El trasplante alognico de progenitores hematopoyticos o alo-TPH supone la sustitucin de los
precursores de las clulas sanguneas del paciente por los de un individuo sano compatible a nivel de los antgenos de histocompatibilidad HLA, generalmente un hermano o, si ello no es posible, un donante voluntario que no sea familiar del paciente pero que sea HLA compatible. Por otra parte, los precursores se pueden obtener de la mdula sea, de la sangre o de un cordn umbilical. El trasplante alognico de progenitores hematopoyticos (alo-TPH) es el nico tratamiento con capacidad de curacin demostrada de la LMC. Hasta la introduccin de los inhibidores de la protena tirosincinasa, era el tratamiento de eleccin para los pacientes menores de 55 aos que tenan un hermano compatible y para los menores de 40 aos con un donante no familiar. En la actualidad, en vista de la elevada capacidad de Imatinib para conseguir respuestas citogenticas, el alo-TPH no debe realizarse de entrada en ningn caso y se reserva como tratamiento para los pacientes jvenes que no responden a los inhibidores de tirosincinasa. Utilidad de la prueba de antigenemia cuantitativa (en leucocitos) en el diagnstico de infeccin activa por citomegalovirus Introduccin
El citomegalovirus (HHV-4) es un virus perteneciente a la familia Herpetoviridae, subfamilia Betaherpesvirinae, presenta simetra icosahdrica con 162 capsmeros y envoltura lipdica. Su ADN es de doble banda, de 235 Kb y codifica aproximadamente 200 protenas (16). La viremia por CMV es un marcador de infeccin diseminada, la cual es de difcil diagnstico clnico. Los mtodos de deteccin de la viremia incluyen el aislamiento viral, la deteccin de cido nucleico y la determinacin de antgenos. Por ser los leucocitos los mejores portadores del virus (32), la deteccin rpida de antgenos tempranos del CMV por tcnicas inmunolgicas en stos, es un indicador de infeccin activa (6,34).
Epidemiologa El CMV es uno de los parsitos humanos ms exitosos (17); la incidencia en la mayora de poblaciones en pases subdesarrollados es mayor del 90%; puede transmitirse en la poblacin va vertical u horizontal, y durante las infecciones primarias, reinfecciones y/o reactivaciones, estas ltimas producidas por su capacidad de permanecer latente en leucocitos y en algunas clulas epiteliales (18,25,32). En cuanto a los mecanismos ms comunes de transmisin (18), cabe citar: va intrauterina, perinatal, postnatal, post transfusin sangunea y post transplante (1, 7). Dada la terapia inmunosupresora, la reactivacin del CMV en transplantados es casi siempre un hecho (4,29,30). En transplante de rganos slidos en seropositivos, se detecta con mayor frecuencia la reactivacin del CMV en el rgano donado, mientras que en transplante de mdula sea (TMO), se detecta con mayor frecuencia la reactivacin del CMV del receptor (19, 16, 39). El CMV se ha asociado como agente causal de rechazos de rganos transplantados y de enfermedad de rechazo injerto contra husped en TMO (16, 24, 27, 36). En los pacientes infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana, el CMV es la infeccin viral oportunista ms frecuente, se presentan casos severos de pneumonitis, coriorretinitis e infeccin diseminada (12, 31). Se ha demostrado un alto porcentaje de transmisin por contacto sexual entre hombres homosexuales (16, 18). Del 20 al 60% de los receptores de transplantes y del 25 al 90% de los pacientes con sida, pueden desarrollar infeccin activa por CMV (24).
