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Calibracin y verificacin de equipos en el laboratorio de seminologa y embriologa. 1

Primera parte. Aspectos generales, microscopa ptica y cmaras de recuento. 2
3
Recomendacin (2014) 4
5
Sociedad Espaola de Bioqumica Clnica y Patologa Molecular 6
Comit Cientfico 7
Comisin de Seminologa y Tcnicas de Reproduccin Asistida 8
9
J oan de Monserrat Vallv, M. Cristina Snchez Pozo, J os Manuel Moreno Cebeira, Mara Gemma Serrano 10
Olmedo, J os Antonio Castilla Alcal. 11
12
JMMoreno@fhalcorcon.es 13
14
INDICE 15
1. INTRODUCCIN 16
2. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIN 17
3. TIPOS DE EQUIPOS 18
4. PROCESO DE CALIBRACIN 19
5. PROCESO DE VERIFICACIN 20
6. PERIODICIDAD DE PROCESOS DE CALIBRACIN/VERIFICACIN 21
7. REQUISITOS DE REGISTROS DE CALIBRACIN/VERIFICACIN DE EQUIPOS 22
8. PROCEDIMIENTO DE CALIBRACIN/VERIFICACIN 23
9. BIBLIOGRAFA 24
1. INTRODUCCIN 25
Los resultados que proporciona el laboratorio clnico deben ser exactos para que permitan una interpretacin 26
clnica correcta (1). 27
La validez de los resultados de medida depende en gran parte del proceso de calibracin y/o verificacin de los 28
equipos. 29
El laboratorio debe documentar e implementar un programa para calibracin y/o verificacin de los equipos 30
cuando stos tengan una influencia directa en los resultados de los ensayos. 31
Segn las normas para la gestin de la calidad ISO 15189:2007 (2) e ISO 9001:2008 (3), los laboratorios 32
clnicos deben comprobar la veracidad de sus resultados y asegurar que son trazables a referencias 33
establecidas. 34

2
En la Norma ISO 9001:2008, el requisito 7.6 (Control de los equipos de seguimiento y de medicin) sugiere 35
tener en cuenta aspectos como: la trazabilidad de los patrones utilizados para la calibracin; la identificacin 36
inequvoca de los equipos de medicin; su integridad; la proteccin contra ajustes innecesarios o no autorizados 37
por un responsable, daos, mala manipulacin; los intervalos de recalibracin; la incertidumbre de las 38
mediciones; el anlisis de los resultados que aparecen en los certificados de calibracin y; las condiciones de 39
uso y conservacin de los equipos (4). 40
En la Norma ISO 15189:2007, el requisito 5.6 (Aseguramiento de la calidad de los procedimientos analticos), 41
apartado 5.6.3, indica que debe disearse y llevarse a cabo un programa de calibracin de sistemas de 42
medicin y de verificacin de la veracidad, para asegurar que los resultados sean trazables al Sistema 43
Internacional de Unidades (S.I.) o por referencia a una constante natural u otra referencia indicada. Cuando esto 44
no sea posible o pertinente, deben aplicarse otros medios para proporcionar confianza en los resultados. 45
Desde la Comisin de Seminologa y Reproduccin asistida se ha decidido iniciar una serie de documentos que 46
faciliten a los usuarios el mantenimiento correcto de las calibraciones y/o verificaciones de sus instrumentos, 47
siendo ste el primero de ellos. 48
2. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIN 49
Este documento proporciona recomendaciones sobre los procesos de calibracin y/o verificacin de los equipos 50
generales del laboratorio de seminologa y embriologa (LSE), la frecuencia de realizacin de dichos procesos y 51
los registros que se deben mantener actualizados. 52
Los equipos comunes con el laboratorio general quedan fuera del mbito de nuestra serie de documentos de 53
recomendacin. 54
No se pretende describir detalladamente la realizacin del proceso de calibracin y/o verificacin de los 55
equipos, dado que se trata de procedimientos especficos para cada equipo, nicamente sealar los controles a 56
que deben estar sujetos los diferentes equipos del LSE para asegurar la exactitud y la trazabilidad de la medida 57
al valor asignado a un patrn, segn las normas para la gestin de la calidad. 58
3. TIPOS DE EQUIPOS 59
El laboratorio debe estar provisto de todos los equipos necesarios para la correcta ejecucin del ensayo. 60
