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Lezione 3: continuazione su

AMINOACIDI E POLIPEPTIDI
Per introdurre i polipeptidi e poi le proteine, bisogna dire qualcosa sulle propriet generali di
ionizzazione degli amminoacidi.
Propriet generali di ionizzazione degli amminoacidi

H H+ H H+ H
H3N+ --- C --- COO H3N+ --- C --- COO H3N+ --- C --- COO
R pK aC R pKaN R

Ricordatevi che la catena principale degli amminoacidi ha due ionizzazioni possibili:
-una del gruppo carbossilico legato al carbonio il gruppo carbossilico legato al carbonio pu
ionizzare a carbossilato (RCOO ), con un suo pK acido. Ricordate il pK dellacido acetico? 4.7.
Ora, nel caso di un gruppo carbossilico legato al carbonio , succede che leffetto induttivo
esercitato dal gruppo amminico cambia drasticamente lacidit del carbossile, tanto vero che la
catena principale dellamminoacido ha un pK acido tra 2 e 2.5: questo perch tale carbonio legato
al carbonio , che legato ad un gruppo carico positivamente, che quindi attrae su di s tutti gli
elettroni, anche attraverso latomo di carbonio del carbonile, e rende pi facile la ionizzazione del
protone.
-una del gruppo amminico legato al carbonio anche lazoto amminico legato al carbonio ha
una sua ionizzazione: lazoto amminico, ibridizzato sp3, con doppietto elettronico, accetta
facilmente un protone e diventa uno ione ammonio quaternario (NH4+); questo succede con un
pK variabile, ora vedremo, tra 7 e 8.

Naturalmente, poi, alla ionizzazione degli amminoacidi contribuisce la catena laterale; di catene
laterali ne abbiamo viste tante. Nellimmagine vediamo un esempio di catena laterale acida.


H pKaC H pKaR H pKaN H
H3N+ -- C -- COOH H3N+ -- C -- COO H3N+ -- C COO H3N+ -- C-- COO
CH2 2.1 CH2 3.9 CH2 9.8 CH2
COOH COOH COOH COOH


Che amminoacido quello nella figura?
Basti pensare che gli amminoacidi acidi sono due: lacido aspartico e lacido glutammico. Lacido
aspartico pi corto, ha un solo metilene legato al carbonio , quindi come se fosse un acido
acetico legato al carbonio .
Si tratta dellacido aspartico.
Ovviamente, quindi, anche questo gruppo carbossilico ha una sua ionizzazione. Quello che succede
nel caso dellaspartato e del glutammato, che NON sono legati al carbonio e NON risentono
delleffetto induttivo, che essi avranno un pK di ionizzazione simile a quello dellacido acetico:
tra 4.5 e 5. Quindi, attenzione!
Le ionizzazioni del gruppo amminico e carbossilico intorno al carbonio hanno
valori unici, diversi, perch risentono delleffetto induttivo; le ionizzazioni delle
catene laterali, invece, sono rappresentate dai valori tipici della ionizzazione del
gruppo chimico in esame, perch qui non c pi leffetto induttivo.

Quindi vedete: il pK acido del carbossile qui addirittura 2.1; dopodich, la ionizzazione del
carbossile situato a livello della catena laterale dellaspartato intorno a 3.9 (insomma, si avvicina a
quella dellacido acetico). La ionizzazione del gruppo amminico addirittura 9.8. Vedremo, poi,
che nei polipeptidi pi grandi, il pK di ionizzazione del gruppo amminico si abbassa.

Il valore medio del pKa di un gruppo -carbossilico di un amminoacido protonato 2.19.
Quindi, questo gruppo acido risulta notevolmente pi forte dellacido acetico (pKa 4,76).
Questa maggiore acidit dovuta alleffetto induttivo elettron-attrattore del gruppo adiacente -NH
3
+
.
Per lo stesso motivo, anche i gruppi carbossilici in catena laterale dellacido aspartico e dellacido glutammico
protonati risultano essere pi forti dellacido acetico.
Tuttavia, leffetto induttivo diminuisce con laumentare della distanza del COOH dal gruppo ammonio

Ricapitolando, un amminoacido come lacido aspartico ha 3 ionizzazioni diverse:
-una per il gruppo amminico;
-una per il gruppo carbossilico;
-una per la catena laterale
3 ionizzazioni diverse danno origine a 4 composti.
Notate che tra tutti i 4 composti dellaspartato non ce n neanche uno che sia neutro: cio, se voi
mi scrivete una formula con (NH2-COOH-COOH), non esiste, sbagliata!
Tutte le ionizzazioni degli amminoacidi sono concetti importanti per spiegare poi la chimica delle
proteine e la catalisi.

