Research Article Open Access

Whitmire et al., J Chromatograph Separat Techniq 2011, S4

http://dx.doi.org/10.4172/2157-7064.S4-001
Artculo de Investigacin Acceso Abierto
Cromatografa y Tcnicas
de Separacin
J Chromatograph Separat Techniq
Tcnicas analticas: Farmacologa
ISSN: 2157-7064 JCGST, Una revista de Acceso Abierto
Validacin completa de un mtodo de bioanlisis por ICP-MS de alta resolucin
para anlisis de hierro en plasma humano con K
2
EDTA
Monica Whitmire
1
*, Anastasia Osredkar
1
, Jennifer Ammerman
2
, Jeff Biss
2
, Chaoyang Huang
2
, Tracy Marshall
2
, Krista Ehringer
2
y Patricia de Lisio
2

1
Investigacin MPI, 54943 North Main Street, Mattawan, Michigan 49071, EE.UU.
2
Investigacin MPI, 3058 Research Drive, Escuela Estatal, Pennsylvania 16801, EE.UU.
*Autor para la correspondencia: Monica Whitmire, MPI Research, 54943
North Main Street, Mattawan, MI 49071, USA, Tel: 1 269 668 3336; E-mail:
monica.whitmire@mpiresearch.com
Recibido el 30 de agosto 2011; Aceptado el 4 de octubre 2011; Publicado el 17
de octubre 2011
Citas: Whitmire M, Osredkar A, Ammerman J, Biss J, Huang C, et al. (2011)
Full Validation of a High Resolution ICP-MS Bioanalysis Method for Iron in
Human Plasma with K2EDTA. J Chromatograph Separat Techniq S4:001.
doi:10.4172/2157-7064.S4-001
Derechos de autor: 2011 Whitmire M, et al. Este es un artculo de acceso
abierto distribuido bajo los trminos de la licencia Creative Commons Attribution
License, que permite el uso ilimitado, distribucin y reproduccin en cualquier
medio, siempre que el autor original y la fuente sean debidamente citados.
Resumen
Objetivo: Validar un mtodo de bioanlisis de espectrometra de masas con plasma de acoplamiento inductivo (ICP-MS)
para la cuantifcacin de hierro en plasma humano con K2EDTA (matriz). Este mtodo se valid utilizando los parmetros de
validacin bioanalticos tpicos.
Materiales y mtodos: los patrones de referencia de hierro y el patrn interno de germanio (IS) eran de Ultra Scientifc.
El agua tena una resistividad 18 Mcm. El cido ntrico y el cido clorhdrico eran de grado ultrapuro. El blanco de matriz
se adquiri en BioReclamation. La linealidad se evalu utilizando ocho patrones preparados en la matriz en un intervalo
equivalente a 0.5-20 g/mL de hierro en la matriz, al comienzo y al fnal de cada secuencia. Las muestras del control de calidad
(QC) se prepararon adicionando la matriz con 0.5, 1.5, 10, 15 y 100 g/mL. En cada secuencia se incluy un blanco que contena
patrn interno y un blanco doble. La selectividad se evalu usando seis lotes diferentes de matriz adicionada con IS y analito al
nivel del LLOQ. Para analizar las muestras preparadas se utiliz un Thermo-Finnigan ELEMENT2 High Resolution ICP-MS.
Resultados: La idoneidad del sistema, selectividad, efecto memoria y robustez cumplen los criterios de aceptacin. La
linealidad se demostr de forma consistente. Las recuperaciones para todos los patrones de calibracin y los QCs estuvieron
dentro de los criterios de aceptacin. La congelacin/descongelacin se demostr durante 4 ciclos. La reproducibilidad sobre la
bancada fue satisfactoria despus de 53 horas de almacenamiento a temperatura ambiente. La reproducibilidad de la reinyeccin
fue satisfactoria tras 96 horas de almacenamiento a temperatura ambiente. La estabilidad del extracto se mantuvo durante 190
horas de almacenamiento a temperatura ambiente. La estabilidad de la disolucin de patrn interno se mantuvo durante 29 das de
almacenamiento a temperatura ambiente. La estabilidad del patrn de calibracin se mantuvo durante 8 das de almacenamiento
a temperatura ambiente. La estabilidad de la disolucin madre de analito se mantuvo durante 29 das de almacenamiento a
temperatura ambiente. La estabilidad en el almacenamiento a largo plazo fue satisfactoria durante 31 das entre 2 y 8C, 31 das
entre -15 y -25C, y 30 das entre -70 y -90C.
Conclusin: Se ha validado con xito un mtodo de bioanlisis por ICP-MS para la cuantifcacin de hierro en plasma
humano con K
2
EDTA.