Los equipos que tengan una influencia directa o indirecta en los resultados de los anlisis deben estar sujetos a 61
un plan de calibracin o verificacin, con independencia de que los resultados que de ellos se obtengan se 62
utilicen para emitir un informe. 63
3.1 EQUIPOS DE MEDICIN: 64
Son los utilizados para obtener los resultados de las mediciones que emite el LSE en sus informes, siguiendo 65
los procedimientos de medida o ensayo. 66
- Microscopio ptico de transmisin. 67
- Cmaras de recuento (concentracin espermtica). 68
- Cmaras para evaluar la movilidad espermtica (preparaciones hmedas de 20 m de profundidad). 69
- Analizadores de imagen asistidos por ordenador (anlisis de semen y morfomtrico de calidad embrionaria). 70
- Espectrofotmetros (bioqumica plasma seminal). 71
- Balanza (peso-volumen seminal). 72

3
3.2 EQUIPOS AUXILIARES: 73
Son equipos de soporte al proceso y que si emiten resultados, no sern reflejados en el informe: 74
- Cabinas de flujo laminar. 75
- Incubadores de atmsfera controlada de CO2 y temperatura. 76
- Platinas termostatizadas para microscopa. 77
- Placas calefactadas y platinas trmicas en cabinas de flujo laminar. 78
- Lupa estereoscpica. 79
- Microscopio invertido con micromanipulador. 80
- Tanques de almacenamiento criognico. 81
- Congeladores programables. 82
- Osmmetros. 83
- Medidores de pH. 84
- Pipetas de desplazamiento positivo. 85
- Pipetas de presin negativa. 86
- Centrfugas. 87
- Medidores externos de temperatura y CO2 (incluyendo sus sondas). 88
En el presente documento trataremos los siguientes equipos de medicin: microscopio ptico de transmisin, 89
cmaras de recuento espermtico y cmaras para evaluar la movilidad espermtica. Otros equipos especficos 90
del LSE sern tratados en documentos posteriores. 91
4. PROCESO DE CALIBRACIN 92
La calibracin de un equipo permite establecer la relacin existente entre los valores de una magnitud indicados 93
por dicho equipo, para un patrn de referencia y los valores conocidos de dicho patrn, a travs de un conjunto 94
de operaciones. El proceso da lugar a un certificado de calibracin. 95
Una calibracin implica realizar una serie de medidas, compararlas con un patrn de referencia, obtener el error 96
de estas mediciones (diferencia entre valor tomado y el valor real establecido por el patrn) y establecer un 97
valor de incertidumbre. 98
La calibracin de los equipos debe realizarse de forma peridica. Debe emplear un mtodo preestablecido, 99
mediante el uso de instrumentos calibrados y patrones de referencia. 100
La calibracin externa de los equipos debe ser llevada a cabo por laboratorios de calibracin que demuestren 101
su competencia, asegurando la calidad de los informes de calibracin que generan cumpliendo, entre otros 102
requisitos, el uso de patrones de medida trazables a patrones nacionales o internacionales. 103
En la adquisicin de equipos nuevos el laboratorio debe exigir a los proveedores el certificado de calibracin de 104
dicho equipo. 105
5. PROCESO DE VERIFICACIN 106
Sirve para confirmar que se cumplen los requerimientos previamente especificados, permitiendo comprobar si 107
las desviaciones entre los valores obtenidos con el equipo de medicin y los valores conocidos de la magnitud 108
medida son menores que el mximo error definido para dicha magnitud. Se evidencia as la eventual necesidad 109
de una calibracin. 110
Se trata de contrastar que un equipo calibrado se conserva dentro de la tolerancia establecida. 111

4
La verificacin permite realizar el chequeo interno entre calibraciones y comprobar el correcto funcionamiento 112
de un equipo despus de una revisin, ajuste o un periodo prolongado de uso. 113
El resultado de una verificacin, generalmente apto o no apto, conlleva la decisin de aceptar el equipo para 114
su uso, realizar ajustes en el equipo, repararlo, ponerlo fuera de servicio o declararlo obsoleto. En todos los 115
