PRCTICA 6

CINETICA ENZIMTICA

INTRODUCCIN
La cintica enzimtica analiza cuantitativamente los factores que intervienen en la velocidad de
reaccin enzimtica. La cintica de Michaelis- Menten establece que durante una reaccin catalizada
por una enzima sta reacciona reversiblemente con el sustrato para formar un complejo enzima
sustrato.
Posteriormente este complejo participa en una reaccin como reactante para dar origen a un
producto y a la enzima libre y activa, lista para participar en una nueva reaccin.


Donde E, S y P representan enzima, sustrato y producto, respectivamente.

A concentracin alta de sustrato, la tasa de reaccin es independiente de la concentracin del
sustrato; para concentraciones de bajas, la tasa de reaccin es de primer orden, se ve afectada por la
concentracin total de enzima.
Uno de los factores ms importantes que afecta la velocidad de una reaccin enzimtica es la
concentracin de sustrato. Sin embargo, estudiar este efecto en el laboratorio se torna difcil dado
que la concentracin de sustrato vara durante el curso de la reaccin. Un mtodo que simplifica la
realizacin de experimentos de cintica es medir la velocidad inicial o V0 donde la concentracin de
sustrato es mucho mayor que la concentracin de la enzima. Bajo estas condiciones, cambios en la
concentracin del sustrato son nfimos y por lo tanto se considera que la concentracin de sustrato se
mantiene constante. Cuando la concentracin de enzima se mantiene constante y la concentracin de
sustrato vara se obtiene la Vmax y Km (Figura1).


Figura 1. Grfica de la ecuacin de Michaelis-Menten.
La velocidad V indica el nmero de reacciones por segundo que son catalizadas por una enzima.
Partiendo de los datos de concentracin inicial del sustrato junto con la velocidad inicial de la
reaccin, puede analizarse los datos siguiendo el modelo de Michaelis-Menten, de Lineweaver-Burk,
Eadie- Hofstee y Augustinsson, entre otros, los cuales aplican transformacin de los datos para su
linearizacin, haciendo posible el clculo de los parmetros cinticos por medio de anlisis grafico y
matemtico.

Tomando los inversos de la ecuacin ( v=(Vm[S]) / (Km + [S]) ) obtenemos:

Figura 2. Representacin lineal de Lineweaver-Burk.
De donde graficando 1/V contra 1/[S] y ajustando una lnea recta, se obtiene la Vmax de la ordenada
al origen y Km de la pendiente. Esta es la aproximacin de Lineweaver-Burk (Figura 2).

Amilasas
Las amilasas son enzimas que hidrolizan, almidn, glucgeno y otros oligosacridos y polisacridos
semejantes, dando glucosa y maltosa como productos finales de la hidrlisis. La determinacin de la
actividad enzimtica de las amilasas depende el tipo que se est analizando y el sustrato.
Las -amilasas son las ms utilizadas a escala industrial y su origen puede ser vegetal, animal o
microbiano (bacterias, mohos y levaduras). Se caracterizan por hidrolizar al azar los enlaces (1-4)
presentes en las cadenas de amilosa y amilopectina produciendo como sustancias terminales, en el
primer caso, glucosa y maltosa, y en el segundo, adems del los sacridos anteriores, cadenas ms o
menos ramificadas llamadas -dextrinas.
Las -amilasas atacan al almidn al azar y nunca por los extremos, lo que permite clasificarlas como
endoenzimas. Este ataque sobre las regiones interiores del sustrato causa un rpido descenso en la
viscosidad de los almidones hinchados y tambin un cambio en la coloracin del complejo yodo
almidn.
Las -amilasas comerciales pueden ser de origen bacteriano (Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis,
Bacillus amiloliquefaciens, etc.) o de origen fngico (Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, etc.). Las de
origen bacteriano son ms termoestables que las fngicas.

OBJETIVO GENERAL
El alumno realizar y analizar la cintica enzimtica de la enzima amilasa.

OBJETIVOS ESPECFICOS
Establecer las velocidades iniciales de una reaccin enzimtica.
Determinar el efecto de diferentes factores como el pH, la temperatura, la concentracin del sustrato
en la velocidad de las reacciones enzimticas.
Determinar la actividad enzimtica de la enzima libre e inmovilizada.

