Castroagudn, V.L.

Protenas Fluorescentes Verdes

Historia
La protena fuorescente verde avGFP fue aislada de la medusa
Aequorea victoria por Shimomura y su equipo en 19!" #l
investi$ador o%serv& que una soluci&n de avGFP se vea verdosa %a'o
la lu( del sol) se torna%a amarillenta %a'o una lampara de tun$steno)
y fuoresca con lu( verde %rillante al ser irradiada con lu( *V"
Posteriormente) en 19+1) este mismo $rupo pu%lic& el espectro
de emisi&n de avGFP con su pico caracterstico a ,-. nm) notando
que la %ioluminiscencia verde del te'ido vivo de la medusa tam%i/n
tena un pico a esa lon$itud de onda" La aequorina) protena de A.
victoria a la que est0 asociada avGFP) emite lu( a(ul 12+- nm3) a una
lon$itud de onda cercana a la de e4citaci&n de avGFP" 5e /sto se
postul& acertadamente que avGFP converta la emisi&n a(ul de
aequorina al %rillo verde que presentan las c/lulas animales" #n ese
mismo a6o 7orin y Hustin$ descu%ren el mismo fen&meno en los
celenterados Obelia 1un hidroide3 y Renilla) siendo los primeros en
de8nir la 9transferencia de ener$a radiativa:) como el mecanismo de
e4citaci&n de avGFP in vivo. #n 19+2) se demostr& que la aequorina
poda transferir e8cientemente su ener$a luminosa a su compa6era
cuando am%as protenas esta%an en contacto adsor%idas en un
soporte cati&nico"
#n 1.+. se o%tuvo la primera estimaci&n) !+ ;5a) para la masa
de avGFP <1=" *n a6o despu/s) por an0lisis de la protena
desnaturali(ada) y de un fra$mento proteoltico que conserva%a
propiedades de a%sor%ancia caractersticas) se determin& que el
crom&foro de avGFP es 2>hidro4i%encilideno>imida(olina>,>ona) y que
/ste se encuentra unido al esqueleto peptdico a trav/s de las
posiciones 1> y !> del anillo 1ver Fi$ura !3" #sto fue con8rmado en
199 por espectroscopa de masa 1para mayor detalle ver referencia
<!=3" Aequorea y Renilla mostraron tener el mismo crom&foro) sin
em%ar$o la protena de Renilla tiene un coe8ciente de e4tinci&n
superior) mayor esta%ilidad conformacional frente a cam%ios en el pH
y tendencia a dimeri(arse"
Pero los avances cruciales en esta historia tuvieron lu$ar con el
clonado del $en de avGFP) la con8rmaci&n en 199! que su e4presi&n
en otros or$anismos crea%a fuorescencia) y su sntesis in vitro en
199. <?=" @ompro%ando as que el $en contena toda la informaci&n
necesaria para la sntesis postraduccional del fuor&foro) y que
nin$una en(ima espec8ca de la medusa era requerida para ello"
Las diferentes GFPs de distintos celenterados parecen ser
compa6eras de protenas quimioluminiscentes 1emisores primarios3 y
e'ercer el control de la emisi&n de lu( in vivo" Pero) aAn no est0
aclarado 1a3 por qu/ estos or$anismos %rillanB 1%3 por qu/ la emisi&n
de lu( verde es preferida a la lu( de los emisores primariosB y 1c3 por
> 1 >
a
Si$uiendo las convenciones de la literatura) en esta mono$rafa las protenas
fuorescentes se denominan de la si$uiente maneraC dos letras iniciales minAsculas
re8eren a la especie de la cual se e4tra'eron" Le si$ue 9FP: 1 del in$l/s Fluorescent
Protein3" Por Altimo un nAmero 8nal que indica la lon$itud m04ima de emisi&n de
fuorescencia en nm" La protena fuorescente verde de A. victoria es conocida
simplemente como avGFP"
La Protena Fluorescente Verde de Aequorea victoria
( avGFP3
a

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qu/ la mayora de estos animales marinos sinteti(an una protena
separada en ve( de mutar la protena quimioluminiscente cam%iando
la lon$itud de su emisi&n"
Los emisores primarios parecen contener cofactores e4ternos
1luma(inas) favinas) peridincloro8la>a y otros cofactores
tetrapirr&licos etc3 como crom&foros) lo cual los descarta como
sondas o marcadores %iotecnol&$icos) 1a pesar de ser altamente
fuorescentes y atractivos pi$mentos accesorios a lar$a lon$itud de
onda3" La correcta inserci&n de todos estos cofactores en otros
or$anismos no se ha lo$rado aAn"
#structura primaria y formaci&n del fuor&foro
La secuencia de !?. amino0cidos de avGFP <2= se presenta en
la Fi$ura 1" Se conocen varias mutantes) cuyas alteraciones
infuencian caractersticas espec8cas y al$unas que han me'orado su
e4presi&n) pero no modi8car el comportamiento $eneral de la
protena"
Fi$ura 1) secuencia de avGFP salva'e" Los amino0cidos que forman el
crom&foro se encuentran su%rayados"
@omo se mencion& anteriormente el fuor&foro es
2>hidro4i%encilideno>imida(olina>,>ona 1ver Fi$ura !3) formado por los
residuos , al + 1Ser>Dyr>Gly en avGFP3 y su sntesis ha sido aclarado"
Primero) avGFP se plie$a en su conformaci&n nativa) lue$o se forma la
imida(olina por ataque nucleoflico de la amida de la Gly + so%re el
> ! >
MSE SER LYS GLY GLU GLU LEU PHE THR GLY
VAL VAL PRO ILE LEU VAL GLU LEU ASP GLY
ASP VAL ASN GLY HIS LYS PHE SER VAL SER
GLY GLU GLY GLU GLY ASP ALA THR TYR GLY