casos se requiere que se genere un informe por escrito con los resultados y decisiones tomados tras la 116
verificacin del mismo. 117
6. PERIODICIDAD DE PROCESOS DE CALIBRACIN/VERIFICACIN 118
El laboratorio debe tener implantado un Plan de mantenimiento, calibracin y/o verificacin de sus equipos 119
como parte fundamental del sistema de calidad. 120
Este plan debe cubrir todos los equipos y definir las actividades a realizar y su periodicidad. Las actividades u 121
operaciones a realizar deben ir encaminadas a prevenir, o en su caso corregir, fallos, deterioros, averas o un 122
mal funcionamiento de los equipos. Este plan debe incluir tanto el mantenimiento interno del propio laboratorio, 123
como el externo (servicio externo de mantenimiento preventivo, en los casos que sea necesario o posible). 124
Tambin incluir las operaciones de calibracin y/o verificacin. 125
La periodicidad de las calibraciones o verificaciones de los equipos se establece en funcin de factores como: 126
naturaleza del equipo, trascendencia de los resultados, grado de utilizacin del equipo, resultados de las 127
calibraciones o verificaciones previas, recomendaciones de la informacin tcnica disponible o publicada, etc. 128
Las calibraciones o verificaciones externas de los equipos suelen realizarse con una periodicidad anual. 129
7. REQUISITOS DE REGISTROS DE CALIBRACIN/VERIFICACIN DE EQUIPOS 130
Los equipos integrados dentro del plan de calibracin/verificacin deben disponer de una etiqueta en la que 131
conste la identificacin del equipo (cdigo de inventario), el tipo de calibracin/verificacin realizada (externa o 132
interna), fecha de la ltima calibracin/verificacin y fecha de la prxima calibracin/verificacin. 133
Cada equipo utilizado en el LSE debe tener en lugar accesible: 134
- Identificacin inequvoca y registro de inventario. 135
- Instrucciones actualizadas de uso y mantenimiento incluido el manual suministrado por el fabricante en el 136
idioma del pas. 137
- Informe de las calibraciones/verificaciones, que contendr: identificacin del equipo (cdigo de inventario y 138
denominacin), fecha de calibracin/verificacin, metodologa o procedimiento empleado para calibrar, norma 139
de calidad bajo la cual se calibra/verifica el equipo, rango de calibracin, equipo de referencia (patrn de 140
calibracin), si aplica las condiciones ambientales (temperatura, humedad, etc.) resultados de las mediciones, 141
fecha prevista de la prxima calibracin/verificacin, criterios de aceptacin, identificacin del tcnico que 142
realiza la calibracin/verificacin, y en el caso de una calibracin, la precisin, exactitud e incertidumbre de la 143
medicin. 144
Cuando se trate de verificaciones de un equipo, el informe deber servir para acreditar que dicho equipo o 145
sistema de medida funciona correctamente y que cumple especificaciones. 146
Se considera que una calibracin o verificacin es interna cuando las operaciones pertinentes son llevadas a 147
cabo por el propio laboratorio, y es externa cuando son llevadas a cabo por un servicio externo contratado, tanto 148
si tienen lugar en el propio laboratorio como en la sede de dicho servicio. 149

5
Los certificados de calibracin externa de patrones o equipos deben ser emitidos por laboratorios de calibracin, 150
acreditados, que aseguren la trazabilidad a patrones nacionales o internacionales reconocidos e incluyan 151
informacin sobre las medidas realizadas y las incertidumbres asociadas. 152
Las operaciones de mantenimiento que se efecten en un equipo, tales como limpieza, revisiones, 153
comprobaciones, sustituciones, reposiciones de material fungible, etc. deben anotarse en un registro de 154
mantenimiento diseado para esta finalidad. 155
En los Procedimientos Normalizados de Trabajo (PNT) de puesta en marcha y funcionamiento de los equipos, 156
pueden incluirse tambin las instrucciones para el mantenimiento, calibracin y/o verificacin de los mismos. 157
Aquellos equipos de medicin que como consecuencia de los resultados defectuosos en las operaciones de 158