Che vuol dire pKa?
pKa il log della costante acida di dissociazione;
la costante acida di dissociazione si esprime come rapporto tra concentrazione dei prodotti e
concentrazione allequilibrio dellacido indissociato:
[anione] [protoni]
[acido indissociato] allequilibrio

Quindi vi deve essere molto chiaro che i pK di ionizzazione del carbossile e dellamminico legati al
carbonio sono unici: uno intorno a 2-2.5, laltro tra 8 e 10, perch il carbonio mette in
comunicazione questi due gruppi chimici e c un forte effetto induttivo.





ACIDO BASE + H+

Non bisogna imparare a memoria i pK di tutte le catene laterali, per fondamentalmente ce ne sono
solo 6 da ricordare:
-laspartato ha un pK intorno a 4;
-il glutammato un pK che si avvicina ancora di pi a quello dellacido acetico, intorno a 4.4;

ACIDO ASPARTICO/GLUTAMMICO:
COOH COO + H+ pKa= 4.0 4.4




quelli importantissimi sono:
-listidina: nellistidina c un gruppo imidazolo: limidazolo pu accettare un protone e cederlo; il
punto che il pK intorno a 6, quindi il pK pi vicino al valore fisiologico: listidina importante
proprio per questa sua propriet di riuscire a trasferire rapidamente protoni, quindi la ionizzazione
dellistidina scrivetela correttamente:



CH2 CH2
+ H+ pKa= 6.0
HN+ NH N NH

lanello imidazolico va fatto come in figura;

-la cisteina pu ionizzare:
-SH S + H+ pKa= 8.5
Abbiamo visto le differenze tra le ionizzazioni degli alcoli e dei tioli, cio passare da alcol a ione
alcossido O , in solvente acquoso quasi impossibile, cio non si riesce neanche a definire un
valore di pK. Per fare lo ione alcossido ci vuole soda 2-3molare, cio molto concentrata per tirar via
il protone allalcol; quindi, in condizioni fisiologiche, gli alcoli non rilasciano mai protoni (tranne la
categoria dei fenoli). Invece i tioli rilasciano facilmente il protone: il pK intorno a 8.5. Ricordate
le propriet della catena laterale della cisteina? Non c solo la ionizzazione, ma anche unaltra
propriet, ovvero la cisteina pu andare incontro a reazione redox: 2 tioli danno un ponte disolfuro+
2 protoni + 2 elettroni;

-la tirosina: propriet dei fenoli, quindi possibile ionizzazione, per con un pK intorno a 10; quindi,
in condizioni fisiologiche, le tirosine saranno sempre protonate;


OH O + H+ pKa= 10.0
-la lisina molto importante: una carica positiva a pH fisiologico, quindi si presenta come ione
ammonio quaternario. Il pK si ionizzazione anche qui intorno a 10. La catena laterale della lisina,
quindi, praticamente sempre protonata;
-NH3+ NH2 + H+ pKa=10

-larginina: possiede un gruppo guanidinico e ha un pK addirittura intorno a 12, quindi anche
larginina, che lamminoacido pi diffuso nel regno animale, un amminoacido con carica
positiva.
H NH2 H NH
N C N C + H+ pKa= 12.0
NH2 NH2+


Che succede quando iniziamo a costruire una catena polipeptidica?
Il legame peptidico vede un carbonio carbonilico legato allazoto amminico del carbonio ; si ha
formazione di un doppio legame delocalizzato, quindi c impossibilit di rotazione intorno al
legame peptidico.




