La linfopenia como el descenso de la relacin T
4
/T
8,

vara segn el tiempo de evolucin y gravedad. Estas anomalas no son especficas de la
infeccin por HIV.

Recomendaciones de CDC: Un ensayo de deteccin de anticuerpos se considera positiva cuando
resultan dos pruebas consecutivas reactivas por ELISA, seguidas de un examen adicional de
Western-Blot (WB).
WB:
* (+) aparecen por lo menos dos de las siguientes bandas: p24, gp41, gp120/160 como
bandas nicas.
* (-) ausente todas las bandas.
* indeterminado: otro patrn distinto (esperar de tres a seis meses y repetir WB).

El diagnstico de la infeccin a travs de la identificacin de los anticuerpos especficos requiere de
un mtodo preliminar de elevada sensibilidad y una prueba suplementaria de rigurosa especificidad.

a) Mtodos de screening.

Aglutinacin pasiva: el vehculo soporte ms utilizado son las partculas de gelatina
sensibilizadas con antgenos de origen recombinante o sinttico. Se realizan en microplacas
en forma simple y rpida no requiriendo procedimientos de lavado. El antgeno utilizado son
partculas de gelatina sensibilizadas con Ags inactivados de VIH-1 y VIH-2 por separado.
Partcula sensibilizada
I nmunocromatogrfico: Son de gran utilidad por la rapidez del resultado, 10 a 15 minutos.
Si bien son ensayos de buena sensibilidad y especificidad, ante un resultado dudoso o
positivo debe realizarse un ELISA. Los antgenos son recombinantes y pptidos sintticos y
detectan Anticuerpos anti VIH 1/2.

ELI SA: segn el origen del antgeno utilizado estos ensayos analticos se clasificaron en
diferentes generaciones.

Test de 1 generacin: los primeros en utilizarse pero en desuso actualmente. Los antgenos
sensibilizantes de la fase slida proceden de lisados de virus cultivados en linfocitos. Su
principal desventaja es la pobre especificidad evidenciada por la gran cantidad de reacciones
falsas positivas por anticuerpos hacia contaminantes celulares, fundamentalmente Ag del
sistema HLA. Pruebas de 2 generacin: utilizan antgenos recombinantes originados al insertar
una regin seleccionada del genoma del VIH en vehculos biolgicos. Las protenas virales
pueden obtenerse en grandes escalas y sin los riesgos asociados a los cultivos del virus. Puede
aumentarse la sensibilidad fabricando fases slidas con varios antgenos recombinantes de
diferentes regiones genmicas del VIH. Persiste el inconveniente de reacciones inespecficas,
13
aunque en menor grado, y debidas en este caso a la reaccin contra determinantes antignicos
del vehculo vector. Mtodos de 3 generacin: incorporan antgenos obtenidos en un
sintetizador de protenas que ensamblan un pequeo nmero de aminocidos obteniendo
pequeos pptidos sintticos representativos de secuencias primarias de protenas del VIH. No
existen reacciones cruzadas y su sensibilidad puede optimizarse usando varios pptidos
sintticos en la sensibilizacin del soporte slido. Detectan anticuerpos totales anti VIH1/2
incluido el subgrupo O. Se utilizan microplacas o strips de poliestireno, micropartculas de
poliestireno (MEIA), enzimoinmunofluorescencia (ELFIA), etc. Los antgenos utilizados son
Ags recombinantes del gen env y gag ms pptidos sintticos de envoltura del VIH-1 y VIH-2.
El perodo de ventana serolgico aproximado es de 22 das.

Mtodos de 4 generacin: tienen la capacidad para detectar anticuerpos totales para VIH-1
(incluidos subgrupo O), VIH-2 y el antgeno p24 de VIH-1. La fase slida est recubierta con
diversos antgenos recombinantes, pptidos sintticos y con anticuerpos anti p24. Algunos de
stos ensayos tienen la ventaja de tener un lmite de deteccin muy bajo (3 pg/ml) para el Ag
p24, que acorta la ventana serolgica a 14-16 das.

