Universidad de las Amricas

Facultad de Educacin
Laboratorio de Biologa Molecular CBI515
ro!esor" Luciana #liveira
$%ABA&# %'C$IC# () 5"
Bacterias
Fluorescentes
Autores"
Mar!ull* +iannina

,alen-uela* +abriela
./011.
I($%#2UCCI3(
(uestra ca4acidad 4ara revelar los detalles m5s n6mos de la biologa
celular 7a aumentado considerablemente gracias al descubrimiento 8
avance de diversas tcnicas de visuali-acin9 Entre ellas destaca el uso
de las 4rotenas :uorescentes9
La 4roteina verde :uorecente !ue identi6cada en la medusa Aequorea
victoria. El gen de esta 4roteina !ue recientemente clonado9 La
con!ormcion tridimencional de la 4roteina es unica 8 cuando es e;4uesta
a la lu- ultravioleta su!re resonancia 8 libera energia en !orma de lu-
verde visible9 <Claudia =egal* manual de 4racticas biologicas molecular>9
La trans!oramcion genetica* es un metodo* ?ue aun?ue 4robablemente
no ocurra en la naturale-a* es interesante 4or?ue demuestra ?ue las
estructuras 8 6siologia del estado de com4etencia ni son im4recindibles
ni son las o4timas 4ara la trans!ormacion mediante 4lasmidos* 8* en
4arte incluso les resultan 4er@udiciales9 Ademas* 8 aun?ue se e;i@an casi
10
1
4lasmidos 4or trans!ormantes* las altas !recuencias de
trans!ormacion <A0B> 4ermiten el estudio de 4lasmidos cri4ticos 8
!acilitan la utili-acion de 4lasmidos ?uimericos <com4uesto 4or 2(A
4rocedente de distintas es4ecies>9 Cui-as la caracteristicas mas
im4ortantes de este metodo sea la de conseguir trans!ormacion
genetica en organismos en los ?ue no se consigue inducir el estado de
com4etencia <Es la ca4acidad de tomar 2(A del ambiente>9 En este
caso* 4or e@em4lo* de Saccharomyces cerevisiae 8 Streptomyces
coelicolor, ?ue ademas !ueron los 4rimeros organismo en los ?ue se
obtuvo trans!ormacion de 4roto4lastos en 4resencia de E+
<olietilenglicol>9
Los 4lasmidios son moleculas circulares de A2( de doble cadena ?ue se
encuentran naturalmente en varias es4ecies de bacterias9 Estos
elementos geneticos son e;tracromosomales* se re4lican de manera
inde4endiente del cromosoma bacteriano 8 codi6can 4ara una gran
variedad de en-imas ?ue con6eren resistencia a antibioticos 8 metales
4esados* degradan com4le@os organicos 8Do 4roducen to;inas* etc9
2adas estas caracteristicas* los 4lasmidos 7an sido em4leados como
vectores o ve7iculos de clonacion de moleculas de A2( !oreaneas ?ue
4ermiten el trans4orte 8 mani4ulacion del mismo9 Es asi como* 7o8 en
dia* se dis4one de una gran variedad de 4lasmidios sinteticos de
naturale-a modular con caracteristicas diversas 4ara lograr 8a sea la
clonacion de un !ragmento de A2( genomico* de cA2( o de C%* o 4ara
la e;4resion de los mismos 8 obtencion del res4ectivo 4roducto 4roteico9
Entre las 4ro4iedades de los 4lasmidios ?ue !avorecen su utili-acion
como vector de clonacion se inclu8en"
=u 4e?ueEo tamaEo ?ue 7ace ?ue el A2( sea !acil de aislar 8
mani4ular*
=u naturale-a circular ?ue 7ace ?ue el A2( sea mas estable
durante la e;traccion9
=u origen de re4licacion inde4endiente del control directo de la