calibracin, verificacin o mantenimiento, o bien por causa de una avera, sea puesto fuera de servicio, deben 159
retirarse a un lugar especfico y sealizarse claramente mediante una etiqueta con el aviso de FUERA DE 160
USO que indique cdigo de inventario del equipo, fecha y motivo de su retirada. Dicha etiqueta debe 161
mantenerse hasta que el equipo haya sido reparado y reconocido como apto para realizar su funcin 162
satisfactoriamente, mediante una calibracin/verificacin previa. 163
8. PROCEDIMIENTO DE CALIBRACIN / VERIFICACIN 164
La calibracin de un equipo establece un ajuste en la medicin de una determinada magnitud. La verificacin 165
comprueba el comportamiento del equipo en relacin a esa magnitud. Como consecuencia de una verificacin 166
puede surgir la necesidad de calibrar nuevamente. 167
El procedimiento de calibracin/verificacin para cada una de las magnitudes debe describirse de forma 168
detallada, como PNT, indicando el material necesario y la periodicidad establecida. 169
La calibracin/verificacin de equipos slo es necesaria cuando pueda afectar significativamente al resultado de 170
los anlisis. Los dems equipos se mantendrn con mantenimientos preventivos peridicos y con controles de 171
seguridad. 172
El laboratorio debe establecer qu equipos estn sujetos a calibracin y/o verificacin interna (operaciones 173
llevadas a cabo por personal del propio laboratorio) o externa (operaciones efectuadas por personal externo, de 174
otros laboratorios o centros acreditados). 175
8.1 MICROSCOPIO PTICO. 176
8.1.1 AJUSTES Y VERIFICACIONES INICIALES: 177
8.1.1.1 AJUSTE DE LA DISTANCIA INTERPUPILAR. 178
Mientras se observa por los oculares, ajustar la visin binocular hasta que los campos de visin derecho e 179
izquierdo coincidan completamente en un nico campo de visin (figura 1). 180
8.1.1.2 AJUSTE DE LAS DIOPTRAS. 181
- Observar con el ojo derecho nicamente por el ocular derecho sin el anillo de ajuste diptrico , enfocar la 182
muestra mediante el mando macromtrico y micromtrico (Figura 2). 183
- Mirando a travs del ocular izquierdo con el ojo izquierdo, girar el anillo de ajuste diptrico hasta enfocar la 184
muestra (Figura 2). 185

6
Algunos microscopios disponen de ambos oculares ajustables de forma independiente. En otros, un ocular es 186
fijo (no ajustable) y otro ajustable. 187
Los oculares ajustables generalmente van marcados con los signos +/- con una escala. Ajustar el ocular a la 188
posicin 0 antes de comenzar este proceso. 189
8.1.1.3 CENTRADO DEL CONDENSADOR 190
- Subir el condensador a la posicin mxima mediante el mando de ajuste de la altura (figura 3). 191
- Enfocar una preparacin utilizando el objetivo 10x. 192
- Girar el anillo del diafragma de campo de modo que la imagen del diafragma quede dentro del campo de 193
visin (figuras 3 y 4). 194
- Mover el mando de ajuste de la altura del condensador para enfocar la imagen del diafragma . 195
- Girar los dos tornillos de centrado del condensador para llevar la imagen del diafragma al centro del campo 196
de visin (figura 3). 197
- Abrir poco a poco el diafragma de campo . El condensador est bien centrado si la imagen est centrada e 198
inscrita en el campo de visin. 199
- Finalmente abrir ligeramente el diafragma de campo hasta que su imagen circunscriba el campo de visin 200
(figura 4) 201
Nota: El diafragma de campo restringe el dimetro del rayo de luz que entra en el condensador. 202
8.1.1.4 AJUSTE DEL DIAFRAGMA DE APERTURA 203
El diafragma de apertura determina la apertura numrica (AN) del sistema de iluminacin. Para obtener una 204
buena resolucin, contraste e incremento de la profundidad de enfoque del campo microscpico, debe estar 205
relacionada la apertura numrica del objetivo con la del sistema de iluminacin. Para ello se recomienda 206
seleccionar una apertura numrica del iris del condensador (diafragma de apertura) en torno al 80% de la AN 207