Tendiendo al mximo de sensibilidad y especificidad, la mayora de los ensayos ELISA actuales
utilizan combinaciones adecuadas de antgenos sensibilizantes procedentes de lisados virales,
protenas recombinantes y pptidos sintticos.

Existen variados formatos y diferentes diseos posibles con estas pruebas.
o ELI SA indirecto: El antgeno viral se une a la fase aslida (en pocillo o placa), se lo
enfrenta al suero del paciente. El anticuerpo especfico con el antgeno viral, se se
hallara en suero del paciente se unir a la fase slida. Se agrega el anticuerpo anti
humano conjugado con enzima. Se agrega el sustrato correspondiente y se hace
lectura. Si existe anticuerpo hay seal de color.
o ELI SA indirectoo (sandwicho captura de anticuerpo): el anticuerpo del conjugado
enzimtico es anti inmunoglobulina humana. Para garantizar la deteccin de todas
las clases de anticuerpos antiVIH debe poseer actividad para todas las molculas de
inmunoglobulinas (G, M y A). No pueden incubarse simultneamente con la muestra
por la inhibicin con las inmunoglobulinas presentes. El desarrollo de color es
directamente proporcional a la concentracin de anticuerpos. Las absorbancias de las
muestras reactivas son superiores al cut off.
o ELI SA competitivo: el conjugado es un anticuerpo antiVIH unido a una enzima.
Puede incubarse conjuntamente con la muestra y la concentracin de anticuerpos es
inversamente proporcional a la intensidad del
color desarrollado. Las reacciones positivas
son las de absorbancias menores al cut off.
o ELI SA de antgeno sandwich: los mismos
antgenos que sensibilizan la fase slida
componen el conjugado enzimtico. Es una
versin muy ventajosa que permite detectar,
aunque no diferenciar, a todas las clases de
anticuerpos formados por el paciente (M, G y
A) pudiendo, por lo tanto, ser ms til en la
infeccin aguda en donde los primeros
anticuerpos responden a la clase molecular
IgM. Este tipo de conjugado tambin puede
incubarse junto a las muestras resultando en
ensayos sandwich con una etapa de
incubacin y lavado menos.
14
o ELI SA captura de antgeno: Puede ser indirecto o competitivo. Los pocillos de la
placa se recubren con anticuerpos monoclonales (AcM) de ratn contra antgeno p24
del ncleo del VIH-1. El amortiguador de ruptura se aade para romper cualquier
virin presente en las muestras de pruebas. Con la adicin de una muestra o control
apropiado que contenga antgeno VIH-1, se forman complejos inmunes con la
interaccin del antgeno en la muestra y el anti-VIH-1 en la fase slida. Seguido de
una incubacin, la muestra se aspira y el pocillo se lava con solucin amortiguadora.
Posteriormente, se aade el antisuero anti VIH-1 (humano) conjugado con
peroxidasa. El anticuerpo marcado se une con los complejos anticuerpo/antgeno
previamente formados de la fase slida. Despus de un lavado e incubacin con
sustrato-cromgeno H
2
O
2
-tetrametilbencidina (TMB), se produce un color azul que
cambia a amarillo cuando la reaccin se detiene con la solucin de parada.

I nmuno dot o dot blot: son pruebas muy fciles de realizar y muy rpidas. No son ensayos
ELISA puesto que no utilizan un conjugado enzimtico para la revelacin de la unin
antgeno anticuerpo. La fase slida es una membrana de nitrocelulosa sobre la cual se
adsorbido pasivamente (blot) un antgeno recombinante o pptido sinttico del VIH
formando un crculo (dot). El conjugado que se emplea es Protena A Au coloidal. La
protena A, procedente del Staphylococcus aureus, tiene la propiedad de unirse a los sitios
Fc de las inmunoglobulinas humanas. La reaccin positiva se visualiza como una zona
circular rosada, por el color del oro coloidal, en la regin donde se encuentra inmovilizado
el complejo antgeno anticuerpo. Son muy tiles en situaciones de emergencia, salas de
autopsias, quirfanos, servicios de transplante de rganos, salas de maternidad, etc. Su
mayor ventaja es la de no requerir instrumental. No es recomendable utilizarla como nica
prueba de screening.

b) Pruebas suplementarias o de confirmacin.