LYS LEU THR LEU LYS PHE ILE CYS THR THR
GLY LYS LEU PRO VAL PRO TRP PRO THR LEU
VAL THR THR PHE SER TYR GLY VAL GLN CYS
PHE SER ARG TYR PRO ASP HIS MSE LYS ARG
HIS ASP PHE PHE LYS SER ALA MSE PRO GLU
GLY TYR VAL GLN GLU ARG THR ILE PHE PHE
LYS ASP ASP GLY ASN TYR LYS THR ARG ALA
GLU VAL LYS PHE GLU GLY ASP THR LEU VAL
ASN ARG ILE GLU LEU LYS GLY ILE ASP PHE
LYS GLU ASP GLY ASN ILE LEU GLY HIS LYS
LEU GLU TYR ASN TYR ASN SER HIS ASN VAL
TYR ILE MSE ALA ASP LYS GLN LYS ASN GLY
ILE LYS VAL ASN PHE LYS ILE ARG HIS ASN
ILE GLU ASP GLY SER VAL GLN LEU ALA ASP
HIS TYR GLN GLN ASN THR PRO ILE GLY ASP
GLY PRO VAL LEU LEU PRO ASP ASN HIS TYR
LEU SER THR GLN SER ALA LEU SER LYS ASP
PRO ASN GLU LYS ARG ASP HIS MSE VAL LEU
LEU GLU PHE VAL THR ALA ALA GLY ILE THR
HIS GLY MSE ASP GLU LEU TYR LYS
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car%onilo del residuo , 1ciclaci&n3) se$uido por deshidrataci&n"
Finalmente) el o4$eno molecular sustrae el hidr&$eno del enlace @>
@ de la Dyr ) con'u$ando el anillo fen&lico con el imida(&lico" #n
ese momento el crom&foro adquiere a%sor%ancia en el visi%le y
capacidad de fuorescer" #ste mecanismo esta %asado en lo si$uiente
<, > +="
a3 #l o4$eno atmosf/rico es necesario para la maduraci&n del
cr&moforo) es decir) para que /ste fuoresca"
%3 La fuorescencia de avGFP aparece con una cin/tica e4ponencial
simple) al tomar contacto con el aire" 5icha cin/tica no es
afectada por la concentraci&n de protena o cofactores
celulares"
c3 Los an0lo$os de imida(olinas se auto>o4idan espont0neamente"
d3 La ciclaci&n propuesta se aseme'a a la ciclaci&n isoest/rica
o%servada para enlaces Esn>Gly" Edem0s Gly + es un residuo
muy conservado en distintas GFP"
e3 La espectroscopa de masa) indica que la GFP preformada
anaer&%icamente pierde solo ! 5a por e4posici&n al aire) lo que
es consistente con la p/rdida de dos hidr&$enos" #sto implica
que la deshidrataci&n 1>1. 5a3 de%e ha%er ocurrido
anaer&%icamente) precediendo a la o4idaci&n"
f3 La cin/tica de refolding proteico ha sido ampliamente
caracteri(ada) a partir de cuerpos de inclusi&n sin crom&foros)
protenas desnaturali(adas con un crom&foro maduro y
protenas desnaturali(adas con el crom&foro reducido por
ditionito" La renaturali(aci&n fue medida por la aparici&n de la
fuorescencia y la resistencia a la di$esti&n con tripsina)
proporcionando las constantes cin/ticas que se ven en la Fi$ura
!"
> ? >
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> 2 >
Fi$ura !" 7ecanismo propuesto para la
formaci&n del cr&moforo por @u%%it en"199,)
<1="
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#studios cristalo$r08cosC estructura secundaria y
terciaria
Eunque la avGFP fue cristali(ada en 19+2) su patr&n de
difracci&n no se report& hasta 19.." La estructura fue resuelta en
199 por dos $rupo de investi$aci&n independientementeC el de Frmo
11#7E3 y el de Gan$ 11GFL3B am%as se resolvieron a 1"9 H" #structuras
de otras mutantes han aparecido posteriormente <.="
La avGFP est0 compuesta por once cordones antiparelelos y
una h/lice " Los cordones forman un %arril de 2- H) atravesado por
la h/lice ) 1Fi$ura ?3 " #l fuor&foro est0 su'eto a la h/lice y sumer$ido
en el centro del %arril" #sta estructura) ha sido llamada -can
1literalmente lata>3" *n nAmero sorprendente de $rupos polares y
mol/culas de a$ua estructurada aparecen en el core) adyacentes al
crom&foro 1Fi$ura 23" @asi la mayora de la secuencia es utili(ada en
formar el %arril y la h/lice a4ial) por ello no hay lu$ares o%vios
donde puedan reali(arse recesiones y reducir el tama6o de la protena
si$ni8cativamente" Los residuos 1 y !?->!?.) est0n desordenados y
no pudieron ser resueltos por difracci&n" #stas re$iones corresponden
a las m04imas recesiones en am%os e4tremos que pueden hacerse
conservando la funci&n %iol&$ica 1fuorescencia3"
> , >
Fi$ura ?" #structura de avGFP en la que se
o%servan los once cordones en el %arril
y el cilindro hueco central atravesado por
una h/lice " #l crom&foro 1en $ris I y en
naran'a en la 8$ura inferior3 se encuentra
en el centro del %arril"
Fi$ura 2" @adenas laterales)
car%onilos y amidas de la cadena
peptdica) y mol/culas de a$ua
presentes en el microentorno del
cromforo" Pro%a%les puentes de
hidr&$enos se indican con lnea de
puntos) con la distancia marcada
en H
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#structura cuaternariaC dimeri(aci&n
La forma del espectro de e4citaci&n de la avGFP salva'e
depende de la concentraci&n de proteica) implicando fen&menos de
asociaci&n" #n 199) Dan$ esta%leci& que esta protena forma dmeros
con
5
J

1 4 1-
>2
7" La interfase de dimeri(aci&n incluye residuos
hidrof&%icos 1Leu !-) Leu !!1 y Phe !!?3 e hidroflicos 1Dyr ?9) Glu
12!) Ens 122) Ser 12+) Esn 129) Dyr 1,1) Er$ 1.) Esn 1+-) Glu 1+!)