Palabras clave: Espectrometra de masas con plasma de
acoplamiento inductivo; ICPMS; Buenas prcticas de laboratorio,
no clnico, preclnico, clnico, mtodo de bioanlisis, validacin del
mtodo, hierro; plasma humano
Abreviaturas: Ar: Argn, As: Arsnico, Cd: Cadmio, CFR: Cdigo
de Reglamentos Federales, Cr: Cromo, Cu: Cobre; EMEA: Agencia
Europea de Medicamentos; EP: Farmacopea Europea; EPA: Agencia
de Proteccin del Medio Ambiente; Diluyente: Agua: HNO
3
: HCl
(490:5:5, v/v/v); FDA: Food and Drug Administation (Estados Unidos),
Fe: Hierro; Ge: Germanio; GLP: Buenas Prcticas de Laboratorio,
HCl: cido clorhdrico, HNO
3
: cido ntrico; Hg: Mercurio, HR:
Alta Resolucin, ICP: Plasma de Acoplamiento Inductivo, ICP-MS:
Espectrometra de Masas con Plasma de Acoplamiento Inductivo; Ir:
Iridio, IS = Patrn Interno; ISWS: Disolucin de Trabajo del Patrn
Interno; LLOQ: Lmite Inferior de Cuantifcacin; Matriz: plasma
humano con K
2
EDTA, Mn: Manganeso, Mo: Molibdeno, Ni: Nquel;
Os: Osmio, Pb: Plomo; Pd: Paladio, Pt: Platino, NIST: Instituto Nacional
de Estndares y Tecnologa, QC: Control de Calidad; R
2
: Coefciente
de determinacin; RD: Desviacin Relativa, RE: Error Relativo; RF:
Radiofrecuencia; Rh: Rodio; Ru: Rutenio; RSD: Desviacin Estndar
Relativa; SOP: Procedimiento Normalizado de Trabajo, SRM: Material
de Referencia Estndar; SST: Prueba de Aptitud del Sistema; ULOQ:
Lmite Superior de Cuantifcacin; USP: Farmacopea de los Estados
Unidos, V: Vanadio
Introduccin
Algunos metales pesados representan un grave riesgo para la salud
y son eliminados del cuerpo muy lentamente. Durante mucho tiempo
el anlisis de metales pesados se ha llevado a cabo bajo las directrices
de la Agencia de Proteccin del Medio Ambiente (EPA) [1,2] y la
Farmacopea de los Estados Unidos (USP) [3]. Las primeras tcnicas
analticas se basaban principalmente en procedimientos colorimtricos
cualitativos, no especfcos y de baja sensibilidad; basados en la
precipitacin de sulfuros metlicos insolubles. Ms recientemente,
la espectrometra de masas con plasma de acoplamiento inductivo
se ha utilizado para proporcionar una cuantifcacin especfca de
metales pesados, precisa y sensible, en muestras ambientales, muestras
forenses, productos nutracuticos y artculos medicinales (principios
activos, productos farmacuticos y excipientes) [4-9]. Las principales
ventajas del ICP-MS en comparacin con los mtodos clsicos son
su capacidad para cuantifcar con exactitud los metales traza a lmites
Cita: Whitmire M, Osredkar A, Ammerman J, Biss J, Huang C, et al. (2011) Validacin completa de un mtodo de bioanlisis por ICP-MS de alta
resolucin para anlisis de hierro en plasma humano con K
2
EDTA. J Chromatograph Separat Techniq S4:001. doi:10.4172/2157-7064.S4-001
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de deteccin mucho ms bajos, la velocidad analtica, la relativa
falta de interferencias, y la capacidad de mltiples istopos. La USP
ha identifcado cuatro metales pesados contaminantes o sospechosos
de plantear un problema signifcativo de seguridad (carcingenos
humanos) como los elementos de clase 1 que deben ser cuantifcados
en los suplementos dietticos y sus ingredientes, as como en principios
activos y excipientes en funcin de sus lmites toxicolgicamente
relevantes: arsnico (As), cadmio (Cd), plomo (Pb), y mercurio
(Hg). Los metales de baja preocupacin desde el punto de vista de la
seguridad son impurezas de clase 2, son generalmente bien tolerados
a exposiciones farmacuticas tpicas y comprenden catalizadores que
pueden haber sido introducidos durante el proceso, tales como el cromo
(Cr), cobre (Cu), manganeso (Mn), molibdeno (Mo), nquel (Ni), paladio
(Pd), platino (Pt), vanadio (V), osmio (Os), rodio (Rh), rutenio (Ru), e
iridio (Ir). Los metales de mnimo inters de seguridad son impurezas
de clase 3 y tienen perfles de seguridad bien establecidos, no tienen
una toxicidad signifcativa, son bien tolerados, y por lo general son
muy abundantes en la naturaleza, como el hierro (Fe). Los lmites para
cada elemento estn basados en las directrices de la Agencia Europea
de Medicamentos (EMEA) [10]. Ms recientemente, el anlisis de
metales mediante ICP-MS se ha llevado a cabo de acuerdo a las Buenas
Prcticas de Laboratorio (GLP) en estudios de seguridad toxicolgica
no clnicos (preclnicos) y clnicos. En algunos casos, los metales son
un componente intrnseco del principio activo y por lo tanto se pueden
usar para proporcionar un medio para la cuantifcacin exacta de la
exposicin para ese material particular basndose en la concentracin
elemental en muestras biolgicas.
El objetivo primario de este estudio fue validar un mtodo analtico
para la determinacin cuantitativa de hierro en plasma humano con
K
2
EDTA (matriz) usando tecnologa de alta resolucin (HR) ICP-MS.
El mtodo fue diseado para la cuantifcacin de un principio activo que
contiene un ncleo de hierro tras la administracin a pacientes humanos,
pero puede ser aplicable a cualquier anlisis de hierro en plasma
humano, sin importar el origen. Este mtodo fue validado de acuerdo
a la Gua para la industria de validacin de mtodos bioanalticos de la
Food and Drug Administration (FDA) [11], 21 Cdigo de Reglamentos
Federales (CFR) Parte 58 reglamentos GLP [12], la industria dirigente
de los informes de reuniones sobre validacin de mtodos bioanalticos
[13-16], y los Procedimientos Normalizados de Trabajo actuales del
MPI (SOPs). La gua sobre validacin de mtodos bioanalticos de
la EMEA [17] se utiliz como referencia. Dado que este estudio est
pensado para ser utilizado en apoyo a los estudios de GLP en seguridad
toxicolgica clnica, se design a la Unidad de Garanta de Calidad
de la Investigacin del MPI para revisar todas las fases del estudio,
incluyendo, pero no limitndole a, GLP del analista en la validacin
bioanaltica y entrenamiento en el ICP-MS, validacin y calibracin
del instrumento, protocolo y correcciones, inspecciones de rutina del
laboratorio, y borrador e informes fnales.