Western blot (WB): es la prueba confirmatoria ms ampliamente utilizada. Complementa
las pruebas de tamizado siendo
mucho ms especfica. Permite
identificar los anticuerpos
involucrados en una reaccin de
rastreo positiva, discriminando su
especificidad hacia los antgenos del
VIH. La mezcla de antgenos VIH
procedentes son protenas
provenientes de un lisados virales
cultivo celular, purificados y
separados en una electroforesis en
geles de poliacrilamida en presencia
de dodecil sulfato de sodio. En estas
condiciones de trabajo los antgenos
se separan segn sus pesos
moleculares. Los antgenos as
separados se electrotransfieren a una
membrana de nitrocelulosa. La
membrana de nitrocelulosa con los
antgenos adsorbidos sobre su
superficie es la fase slida sobre la
que se realiza un ELISA. Adems
hay pptidos especficos para VIH-2. La visualizacin se da por la formacin de un
15
producto insoluble que precipita en el sitio donde ha ocurrido cada reaccin antgeno
anticuerpo (bandas de precipitacin). Conjuda es anti IgG conjugada con fosfatasa alcalina.
El tipo viral detectado es VIH-1 includo el subgrupo O + VIH-2. Los resultados se
informan como negativos, positivos o indeterminados. Si bien existen muchos criterios de
positividad de diferentes organizaciones internacionales, en Argentina se siguen los
establecidos por la Cruz Roja Norteamericana que definen a un Western como positivo
cuando se detectan al menos un anticuerpo hacia una protena derivada de cada uno de los
genes env, gag y pol. La ausencia de bandas origina un resultado negativo. La presencia de
cualquier nmero y combinacin de bandas pero sin reunir el criterio de positividad
establecido define a un Western indeterminado. Criterios de positividad (CDC: Center for
Disease Control) para VIH-1 es dos de las siguientes bandas: gp160/120; p24; gp41.

16

I nmunoensayos en lnea (LI A): son test confirmatorios de segunda generacin en los
cuales se adsorben directamente sobre membranas de nylon o de nitrocelulosa antgenos
recombinantes o pptidos sintticos representativos del VIH, y no proviene de una corrida
electrofortica. Permite el sembrado de antgenos de mas de un virus en la misma tira de
nitrocelulosa, as como tambin la deteccin simultnea de anticuerpos contra distintos
tipos virales de un mismo virus. Los anticuerpos detectados son de istotipo IgG. El
conjugado es anti IgG conjugada con fosfatasa alcalina. El tipo viral detectado es VIH-1
includo el subgrupo O + VIH-2. El antgeno utilizado son protenas recombinantes y
pptidos de VIH-1 y VIH-2. Esta tcnica permite eliminar los problemas de interpretacin o
los resultados atpicos generados al emplear lisado de virus. El criterio de positividad ser
segn el fabricante.
La I nmunofluorescencia indirecta (I FI ) y la Radioinmunoprecipitacin (RI PA) tambin
son tcnicas confirmatorias pero menos utilizadas por contener material radioactivo y
cultivos celulares con virus VIH. Es una tcnica extremadamente sensible y especfica. Se
utilizan aminocidos marcado radiactivamente y se le agrega al medio de cultivo de clulas
infectadas con VIH. El virus al replicarse incorpora el aminocido marcado a sus protenas.
Luego las partculas virales son lisadas y enfrentadas con el suero a estudiar. El
inmunocomplejo formado es precipitado con una protena A, luego se realiza una corrida
electrofortica y la protenas marcadas y separadas son visualizadas por autorradiografas.