Dyr !--) Ser !-!) Gln !-2 y Ser !-.3" #n la estructura determinada
por difracci&n de K4 se o%servan dmeros dependientes del m/todo
de crecimiento del cristal" #n cam%io la GFP de Renilla es un dmero
o%li$ado que s&lo se separa en condiciones desnaturali(antes"
Dam%i/n se ha lo$rado cristali(ar esta protena mon&mero)
reempla(ando la Ser , por Dhr"
@lasi8caci&n de las GFPs
#n %ase a las propiedades espectrales del crom&foro las
variantes de GFP pueden ser divididas en siete clases <1=C
@LES# L" (Equilibrio fenol-fenolato). E este $rupo
pertenecen la avGFP) que presenta el espectro m0s
comple'o de todas las GFP" Posee un m04imo de e4citaci&n
a ?9, nm y otro a 2+, nm) siendo el primero tres veces
mayor en amplitud que el se$undo" E pH +"-) la e4citaci&n
a ?9, nm ori$ina una %anda de emisi&n a ,-. nm)
mientras que e4citando a 2+, nm) se o%tiene emisi&n a
,-? nm" #l hecho de que el m04imo de emisi&n dependa
de la e4citaci&n indica la e4istencia de dos formas del
crom&foro) que no lle$an al equili%rio en el tiempo de vida
del estado e4citado" E pH 1->11) cuando la protena est0
cerca de desnaturali(arse) incrementos en la <HM
>
=
aumentan la amplitud de la a%sorci&n a 2+, nm a
e4pensas del pico a ?9, nm" La forma m0s simple de
interpretar este fen&meno es pensar que el pico a 2+, nm
de de%e a la a%sorci&n del fenolato" 7ientras que el pico a
?9, representa la a%sorci&n del fenol" E su ve( la emisi&n
a ,-? nm podra de%erse al fenol) mientras que el pico a
,-. nm correspondera a la emisi&n del fenolato" #ste
Altimo) adem0s podra desprotonarse en el estado
e4citado) pues el pNa de los fenoles es menor en este
estado"
#l mecanismo m0s pro%a%le a trav/s del cual ocurre
la transferencia de protones desde y hacia el fenol) es via
puentes de hidr&$eno entre de mol/culas de a$ua y la Ser
!-, al Glu !!!" #n la estructura cristalina del mon&mero
de avGFP salva'e) la Dhr !-? 1capa( de rotar y esta%ili(ar el
> >
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o4iani&n3 e4iste en dos conformacionesC .,O con el $rupo
MH ale'ado del o4$eno fen&lico y 1,O rotado hacia /l"
#sta proporci&n coincide con la estimaci&n espectroscopica
so%re la relaci&n fenolPfenolato en el equili%rio <.="
La coe4istencia de am%as especies de crom&foros
que dan dos picos en el espectro de la protena salva'e)
tiene pocas venta'as y varias desventa'as para su uso
como herramienta molecular" Si la avGFP ser0 detectada
por el o'o desnudo) la e4citaci&n con *V es conveniente)
pues el *V es invisi%le" Sin em%ar$o) de%ido a que la
iluminaci&n intensa con *V puede da6ar al o'o) un 8ltro
e4terno de%e ser empleado" Dam%i/n el scatering)
autofuorescencia y la posi%ilidad de fotode$radaci&nde los
te'idos son m0s severos con e4citaci&n por *V" Por ello) la
e4citaci&n a 2+- nm reducira estos pro%lemas) pero /sta
es ine8ciente dado que s&lo el 1,O del crom&foro se
presenta como ani&n" La fotoisomeri(aci&n) el
despla(amiento del equili%rio fenolPfenolato posterior a la
e4citaci&n lumnica) es el mayor impedimento para la
cuanti8caci&n de la fuorescencia en im0$enes) aunque
permite el monitoreo del tr08co y difusi&n de protenas
marcadas con avGFP) por irradiaci&n local de una c/lula
con un punto o fran'a de *V intensa y si$uiendo lue$o por
an0lisis de im0$enes) la tasa de fotoisomeri(aci&n"
#ste fen&meno de fotoisomeri(aci&n es el
responsa%le a su ve( de la intermitencia de la
fuorescencia en esta clase de protenas) que puede llevar
a importantes errores e4perimentales cuando la
desaparici&n o la intensidad de la fuorescencia sea la
se6al esperada) 1un profundo an0lisis del tema
considerando aspectos estructurales) cin/ticos)
ener$/ticos y termodin0micos puede hallarse en las
referencias <9= a <1?=3"