Reinfeccin, reactivaciones y recurrencia. Reinfeccin: implica que el paciente se infecta de nuevo con una cepa diferente a la de la infeccin primaria. Reactivacin: el virus que se encuentra en estado latente y sin aplicarse (no se detecta ARm viral), inicia un nuevo ciclo de replicacin, con produccin de virus, aunque no necesariamente con sintomatologa. Persistencia: el virus se replica constantemente aunque en baja tasa, siempre se puede detectar ARm viral, se ha determinado este estado de persistencia principalmente en pacientes con sida. En cuanto a las reactivaciones, pueden darse en seropositivos, inclusive hasta de dos cepas latentes diferentes. Se ha observado que el proceso, es edad dependiente, as que la probabilidad de reactivaciones baja casi a cero despus de los 30 aos de edad (16). Estudios genticos han demostrado reinfeccin an con la misma cepa de la infeccin primaria, lo que corrobora que la seropositividad no implica proteccin. Clnicamente es imposible diferenciar una infeccin primaria, de una reinfeccin o de una reactivacin. Los cuadros clnicos ms importantes, se especifican en el Cuadro 1. Cuadro 1 Cuadros clnicos ms frecuentemente asociados a CMV
El diagnstico de laboratorio del CMV puede realizarse por varias tcnicas (8, 16, 32, 36) entre ellas: 1. Aislamiento en cultivo celular a partir de muestras de orina, saliva o leucocitos; el mayor inconveniente de esta tcnica es el tiempo requerido, que puede llegar inclusive de 22 a 56 das. Este mtodo puede realizarse en nuetro pas, en laboratorios especializados. 2. Diagnstico histolgico: observando las inclusiones de "ojo de pjaro" en cortes de tejido, patognomnicas de infeccin citomeglica. Es un mtodo muy especfico, pero poco sensible. 3. Observacin del agente por microscopa electrnica o inmunomicroscopa: no es una tcnica que se puede utilizar de rutina en hospitales nacionales, adems morfolgicamente los herpetoviridae son similares. 4. Hibridacin o Reaccin en Cadena de Polimerasa (PCR): sirve para identificar el ADN o el ARNm viral (37). Aunque es la tcnica ms utilizada en pases desarrollados, todava en los hospitales nacionales no contamos con esta tecnologa; adems, la interpretacin de demostracin de ADN de virus que producen infecciones latentes es conflictiva (13, 33). 5. Determinacin de antgenos virales por inmunofluorescencia (IFA) o ELISA de captura, en biopsia fludos o leucocitos (antigenemia). 6.Diagnstico serolgico: es quizs la tcnica que presenta mayores problemas de interpretacin (23), por los siguiente aspectos:
6.1 Una IgG positiva slo tiene inters epidemiolgico, ya que persiste de por vida luego de la infeccin primaria. 6.2 La IgM persiste por 3 o 4 meses post-infeccin primaria, pero no se eleva en reactivaciones en personas inmunocompetentes (16). 6.3 Las personas inmunodeficientes pueden dar falsos negativos por IgG, ya que presentan ttulos muy bajos. Contrario a lo observado en inmunocompetentes los inmunosuprimidos no elevan IgM en la primoinfeccin, pero s luego de reactivaciones; probablemente su sistema inmune necesite de un estmulo mayor (16). 6.4 Puede darse transferencia pasiva de IgG en transfusiones. 6.5 La seropositividad no implica proteccin ni de una reinfeccin ni de una reactivacin. 6.6 Es prcticamente imposible distinguir serolgicamente una reinfeccin de una reactivacin. La tcnica de determinacin de antgenos virales por inmunofluorescencia en leucocitos (antigenemia), es una tcnica propuesta por van der Bij y colaboradores a finales de los aos 80 (37); permite detectar antgenos tempranos virales en leucocitos, principalmente la pp65 (14, 22, 33). Es una tcnica con un 90% de sensibilidad y un 96% de especificidad, que correlaciona muy bien con las manifestaciones clnicas y con el pronstico del paciente (4, 37). Se han realizado varios estudios comparando la tcnica de antigenemia, con las tcnicas de "shell vial", PCR e hibridacin, y han demostrado que existe muy buena correlacin entre antigenemia y enfermedad activa por CMV, demostrada por cultivo o determinacin directa del ADN viral (9, 11, 13, 26, 33, 35). Quizs su mayor ventaja sea el tiempo necesario para obtener los resultados: de 4 a 6 horas. La tcnica cuantitativa en polimorfonucleares, se puede utilizar para monitorear pacientes antes, durante y despus del tratamiento con ganciclovir o foscamet (15, 22, 27, 36). El diagnstico por antigenemia es ideal para detectar citomegalovirus activo en receptores de transplantes y en individuos con infeccin o enfermedad por