Diagnstico de la enfermedad viral aguda
Obtener la muestra lo antes posible.
A los 20 das obtener nueva muestra para ver cambios en la respuesta inmune.
17
Solicitar muestra cada 30 das.
Estudiar las clulas que secretan citoquinas (IL-1 estimuladora de linfocito T) tales como
macrfagos (procesan el material viral al ser clulas presentadoras de antgeno) y clulas
dendrticas (no procesan el antgeno pero amplifica la presentacin del mismo).
Para que se liberen sustancias que destruyan las clulas infectadas, los linfocitos T deben
portar el marcador CD
8
-CD
28
(Linfocitos T citotxicos) en la superficie, ya que son los ms
importantes en la eliminacin de clulas infectadas.
L
T
CD
4
(+) +L
TH
TH
I
inflamatoria
TH
II
colaboradores, secretan interleucinas para estimular al
linfocito B.
CD
8
(+) +L
TC
supresores relacionados con la tolerancia a antgeno extrao.
se asocia a una enfermedad en L
T
supresores en sndromes
autoinmunes.

Los tipos de anticuerpos son contra la estructura externa del virus (neutraliza el virin y dosminuye
su infectividad) o detecta protenas virales internas (anticuerpos anti core).

a) Esquema clsico de una enfermedad viral:
1- Clulas infectadas (virus con lisis celukar) provoca respuesta inmune al virus y
partculas subvirales.
2- Los virus liberados a sangre quedan expuesto a a los anticuerpos neutralizantes y los
sistemas de depuracin captan los inmunocomplejos.
3- Las clulas donde se replican los viriones son sometidas a interferones y si existen
antgenos de superficie se provocar la lisis a travs del sistema inmunocomplejo-
sistema complemento o por linfocitos T.
4- Terminan con las clulas infectadas que expresaban antgenos de superficie.
5- Comienza la convalecencia.
b) Respuesta inmune en infecciones crnicas:
No existe lisis celular y los viriones emergen por brotacin de membrana:
1- La destruccin por el proceso inflamatorio es menor.
2- El virus liberado inicia la respuesta y es tomando por macrfagos por lo que no existe
contacto con el antgeno (respuesta inmune lenta).
3- Hay pocos anticuerpos neutralizantes.
4- Quedan bloqueados todos los anticuerpos de superficie y los linfocitos no van a
reconocer al antgeno.
5- Se instala la cronicidad.

Mtodos serolgicos en el Laboratorio de Banco de Sangre
Los parmetros a analizar en las muestras de sangre de los donantes son Antigenemia p24 y
Anticuerpos anti-VIH-1y anti-VIH-2.
Ag p24: su determinacin no tiene fuerza de ley, su
aplicacin responde a una norma recomendada por la
Asociacin Argentina de Hemoterapia e
Inmunohematologa. Para aumentar la posibilidad de
detectar el antgeno p24 en suero deben utilizarse
tcnicas de muy alta sensibilidad y que agreguen
agentes disociantes de los inmunocomplejos de los
cuales forman parte. Una de las variantes ms utilizadas
son los ensayos ELISA que incorporan al sistema
Avidina Biotina como amplificador adicional de la reaccin antgeno anticuerpo. La fase slida es
sensibilizada con anticuerpos monoclonales anti p24. La actividad del conjugado resulta de la
accin secuencial de dos conjugados diferentes: el primero est formado por anticuerpos anti p24
18
biotina y el segundo por avidina enzima. Cada molcula de antgeno unida a la fase slida ser
amplificada cuatro veces por las caractersticas de la reaccin entre avidina y biotina. Otro de los
mtodos es usar como conjugado anticuerpos anti HVI-1 marcados con peroxidada que se revela
con TMB. El Ag p24 es detectado aproximadamente una semana antes que los ensayos que detectan
anticuerpos, 14 a 16 das de la infeccin. En el diagnstico peditrico se emplea esta metodologa
con la realizacin de la disociacin cida que aumenta la sensibilidad por destruccin de los
inmunocomplejos antgeno-anticuerpo. Tambin puede aumentarse la especificidad utilizando el
test de neutralizacin.
Anticuerpos anti-VI H: los mtodos que deben ser usados para su determinacin son los ELISA o
bien las aglutinaciones de partculas de gelatina. Es exigencia que, cualquiera sea el mtodo,
permita detectar a los dos tipos de virus, VIH1 y VIH2. Por lo tanto los ensayos deben incluir
antgenos provenientes de ambos. La protena antignica representativa del VIH2 es la gp36,
codificada por su gen env. Su eleccin para formar parte de la mezcla antignica obedece a que en
las regiones env es donde se presenta la mayor variabilidad gentica en el VIH, mientras que las
regiones gag y pol son ms conservadas. Actualmente existen pruebas para la deteccin conjunta de
antgeno p24 y anticuerpos antiVIH. Su concepcin est orientada a los bancos de sangre contando
con la ventaja de reunir ambos procedimientos en uno solo. Sin embargo, ante un resultado positivo,
deber determinarse luego si se debe a antigenemia, a anticuerpos o a ambos, con mtodos que
permitan su discriminacin. La prevalencia de la infeccin por VIH en la poblacin de banco,
medida por la deteccin de Anticuerpos, es igual a 0,06%.