La avGFP se ha plie$a correctamente a temperatura
am%iente o de%a'o de ella 1consideremos que los
or$anismos en los cuales se encontr& esta protena) hasta
ahora) nin$uno es de a$uas c0lidas3 es esta%le y fuoresce
hasta los , Q@" *tili(ando !"A s#u$ing se han o%tenido
mutantes que me'oran el ple$ado a ?+Q@) temperatura de
tra%a'o en la mayora de los cultivos celulares) reduciendo
la formaci&n de a$re$ados a altas concentraciones e
incrementando la difusi%ilidad de la protena"
@LES# LL (Cromforo fenolato)" #sta clase de avGFP es la m0s
ampliamente utili(adaB com%ina una alta fuorescencia con
espectros de e4citaci&n y emisi&n simples" La mutaci&n
S,D) es la m0s comAn para causar la ioni(aci&n del
crom&foro) aunque tam%i/n otros residuos alif0ticos como
Gly) Ela) @ys y Leu) tienen efectos similares" La triple
mutante F27) S,G) R9L o%tenida por muta$/nesis al
a(ar) es muy popular" #n S,D avGFP el pico de e4citaci&n
> + >
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a ?9, nm se suprime) dado que no e4iste el fenol) y el
m04imo 2+->2+, nm del ani&n se intensi8ca de cinco o
seis veces en amplitud y se corre a 2.9>29- nm" La
o4idaci&n del fuor&foro maduro es cerca de cuatro veces
m0s r0pida que en la protena salva'e" #s esta%le cuando
se e4presa temperatura am%iente) pero tiende a ple$arse
mal y producir a$re$ados no fuorescentes a temperaturas
mayores"
La Ser , promueve la ioni(aci&n del crom&foro
porque en la estructura nativa s&lo esta serina puede
formar un puente de hidr&$eno con la cadena de Glu !!!
para permitir la ioni(aci&n de ese car%o4ilato) el cual est0
?"+ H de distancia del crom&foro" Gly) Ela y Lys no pueden
formar estos puentes) y Dhr o @ys son demasiado $randes
para adoptar la conformaci&n correcta en el 9super
po%lado: interior proteico" Los otros $rupos polares que
solvatan al fuor&foro son entonces su8cientes para
promover su ioni(aci&n) mientras que si el Glu !!! es un
ani&n) las repulsiones electrost0ticas prohi%en al
fuor&foro convertirse en un ani&n tam%i/n" #sta hip&tesis
e4plicara por qu/ la mutaci&n del Glu !!! a Gly da el
mismo espectro que las mutantes en la Ser ," E pesar
de los %ene8cios de esta mutante) no se han detectado)
en la %i%lio$rafa consultada) e'emplos de la aplicaci&n de
#!!!G"
@LES# LLL (Fenol en el cromforo)" La ioni(aci&n del crom&foro
puede ser reprimida a trav/s del cam%io de la Dhr !-? a
Lle) suprimi/ndose el pico de e4citaci&n a 2+, nm)
de'ando solamente el de menor lon$itud de onda 1?99
nm3" #l crom&foro) presumi%lemente) no puede solvatarse
una ve( que el MH de la Dhr no est0 presente) por lo tanto
queda neutro en la mayora de las mol/culas en estado
%asal" Sin em%ar$o) la emisi&n se da a ,11 nm porque
ocurre desprotonaci&n en este estado"
#n lo que respecta a la optimi(aci&n en el proceso
de ple$amiento) estas mutantes poseen la venta'a de ser
fotoqumicamente m0s simples" El carecer del pico de
e4citaci&n a 2+9>29- nm) pueden emplearse 'unto con las
avGFP clase LL para una do%le marcaci&n" Las lon$itudes
de onda para su e4citaci&n) se a'ustan a la mayora de los
equipos de microscopa de fuorescencia dise6ados para
indicadores racionales de e4citaci&n) pudi/ndose eliminar
cualquier pro%lema en el re$istro de las im0$enes
causado por la alternancia de los 8ltros de emisi&n"
#sta clase de avGFP posee adem0s la mayor
diferencia entre los m04imos de e4citaci&n y emisi&n)
este $ran corrimiento de Sto;es puede ser una venta'a
para la utili(aci&n de l0seres"
> . >
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@LES# LV (Fenolato en sistema electrnico apilado). Las
mayores lon$itudes de onda de emisi&n son alcan(adas a
trav/s de mutaciones que apilen anillos arom0ticos) que
$eneralmente son de la cadena lateral del residuo !-?)