Este mtodo fue validado con el fn de cuantifcar el contenido de
hierro en muestras de plasma humano obtenidas en estudios clnicos con
pacientes tratados con un principio activo farmacutico que contiene
hierro. Los estudios previos que haban sido realizados incluan hierro
en un anlisis multielemental por ICP-MS en sangre, suero o muestras
biolgicas [18-22]. El ensayo descrito en el presente informe pretende
llevar los criterios de aceptacin del bioanlisis y el diseo del estudio
para un anlisis por ICP-MS a un nico elemento, lo cual se aplica
histricamente al anlisis ambiental.
Este mtodo de bioanlisis por ICP-MS para la cuantifcacin de
hierro en plasma humano con K
2
EDTA se valid en un intervalo de
0.5 a 20 g/mL. El mtodo se evalu para determinar su capacidad
para cuantifcar hierro en plasma humano con K
2
EDTA en muestras
que tienen un contenido en hierro de hasta 100 g/mL tras su dilucin.
La estabilidad se evalu despus de un mes de almacenamiento en
condiciones de refrigeracin (2 a 8C), congelacin (-15 a -25C) y
ultra congelacin (-70 a -90C).
Identifcacin del patrn de
calibracin
Volmenes empleados (mL)
Volumen total (mL) Concentracin fnal (g/mL)
100 1000 g/mL de Fe Diluyente
S0 0 1.000 1.000 0
S1 0.005 (100) 0.995 1.000 0.5
S2 0.010 (100) 0.990 1.000 1
S3 0.020 (100) 0.980 1.000 2
S4 0.005 (1000) 0.995 1.000 5
S5 0.010 (1000) 0.990 1.000 10
S6 0.015 (1000) 0.985 1.000 15
S7 0.018 (1000) 0.982 1.000 18
S8 0.020 (1000) 0.980 1.000 20
Tabla 1: Preparacin de los patrones de calibracin.
Identifcacin de la muestra QC
Volmenes empleados (mL)
Volumen total (mL)
Concentracin de Fe adicionada a la matriz
(g/mL)
100, 1000 o 10000 g/mL de Fe Matriz
Control QC (i.e., no Fe) 0.000 1.000 1.000 0
LLOQ 0.005 (100) 0.995 1.000 0.5
QC bajo 0.015 (100) 0.985 1.000 1.5
QC medio 0.010 (1000) 0.990 1.000 10
QC alto 0.015 (1000) 0.985 1.000 15
QC dilucin 0.010 (10,000) 0.990 1.000 100
Tabla 2: Preparacin de las muestras QC.
Cita: Whitmire M, Osredkar A, Ammerman J, Biss J, Huang C, et al. (2011) Validacin completa de un mtodo de bioanlisis por ICP-MS de alta
resolucin para anlisis de hierro en plasma humano con K
2
EDTA. J Chromatograph Separat Techniq S4:001. doi:10.4172/2157-7064.S4-001
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J Chromatograph Separat Techniq
Tcnicas analticas: Farmacologa
ISSN: 2157-7064 JCGST, Una revista de Acceso Abierto
Materiales y Mtodos
Analito, patrn interno, matriz e informacin de los reactivos
Los patrones de hierro para plasma de acoplamiento inductivo
(ICP), usados como analito y como patrn de referencia (1000 g/mL
y 10000 g/mL, respectivamente) eran disoluciones ULTRAgradeTM
adquiridas en Ultra Scientifc, North Kingstown, Rhode Island. El
patrn de germanio para ICP usado como patrn interno (IS, 1000 g/
mL), era una disolucin ULTRAgrade TM adquirida en Ultra Scientifc,
North Kingstown, Rhode Island. El blanco de plasma humano con
K
2
EDTA, el plasma humano lipmico con K
2
EDTA, el plasma humano
hemolizado con K
2
EDTA, y el plasma humano diabtico tipo II con
K
2
EDTA fueron adquiridos en BioReclamation, Westbury, Nueva
York. El plasma diabtico tipo II tena medicamentos concomitantes de
Synthroid, Allopurinol, Lasix, Amlodipino, Metoprolol, vitamina D,
Avodart, Zocor y Levemir. Un material de referencia estndar (SRM,
1598a) de componentes inorgnicos en suero animal fue obtenido de
animales bovinos y porcinos sanos y adquiridos en el Instituto Nacional
de Estndares y Tecnologa (NIST), Gaithersburg, Maryland. Ultrex,
grado ultra puro, cido ntrico (HNO
3
) y cido clorhdrico (HCl) se
obtuvieron de JT Baker, Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, Nueva
Jersey. Agua con una resistividad 18 Mcm se obtuvo usando un
sistema de osmosis inversa DiamondTMRO de Barnstead International,
Dubuque, Iowa.
Limitaciones del mtodo
Este mtodo es para la determinacin de hierro (
57
Fe) en el plasma
humano con K
2
EDTA en concentraciones que van de 0.5 a 20 g/mL.