Il legame peptidico un legame abbastanza forte; nel mondo animale, per fare un legame peptidico,
serve un ribosoma. Importante ricordare, per, che in alcuni batteri esiste una sintesi peptidica non
ribosomiale: questultima molto importante: molti batteri fabbricano antibiotici utilizzando
proprio la sintesi peptidica non ribosomiale; quindi esiste nella realt: un metabolismo complesso
presente nei batteri e che permette la formazione di peptidi anche senza ribosoma.

Una volta formato il legame peptidico, il peptide risultante avr quindi un suo gruppo amminico,
che noi chiamiamo N-terminale, e un gruppo carbossilico, che chiamiamo C-terminale. Quindi,
iniziamo a contare il polipeptide a partire dallN-terminale: lamminoacido 1 quello che possiede
il gruppo amminico libero; lultimo amminoacido quello che possiede il carbossile libero; quindi,
quando andiamo a numerare gli amminoacidi sul polipeptide, il primo avr una carica positiva,
quindi si chiamer N-terminale, lultimo avr una carica negativa e sar il C-terminale.
H H
H3N+ C CO NH C COO + H2O
R1 R2

Insomma, quando andiamo a parlare di peptidi o polipeptidi, che quindi diventano polielettroliti
quasi sempre (perch vari amminoacidi danno contributi diversi di cariche di ionizzazione), non ha
pi molto senso considerare i singoli pK delle singole catene laterali: si utilizza un parametro che si
chiama punto isoelettrico. Il punto isoelettrico, in un dipeptide, semplicemente la somma dei pK
dei gruppi ionizzabili presenti diviso 2:
pI= (pK1 + pK2) / 2

In generale, in un polipeptide, il punto isoelettrico diventa ovviamente una sommatoria pi
complessa, per il punto isoelettrico ha anche unaltra definizione, importantissima e da sapere per
lesame:
il punto isoelettrico quel valore di pH al quale la somma delle cariche positive e negative di un
polipeptide uguale a 0.
Quindi, il punto isoelettrico ci d una misura dellacidit o della basicit di un polipeptide o di una
proteina.
Questo molto importante perch, come vedrete anche in biochimica clinica, le proteine del plasma
si possono separare in base al loro punto isoelettrico. Ad esempio, quando noi diciamo che
lalbumina, la proteina pi abbondante del plasma, ha un punto isoelettrico pari a 4.5, cosa
intendiamo?
Definizione del punto isoelettrico: quel valore di pH, cio 4.5, al quale la somma delle cariche
positive e negative dellalbumina nulla. Quindi, a pH 4.5, lalbumina avr carica netta totale
uguale a 0.
Lalbumina normalmente si trova nel plasma a pH 7.2; se ha un punto isoelettrico di 4.5, a pH 7.2
come sar carica lalbumina? Sar carica negativamente, quindi sar un polianione.
Il punto isoelettrico 4.5 praticamente il pK dellacido acetico, quindi lintera molecola
dellalbumina ha un pK generale, che deriva dalla somma di tutte le cariche presenti sulla
superficie, che uguale a quello dellacido acetico: ne deriva che lalbumina una proteina acida;
acida vuol dire che avr una prevalenza di gruppi acidi sulla superficie, dunque aspartici e
glutammici. Le immunoglobuline, invece, hanno punti isoelettrici basici, sono proteine basiche.
Quindi, il concetto di punto isoelettrico molto importante per tutta lanalitica chimica, in
particolare per la chimica clinica delle proteine, poich fondamentale per separare tra loro le
proteine plasmatiche. Siccome possibile ed relativamente facile separare le proteine in base al
loro punto isoelettrico, questo concetto di punto isoelettrico va tenuto a mente in maniera molto
chiara.
Lemoglobina ha un punto isoelettrico uguale a 7.0. Dato che il pH fisiologico pari a 7.2, come
sar carica lemoglobina? Lemoglobina praticamente neutra, nel senso che la somma delle
cariche positive e negative praticamente nulla, oppure si pu considerare lievemente acida, con
un eccesso di 1 carica negativa su 100 amminoacidi.