cerca del ani&n fenolato del crom&foro y del residuo ,"
Dodos los amino0cidos arom0ticos IHis) Drp) Phe y Dyr> en
posici&n !-?) incrementan la de e4citaci&n y emisi&n
hasta !- nm) en el orden mencionado" #stas mutantes)
fueron dise6adas a partir de la estructura cristalina de
S,D) con la e4pectativa de que una polari(a%ilidad
adicional en la (ona del crom&foro e interacciones >)
redu'eran la ener$a del estado e4citado) y con ello)
incrementaran tanto la de e4citaci&n) como la de
emisi&n" #l reempla(o de la Gln 9 por Lys) produ'o un
corrimiento e4tra de 1>! nm) llevando la emisi&n a ,!9
nm) y donde a pesar de que esta lon$itud es de lu(
verdoso) la cola a mayor lon$itud de onda del espectro es
su8ciente para que la fuorescencia o%servada sea
amarilla" Por ello las avGFPs clase LV se han llamado GFP
1%ello&is# Fluorescent Protein> Protenas Fluorescentes
Emarillentas3) nom%re que tam%i/n a sido aplicado a la
protena fuorescente de Vibrio 'sc#eri) conocida en el
mercado como Sio GelloT 1Pharmenin$en3"
El$unas de estas mutantes e4hi%en un decaimiento
en el rendimiento cu0ntico con perdidas en la
fuorescencia superiores al 9-O y e4traordinariamente
cortos perodos de vida interpretados en t/rminos de
conversiones internas) producidos por movimientos de
torsi&n en el crom&foro inducidos por la lu( con que se los
e4cita <12=" Para mas datos so%re la din0mica
intramolecular de estas protenas y la infuencia de la
misma en los ensayos e4perimentales) ver la referencia
ori$inal <1,="
@LES# V (Indol en el cromforo)" La sustituci&n GU) da lu$ar
a un nuevo crom&foro con un anillo ind&lico es ve( de uno
fen&lico" Las lon$itudes de emisi&n y e4citaci&n se corren
a 2? y 2+ nm respectivamente) intermedias entre las
que hallamos cuando est0n presentes en el crom&foro un
fenol neutro o un fenolato ani&nico" #sta mutante requiere
otros cam%ios para alcan(ar un %rillo adecuado" Las
protenas de esta clase se denominan C(an Fluorescent
Proteins) @FP) 1Protenas Fluorescentes color @yan3) dado
el color a(ul>verdoso o c(an de su emisi&n" *na curiosidad
de este $rupo) es que los espectros de a%sorci&n y emisi&n
presentan una curva con dos hom%ros) en ve( de un pico
de8nido) esto puede de%erse a distintos estados
vi%racionales u otros estados cu0nticos que se equili%ran
dentro del tiempo de vida del estado e4citado"
> 9 >
Castroagudn, V.L. Protenas Fluorescentes Verdes
@LES# VL (Imidazol en el cromforo)" La mutaci&n GH u%ica un
$rupo imida(&lico en el crom&foro) y corre la lon$itud de
onda de e4citaci&n m0s aAn que en los e'emplos de la
@lase V" Los picos de e4citaci&n y emisi&n est0n
respectivamente en ?.? y 22+ nm) por lo tanto la
fuorescencia emitida es a(ul) 1ver Fi$ura 113" Se
denomina a es este $rupo es SFPs) )lue Fluorescent
Protens 1Protenas Fluorescentes E(ules3" Varias
estructuras de este $rupo ya han sido resueltas" Son
Atiles para marcaciones do%les"
E pesar de que mediante mutaciones se ha
me'orado su velocidad de ple$amiento) las SFP tienen %a'o
rendimiento cu0ntico y son muy f0ciles de decolorar
1fotobleac#ing3"
@LES# VLL (Fenilo en el cromforo)" Las menores lon$itudes de
onda de e4citaci&n de o%tienen con una Phe en la posici&n
" #sta mutante ha sido muy poco estudiada ya que por
ahora no se ha propuesto un uso pr0ctico para ensayos
que requieran una protena con lon$itud de e4citaci&n tan
corta 1?- nm3" Sin em%ar$o demuestran que cam%ios en
el residuo puede crean un crom&foro con una $ran
variedad propiedades"
Kelaci&n entre la estructura y las propiedades &pticas
La avGFP desnaturali(ada tiene sus m04imos de a%sorci&n a
?.2 nm) a pH 0cido o neutroB y a 22. nm a pH alcalino) con un pNa de
."1" #stos m04imos de a%sor%ancia y e4citaci&n) %astante similares a
los de la protena intacta) sirvieron como una de las primeras prue%as
para postular la presencia de un crom&foro neutro y uno ani&nico" La
protena fuorescente desnaturali(ada o peque6os fra$mentos de
prote&lisis conteniendo el crom&foro son no fuorescentes)
presumi%lemente porque el crom&foro est0 e4puesto al quenc#ing por
choque con mol/culas de a$ua) de o4$eno parama$n/tico o
isomeri(aci&n cis>trans <!=" La peque6a diferencia entre los m04imos
de a%sor%ancia entre la protena nativa y desnaturali(ada o%viamente
se de%e al am%iente estructurado de /sta Altima" #n particular) a la
Er$ 9 que u%ica una car$a positiva muy cerca del $rupo car%onilo de
la imida(olina" #ste cati&n esta%ili(ara electrost0ticamente la intensa
densidad electr&nica del crom&foro en el estado e4citado" #sta
atracci&n electrost0tica e4plica el corrimiento hacia el ro'o de la
protena intacta respecto a la desnaturali(ada" #s m0s) se ha
demostrado que cam%iando la Er$ 9 por @ys) en S,D) se produce
un corrimiento hacia el a(ul en el m04imo de e4citaci&n) 2.9 a 2+!
nm) y en el de emisi&nC de ,11 a ,-? nm"
#fectos del am%iente so%re las propiedades de las GFPs
#fecto del pH
> 1- >
Castroagudn, V.L. Protenas Fluorescentes Verdes
La protena avGFP salva'e a%sor%e menos a altos pH 111>1!3)
mientras que la fuorescencia se de%ilita a ?9, nm y se intensi8ca a
los 2+- nm <11=" Dales valores de pH) nunca se hallan en sistemas
vivos" La fuorescencia de la avGFP es tam%i/n atenuada a pH 0cido)
con un pNa aparente de 2"," Varias mutantes con propiedades
espectrales me'oradas a pH +) son m0s sensi%les al pH que la
protena ori$inal siendo atenuadas en un ,-O a pH ,"," Han sido
hallados en al$unas especies de la @lase LV 1donde la Dhr !-? es
reempla(ada por un amino0cido ar&matico3 pas tan altos como "."