Las muestras con concentraciones por encima del lmite superior de
cuantifcacin (ULOQ) pueden ser diluidas dentro del intervalo de la
curva de calibracin, procesarse, y luego ser analizadas. Debido a las
concentraciones endgenas de hierro en el plasma humano, la curva
de calibracin se prepar en una matriz de agua:HNO
3
: HCl (490:5:5,
v/v/v) (diluyente).
Los materiales de control utilizados para la preparacin de las
muestras para el control de calidad (QC) fueron preseleccionados para
las concentraciones endgenas de hierro. El material de control era
adecuado para su uso si la concentracin endgena era menor que el
lmite inferior de cuantifcacin (LLOQ) de 0.5 g/mL. Si el material
de control no cumpla con este requisito, no se empleaba para preparar
muestras de QC.
En cada secuencia se analizaron rplicas del blanco de control para
proporcionar una lnea base a fn de sustraerla de las muestras de QC
adicionadas antes de determinar el error porcentual relativo.
Pretratamiento y preseleccin de los tubos de centrfuga
Todos los tubos de centrfuga de 15 mL fueron pretratados y
preseleccionados antes de su uso. Todos los tubos y los tapones se
sumergieron durante un mnimo de 12 horas en una disolucin de
lavado de HNO
3
al 1% en un recipiente tapado. Los tubos y los tapones
se enjuagaron con agua con una resistividad 18 Mcm. Los tubos y
las tapas se sacudieron y se dejaron secar al aire para la preseleccin.
Se aadieron aproximadamente 10 mL de diluyente a cada tubo
pretratado, los tubos se taparon y se agit la mezcla en un agitador
Roto-shake Genie a la mxima velocidad durante 2 minutos. Entonces
el diluyente de cada tubo se analiz por HR ICP-MS, junto con el
primer patrn de la curva. El criterio de aceptacin fue 20% de la
respuesta total de hierro en el primer patrn de la curva. Los tubos que
superaron este lmite se descartaron. Los tubos que si respetaron este
lmite se enjuagaron con agua, se sacudieron y se dejaron secar al aire.
Preparacin de disoluciones y muestras
Disolucin de trabajo del patrn interno (ISWS): Una alcuota
de 100 L de la disolucin comercial de 1000 g/mL de germanio
se aadi a un Digitube de polipropileno de 50 mL y se aadieron al
tubo 20 mL de agua aproximadamente y 0.5 mL de cido ntrico. El
volumen fnal se llev hasta 50 mL con agua, y la disolucin se mezcl
bien por inversin.
Disoluciones madre de calibracin y de QC: Se prepararon
dos disoluciones equivalentes: una se us para preparar la curva de
calibracin y otra para preparar las muestras de QC. Una alcuota de
500 L de la disolucin comercial de 10000 g/mL de patrn primario
de hierro se aadi al DigiTUBE de polipropileno de 50 mL y, a
continuacin se aadieron al tubo 20 mL de agua aproximadamente

Pendiente = 0.0659
Ordenada en el origen = 0.0027
R
2
= 0.999
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
0 5 10 15 20 25
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d

n
o
r
m
a
l
i
z
a
d
a

(
F
e
/
G
e
)
Curva de calibracin representativa de HR ICP-MS.
Concentracin de hierro (g/mL)
Figura 1: Curva de calibracin representativa de HR ICP-MS.
Hierro (Fe) m/z 57
Germanio (Ge) m/z 72
Potencia de radiofrecuencia (RF) 1.3 kW
Flujo de gas argn (Ar) fro 16 L/min generalmente
Flujo de gas Ar del plasma 0.8 L/min generalmente
Flujo de gas Ar del
nebulizador
0,80-1,1 L/min generalmente
Nebulizador PFA-100 micro fujo
Cmara de spray Ciclnica
Modo del detector Dual
Unidades de medida cps
Velocidad de la bomba
peristltica
12 R/min
Tubos de la bomba peristltica
Black-black (0.76 mm i.d. x 150 mm 2-stop,
PVC)
Tiempo de toma de muestra 120 s
Tiempo de lavado 120 s
Modo de resolucin Medio
Tiempo de muestra 20 ms
Muestras/pico 30
Ventana de masas 300 (
57
Fe and
72
Ge)
Ventana de bsqueda 60 (
57
Fe), 10 (
72
Ge)
Ventana de integracin 20(
57
Fe), 20(
72
Ge)
Puntos de adquisicin 10
Tipo de barrido EScan
*Los parmetros se ajustaron para optimizar la respuesta del sistema sobre la
base de una medida a medida
Tabla 3: Ajustes tpicos del instrumento HR ICP-MS.
Cita: Whitmire M, Osredkar A, Ammerman J, Biss J, Huang C, et al. (2011) Validacin completa de un mtodo de bioanlisis por ICP-MS de alta
resolucin para anlisis de hierro en plasma humano con K
2
EDTA. J Chromatograph Separat Techniq S4:001. doi:10.4172/2157-7064.S4-001
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J Chromatograph Separat Techniq
Tcnicas analticas: Farmacologa
ISSN: 2157-7064 JCGST, Una revista de Acceso Abierto
y 1.0 mL de cido ntrico. El volumen fnal se llev hasta 50 mL con
agua y a continuacin la disolucin se mezcl completamente mediante
inversin.