Cominciamo a schematizzare un peptide (fondamentalmente sarete chiamati a scrivere dipeptidi per
lesame: dal dipeptide in su si usa il computer).
Dovendo schematizzarlo, voi prima scriverete la sequenza di legami peptidici con la catena laterale,
lasciando liberi i carboni , e poi aggiungete le catene laterali: questo il modo migliore per
scriverli. Ad esempio, chi questo dipeptide? Come lo identifichiamo?
H H
H3N+ - C - CO- NH C - COO
CH CH2
H3C OH
:N
NH
Il primo amminoacido la treonina, il secondo listidina, quindi questo dipeptide sar THR-HIS,
oppure, nel codice a una lettera, sar TH.
Ecco, i codici degli amminoacidi piano piano li impareremo. Il codice a una lettera
particolarmente utile per fare paragoni tra sequenze di amminoacidi, quindi uno la sequenza genica
la traduce in sequenza amminoacidi con il codice a una lettera, e va avanti.
Un esempio di un peptide molto semplice: questo un peptide molto semplice, fisiologico, che si
chiama bradichinina, ed un mediatore dellinfiammazione. Dov e chi lamminoacido 1?

Arg- Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg
Questo peptide inizia e finisce con unarginina (da riconoscere per il suo gruppo guanidinico); ci
sono infatti due gruppi guanidinici.
Come fate a dire qual lN- terminale e qual il C-terminale? Per dire quali sono lN-terminale e il
C-terminale, dovete trovare nella struttura i carboni N- terminale e C-terminale. Qual il
carbonio N- terminale? Sar quello che avr un gruppo amminico libero, non posso sbagliare;
quindi, da qui riconosco la catena laterale dellarginina e lamminoacido numero 1 della
bradichinina. Lamminoacido numero 2 una prolina, numero 3 una prolina, numero 4 una glicina,
numero 5 fenilalanina, poi di nuovo prolina, fenilalanina e cos via, fino a terminare con
unarginina. Voi non sarete mai chiamati a scrivere sul foglio la formula di un polipeptide di questo
tipo, per sarete chiamati a sapere che quella formula un polipeptide, a capire come si orienta
quella molecola, dove sono i legami peptidici, dove sono i carboni , dove sono le catene laterali.
Faremo una serie di esempi e quando passeremo alle proteine vi sar ancora pi evidente. Quindi
questo un tipico polipeptide. Non ancora una proteina perch per avere una proteina ci vogliono
(o almeno, nella vecchia classificazione di volevano) gli elementi di struttura secondaria delle
proteine, che in genere i peptidi non hanno. Strutture secondarie e terziarie le facciamo nella
prossima lezione per voi gi conoscete gli elementi delle strutture secondarie, che sono le -eliche
e i foglietti . Naturalmente, nella classificazione moderna non pi cos ovvia questa distinzione,
poich noto che ci sono anche famiglie importanti di proteine che non presentano alcun elemento
di struttura secondaria: sono proteine scoperte recentemente, ma proprio nel genoma umano, e
quindi sfuggono un po. Allo stesso tempo vengono chiamate proteine perch delle volte hanno
anche 1000 amminoacidi.

Quali sono i 3 fondamentali fattori di interazione tra le catene laterali degli amminoacidi che poi
determinano la struttura tridimensionale del polipeptide?
Le forze che portano alla formazione di un polipeptide, e che quindi tengono insieme le strutture di
amminoacidi e proteine, sono 3:
1) Legame a idrogeno: per avere un legame a idrogeno ci vuole un atomo donatore, che possegga
un idrogeno legato covalentemente, e un atomo accettore, che possegga un doppietto
elettronico. Senza questi elementi, il legame a idrogeno non si fa.