Sera de esperar que al no estar presente el MH de la treonina el
fenolato del crom&foro se desta%ilice" Sin em%ar$o el efecto del 0cido
atenAa la fuorescencia totalmente) en ve( de correrla hacia
menores que corresponderan al crom&foro protonado" La sensi%ilidad
de esta protena a pH intermedios tienen venta'as y desventa'asB ya
que la fuorescencia no se desarrolla en or$anelas 0cidas como
lisosomas) endosomas o el aparato de Gol$i" #sta sensi%ilidad puede
ser utili(ada como un indicador de pH intracelular) diri$iendo la
protena a los distintos compartimentos celulares" Vo o%stante hay
que introducir controles de cali%raci&n para descartar efectos
inespec8cos"
#fectos de la temperatura y la concentraci&n proteica
E altas concentraciones de protena se ampli8ca el pico m04imo
de e4citaci&n a e4pensas del de 2+- nm) porque la a$re$aci&n impide
la ioni(aci&n" #l aumento de la temperatura de 1, a , Q@ decrece
modestamente la e4citaci&n a ?9, nm y la incrementa a 2+- nmB
mayores temperaturas causan desnaturali(aci&n) con p/rdida del ,-O
de la fuorescencia a +.Q@" @omo se mencion& anteriormente)
incrementar la temperatura de !- a ?+ Q@ afecta profundamente la
maduraci&n de avGFP salva'e"
#fectos Post>#4citaci&n
Las GFPs tienen una admira%le capacidad para sufrir
transformaciones fotoqumicas) las cuales posi%ilitan la visuali(aci&n o
el transporte de protenas fusionadas o marcadas con ellas" *na (ona
de8nida de una c/lula o te'ido puede moment0neamente e4ponerse a
una iluminaci&n muy intensa y anali(arse las reacciones fotoqumicas
y las fotoconversiones posteriores a la iluminaci&n) que sufren las
protenas mediante la toma de im0$enes en el transcurso del tiempo"
@omo mnimo cuatro conversiones fotoqumicas fueron
descriptas para una o m0s GFPs <1=C
1" Foto%lanqueamiento simple e irreversi%le"
!" @onversi&n del m04imo de e4citaci&n de ?9, a 2+, nm"
?" P/rdida de la e4citaci&n a 2.. nm) reversi%le por
iluminaci&n a 2- nm 1ocurre en las SFPC el cr&moforo
es llevado a un estado e4citado protonado 1no
fuorescente3) con un m04imo de e4citaci&n a 2- nmB
> 11 >
Castroagudn, V.L. Protenas Fluorescentes Verdes
posteriormente la e4citaci&n a /sta resta%lece la
fuorescencia3"
2" Generaci&n de fuorescencia ro'a lue$o de iluminar a
2.. nm en condiciones anaer&%icas" Kesta mucha
investi$aci&n para dilucidar este mecanismo) pero ha
sido de $ran utilidad para medir in vivo la capacidad de
difundir de las avGFP en %acterias"
5emanda de M
!
La demanda de M
!
para deshidro$enar el enlace > del residuo
) implica que la protena no puede volverse fuorescente en
anaero%ios o%li$ados" #sto limita el ran$o de sistema en los que se
puede e4presar esta protena" *na ve( que se ha completado la
maduraci&n el M
!
ya no se necesita" Por otro lado la o4idaci&n es un
paso lento) lo que no permitira monitorear cam%ios r0pidos en la
e4presi&n de $enes" La dependencia con la pM
!
no ha sido
caracteri(ada por ello) no se sa%e si la pM
!
atmosf/rica acelerara la
o4idaci&n" La mutante S,D ha mostrado tener una constante de
o4idaci&n e4ponencial de -", h) cuatro veces mayor que la de la
protena salva'e"
#nsayos histol&$icos
Los solventes 0cidos as como el $lutaraldehdo y formaldehdo
utili(ados para 8'ar cortes histol&$icos) causan la desnaturali(aci&n y
p/rdida de la fuorescencia de estas protenas"
5etecci&n de las protenas fuorescentesC factores a
considerar
*n la +resente secci,n del traba-o cabe .encionar algunos otros
as+ectos, en este caso no del a.biente, que +ueden afectar a la
+rotena, no co.o tal, sino co.o reactivo en un e/+eri.ento de
biologa .olecular o celular.
#l nivel de e4presi&n y de detecci&n de las protenas fuorescentes
depende de muchos factores) los mas importantes sonC
La cantidad total de protena
0. Vumero de copias del $en y duraci&n de la e4presi&n
1. Fuer(a transcripcional de los promotores y en#ancers
2. #8ciencia de la traducci&n) incluyendo la secuencia de
No(a; y el uso de codones
3. Eusencia de s+licing en el mKVE) de$radaci&n de
protenas y e4portaci&n
#8ciencia de la formaci&n postraduccional del Fluor&foro
> 1! >
Castroagudn, V.L. Protenas Fluorescentes Verdes
1" Solu%ilidad versus formaci&n de cuerpos de inclusi&n
!" 5isponi%ilidad de chaperonas
?" 7al ple$amiento por fusi&n a protenas del hospedador
2" Diempo) temperatura) disponi%ilidad de M
!