Patrones de calibracin: Patrones de calibracin que van desde
0.5 g/mL a 20 g/mL de hierro se prepararon en agua:HNO
3
:HCl
(490:5:5, v/v/v) de acuerdo a la siguiente tabla. Cada disolucin
preparada se mezcl vigorosamente por agitacin en vrtice. Se
prepar un nico conjunto de patrones de calibracin y a continuacin
se analizaron por duplicado al principio y al fnal del lote de muestras.
Muestras de QC: Las muestras de QC en el LLOQ, bajo, medio,
alto, y las diluciones de QC se prepararon en matriz de acuerdo a la
siguiente tabla. Todas las muestras se mezclaron vigorosamente por
agitacin en vrtice. Las muestras diluidas de QC se diluyeron 10 veces
con diluyente antes de la preparacin y el anlisis de las muestras.
Procedimiento de extraccin
1. La matriz se dej descongelar a temperatura ambiente.
2. Las muestras matriz se mezclaron mediante agitacin en vrtice.
3. Se aadieron a los tubos preseleccionados de centrfuga de 15.0
mL alcuotas de 100 L de control de QC, muestras de QC, o patrn
de calibracin.
4. Se aadi a todos los tubos, excepto a los tubos del blanco doble,
una alcuota de 100 L de la ISWS.
5. Se aadieron alcuotas de 100 L de diluyente a los tubos de
blanco doble.
6. A cada tubo se aadieron alcuotas de 9.80 mL de diluyente.
Los tubos se taparon y el contenido se mezcl vigorosamente mediante
inversin en el agitador Roto-shake Genie a mxima velocidad durante
2 minutos.
7. Las muestras se analizaron mediante HR ICP-MS.
Equipamiento y componentes del HR ICP-MS
Se emple un HR ICP-MS Thermo Finnigan-Element2 equipado
con un automuestreador y un sistema de adquisicin de datos con
software Thermo Element2 versin 2.41.
Criterios de aceptacin de la secuencia de anlisis
Disolucin de Prueba de Aptitud del Sistema (SST): Se prepar
un patrn de calibracin adicional a la concentracin LLOQ y se us
como disolucin SST. La respuesta del analito (
57
Fe) en la disolucin de
SST fue al menos 10 veces la respuesta en el diluyente. El instrumento
oper en un modo de resolucin media. La resolucin de la masa en este
modo fue de al menos 2500 para
57
Fe. El tercer paso de la evaluacin
SST fue el anlisis de una curva de calibracin. La curva de calibracin
SST se calcul como la relacin de respuestas (respuesta analito/
respuesta IS) frente a la concentracin de analito, usando un anlisis
por mnimos cuadrados. Los criterios de aceptacin para el anlisis de
regresin lineal fueron: 1) todas los patrones de calibracin de SST
tienen un error relativo (RE) del 10.0% respecto a la concentracin
nominal ( 15.0% LLOQ), 2) el coefciente de determinacin (R2)
0.990, y 3) todos los patrones de calibracin SST deben ser utilizados
en el anlisis de regresin.
Curva de calibracin: La curva de calibracin para cada secuencia
se calcul como la relacin de respuestas (respuesta analito/respuesta
IS) frente a la concentracin de analito, usando un anlisis por mnimos
cuadrados. Los criterios de aceptacin para el anlisis de regresin
lineal, incluyendo las concentraciones calculadas de los patrones de
calibracin, fueron: 1) todos los patrones de calibracin estn dentro
del 10.0% RE de la concentracin nominal ( 15.0% LLOQ), 2) R
2

0.990, y 3) todos los patrones de calibracin deben ser utilizados en
el anlisis de regresin.
Blanco de reactivos doble: En cada secuencia se incluy un blanco
doble de reactivos (diluyente sin IS) para la evaluacin del posible
efecto memoria. Los blancos dobles deben estar situados despus del
ULOQ y no deben exceder ms de un 20.0% la respuesta media del
analito en los patrones LLOQ ni 5.0% de la respuesta media del patrn
interno en los patrones LLOQ.
Rendimiento del sistema: El rendimiento del sistema se control
a lo largo de la secuencia analtica inyectando peridicamente las
muestras de QC. Los resultados de las muestras de QC proporcionan
la base para aceptar o rechazar la secuencia. Al menos el 66.7% de
todas las muestras de QC y el 50% a cada nivel deben estar dentro del
15.0% RE de sus respectivas concentracin nominales.
Resultados y Discusin
Prueba de aptitud del sistema
Antes de cada secuencia de validacin, se inyect una disolucin
SST (patrn de calibracin LLOQ) (n = 1) y se compar con la
respuesta de una inyeccin de diluyente. La respuesta del analito
(
57
Fe) en cada inyeccin SST fue al menos 10 veces la respuesta de
la inyeccin de diluyente en cada secuencia. Adems, la resolucin de
las masas en el modo de resolucin media fue al menos de 2500 para
57
Fe. El tercer componente de la evaluacin SST fue el anlisis de una
curva de calibracin. Se utilizaron todos los patrones de calibracin
SST en el anlisis de regresin, con un R
2
0.990, y todos los patrones
de calibracin SST estuvieron dentro de 10.0% RE del nominal (
15.0% RE en LLOQ). Todos los criterios de SST se satisfcieron para
todas las secuencias de anlisis.