re4licacion del cromosoma bacteriano9
=us multi4les numeros de co4ias de manera ?ue aumenta la
e6ciencia de la e;traccion del A2( 4lasmidico9
LA 4resencia de marcadores seleccionables* tales como genes de
resistencia a antibioticos* 7aciendo asi mas !acil la deteccion 8
seleccin de las bacterias ?ue contienen 4lasmidios9
La estructura modular de todo 4lasmidio com4rende basicamente"
19 Un origen de re4licacion autonomo ?ue 4ermita un alto numero de
co4ias 4or bacterias9
/9 +enes de resistencia a antibioticos9
F9 Marcadores de seleccin9
19 Un sitio multi4le de clonacion* caracteri-ad 4or la 4resencia de
sitios unicos 4or en-imas de restriccion* no encontrados en
ninguna otra region del 4lasmido9

#b@etivos"
19. #btener un cultivo :uorescente utili-ando +F
/9. Com4robar la utili-acion de 4lasmidos 4ara incor4orar A2( !oraneo9
Materiales y Mtodos
Materiales en tu estacin de trabajo:
G asas de inoculacin
1 4i4etas de trans!erencia
1 tubo con medio LB
/ tubos con solucin de
trans!ormacin
Linterna U,
+radilla de es4on@a
1 4lacas con medio de cultivo
Basurero
Contenedor con 7ielo
Materiales generales a cargo del profesor:
laca con Escherichia coli
2(A 4lasmidial
MasHing ta4e
BaEo termost5tico
Incubador
Metodos"
Actividades DA 1
19 Preparacin de clulas competentes. Los tubos rotulados
como P!A"M#D#$ 8 %P!A"M#D#$ contienen solucin de
trans!ormacin9 Utili-ando un asa estril toma una colonia de
Escherichia coli de la 4laca ?ue te dar5 el 4ro!esor9 $oma el tubo
rotulado con %P!A"M#D#$ 8 sumerge el asa con bacterias
com4letamente en la solucin de
trans!ormacin9 Luego* agita girando el asa entre tus dedos ndice
8 4ulgar 7asta ?ue la sus4ensin se vuelva 7omognea9 2esec7a
el asa en el basurero 8 cierra el tubo9 Con una nueva asa 8 re4ite
el 4rocedimiento 4ara el tubo rotulado como P!A"M#D#$9 Este
tubo corres4onde a un e&perimento control* donde las bacterias
ser5n sometidas a todo el tratamiento 4ero en ausencia de
4lasmidio* con el 4ro4sito de com4robar ?ue los resultados
6nales son atribuibles a la trans!ormacin con el 4lasmidio9

/9 =umerge una nueva asa estril dentro de la solucin ?ue contiene
el 4lasmidio ?ue te dar5 el 4ro!esor9 AegIrate de ?ue se !orma una
4elcula de l?uido en el ori6cio del asa9 Introduce el asa en el tubo
con bacterias rotulado como %P!A"M#D#$9 2esec7a el asa en el
basurero9 Cierra el tubo 8 no
agregues 2(A 4lasmidial
al tubo
P!A"M#D#$9
F9 Coloca los tubos en la gradilla de es4on@a e incIbalos en 7ielo 4or
10 minutos9 AsegIrate de ?ue los
tubos estn en contacto con el 7ielo
4ara una adecuada trans!erencia de
calor9
19 E;amina la solucin de A2( 4lasmidial ?ue contiene el gen de la
4rotena :uorescente verde ilumin5ndola con la linterna de lu- U,9
JCu es4eraras observarK
59 "'oc( trmico. Utili-a la gradilla de es4on@a como so4orte 4ara
trans!erir ambos tubos al baEo de agua <a 1/LC>* 4or 50
segundos9 AsegIrate ?ue ?ueden en contacto con el baEo9 Una
ve- cum4lidos los 50 segundos* vuelve a 4oner los tubos en 7ielo
e incuba 4or / minutos9 !a transferencia entre 'ielo)ba*o y
)
P!A"M#D#
AD+
P!A"M#DA!