VIH (5,19). En pacientes post-transplante de rganos slidos se recomienda cada 2 semanas los primeros 3 meses y mensualmente por 6 a 12 meses (33). En pacientes sidticos o bien post-transplante de mdula sea, se recomienda una vez por semana cuando se sospeche clnicamente la infeccin (fiebre por 3 das o ms, artralgia, leucopenia, trombocitopenia, aumento de enzimas hepticas o pneumonitis inexplicable) (22, 27). La muestra requerida para el anlisis, debe ser de 6 a 10 ml de sangre total heparinizada, y es necesario que el procedimiento de la muestra se lleve a cabo dentro de las 2 primeras horas post- recoleccin, el 80% de la tasa de deteccin puede disminuir si la muestra se procesa despus de 6 horas de la recoleccin (5, 28). En cuanto a la tcnica en s, se puede realizar tanto cuantitativa en polimorfonucleares separados con Dextran PM 70000 (21) o bien cualitativa en linfocitos separados con Ficoll-Hipaque (38). La determinacin de antgenos se puede llevar a cabo por inmunofluorescencia (IFA) o inmunoperoxidasa (IPA), si se usa la inmunoperoxidasa en leucocitos totales, hay que eliminar la actividad peroxidasa endgena producidas por los eosinfilos, con un pretratamiento con metanol- H 2 O 2 (14). Sin embargo, se obtienen mejores resultados con la IFA. Se puede utilizar adems el sistema avidina-biotina o fosfatasa alcalina para el marcaje. La interpretacin se basa en el conteo del nmero de leucocitos positivos por 200.000 leucocitos estudiados (20): a) Negativo: 0 (cero) leucocitos positivos. b) Positivo dbil: de 1 a 10 leucocitos positivos c) Positivo: de 10 a 49 leucocitos positivos d) Altamente positivo: 50 o ms leucocitos positivos. Los resultados positivos dbiles pueden esperarse durante etapas tempranas de las reactivaciones o durante el tratamiento antiviral (2, 5). Un aumento en la antigenemia implica infeccin activa; una disminucin correlaciona muy bien con eficacia del tratamiento y por el contrario, antigenemia altamente positivas an despus de tratamiento indican resistencia a ste (24). En el Hospital Nacional de Nios, hemos estado utilizando la tcnica de antigenemia para el diagnstico de infeccin aguda por CMV; hasta el momento hemos procesado 70 muestras, de las cuales 12 (17%) se reportaron altamente positivo, 13 (19%) como positivo, 7 (10%) positivo dbil y 38 (54%) negativo. En nuestro Hospital utilizamos la prueba de antigenemia nicamente en pacientes seropositivos por VIH, pacientes post transplante, principalmente de mdula sea y en pacientes cuya sintomatologa sugiera al mdico una posible infeccin aguda por CMV. De los resultados obtenidos, todos los casos reportados como altamente positivo, corresponden a pacientes seropositivos por VIH, con reactivaciones del CMV. Dentro de los reportados positivo, la mayora de casos (75%), corresponden a pacientes post transplante de mdula sea con reactivacin viral y el 25% restante a infecciones primarias por CMV, diagnosticados como tales por ser IgG e IgM anti-CMV negativas. Los casos dbil positivo, no mostraron ningn patrn epidemiolgico en especial, pero al 50% de estos pacientes, cuando se les repeta el examen una semana despus, estaban positivos o altamente positivos, lo que indica que los resultados obtenidos en la primera muestra, se deban probablemente a etapas tempranas de infeccin. Los resultados negativos se asociaron con no infeccin por CMV, no reactivacin del virus o tratamientos exitosos con ganciclovir. Es importante anotar que en aquellos casos altamente positivos, tratados con ganciclovir, a partir del da 2 del tratamiento, el conteo del nmero de clulas positivas decae drsticamente hasta llegar a negativizarse.
Conclusiones La tcnica de antigenemia cuantitativa para el diagnstico de infeccin activa por CMV, es altamente sensible y especfica, puede darnos un estimado de la carga viral y puede utilizarse para monitoreo del tratamiento antiviral. En pacientes con sida o transplantados, es una prueba ideal para el diagnstico de reactivaciones del CMV, incluso antes de la aparicin de sntomas, lo que permite instaurar la terapia antes de la reactivacin clnica. Ya que est demostrado que la serologa no la podemos utilizar para el diagnstico de reactivaciones o reinfecciones del citomegalovirus, la antigenemia es la prueba diagnstica de eleccin en estos casos; adems, correlaciona muy bien otras tcnicas moleculares por PCR e hibridacin y tiene la ventaja de no requerir equipo tan valioso y sofisticado, por lo que es posible realizarla en nuestros hospitales.