Selectividad
Para la selectividad se evaluaron ocho lotes de matriz. Entre
estos lotes, se incluyeron las siguientes consideraciones especiales:
al menos un lote de de plasma lipmico, al menos un lote de plasma
hemoltico, al menos un lote de plasma de un varn de ms de 60 aos
con diabetes de tipo II, y al menos tres lotes de plasma de varones y
tres de mujeres. Ninguno de los ocho lotes de matriz empleados en el
ensayo de selectividad tuvo una respuesta signifcativa para el IS (pico
de respuesta del IS en los blancos de plasma 5.0% de la respuesta
media del IS en los patrones LLOQ). Tras las pruebas fnales, todos
los tipos de matriz analizados cumplieron con xito los criterios de
aceptacin de precisin media de 20.0% RE de la concentracin
nominal cuando fue adicionada a la concentracin LLOQ. Por lo tanto,
el mtodo es selectivo para el hierro y el IS. Sin embargo, deben tomarse
precauciones en la recogida de muestras para no romper los glbulos
rojos, liberando de este modo ms hierro en el plasma y elevando el
contenido de hierro total por encima de los niveles endgenos tpicos.
Linealidad
Debido a la concentracin endgena de hierro en plasma
humano, se prepararon curvas de calibracin en una matriz 5:5:490
HNO
3
:HCl:agua (v:v:v). Se inyectaron dos curvas de calibracin: una
al principio y otra al fnal de cada secuencia de validacin. Se gener
una nica regresin a partir de las dos curvas de calibracin. Todas
las curvas de calibracin cumplieron los criterios de aceptacin de la
validacin (100% de los puntos utilizados en la regresin, un mnimo
Cita: Whitmire M, Osredkar A, Ammerman J, Biss J, Huang C, et al. (2011) Validacin completa de un mtodo de bioanlisis por ICP-MS de alta
resolucin para anlisis de hierro en plasma humano con K
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de ocho patrones, y los puntos de la curva dentro de 10.0% RE, RE
15.0% en el LLOQ).
Para esta validacin se utiliz regresin lineal sin ponderacin.
Las curvas de calibracin tuvieron una pendiente consistente con poca
variabilidad en la interseccin observada y R2 0.999, lo cual cumpli
el criterio de aceptacin (R2 0.990).
Efecto memoria
El efecto memoria se evalu mediante la inyeccin de dos blancos
dobles despus de cada patrn de calibracin ULOQ para todas excepto
para las dos secuencias de validacin aceptadas. Los criterios de
aceptacin para los blancos fueron una respuesta para el hierro 20.0%
en comparacin con la respuesta media de hierro en los patrones LLOQ
aceptables y una respuesta para el IS 5.0% respecto a la respuesta
media del IS en los patrones LLOQ aceptables. EL efecto memoria no
afecta a este ensayo.
Evaluacin del material de referencia estndar
Los SRM comprados a NIST fueron analizados (n=6) en cada
secuencia de validacin principal. El SRM fue preparado usando
suero bovino y porcino sano enriquecido con diversos constituyentes
inorgnicos, como la concentracin de hierro certifcada de 1680
60 g/L. Aunque el SRM no era la misma matriz que el resto de las
muestras de validacin, se utiliz el SRM para demostrar la capacidad
de la curva de calibracin en matriz para cuantifcar con exactitud el
hierro en una matriz biolgica.
Los criterios de aceptacin fueron una concentracin media con
10.0% RE de la nominal y 10.0% de desviacin estndar relativa
(RSD). El SRM se analiz en tres conjuntos de datos (total n = 18).
El % RE promedio vari de -1.1% a 3.6%, y la RSD fue 5.4%. Los
resultados mostraron que todo el contenido de hierro en el SRM se
puede cuantifcar con exactitud utilizando la curva de calibracin en
matriz.
Exactitud y precisin
La exactitud intra-da de las muestras QC (n=6) se determin para
cada secuencia de validacin. La precisin inter-da de las muestras QC
se determin a travs de las tres secuencias de validacin y la secuencia
de robustez. El criterio de aceptacin fue una concentracin media de
15.0% RE de la concentracin nominal para cada nivel ( 20.0% para
LLOQ). Para las muestras LLOQ (0.5 g/mL), la precisin intra-da
para las tres secuencias de validacin vari de -10.4% a 2.2%, y la
precisin inter-da fue de -1.4%. Para las muestras de QC bajas (1.5
g/mL), la precisin intra-da para las tres validaciones vari entre
-5.0% y -1.9%, y la precisin inter-da fue -2.9%. Para muestras de QC
medias (10 g/mL), la precisin intra-da vari entre -2.6% y -0.4%, y
la precisin inter-da fue -1,1%. Para muestras de QC altas (15 g/mL),
la precisin intra-da vari de -2.3% a -0.6%, y la precisin inter-da
fue -1.6%. Todos los resultados cumplieron el criterio de aceptacin.
La precisin intra-da de las muestras QC se determin para cada
secuencia de validacin que contena al menos tres rplicas a cada nivel
de concentracin del QC. La precisin inter-da de las muestras QC se
determin a travs de las tres secuencias de validacin y la secuencia
de robustez. El criterio de aceptacin fue una RSD 15.0% para cada
nivel ( 20.0 para LLOQ). Para las muestras LLOQ, la precisin intra-
da vari de 2.0% a 10%, y la precisin inter-da fue de 9.1 %. Para
las muestras de QC bajas, la precisin intra-da vari entre 2.4% y
2.7%, y la precisin inter-da fue 3.5%. Para muestras de QC medias,
la precisin intra-da vari entre 2.0% y 4.0%, y la precisin inter-da
fue 2.7%. Para muestras de QC altas, la precisin intra-da vari de
2.4% a 3.6%, y la precisin inter-da fue 3.0%. Todos los resultados
cumplieron el criterio de aceptacin.