) velocidad
intrnseca de ciclaci&nPo4idaci&n
Propiedades moleculares de la protena madura
0. Lon$itudes de onda de e4citaci&n y emisi&n
1. @oe8ciente de e4tinci&n y rendimiento cu0ntico de la
fuorescencia
2. Sucepti%ilidad a la fotoisomerisasi&n y fotobleac#ing
3. 5imeri(aci&n
Kelaci&n se6alPruido
1" Eutofuorescencia de las c/lulas y medios de cultivo
!" Locali(aci&n de la protenas) difusi&n versus
con8namiento a peque6as re$iones su%celulares o
tisulares
?" @alidad de la e4citaci&n) 8ltros de emisi&n y espe'os
dicroicos
2" Sensi%ilidad) ruido y corriente oscura del fotodetector
#n ve$etales ha sido imprescindi%le la modi8caci&n de codones
para eliminar un sitio crptico de s+licing) as mismo como para
me'orar la e4presi&n en mamferos" Dam%i/n) para mamferos) se
a$re$& la secuencia de No(ac para iniciar la traducci&n" Se reali(aron
muchas mutaciones con el o%'etivo de me'orar y acelerar el ple$ado)
la mayora de ellas consisten en el reempla(o de residuos
voluminosos por otros m0s peque6os 1ver Fi$ura ,3" Para me'orar el
proceso de ple$amiento se pueden emplear chaperonas" #sto Altimo
llev& a la utili(aci&n de las protenas fuorescentes a ser sustratos
Atiles para se$uir el funcionamientos de las chaperonas mismas)
proveyendo un sistema continuo y no destructivo para o%servar el
ple$amiento) pues s&lo cuando sea e4itoso) se ver0 fuorescencia"
> 1? >
Castroagudn, V.L. Protenas Fluorescentes Verdes
Fi$ura ," 7utaciones m0s importantes en la estructura de GFP que me'oran el ple$amiento a ?+Q@ Frmo
7) et al" Science !+?C 1?9!>9," 11993
Eplicaciones de las Protenas Fluorescentes
Eplicaciones pasivas
Las aplicaciones pasivas en investi$aciones) especialmente en
%iolo$a celular de las protenas fuorescentes 1PF3) pueden dividirse
entre los usos como marcador 1tag3 o indicador (Re+orter 4ene, Cell
5ar6er o Fusi,n 7ag3" #l uso como marcador) el mayoritario a la fecha
Ws&lo %asta con colocar +rotenas 8uorescentes en un %uscador en la
U#S y o%servar los miles de pu%licaciones que las emplean en las
m0s dispares disciplinasW) refe'an los niveles de e4presi&n o la
u%icaci&n su%celular causada por los dominios marcados o por
protenas del hospedador que han sido fusionadas a una protena
fuorescente" @omo indicador) la fuorescencia es tam%i/n alterada
postraduccionalmente por el am%iente qumico o intreracci&n
protena>protena"

El no ser esta protena una en(ima) su utili(aci&n es
prometedora en em%riones intactos y animales tran$/nicos) y el
control de la transferencia de $enes" Pero a causa de que la
marcaci&n carece de ampli8caci&n) la sensi%ilidad del m/todo se
limita no por el instrumento sino por la autofuorescencia de los
te'idos" Para duplicar la fuorescencia del entorno y lo$rar un ensayo
detecta%le Se necesita una cantidad de protena fuorescente de 17
11-
,
copias en un volumen celular tpico de 1>! pL3 de avGFP
correctamente ple$ada de protenas <1=" Por ello es tan intensa la
%Asqueda de mutantes altamente fuorescentes" @uando se o%servan
protenas fuorescentes en un compartimento dado de la c/lula) se
requiere menos concentraci&n) ya que es muy $rande el contraste
con el resto de la c/lula no marcado"
#l uso m0s e4tendido de las PF es como protenas marcadoras
fusionadas a otra" #n estos casos) se de%e veri8car que la fusi&n no
afecte el ple$amiento" Edem0s) como am%os e4tremos terminales
est0n muy pr&4imos) se han hecho estudios para fusionar la protena
que se quiere estudiar en loo+s o dominios e4ternos) no crticos para
la fuorescencia"
Protenas fuorescentes como indicadores activos
La cora(a r$ida con que prote$e la estructura terciaria al
crom&foro) le permite fuorescer y lo prote$e del foto%lanquemiento)
pero di8culta ser sensi%le al am%iente" Sin em%ar$o Haups ha
demostrado que un $rupo hidro4ilo de la Dyr apunta hacia la
super8cie del %arril y forma un puente de hidr&$eno con una
mol/cula de a$ua del solvente) una se$unda mol/cula de a$ua en la
super8cie de la protena u%icada a 2"1 H de la anterior) podra
comunicar por rearre$los din0micos de alrededor de 1 H al MH de la
> 12 >
Castroagudn, V.L. Protenas Fluorescentes Verdes
Dyr el pH del seno del solvente <1-=" 70s e'emplos como este
quedan por descifran para comprender como a pesar de su r$ida
estructura estas protenas son tan %uenos %iosensores" 7uchas
mutantes que pueden ser indicadores de los cam%ios am%ientales) se
han lo$rado en los Altimos a6os) no s&lo alteradas para 9medir: el
pH) sino tam%i/n con sitios de fosforilaci&n) donde se incorporan
fosfatos s&lo en condiciones de8nidas" Mtro e'emplo es una avGFP