Resumen Se discute en este trabajo la importancia de la prueba de antigenemia para el diagnstico de infeccin activa por citomegalovirus (CMV). Se presenta una revisin de los principales aspectos involucrados en la transmisin del virus, as como ventajas y desventajas de la mayora de tcnicas utilizadas en el diagnstico del CMV, especificando las ventajas que presenta la antigenemia en cuanto a especificidad, sensibilidad, tiempo y correlacin con la clnica del paciente; adems, la utilidad de la prueba en el monitoreo de la terapia antiviral.
INTRODUCCIN El citomegalovirus (CMV) es un virus ADN de la familia Herpesviridae. En la poblacin general, la infeccin por CMV tiene una gran prevalencia que aumenta con la edad, infectndose hasta dos tercios de los individuos y persistiendo de forma latente en el organismo del husped de forma indefinida. Mientras que en la poblacin general esta infeccin se presenta de manera asintom- tica o mnimamente sintomtica en forma de sndrome mononuclear, en la poblacin de pacientes sometidos a trasplante renal la infeccin por CMV puede derivar en una gran variedad de manifestaciones clnicas y de afectacin de diversos rganos que se asocian con una morbilidad y una mortalidad significativas. La administracin de frmacos inmunosupresores para la prevencin del rechazo inmunolgico est directamente relacionada con el aumento del riesgo de enfermedad por CMV, concretamente con el uso de terapias de induccin y de derivados del cido micofenlico1-3. Las manifestaciones clnicas de la enfermedad por CMV son inespecficas, por lo que se hace necesaria la utilizacin de tcnicas microbiolgicas ms especficas para el diagnstico. Sin embargo y aunque las tcnicas para la deteccin del CMV han mejorado de forma sustancial en la ltima dcada, su interpretacin se hace difcil, por lo que es preciso poner en contexto estas tcnicas, la situacin clnica del paciente y el tipo de muestra analizada. En este sentido, aunque el aislamiento del CMV podra parecer definitivo para el diagnstico de un determinado cuadro clnico, ste podra estar causado por otros microorganismos. Por otro lado, la histologa constituira el diagnstico definitivo, pero en la gran mayora de los casos esto no es posible. INFECCINENFERMEDAD Un aspecto importante a tener en consideracin es la diferencia que existe entre infeccin y enfermedad por CMV.
Infeccin por citomegalovirus Implica la deteccin del virus CMV en el organismo mediante cultivos, tcnicas de biologa molecular o la confirmacin del contacto con el virus mediante tcnicas serolgicas (seropositividad a IgG). Para el diagnstico de infeccin reciente o primoinfeccin, es necesario la seroconversin con aparicin de anticuerpos IgM anti-CMV, un incremento de cuatro veces o ms del ttulo de IgG preexistente o la deteccin del virus mediante cultivos o tcnicas de biologa molecular en pacientes previamente no infectados. Hablamos de infeccin activa en aquellos pacientes con serologa positiva IgG que presentan datos de replicacin activa del virus detectada mediante cultivos o tcnicas de biologa molecular. En caso de serologa positiva sin datos de replicacin del virus, se tratara de una infeccin latente4,5 (Grado de recomendacin: basado en consenso).
Enfermedad por citomegalovirus Para su diagnstico, precisa que se aada a la evidencia de infeccin por CMV la presencia de sntomas clnicos compatibles. Segn los sntomas clnicos, podemos distinguir entre el sndrome viral-mononuclear y la enfermedad invasiva. El sndrome viral consiste en un cuadro febril inespecfico, acompaado con frecuencia de leucopenia. Cuando la enfermedad produce una afectacin de uno o ms rganos en forma de neumonitis, hepatitis, enterocolitis, encefalitis, coriorretinitis, etc., hablamos de enfermedad invasiva6-9 (Grado de recomendacin: basado en consenso).
DIAGNSTICO PRETRASPLANTE Se realiza mediante serologa CMV IgG y constituye la base fundamental para estratificar el riesgo de infeccin y/o enfermedad y planificar las estrategias de prevencin. Mediante la determinacin de IgG anti-CMV, clasificamos tanto a los donantes como a los receptores de un trasplante renal en seropositivos o seronegativos. Un aspecto importante a tener en cuenta es la necesidad de confirmar la seronegatividad del receptor en el momento del trasplante, ante la posibilidad de su seroconversin desde la ltima determinacin de anticuerpos previa al trasplante8 (Grado de recomendacin: basado en consenso).