Se llevaron a cabo secuencias adicionales a parte de la de la
validacin principal y la secuencia de robustez contuvo muestras
de QC al menos por duplicado a cada nivel de concentracin. Estas
muestras de QC se utilizaron nicamente para aceptar o rechazar las
secuencias. Las secuencias se consideraron vlidas si al menos 66.7%
del total de las muestras de QC y por lo menos 50% de las muestras de
QC a cada nivel estuvieron dentro de 15.0% RE del valor nominal.
Dilucin
La recuperacin para las muestras diluidas se valid a 100 g/
mL (n = 6) para abarcar el anlisis de muestras originalmente por
encima del lmite superior del intervalo de calibracin. Las muestras se
diluyeron 10 veces con diluyente para lograr una concentracin dentro
del intervalo de calibracin y se analizaron en el da de la preparacin.
El RE promedio fue de 2.2%, y la RSD fue 1.3%. Dado que la exactitud
y la precisin fueron ambas demostradas (RE 15.0%, RSD 15.0%),
hasta una dilucin de 10 veces la muestra, la cuantifcacin del hierro
en el plasma humano no est comprometida.
Robustez
La robustez se analiz en un conjunto de datos (n=6 a cada
concentracin) usando un analista de preparacin distinto en cada una
de las tres series de validacin principales. Los criterios de aceptacin
fueron una concentracin media de 15.0% RE del nominal ( 20.0%
para LLOQ) y 15.0% RSD ( 20.0% para LLOQ). El RE promedio
para las muestras LLOQ fue 5.2% y la RSD fue 5.2%. El RE promedio
de las muestras de QC bajas fue -0.7% y la RSD fue 4.6%. El RE
promedio para las muestras de QC media fue de -0.8%, y la RSD fue
2.2%. La media del RE de las muestras QC altas fue -1.9% y la RSD
fue 3.6%. Se cumplieron todos los criterios de aceptacin, por lo tanto,
se demostr la robustez del ensayo.
Resultados de estabilidad
Ciclo congelacin/descongelacin: Se evaluaron las muestras de
QC a concentraciones bajas y altas (n=6) despus de cuatro ciclos de
congelacin/descongelacin, y los resultados promedios se compararon
con los valores nominales. El RE promedio de las muestras de QC bajas
fue -6.9% y la RSD fue 5.0%. El RE promedio para las muestras de
QC altas fue -0.4%, y la RSD fue 3.8%. Las muestras demostraron ser
estables a lo largo de cuatro ciclos de congelacin/descongelacin ya
que el RE promedio en cada nivel fue de 15.0% respecto a los valores
nominales correspondientes y la RSD en cada nivel fue 15.0%.
Estabilidad sobre la bancada: la estabilidad sobre la bancada
para muestras de QC a concentraciones bajas y altas se evalu (n=6)
despus de 53 horas a temperatura ambiente. Los resultados promedio
se compararon con las concentraciones nominales. El RE promedio
de las muestras de QC bajas fue -3.3% y la RSD fue 3.7%. El RE
promedio de las muestras QC altas fue -0.7% y la RSD fue 3.8%. El RE
promedio en cada nivel fue de 15.0% respecto a los correspondientes
valores nominales y la RSD en cada nivel no super el 15.0%. Las
muestras de plasma humano que contienen hierro son estables hasta 53
horas a temperatura ambiente.
Reproducibilidad de la reinyeccin: La reproducibilidad de la
reinyeccin (estabilidad post-procesado) se evalu por reinyeccin
de muestras de QC (n=6) y patrones de calibracin que haban sido
almacenados durante 96 horas en condiciones ambientales. Los
Cita: Whitmire M, Osredkar A, Ammerman J, Biss J, Huang C, et al. (2011) Validacin completa de un mtodo de bioanlisis por ICP-MS de alta
resolucin para anlisis de hierro en plasma humano con K
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patrones de calibracin de la inyeccin original fueron utilizados para
cuantifcar las muestras de QC reinyectadas. La reproducibilidad de la
reinyeccin de las muestras de QC cumpli los criterios de aceptacin
de validacin para la exactitud (concentracin media calculada
dentro de 15.0% RE de la concentracin nominal) y la precisin
(concentracin calculada 15.0% RSD). Las muestras se pueden
mantener en condiciones ambientales hasta 96 horas en la disolucin de
inyeccin sin que esto afecte negativamente a la cuantifcacin exacta
de hierro utilizando patrones de calibracin antiguos. El RE promedio
de las muestras de QC bajas fue -7.2% con una RSD de 3.4%. El RE
promedio para las muestras de QC medias fue -2.4% con una RSD de
2.3%. El RE promedio de las muestras de QC altas fue -1.1% con una
RSD de 2.9%.
Estabilidad del extracto: La estabilidad del extracto se evalu
mediante el anlisis de muestras de QC ya extradas, de concentraciones
bajas y altas (n=6), las cuales haban sido almacenadas durante 190
horas en condiciones ambientales. Las muestras de QC se cuantifcaron
utilizando patrones de calibracin recin preparados. La estabilidad del
extracto de las muestras de QC cumpli los criterios de aceptacin de
validacin de la exactitud (concentracin promedio calculada con
15.0% RE de la concentracin nominal) y la precisin (concentracin
calculada 15.0% RSD). Las muestras se pueden mantener en
condiciones ambientales hasta 190 horas en la disolucin de inyeccin
sin que esto afecte negativamente a la cuantifcacin exacta de hierro
utilizando patrones de calibracin recin preparados. El RE promedio
de las muestras de QC bajas fue -5.2%, con una RSD de 3.2%. El RE
promedio de las muestras de QC altas fue 0.2%, con una RSD de 2.2%.