%P!A"M#D
#$
)
P!A"M#D#
%
P!A"M#D#
E.COLI
,-1.1
ba*o)'ielo debe reali/arse r0pidamente para obtener
mejores resultados de transformacin
M9 1tapa de recuperacin. =aca la gradilla con los tubos del 7ielo 8
d@ala en el mesn9 Abre el tubo rotulado NLA=MI2I# 8 utili-ando
una 4i4eta de trans!erencia agrgale /50 OL de caldo LB9 Cierra el
tubo 8 re4ite el 4rocedimiento con el tubo PLA=MI2I# 8 usando
una nueva 4i4eta de trans!erencia9 2esec7a las 4i4etas en el
basurero9 Incuba durante 10 minutos a tem4eratura ambiente9
(ota" tambin 4uedes
mantener los tubos en
tus manos 4ara ?ue la
tem4eratura de
recu4eracin sea m5s
adecuada9
G9 "eleccin de transformantes. 2istribu8e las 4lacas de etri con
medio de cultivo en el mesn sin abrirlas9 Las 4lacas contienen lo
siguiente"
LB <Luria Brot7>" medio de cultivo ?ue 4rovee los nutrientes 4ara el
crecimiento bacteriano9
Am4" antibitico am4icilina* in7ibidor del crecimiento bacteriano9
Ara" arabinosa* a-Icar inductor de la e;4resin de gfp.
)
P!A"M#D
M1D#$
!-
%
P!A"M#D#
,#1!$ ) 1. min 2345 ) 6. seg ,#1!$ ) 3
min
A9 +ol4ea suavemente los tubos con tus dedos 4ara me-clar la
solucin9 Utili-ando una 4i4eta de trans!erencia 4ara el tubo
%P!A"M#D#$ 8 otra 4ara el )P!A"M#D#$* toma 100 OL de las
soluciones de los e;4erimentos Qde trans!ormacinR 8 QcontrolR 8
trans6relas a las 4lacas a4ro4iadas como indica la 6gura9
2esec7a las
4i4etas en
el basurero9
S9 Usando un asa 4ara cada 4laca* es4arce las sus4ensiones 4or todo
el agar* movindola r54idamente de ida 8 vuelta a lo largo de toda
la su4er6cie9 2esec7a las asas en el basurero9 (# %E=I#(E=
MUCT# EL A+A%* UE= UE2E %#ME%=E9 (o mantengas las
4lacas abiertas m5s tiem4o del necesario 4or?ue 4odran
contaminarse9
)
P!A"M#D
)
P!A"M#D#
%
P!A"M#D
%P!A"M#
D$
17P18#M1+9$
5$+98$!
17P18#M1+9$ D1
98A+":$8MA5#$+
109 A4ila tus 4lacas 8 !@alas con masHing ta4e9 Escribe el
nombre de tu gru4o 8 luego llvalas a la estu!a incubadora a FG)C
donde deben 4ermanecer 7asta el da siguiente9 2urante la
incubacin el agar debe estar 7acia arriba* como se indica en la
6gura9
8esultados
Al 7acer el analisis de los resultados* no contamos con el video 4ara 4oder
anali-ar en 4ro!undidad lo ?ue ocurrio con nuestras muestras9 Los calculos de
e6ciencia no son !actibles de calcular debiso a ?ue !altan datos 4ara 4oder
reali-arlos de !orma e;acta9
Los resultados obtenidos 4or nuestro gru4o !ueron los siguientes"
laca con lBD.4lasmidio U muc7a bacterias
laca con lB Dam4D.4las U nada de bacterias
laca LBDam4D4las P U toda la 4laca llena *4resencia de muc7as
colonias <buena e6ciencia>
laca LBDam4DaraD4las P U menos cantidad de colonias
Con estos resultados 4odemos a4reciar ?ue e;istio un crecimiento bacteriano
con el antibiotico ingresado en el cultivo 8 se llevo a cabo la trans!ormacion
?ue deseabamos9 =i bien no e;istio un gran crecimiento bacteriano* esto 4uede
deberse a ?ue la muestra tomada no contenia muc7as bacterias* o bien no
todas ad?uirieron la modi6cacion ?ue se re?ueria9
Discusin
El ?ue la 4laca ?ue contenia LBDam4DaraD4las P no tuviera una me@or
e6ciencia* se 4uede 7aber ocurrido un 4roblema de me-cla de solucion o bien
no todas las bacterias ?ue !ueron sacadas* lograron la trans!ormacion genetica
deseada* 4or ese motivo no e;iste una ma8or cantidad de bacterias 4ara
observacion9
5onclusin