DIAGNSTICO POSTRASPLANTE Cultivos Mediante el cultivo en fibroblastos humanos, el CMV puede ser aislado a partir de muestras de distintos orgenes, como sangre, orina, lquido cefalorraqudeo, lavados bronquiales o biopsias de tejidos. Sin embargo, el tiempo prolongado que se necesita para el crecimiento en el medio de cultivo que, dependiendo de los casos, puede llegar a ser de hasta 6 semanas, impide que se utilice en la prctica clnica habitual. La deteccin del antgeno temprano del CMV en medios de cultivo (cultivos de Shell-vial), utilizando anticuerpos monoclonales dirigidos contra este antgeno en muestras de sangre, orina, etc., indica replicacin temprana del virus en las clulas. Los resultados de esta tcnica habitualmente, se obtienen en un plazo de 2 a 3 das. Actualmente, esta tcnica ha sido desplazada por los nuevos mtodos diagnsticos disponibles10.
Serologa para citomegalovirus (IgM/IgG) En la actualidad, no se considera de utilidad clnica la utilizacin de la serologa para el diagnstico de la enfermedad por CMV en el postrasplante renal11,12 (Grado de recomendacin: basado en consenso).
Antgeno pp65 de citomegalovirus La tcnica conocida como antigenemia de CMV consiste en la deteccin de la protena pp65 en leucocitos polimorfonucleares neutrfilos de sangre perifrica, mediante anticuerpos monoclonales dirigidos contra este antgeno. La sensibilidad y la especificidad de esta tcnica para el diagnstico de infeccin por CMV es alta y tiene una buena correlacin con la viremia12-16. La mayor limitacin de la tcnica es la falta de criterios estndar para la interpretacin de un mismo resultado entre laboratorios, al depender de un observador experimentado para su interpretacin. Otros inconvenientes son la necesidad de un tiempo corto para el procesamiento de la muestra, y ser una tcnica manual y laboriosa. Por el contrario, es un mtodo diagnstico de bajo coste econmico en relacin con las tcnicas de biologa molecular, como la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Esta tcnica no es interpretable en el caso de presentar el paciente una neutropenia de menos de 1000 n/ucl11,14. Aunque no existe un consenso extendido, es ms importante la tendencia de la antigenemia que un punto de corte concreto. Por otro lado, los criterios de positividad son distintos para la infeccin que para la sospecha de enfermedad por CMV. El resultado se expresa en nmero de neutrfilos positivos para el Ag pp65 de cada 100.000. Para el diagnstico de infeccin, un Ag pp65 CMV > 1 cel/100.000 neutrfilos es significativo. Para la enfermedad por CMV, el punto de corte vara segn la serologa del paciente; si el paciente es seronegativo, el diagnstico de enfermedad se hara si el Ag pp65 es >_ 1 cel/100.000 neutrfilos. En el caso de ser seropositivo, el diagnstico de enfermedad se realizara con Ag pp65 > 10 cel/100.000 neutrfilos (tabla 1). La aplicacin de esta tcnica tiene fundamentalmente tres utilidades. La primera, tal como se ha mencionado previamente, es el diagnstico de infeccin-enfermedad. La segunda es el tratamiento anticipado como criterio para empezar el tratamiento. Y terce-ra, para monitorizar la respuesta al tratamiento ya instaurado11,17-19 (Grado de recomendacin: dbil). Carga viral-Reaccin en cadena de la polimerasa-Citomegalovirus Actualmente, la PCR constituye la tcnica de eleccin en el diagnstico de la infeccin por CMV, al ser una tcnica ms sensible que la antigenemia. Sin embargo, existe una dificultad a la hora de definir la negatividad de la PCR e instaurar por tanto los puntos de corte para establecer el diagnstico, al poderse detectar ADN viral en pacientes sin enfermedad activa12,20-25. En general, podemos decir que se trata de una tcnica objetiva y rpida, aunque el equipo necesario tiene un alto coste. Las tcnicas de PCR las podemos dividir en cualitativas o cuantitativas, y en comerciales automatizadas o caseras. Adems, dependiendo de si la reaccin en cadena se detecta de forma inmediata o tras 12-24 horas, la PCR es tiempo real o convencional, respectivamente (tabla 2). La muestra utilizada puede ser sangre total que ofrece una mayor sensibilidad y proporciona un reflejo ms real de la infeccin-enfermedad por CMV o plasma, que tiene como ventajas