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=
l
A = Absorbancia
A
o
= Intercepto curva de calibrado
l = pendiente curva de calibrado
t = tiempo (minutos)
El valor de Coeficiente de Extincin a considerar para p-Nitrofenol medido a
405 nm es 18,45 (mM*cm)
-1
, por tanto la unidad de velocidad quedara en
mM/min
Una unidad enzimtica que suele usarse es la Unidad Internacional (UI) de enzima
y se define como la cantidad que cataliza la formacin de 1 mol de producto por
minuto en condiciones definidas de ensayo.
Instituto de Ciencias Naturales
CQU 310 Laboratorio de Bioqumica | Universidad de las Amricas
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PARTE EXPERIMENTAL
Ensayo de Actividad Enzimtica: Determinacin de la Actividad -
Glucosidasa (Mtodo Discontinuo):
0,9 ml de p-nitrofenil--D-glucopiransido (pNPG) 2 mM disuelto en el
tampn apropiado se pre incuba durante 3 min., a 40 C, o a la temperatura
indicada, luego se inicia la reaccin al adicionar 0,1 ml de extracto enzimtico. La
reaccin se detiene despus de 5 minutos con 2,0 ml de Na
2
CO
3
1M. El p-
nitrofenolato producido se lee a 405 nm y se determina su concentracin en una
curva estndar (calibrado) de p-nitrofenolato.
CURVA DE CALIBRADO
Para este anlisis se utilizar el valor de Coeficiente de extincin de 18,45
(mM*cm)
-1
para realizar los clculos.
A) EFECTO TEMPERATURA: Prepare tres tubos con concentraciones
constantes de enzima y sustrato, a un valor de pH apropiado (pH = 5,0) e
incbelos a diferentes temperaturas un tiempo determinado de acuerdo con la
tabla indicada a continuacin.
Nota:
1.- Preincube los tubos slo con sustrato por 3 minutos a la temperatura
correspondiente.
2.- Controle la temperatura del ambiente.
Transcurrido el tiempo de incubacin, detenga inmediatamente la reaccin,
agregando el carbonato de sodio, mida la absorbancia de cada tubo a 405 nm.
Tubos PnPg
2mM
Pre-
Incubacin
Enzima Incubacin Na
2
CO
3
Estndar 25C 0,9 ml 3 min 0,1 ml 5 min 0,2 ml
M.P.1 40C 0,9 ml 3 min 0,1 ml 5 min 0,2 ml
M.P.2 100C 0,9 ml 3 min 0,1 ml 5 min 0,2 ml
BLANCO: Se prepara con 0,9 ml de sustrato ms 2,0 ml de Na
2
CO
3
y por ltimo
0,1 ml. de enzima. Ocupe el blanco para calibrar el espectrofotmetro.
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B) EFECTO pH: Prepare los tubos que contengan concentraciones
constantes de enzima y sustrato a diferentes pH; incbelos a la
temperatura determinada como ptima por 5 min. Detenga la reaccin agregando
a cada tubo 2,0 ml de carbonato de sodio 1,0 M. Lea la absorbancia a 405 nm
en el espectrofotmetro.
Tubos PnPg 2mM Preincubacin Enzima Incubacin Na
2
CO
3
pH 3.0 0,9 ml 3 min. 0,1 ml 5 min. 0,2 ml
pH 5.0 0,9 ml 3 min. 0,1 ml 5 min. 0,2 ml
pH 7.0 0,9 ml 3 min. 0,1 ml 5 min. 0,2 ml
BLANCO: Se prepara con 1 ml de sustrato ms 2,0 ml de Na
2
CO
3
y por ltimo, 0,1
ml de enzima. Para cada pH debe preparar un blanco.
CALCULOS:
Con los resultados obtenidos y utilizando el coeficiente de extincin
milimolar, calcule la velocidad de la reaccin en las diferentes condiciones.