Cuestionario Pre-laboratorio
1. Define enzima.
2. Define actividad enzimtica
3. Enlista los tipos de enzimas de acuerdo a su actividad.
4. Menciona tres bioprocesos de produccin de enzimas
5. Cul es la importancia de la determinacin de actividad enzimtica?

MATERIALES EQUIPO REACTIVOS
-Micropipeta del rango de 0.1 a
1 mL
-Micropipeta del rango de 0.020
a 0.2 mL
-Tubos de 1.5 mL
-Gradilla para tubos de 1.5 mL
-Vasos de pp de 1L y 250 mL
-Termmetro
-Probeta de 100 mL
-Cronmetro
-Espectrofotmetro con celdas
-Vortex
-Parrilla de calentamiento con
agitacin
-Soporte universal con varilla
-Pinzas para termmetro

-Sustrato: Almidn a una
concentracin de 10 mg/mL.
-Regulador de fosfatos pH 7.0
a 0.2M (NaH2PO4, 0.2 M,
200mL y Na2HPO4, 0.2 M,
350 mL)
-Regulador de acetatos a
diferentes pH (3, 4, 5, 6, 7, 8)
0.2 M
-Solucin de Amilasa
-Reactivo de DNS



DESARROLLO EXPERIMENTAL
I. Determinacin de las velocidades iniciales
1. Preparar, por duplicado tubos de 1.5 mL, como se indica en la tabla 1, adicionando, 0.20 mL de
sustrato.
2. Posteriormente adicionar a cada tubo 0.05 mL (50 L) de la solucin de amilasa (excepto al testigo)
con un intervalo entre cada tubo de 30 segundos para detener la reaccin en el tiempo exacto.
3. Adicionar los 0.5 mL del buffer de acetatos a pH 5.
4. Incubar los tubos por 5 minutos (tiempo de reaccin T1) a 30 C (o temperatura ambiente).
5. Pasado el periodo de incubacin, detener la reaccin sumergiendo los tubos en un bao de hielo,
tomar 0.1 mL de la mezcla de reaccin y adicionarlo a un tubo conteniendo 0.1 mL del reactivo DNS.
6. Continuar la determinacin de azcares reductores por el mtodo de DNS.
7. A partir de los valores de absorbancia y tiempo de incubacin se pueden determinar los valores de
actividad enzimtica.
8. Repita los pasos del 1 al 6 para los diferentes tiempos T2, T3, T4 y T5

Tabla 1. Cantidades de los diferentes reactivos para obtener las velocidades
iniciales para la enzima amilasa en diferentes tiempos.
Tubo T1 (5
min)

T2 (10
min)
T3 (15
min)
T4 (20
min)
T5 (20
min)
Blanco
Solucin de
Amilasa (mL)
0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 ------
Solucin
de sustrato (0.2 M) (mL)
0.20 0.20 0.20 0.20 0.20

0.20

Buffer acetato pH (5)
(mL)
0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
Agua destilada (mL) 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25

0.3



II. Determinacin del efecto del pH sobre la reaccin enzimtica.
1. Preparar, por duplicado tubos de 1.5 mL, como se indica en la tabla 2, adicionando, 0.20 mL de
sustrato.
2. Posteriormente adicionar a cada tubo 0.05 mL (50 L) de la solucin de amilasa (excepto al testigo)
con un intervalo entre cada tubo de 30 segundos para detener la reaccin en el tiempo exacto.
3. Adicionar los 0.5 mL del buffer de acetatos al pH indicado en la tabla 2.
4. Incubar los tubos por 15 minutos a 30 C (o temperatura ambiente).
5. Pasado el periodo de incubacin, detener la reaccin sumergiendo los tubos en un bao de hielo
picado. Tomar 0.1 mL de la mezcla de reaccin y adicionarlo a un tubo conteniendo 0.1 mL del
reactivo DNS.
6. Continuar la determinacin de azcares reductores por el mtodo de DNS.
7. A partir de los valores de absorbancia y tiempo de incubacin se pueden determinar los valores de
actividad enzimtica.