una ms fcil realizacin de la tcnica y una mayor automatizacin. Existen diversas tcnicas comerciales automatizadas, como el COBAS AMPLICOR, LightCycler (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), el sistema de captura hbrida (Digene Corporation, Gaithersburg, MD) o el Abbott RealTime CMV assay (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois), para la realizacin de la PCR cuantitativa. Sin embargo, con frecuencia se realizan diversas tcnicas no comerciales o caseras en el laboratorio de microbiologa, lo que implica que las cargas virales entre los distintos ensayos nos sean comparables por las diferencias en el diseo de la tcnica. Las ventajas respecto a las tcnicas comerciales son un menor riesgo de contaminacin o una mayor rapidez en la obtencin del resultado. Bien sea una tcnica comercial o casera, se recomienda que la PCR sea cuantitativa a tiempo real25,26. Cualquier valor positivo de PCR de CMV se considera indicativo de infeccin. Aunque cualquier grado de positividad debe poner en alerta sobre el desarrollo de enfermedad, se sugieren como resultados sospechosos de enfermedad > 500 copias en plasma en receptores de trasplante renal seronegativos (R-) y > 1000 en plasma en seropositivos (R+). Sin embargo, la cintica de replicacin viral es ms importante que un valor nico y aislado de carga viral. Para comparar los resultados de carga viral en sangre total respecto a plasma, es necesario conocer la equivalencia (10 veces ms en sangre respecto al plasma); 500 cp/ml en plasma equivalen a 5000 cp/ml en sangre total27,28 (tabla 3) (Grado de recomendacin: dbil). La utilidad de estas tcnicas es, por un lado, el diagnstico de la infeccin por CMV (siendo de eleccin frente a la antigenemia) y, por otro, la monitorizacin en la terapia anticipada19,29- 31 (Grado de recomendacin: fuerte). Puede utilizarse en la monitorizacin del tratamiento, pero existe una dificultad en el momento de definir la negatividad de la PCR, sugirindose suspender el tratamiento con < 500 cp/ml31 (tabla 3) (Grado de recomendacin: dbil). La propuesta de cronograma de monitorizacin sera: 1. Terapia anticipada: -Quincenal hasta el tercer mes. -Mensual hasta el 6. mes. -Posteriormente individualizada. 2. Profilaxis primaria.
3. Postratamiento. (Grado de recomendacin: basado en consenso). pp67-cido ribonucleico mensajero La protena pp67 es una protena del CMV que indica una replicacin viral activa. La tcnica NucliSENS (bioMrieux) es una tcnica de amplificacin de cidos nucleicos (NASBA) que detecta el cido ribonucleico mensajero que codifica la protena pp67. Se trata de una tcnica cualitativa, menos sensible que las tcnicas de PCR de ADN y no se recomienda en el trasplante de rganos slidos11,32. Genotipo gB Mediante esta tcnica se analiza el genotipo del gen que codifica la glucoprotena (gB) de la envuelta del virus. Existen cuatro tipos: genotipo gB 1 a 4. El ms frecuente es el genotipo gB2. Aunque pueden existir otras cepas por coinfeccin a lo largo del tiempo, no parece tener relevancia ni relacin con la clnica33. Enfermedad invasiva En casos de antigenemia negativa o falta de respuesta al tratamiento emprico para el diagnstico definitivo de enfermedad invasiva, puede ser necesario la realizacin de otras pruebas o biopsias que incluyen la identificacin de cuerpos de inclusin, antgeno viral o ADN viral por inmunohistoqumica o PCR. Esta circunstancia acontece con relativa frecuencia en los casos de enfermedad invasiva del tracto digestivo11,26(Grado de recomendacin: dbil). TEST DE SENSIBILIDAD ANTIVIRAL Tcnicas fenotpicas Determinan la concentracin de antiviral que inhibe la replicacin del virus. Se trata de un proceso lento que precisa de unas cuatro semanas para la obtencin de los resultados. Existen tres tcnicas: la reduccin de placa, la inhibicin de sntesis proteica y la citometra de flujo14,26 (Grado de recomendacin: basado en consenso). Tcnicas genotpicas Detectan mutaciones en los genes UL54 y UL97 del CMV, aunque no existe una clara correlacin con las tcnicas fenotpicas. El gen UL97 es esencial para la fosforilacin del ganciclovir a su forma activa. El gen UL54 es la diana de accin de los frmacos antivirales. Una mutacin a este nivel puede conferir una resistencia al ganciclovir, al foscarnet y al cidofovir. La mayora de las mutaciones de estos genes se encuentran asociadas. Se recomienda el estudio de estas mutaciones en los casos de no respuesta al tratamiento14,26 (Grado de recomendacin: basado en consenso). CONCEPTOS CLAVE 1. En la enfermedad por CMV, a los datos de infeccin viral se debe aadir la existencia de sntomas clnicos compatibles. 