En biologa molecular* trans!ormacin es la alteracin gentica de una
bacteria resultante de la absorcin directa* incor4oracin 8 e;4resin del
material gentico e;geno <A2( e;geno>9 El A2( e;geno se encuentra
en el ambiente 8 se introduce a travs de la membrana de la clula
bacteriana9 La trans!ormacin ocurre de !orma natural en algunas
es4ecies de bacterias* aun?ue tambin se 4uede e!ectuar 4or medios
arti6ciales9 ara ?ue ocurra la trans!ormacin* la bacteria debe estar en
un estado de com4etencia* lo ?ue 4uede ocurrir como una res4uesta
limitada en el tiem4o a las condiciones ambientales* tales como la !alta
de nutrientes 8 una densidad celular elevada9 La trans!ormacin es uno
de los tres 4rocesos 4or los ?ue el material gentico e;geno se 4uede
introducir en una clula bacteriana9 Los otros dos son la con@ugacin 8 la
transduccin9 A la trans!ormacin de clulas eucariotas se le llama
trans!eccin9
El trmino trans!ormacin es tambin usado* de manera m5s general*
4ara describir mecanismos de trans!erencia de A2( o A%( en biologa
molecular <es decir* teniendo en cuenta m5s ?ue las consecuencias
genticas>9 or e@em4lo la 4roduccin de transgnicos como ma-
transgnico re?uiere la insercin de nueva in!ormacin gentica en el
genoma del ma- usando el mecanismo a4ro4iado de trans!erencia de
A2(V al 4roceso se le llama comInmente trans!ormacin9
El A%( tambin 4uede ser trans!erido en las clulas usando mtodos
similares* 4ero esto no 4rovoca normalmente cambios 7eredables 8 4or
lo tanto no es una trans!ormacin real.
Mecanismos
La trans!ormacin se re6ere a un cambio gentico estable 4roducido al
incor4orar A2( desnudo <A2( sin clulas o 4rotenas asociadas> al
genoma* 8 la com4etencia re6ere al estado de ser ca4a- de incor4orar
A2( e;geno del ambiente9 2os !ormas distintas de com4etencia deben
ser distinguidas" natural 8 arti6cial9
5ompetencia +atural
Algunas bacterias son ca4aces de incor4orar de manera natural* A2(
ba@o condiciones de laboratorioV 8 muc7as m5s 4ueden ser
ca4aces de 7acerlo en sus ambientes naturales9 Estas es4ecies
traen un con@unto de ma?uinaria gentica es4ec6ca 4ara llevar
el A2( a travs de la membrana o membranas9
5ompetencia arti;cial
La com4etencia arti6cial no est5 codi6cada en los genes celulares9 =ino
?ue es inducida 4or 4rocedimientos en el laboratorio* en donde las
clulas son convertidas en 4ermeables de !orma 4asiva* a travs de
condiciones ?ue normalmente no ocurren en la naturale-a9
/
Las clulas en!radas en 4resencia de cationes divalente como Ca
/P
<en
CaCl
/
> 4re4ara las membranas celulares 4ara ser 4ermeables al A2(
4lasmidial9 Las clulas son incubadas en 7ielo con el A2( 8 luego darles
brevemente un s7ocH trmico <e@" 1/ )C 4or F0.1/0 segundos>* lo ?ue
causa ?ue el A2( entre en la clula9 Wste mtodo !unciona mu8 bien en
A2( 4lasmidial circular9 Una e;celente 4re4aracin de clulas
com4etentes entrega X10
A
colonias 4or microgramo de 4lasmidio9 Una
4obre 4re4aracin entrega a4ro;imadamente 10
1
DOg o menos9 Buenas
4re4araciones no.comerciales debiesen arro@ar 10
5
a 10
M
trans!ormantes
4or microgramo de 4lasmidio9
Este mtodo no !unciona mu8 bien con molculas lineares* como
!ragmentos de A2( cromosomal* 4robablemente 4or?ue las en-imas
e;onucleasas en la clula r54idamente degradan el 2(A lineal9 Las
clulas naturalmente com4etentes son generalmente trans!ormadas de