O




Bastano questi elementi? No: serve un protone che venga messo in comune tra latomo
donatore e latomo accettore.
Il legame a idrogeno anche un fenomeno quantistico: il protone si posiziona tra i due
atomi e questinterazione tra protone e doppietto elettronico genera una forza attrattiva che
determina una certa distanza tra donatore e accettore: tale distanza (d) varia tra 2.3 ed
addirittura 3, quindi si verificano grosse variazioni di lunghezza, che dipendono da che
cosa? Dipendono dalle propriet del legame a idrogeno: il legame a idrogeno lunico che
ha delle forti propriet direzionali: lenergia del legame a idrogeno massima quando il
protone giace nellasse che congiunge il nucleo del donatore al nucleo dellaccettore; se il
protone giace esattamente sullasse, il legame a idrogeno un legame forte e avr una
distanza breve di circa 2.3-2.4 . In realt, la distanza di 2.3 nel mondo biologico non si
vede; per intenderci, per, lacido fluoridrico (HF) costituito da un legame a idrogeno con
una distanza di 2.3 tra idrogeno e fluoro. Nel mondo biologico, un legame con distanza di
2.4-2.5 gi un legame molto forte. Se lidrogeno, per, fuori asse, il legame a idrogeno
Donatore
Accettore
diventa pi debole; se lidrogeno arriva a 90, il legame a idrogeno non si forma pi. Quindi,
una propriet importante del legame a idrogeno che ha propriet direzionali: il protone si
deve trovare lungo lasse che congiunge il nucleo del donatore a quello dellaccettore. Le
distanze sono molto variabili e quindi anche le energie del legame a idrogeno sono molto
variabili, perch dipendono:
-dalla forza del donatore e dellaccettore: ci sono forti donatori di legame a idrogeno, come
ad esempio il gruppo fenolico (OH) della tirosina, e deboli donatori di legame a idrogeno,
come il carbonio alifatico (CH alifatico); per quanto riguarda gli accettori, i doppietti
elettronici del gruppo amminico sono forti accettori di legame a idrogeno, i doppietti
elettronici liberi di un gruppo alcolico sono buoni accettori di legame a idrogeno; anche
lossigeno del doppio legame, in un carbonile, un buon accettore di legame a idrogeno,
perch ?



O

C


Il carbonile ha un ossigeno legato con un doppio legame ad un carbonio. Lossigeno del
carbonile possiede 2 doppietti elettronici: lossigeno qui ibridizzato sp2, quindi sar un
accettore di legami a idrogeno con queste specifiche propriet direzionali: il donatore far
un legame a idrogeno preferenziale con lossigeno carbonilico lungo le bisettrici del
triangolo identificato dal piano su cui giace lossigeno sp2. Quindi, tutti questi atomi sono
ottimi accettori di legame a idrogeno.
Le energie variano in funzione di questo: un legame a idrogeno forte pu arrivare
addirittura allenergia di 8-10 Kcal/mole, che quasi quanto un legame covalente debole! I
legami covalenti, infatti, sono compresi tra 10 e 100 Kcal/mole. A 10 Kcal/mole ci sono dei
legami a idrogeno talmente forti che arrivano vicino al valore di un legame covalente
debole. Altres, vi sono legami a idrogeno debolissimi, con energia di 0.1 Kcal/mole.
Quando ce ne sono tanti, per, determinano il ripiegamento della struttura tridimensionale
della proteina.

2) Interazioni elettrostatiche: tra carica positiva e carica negativa. Quali sono le propriet di
uninterazione elettrostatica? Linterazione elettrostatica obbedisce alla legge di Coulomb: La
forza uguale al prodotto delle cariche fratto il quadrato della distanza tra le due cariche, il tutto
mediato da una costante dielettrica del mezzo:



Linterazione elettrostatica ha propriet direzionali? No, sferosimmetrica. Quindi, la
differenza fondamentale dal legame a idrogeno che linterazione elettrostatica NON
direzionale ma sferosimmetrica. Linterazione elettrostatica, quella che si forma nei cristalli
dei sali, intatti, totalmente sferosimmetrica: non ha propriet direzionali. Ci devono essere
una carica positiva e una carica negativa.
Lenergia dellinterazione elettrostatica in genere bassa, ma fortemente dipendente dal
mezzo in cui si trovano: in acqua, le interazioni elettrostatiche valgono poco, al massimo 1
Kcal/mole. Le interazioni elettrostatiche, per, sono altres importanti nel determinare le
interazioni tra amminoacidi, anche se alla fine coinvolgono solo 4 amminoacidi, quali?
-Acido aspartico e Acido glutammico per le cariche negative;
-Lisina e Asparagina per le cariche positive.
Quando combinate questi amminoacidi nelle varie combinazioni possibili, avete fatto tutte le
possibili interazioni elettrostatiche consentite nelle proteine; volendo, potete aggiungere lN-
terminale e il C-terminale.