Tabla 2. Cantidades de los diferentes reactivos para determinar el efecto del pH
en la actividad enzimtica de la amilasa.

pH pH (3 )

pH (4) pH (5) pH (6) pH (7) pH (8) Blanco
Solucin de
Amilasa (mL)
0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 --------
Solucin
de sustrato (mL)
0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20

Buffer acetato 0.2 M (el
pH es el que se indica en
la fila superior)
0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
Agua destilada (mL) 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.3

Nota: para el blanco control use el buffer de pH 5

III. Determinacin del efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica.
1. Preparar, por duplicado tubos de 1.5 mL, como se indica en la tabla 3, adicionando, 0.20 mL de
sustrato.
2. Posteriormente adicionar a cada tubo 0.05 mL (50 L) de la solucin de amilasa (excepto al testigo)
con un intervalo entre cada tubo de 30 segundos para detener la reaccin en el tiempo exacto.
3. Adicionar los 0.5 mL del buffer de acetatos al pH 5
4. Incubar los tubos por 15 minutos a las diferentes temperaturas indicadas en la tabla 3,
5. Pasado el periodo de incubacin, detener la reaccin sumergiendo los tubos en un bao de hielo
picado. Tomar 0.1 mL de la mezcla de reaccin y adicionarlo a un tubo conteniendo 0.1 mL del
reactivo DNS.
6. Continuar la determinacin de azcares reductores por el mtodo de DNS.
7. A partir de los valores de absorbancia y tiempo de incubacin se pueden determinar los valores de
actividad enzimtica.

Tabla 3. Cantidades de los diferentes reactivos para determinar el efecto de la
temperatura en la actividad enzimtica de la amilasa.

Temperatura 10C

20 C 30C 40C 50C 60C Control
Solucin de
Amilasa (mL)
0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 ------
Solucin
de sustrato (mL)
0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20

Buffer acetato 0.2 M (el
pH es el que se indica en
la fila superior)
0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
Agua destilada (mL) 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.3

Nota: para el blanco control use la temperatura ambiente.

Una vez que estableci cual es el pH y la temperatura optima para la actividad de la amilasa,
determine la velocidad de reaccin cambiando las concentraciones de sustrato.

IV. Determinacin del efecto de la concentracin de sustrato sobre la velocidad de las reacciones
enzimticas.
1. Preparar, por duplicado tubos de 1.5 mL, como se indica en la tabla 4, adicionando el volumen de
sustrato como se indica en la tabla 4.
2. Posteriormente adicionar a cada tubo 0.05 mL (50 L) de la solucin de amilasa (excepto al testigo)
con un intervalo entre cada tubo de 30 segundos para detener la reaccin en el tiempo exacto.
3. Adicionar los 0.5 mL del buffer de acetato al pH optimo obtenido en la seccin II.
4. Incubar los tubos por 15 minutos a la temperatura optima obtenida en la seccin III.
5. Pasado el periodo de incubacin, detener la reaccin sumergiendo los tubos en un bao de hielo
picado. Tomar 0.1 mL de la mezcla de reaccin y adicionarlo a un tubo conteniendo 0.1 mL del
reactivo DNS.
6. Continuar la determinacin de azcares reductores por el mtodo de DNS.
7. A partir de los valores de absorbancia y tiempo de incubacin se pueden determinar los valores de
actividad enzimtica.

Tabla 4. Cantidades de los diferentes reactivos para determinar la velocidad de
reaccin a diferentes concentraciones de sustrato.

Concentracin
de sustrato
[mg/mL]
0.10 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 Control
Solucin de
Amilasa (mL)
0.050 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 ------
Solucin
de sustrato
(mL)
0.010 0.05 0.1 0.20 0.30 0.40 0.45 0.20

Buffer acetato
0.2 M pH
optimo
0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
Agua destilada
(mL)
0.44 0.4 0.350 0.250 0.15 0.050 0 0.30

Determine la km y Vmax con los resultados obtenidos.

Cuestionario post-laboratorio
1. Cmo afecta la temperatura la cintica de una enzima?
2. Cmo altera el pH lo valores de Km y Vmax?
3. Porqu se realiza la linearizacin de la ecuacin de Michaelis-Menten?
4. De que dependen los valores de las constantes cinticas en una reaccin enzimtica?

Dubois, T., Jacquet, A., Scheneck, A. G. and Looze, Y. (1988). The thiol proteinases from the latex of
Carica papaya L. I. Fractionation Purification and Preliminary Characterization. Biological Chem
Hoppe- Seyler. 369: 733-740.
Jeremy Mark Berg, Lubert Stryer, Jeremy Berg, John Tymoczko. (2008). Bioquimica. Editorial Revert.
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Segel H. Irwin. (1976). Biochemical Calculations How to solve mathematical problems in general
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