manera m5s e6ciente con A2( linear ?ue con 4lasmidios9
La Electro4oracin es otra manera de crear agu@eros en clulas
bacterianas <8 otros ti4os tambin>* mediante gol4es de electricidad en
un cam4o elctrico de 10./0H,Dcm9 El A2( 4lasmidial 4uede entrar en la
clula a travs de sos agu@eros9 =e aconse@a usar ste mtodo con A2(
4lasmidial de gran tamaEo9
F
Los mecanismos de re4aracin de
membrana* cerrar5 r54idamente estos agu@eros des4us del s7ocH9
Transformacin de plasmidio
ara ser mantenido de manera estable 4or la clula* el A2( 4lasmidial
debe contener un origen de replicacin* ?ue 4ermitir5 la re4licacin
en la clula* inde4endientemente del cromosoma9 2ebido a ?ue la
trans!ormacin usualmente 4roduce una me-cla de inusuales
trans!ormaciones 8 abundantes clulas no.trans!ormadas* se necesita de
un mtodo 4ara identi6car las clulas ?ue 7an ad?uirido el 4lasmidio9
Los 4lasmidios utili-ados en este ti4o de e;4erimentos* contienen
usualmente un gen ?ue les otorgue resistencia a un antibitico9 La ce4a
bacteriana a trans!ormar* debe ser sensible a ste9
Las clulas ca4aces de crecer en un medio de cultivo con este
antibitico* ser5n las ?ue 7an sido trans!ormadas 4or el 4l5smido* 8 las
clulas ?ue no 4uedan crecer carecer5n de ste9
#tro marcador* usado 4ara identi6car bacterias E. coli ?ue 7an ad?uirido
4l5smidios recombinantes* es el gen lacZ* ?ue codi6ca 4ara Y.
galactosidasa9 2ebido a ?ue la Y.galactosidasa es un 7omotetr5mero* en
?ue cada monmero esta 7ec7o de una 4rotena lacZ- 8 lacZ-* si solo
una de estas 4rotenas se e;4resa en la clula resultante* no se !ormar5
la en-ima !uncional9 2e esta manera* si una ce4a de E. coli ?ue ni tenga
el gen lacZ- en su genoma* es trans!ormado usando un 4lasmidio ?ue
contiene el gen !altante* las clulas 4roducir5n Y.galactosidasa* mientras
?ue las no.trans!ormadas no lo 7ar5n9
En ste ti4o de trans!ormacin* la regin ?ue contiene el sitio mIlti4le
de clonamiento* o sitio polylin(er* reside en el !ragmento del gen lacZ-
* lo ?ue signi6ca ?ue los 4lasmidios recombinantes tendr5n el gen
deseado insertado en alguna 4arte dentro de lacZ-9 Cuando este
!ragmento gentico interrum4ido sea e;4resado 4or la E. coli* no se
4roducir5 una 4rotena lacZ- utili-able* 4or lo ?ue no se !ormar5 Y.
galactosidasa utili-able9 Cuando es crecida en un medio ?ue contiene la
galactosa modi6cada Z.gal* las colonias ?ue son ca4aces de metaboli-ar
el sustrato <8 4or lo tanto* 7an sido trans!ormadas* 4ero no 4or
4lasmidios recombinantes> a4arecer5n en color a-ulV las colonias ?ue no
4uedan metaboli-ar el sustrato <8 4or ende no 7an sido trans!ormadas
4or 4l5smidios recombinantes> a4arecer5n de color blanco9
En este laboratorio en 4articular se incor4oro el gen +F a un 4lasmidio
el cual en las condiciones adecuadas !ue ca4a- de incor4orar este gen a
su estructura molecular* 4udiendo de esta !orma e;4resarlo 8 re4licarlo
7acia otra 4rogenie9
-ibliograf<a
1. Claudia Andrea Segal ischine!"#$ % &''(. Manual de
)racticas Biologia Molecular de la Celula L *ni!ersidad
+acional Autnoma de M,-ico. Facultad de Ciencias%
p.ginas /&/.
2. Alfonso 0imene" sanche"% 1e!erte% /23&% 4en,tica
molecular 5acteriana% pagina 66(.
3. Concepcin 7. )uerta B. $ Claudia ). *re8a ). )r.cticas de
5iolog9a molecular% onti6cia Universidad &averiana* /005 . 100
45ginas