3) Interazioni idrofobiche: attenzione, non le ho chiamate forze. In realt c una formula per la
forza di uninterazioni idrofobica, che per una formula difficile perch deriva dalle cosiddette
interazioni diplo indotto - diplo indotto; quindi, la forza di attrazione, in queste interazioni,
nasce dalla media (pesata nel tempo) di permanenza del diplo indotto.
Il diplo indotto si forma ad esempio in un sistema aromatico, ma transientemente, perch gli
elettroni non stanno fermi; transientemente, dunque, si generano variazioni di carica: quella la
generazione del cosiddetto diplo indotto diplo indotto. Questa forza di interazione, per,
debolissima, mentre si sa che le interazioni idrofobiche sono molto importanti per tenere
insieme la struttura di una proteina. La forza di uninterazione idrofobica, infatti, varia tra 0.1 e
0.2 Kcal/moli, per uninterazione idrofobica tra due polipeptidi li fa stare insieme, come si
spiega? Qui la termodinamica che parla: chi domina linterazione idrofobica non tanto la
forza di interazione diplo indotto diplo indotto, che proporzionale allentalpia di reazione,
ma c soprattutto un fattore entropico: il fattore entropico deriva dal fatto che tutte queste
catene laterali non hanno alcuna interazione col solvente, cio con lacqua, mentre sia legame a
idrogeno sia i ponti elettrostatici possono avere interazione con lacqua. Quindi, il fatto che le
interazioni idrofobiche non abbiano interazioni con lacqua favorisce linterazione, con le
medesime caratteristiche idrofobiche; cio gli alifatici e gli aromatici stanno bene tra loro in
assenza di acqua allinterno. La non partecipazione dellacqua, quindi, favorisce laggregazione
di questi composti: si tratta di un fenomeno di natura puramente entropica. Dal punto di vista
meccanicistico si pu spiegare anche meglio: consideriamo il benzene; si scioglie il benzene
nellacqua? Anche se vi hanno insegnato che i composti aromatici non si sciolgono in acqua:
questa informazione sbagliata! S, il benzene si scioglie in acqua: arriva addirittura a
concentrazioni di 1 M (1micromolare). Un micromolare, certo, poco, per cui quando i
chimici del passato facevano soluzioni acquose con composti aromatici dicevano che non si
scioglievano; in realt, il benzene si scioglie eccome, tant vero che la contaminazione delle
falde acquifere col benzene e suoi derivati un problema serissimo. Quindi il benzene si
scioglie, certo pochissimo, 10 alla -6 molare, poi trasformatelo in grammi/litro e vi accorgete
che poco, ma nella tossicologia il benzene si dosa eccome! Il problema che il benzene si
scioglie nellacqua in maniera del tutto anomala: non solvatato; il benzene in acqua fa s che le
molecole dellacqua si ordinino secondo legami a idrogeno disposti a formare una cavit
ordinata di molecole dacqua e tale cavit accoglie una molecola di benzene allinterno: cio
non c nessun legame a idrogeno e nessuna interazione tra acqua e benzene, si forma solo una
cavit ordinata di molecole dacqua, che tra loro formano una serie di legami a idrogeno, tali da
formare una cavit; in questa cavit sono contenuti i legami idrofobici. Quindi, dal punto di
vista entropico che succede? Il benzene ha causato un incremento di ordine, cio una
diminuzione di entropia locale, dellacqua. Ripeto: locale, altrimenti violerebbe il secondo
principio della termodinamica. Sistemi come questi cosa fanno? Certo lacqua, per fattori
entropici, tender a spingere il benzene fuori dalla soluzione; che vuol dire spingere via dalla
soluzione in termini meccanicistici? Vuol dire formare cavit sempre pi grandi con tante
molecole di benzene. Quando vi pi di un certo numero di molecole di benzene nella cavit, si
forma una gocciolina di benzene e a quel punto diciamo che il benzene non pi in soluzione
(per fino a 10 alla -6 molare in soluzione eccome). Applicate questo alle proteine e tutto
torna: amminoacidi e proteine sono stabilizzate da interazioni idrofobiche in cui lacqua confina
una serie di catene laterali idrofobiche (aromatiche o alifatiche) in una zona precisa, ristretta, in
maniera da compensare quella diminuzione di entropia che deriva dalla strutturazione
dellacqua intorno ai residui idrofobici.