Algoritmo diagnstico de la infeccion por VIH

PRIMERA MUESTRA

TECNICA DE TAMIZAJE
(DETECCIN DE ANTICUERPOS VIH-1/VIH-2)

No infectado NO REACTIVO 2da. Muestra REACTIVO
(confirmado por repeticin)

Infectado en perodo de ventana REACTIVO

ADN pro viral por PCR cualitativa WESTERN BLOT

NO REACTIVO INDETERMINADO REACTIVO

SEGUIMIENTO Infectado

WB (1, 3, 6 meses)
ADN pro viral por PCR cualitativa

Tratamiento

Se basa en:
1- Administracin de antirretrovirales. Existen dos tipos: los inhibidores de la
transcriptasa (AZT, DDI, DDC, D4T, 3TC) y los inhibidores de la proteasa
(indivovir, saquinovir, ritonavir, nelfinovir).
19
2- Apuntalar el sistema inmunitario: se pretende actuar sobre el VIH bloqueando la
sntesis de ADN viral. Son medicamentos txicos que pueden lesionar rin, hgado
y sistema hematopoytico. Son foscarnet, HP23, BWA, 509U, ansamycina. Se
administra asociados a estimuladores de la inmunidad (IL-2 e INF-gamma), a
inmunoterapia adoptiva (transplante de mdula sea y transfuncin de leucocitos) y a
inmunomoduladores (isoprinosina, timopectina, azimexon e indometacina).
3- Tratamiento de infecciones oportunistas.

Las vacunas frente al VIH pueden seguir dos estrategias, las dirigidas a crear una vacuna preventiva
en individuos no infectados por el virus y las que desarrollan una vacuna teraputica en personas
seropositivas. En la actualidad no existe ninguna vacuna preventiva que haya probado ser eficaz
contra el virus del sida. Los dos nicos ensayos en fase III realizados hasta el momento que
utilizaron la protena gp160 recombinante como base de la vacuna han fracasado. Esta situacin ha
generado una polmica en la comunidad cientfica sobre las estrategias adecuadas para desarrollar
una vacuna frente al VIH y los requisitos para iniciar estudios en fase III. Las vacunas teraputicas
basadas en particulas virales desprovistas de la envuelta viral e inactivadas tampoco han
demostrado eficacia clnica.

Virus VIH Virus VIH
inactivo atenuado

Subunidades
recombinantes

Pptido VIH

Vectores virales Plsmido de Vectores bacterianos
recombinantes ADN recombinantes

Enfermedades Asociadas A Retrovirus

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I nmunologa I I 2do. Ao 4to. Cuatrimestre

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