2. La indicacin de las tcnicas serolgicas de CMV en trasplante renal es la clasificacin de los donantes y receptores en seronegativos o seropositivos, y no en el diagnstico de infeccin activa o enfermedad por CMV. 3. La antigenemia de CMV (pp65), aunque de utilidad en el diagnstico de infeccin activa, en el tratamiento anticipado y en la monitorizacin del tratamiento, tiende a ser relegada a favor de las tcnicas de biologa molecular (PCR). 4. En la actualidad, la tcnica de eleccin para el diagnstico de la infeccin por CMV es la PCR cuantitativa a tiempo real. 5. Tanto para la tcnica de antigenemia como para la PCR cuantitativa, es ms importante la tendencia en el tiempo que una determinacin aislada. Lo bsico
La extraccin de ADN (cido desoxirribonucleico) es un proceso vital con muchas aplicaciones cientficas. En la investigacin y la medicina, sus usos incluyen secuenciacin del ADN, la deteccin de los virus y las bacterias, y la investigacin de enfermedades y trastornos con base gentica. En el campo de la ciencia forense, es utilizado para la identificacin de los muertos y los vivos, as como el anlisis de la escena de crimen. A pesar de sus resultados sofisticados, la extraccin de ADN es en realidad muy simple, y las tcnicas de extraccin bsicas funcionan igual de bien en un laboratorio de investigacin o en casa. La extraccin de ADN comienza con la obtencin de una muestra de ADN. Dado que todos los organismos vivos contienen ADN, las opciones disponibles para la muestra son prcticamente infinitas, y la eleccin por lo generalse relaciona directamente con el tema del objeto de estudio. El ADN humano es fcil de obtener por pequeos toques en el interior de la mejilla con un hisopo de algodn. Las muestras de plantas pueden ser adquiridas cortando una seccin del material de origen. Extraccin en el laboratorio Una vez que la muestra es obtenida, se debe degradar para obtener el material gentico que se encuentra dentro de las clulas individuales. En el laboratorio, la muestra normalmente se coloca en un dispositivo llamado tubo Eppendorf. Una solucin especial es aadida al tubo, a continuacin, y el tubo se coloca en un bao de agua caliente. El propsito de la solucin es lisar (romper) la estructura celular del material. Contiene dos ingredientes fundamentales: un detergente especialmente diseado y una enzima llamada proteinasa K. Una vez en el bao de agua caliente, el detergente corroe la membrana celular de la muestra y la membrana nuclear que rodea el material gentico de la clula. Una vez que estas membranas son alteradas, la proteinasa K degrada una protena llamada histona, que envuelve al ADN. El tubo Eppendorf se retira del bao de agua, y una solucin de sal concentrada se aade para agrupar la protena indeseada y los restos celulares. El tubo se coloca en una pequea centrfuga, en donde la fuerza centrfuga deja el ADN difundido en una capa de la solucin por encima del exceso de material ms pesado. A continuacin, el ADN se retira y se coloca en otro tubo. Se agrega alcohol isoproplico y se mezcla cuidadosamente. Este proceso hace que el ADN de la solucin se agrupe en filamentos visibles. Entonces, el material se coloca otra vez en la centrfuga para forzar a las hebras de ADN a juntarse. El alcohol se retira y el ADN se deja secar. Una vez que se haya completado el proceso, la muestra de ADN resultante podr ser almacenada y utilizada para cualquiera de sus muchos propsitos. La extraccin de ADN requiere una serie de etapas bsicas. En primer lugar tienen que romperse la pared celular y la membrana plasmtica para poder acceder al ncleo de la clula. A continuacin debe romperse tambin la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Por ltimo hay que proteger el ADN de enzimas que puedan degradarlo y para aislarlo hay que hacer que precipite en alcohol.