fusionada a la protena Sha;er del canal de potasio) que constituye el
primer sensor &ptico del potencial de mem%rana $en/ticamente
codi8cado" Pero la manera m0s $eneral de hacer un sensor
%ioqumico con una protena fuorescente es e4plotar la capacidad de
transferir la ener$a de resonancia de la fuorescencia 1en in$l/s FK#D
Fluorescence Resonance *nerg( 7ransfer3) entre dos protenas de
diferente color" FK#D es un fen&meno mec0nico cu0ntico que ocurre
cuando dos fuor&foros estas pr&4imos 1X1-- H de distancia3 y el
espectro de emisi&n de uno) el dador) se superpone con el de
e4citaci&n del se$undo) el aceptor" Sa'o estas condiciones) la
e4citaci&n del dador produce la emisi&n del receptor a e4pensas del
pasa'e de ener$a" @ualquier se6al %ioqumica que cam%ie la distancia
entre los fuor&foros o su orientaci&n de sus dipolos en el espacio)
modular0 la e8ciencia de FK#D"
Los cam%ios en la emisi&n de la relaci&n aceptorPdador) son
ideales para o%tener im0$enes celulares y utili(ar citometra de fu'o)
porque las dos emisiones pueden o%tenerse simult0neamente y sus
ra(ones cancelan las variaciones dadas por la concentraci&n de
protenas) $rosor de la c/lula) fuorescencia de medio) haciendo
a%soluta la e8ciencia de detecci&n" #ste mismo m/todo ha sido
empleado en el estudio de la dimeri(aci&n de los factores de
transcripci&n) fusionando SFP y GFP a cada uno de los factores) las
protenas fuorescentes ser0n capaces de dar FK#D cuando las
protenas que las acompa6en interactAen"
Si unimos protenas fuorescentes por un corto p/ptido que
conten$a la secuencia de restricci&n de una proteasa) los cam%ios en
FK#D pueden utili(arse para se$uir el funcionamiento de esta en(imaB
pues FK#D se interrumpir0 cuando am%as protenas sean separadas
por prote&lisis"
@on avGFP se han fa%ricado los primeros indicadores
din0micamente sensi%lesB en 199+ dos $rupos por separado) han
unido dos protenas fuorescentes) por un p/ptido de ! amino0cidos
conteniendo un dominio de uni&n a @a
YY
de la calmodulina" #ste
espaciador da%a lu$ar al desarrollo de FK#D de SFP a GFP) porque es
lo su8cientemente lar$o y fe4i%le para permitir que las protenas se
dimeri(aran" Pero cuando una @a
YY
) o sea cuando este esta%a
presente en el medio) cam%ia%a su conformaci&n e interrumpa la
FK#D" #ste sensor tiene innumera%les aplicaciones en el estudio del
te'ido muscular y en neuro%iolo$a" Para ahondar en el tema
consultar la referencia <1="
> 1, >
Castroagudn, V.L. Protenas Fluorescentes Verdes
La t/cnica de FK#D) en resumen) presenta las si$uientes
venta'asC
0. Dra%a'ar in vitro y con c/lulas vivas de mamferos) no s&lo
levaduras"
1. Kesponder din0micamente a las modi8caciones postraduccionales"
2. Elta resoluci&n temporal 1milise$undos3 y espacial 1su%micrones3"
3. La interacci&n con otras protenas puede darse en cualquier lu$ar
de la c/lula) no necesitan ser enviadas al nAcleo"
9. #l $rado de disociaci&n puede ser cuanti8cada) si el -O y el 1--O
de uni&n pueden ser determinados in situ"
:. La e8ciencia de FK#D al 1--O de comple'aci&n aporta informaci&n
estructural.
G ciertas desventa'asC
1" 5e%en e4presarse protenas de fusi&n) donde am%as partes de%en
permanecer funcionales"
!" Si las PFs est0n muy distantes unas de otras 1a Z .- EQ3 o mal
orientadas) FK#D fallar0"
?" Lncluso sin asociaciones) la superposici&n de espectros contri%uye
aporta al$o de se6al en los de FK#D"
2" Se necesitan controles positivos y ne$ativos"
," La homodimeri(aci&n es m0s difcil de monitorear que la
heterodimeri(aci&n"
> 1 >
Castroagudn, V.L. Protenas Fluorescentes Verdes
*na Vueva t/cnicaC Sistema de #4citaci&n por 5os Fotones
*na de las t/cnicas nuevas m0s promisorias en microscopa de
fuorescencia de alta resoluci&n es la e4citaci&n por dos fotones" #n
esta t/cnica dos fotones infrarro'os $olpean un fuor&foro con una
diferencia de fentose$undos) y la suma de sus ener$as simula un
solo fot&n de lon$itudes de onda medio) o sea del *V al a(ul" #sta
coincidencia requiere fu'os e4tremadamente $randes y por ello
ocurre solamente en un $rado si$ni8cativo en el foco de un
microscopio de $ran apertura num/rica iluminado por un pulso de
l0ser" 5ado que otras re$iones de la muestra) las que no est0n en los
planos del foco) no son e8cientemente e4citadas) no emiten
fuorescencia y no est0n sometidas a fotoblec#ing o da6os por la lu("
Las avGFP salva'e) @lase V y @lase VL son %uenos fuor&foros para esta
t/cnica" La protena salva'e presenta condiciones &ptimas al ser
vivamente e4citadas con pulsos de +-- I .-- nm) los cuales son los
ran$os &ptimos de funcionamiento de los l0seres comerciales de
titanio>(a8ro"
> 1+ >