Estabilidad de la disolucin madre: Se evalu la estabilidad
ambiental de la disolucin madre de hierro y ISWS a los 29 das
mediante la comparacin de una disolucin fresca y una disolucin
antigua (n = 6). Las disoluciones ambientales cumplieron los criterios
de aceptacin (con 7.0% de desviacin relativa [RD] de hierro y
20.0% RD para el IS, 15.0% RSD). Las disoluciones madre de hierro
y ISWS son estables hasta 29 das a temperatura ambiente. El % RD
para el analito fue -1.4% con RSD 4.7%. El % RD para los ISWS fue
-1.1% con RSD 1.0%.
La estabilidad ambiental de las disoluciones patrn de calibracin
menor y mayor se evalu a los 8 das mediante la comparacin de una
disolucin fresca y una disolucin antigua (n=6). Las disoluciones
ambientales cumplieron los criterios de aceptacin (con 7.0% RD,
15.0% RSD). El hierro es estable en los patrones de calibracin durante
un mximo de 8 das a temperatura ambiente. El % RD fue -0.4% y
3.1% para las disoluciones de calibracin baja y alta, respectivamente.
Los RSDs fueron 6.8% para todas las disoluciones analizadas.
Para la estabilidad de almacenamiento a largo plazo las muestras de
QC (n=6) fueron almacenadas durante intervalos de aproximadamente
1 mes (31 das) de 2 a 8C y de -15 a -25C (en lo sucesivo, 4C y
-20C). Las muestras de QC fueron tambin almacenadas durante 30
das a -70 a -90C (en lo sucesivo, -80C). Las muestras se evaluaron
frente a una curva de calibracin fresca, y los valores medios se
compararon con la concentracin nominal.
A 4 C, el RE para las muestras de QC bajas fue 0.6% y la RSD
fue 3.7%. El RE para las muestras de QC altas fue 4.6%, y la RSD fue
2.7%. A -20C, el RE para las muestras de QC bajas fue 2.9%, y la
RSD fue 2.8%. El RE para las muestras de QC altas fue 3.9%, y la RSD
fue 3.9%. A -80C, el RE para las muestras de QC bajas fue -8.4% y
la RSD fue 2.5%. El RE para las muestras de QC altas fue -5.1%, y la
RSD fue 1.2%.
Las muestras demostraron ser estables durante al menos 31 das
cuando se almacenan tanto a 4C como -20C y durante al menos 30
das a -80C a cada concentracin evaluada, ya que el RE promedio
para cada nivel estaba dentro de 15.0% y el RSD no excedi de
15.0%.
Conclusin
El MPI Research ha validado de forma satisfactoria un ensayo HR-
ICP-MS para hierro en plasma humano con K
2
EDTA. El mtodo es
exacto y preciso para la determinacin de hierro en plasma humano
con K
2
EDTA en el intervalo de calibracin validado de 0.5 a 20 g/
mL. El mtodo fue selectivo para la cuantifcacin de hierro y IS en
el plasma humano con K
2
EDTA. Sobre la base de la evaluacin de
este mtodo, la capacidad de cuantifcar hierro en presencia de fuentes
de plasma especializado no est afectada de forma negativa. El efecto
memoria no afecta a la cuantifcacin exacta del hierro. Las muestras
con una concentracin por encima de la ULOQ pueden cuantifcarse
con exactitud mediante la dilucin de las muestras, hasta una dilucin
de 10 veces con diluyente para conseguir una concentracin dentro del
intervalo de la curva de calibracin. Las muestras pueden ser expuestas
a un mximo de cuatro ciclos de congelacin/descongelacin del plasma
humano con K
2
EDTA sin afectar negativamente a la cuantifcacin
exacta del hierro. Las muestras pueden ser expuestas durante un
mximo de 53 horas a temperatura ambiente en plasma humano con
K
2
EDTA sin afectar negativamente a la cuantifcacin exacta del
hierro. Las muestras pueden ser almacenadas durante un mximo de 96
horas a temperatura ambiente en una disolucin inyectable sin afectar
negativamente a la cuantifcacin exacta del hierro utilizando patrones
de calibracin antiguos. Las muestras pueden ser almacenadas durante
un mximo de 190 horas a temperatura ambiente en una disolucin
inyectable sin afectar adversamente a la cuantifcacin exacta del hierro
utilizando patrones de calibracin recin preparados. Las disoluciones
madre y de calibracin de hierro fueron estables, a temperatura
ambiente, durante un mximo de 29 y 8 das, respectivamente.
ISWS se mantuvo estable hasta 29 das almacenada a temperatura
ambiente. Las muestras se pueden almacenar durante ms de 31, 31,
o 30 das a 4C, -20C o -80C, respectivamente, en plasma humano
con K
2
EDTA sin afectar negativamente a la cuantifcacin exacta de
hierro. Hemos validado con xito un mtodo de bioanlisis HR ICP-
MS para la cuantifcacin de hierro en plasma humano con matriz
K
2
EDTA mediante el empleo de los aspectos crticos de GLPs, guas
bioanalticas y criterios compendio.
Agradecimientos
Todos los autores son empleados de MPI Research. En la produccion de este
manuscrito no se us ayuda para la escritura.
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