del objetivo en uso, mediante uno de los siguientes procedimientos: 208
- Seleccionar en la escala de AN del condensador un valor en torno al 80% del valor de AN indicado en el 209
objetivo (figura 5). Ejemplo: Objetivo Plan 40x con AN=0.65 / 0,65 x 0,8=0,5 / posicionar el diafragma de 210
apertura del condensador al valor 0,5. 211
- Quitar uno de los oculares y mirando por el conducto del mismo ajustar la imagen abriendo o cerrando el 212
diafragma de apertura del condensador (figura 6) hasta observar la la imagen de la figura 7. 213
8.1.1.5 AJUSTE DE ANILLOS DE FASES PARA EL USO DE OBJETIVOS DE CONTRASTE DE FASES 214
- Posicionar el objetivo de eleccin en la trayectoria de la luz. 215
- Girar el revlver del condensador de contraste de fase hasta que indique el nmero de Ph que se corresponda 216
con el nmero de Ph sealado en el objetivo ( en figura 8) 217
- Enfocar la preparacin. 218
- Retirar uno de los oculares e insertar el telescopio centrador ( en figura 9) en el tubo portaocular. 219
- Girar el foco del telescopio centrador hasta que el anillo luminoso (anillo del condensador) y el anillo oscuro 220
(anillo del objetivo) estn enfocados (figura 10). 221
- Girar los dos botones de centrado de los anillos luminosos del condensador hasta que el anillo luminoso y el 222
anillo oscuro estn colocados de manera concntrica y superpuestos (figura 10). 223

7
- Se recomienda usar un filtro ptico verde (posicionado en en figura 10) para garantizar las mejores 224
condiciones de contraste de fases, ya que la ptica est diseada para esta longitud de onda ( =500 nm - 570 225
nm). 226
8.1.2 CALIBRACIN-VERIFICACIN DE RETCULAS DE OCULAR 227
Las retculas de ocular se utilizan en el anlisis de morfologa espermtica (para verificar tamaos de la 228
estructura del espermatozoide), as como en el anlisis de movilidad (como referencia del desplazamiento de 229
los espermatozoides) y concentracin espermtica (determinacin de la superficie de recuento en determinadas 230
cmaras) (5). 231
8.1.2.1 MICRMETRO DE OBJETO 232
Un micrmetro de objeto es simplemente un portaobjetos con un patrn longitud grabado en su superficie. El 233
portaobjetos micromtrico se coloca sobre la platina del microscopio y se utiliza como referencia para calibrar- 234
verificar las retculas de ocular que se insertan en uno de los oculares del microscopio, tal como se describe en 235
el siguiente apartado. 236
Los micrmetros de objeto deben calibrarse externamente por un laboratorio de calibracin acreditado, el cual 237
emite un certificado de calibracin. 238
Debe quedar registro de la evaluacin de los resultados expresados en el certificado de calibracin del 239
micrmetro y de su aceptacin como vlidos conforme a los criterios de aceptacin establecidos en el PNT. 240
Se recomienda una calibracin externa con periodicidad anual. 241
8.1.2.2 RETCULA DE OCULAR 242
El procedimiento de calibracin-verificacin de un micrmetro de ocular en un microscopio ptico o 243
estereoscpico se realiza del siguiente modo (figuras 12 a 17): 244
- Colocar la retcula de ocular en uno de los dos oculares del microscopio, posicionando el lado rotulado 245
mirando hacia la montura . 246
- Colocar un portaobjetos micromtrico (que tiene una escala de longitudes conocidas), calibrado previamente 247
tal como se ha indicado con anterioridad, sobre la platina del microscopio. 248
- Localizar a bajos aumentos (objetivo de 10x) la escala graduada del micrmetro de objeto y centrarla en el 249
campo de visin del microscpico. 250
- Seleccionar el objetivo a usar. 251
- Enfocar el micrmetro de objeto. 252
- Girar la escala de la retcula del ocular de tal modo que quede posicionada paralelamente a la escala del 253
portaobjetos micromtrico. 254
- Hacer coincidir en un punto ambas escalas. 255
- Contar cuntos unidades del micrmetro de objeto (X) equivalen a un determinado nmero de intervalos del 256
retculo de ocular (Y). 257
- Determinar el valor de calibracin con la frmula X/Y (X-Micrmetro de objeto: nmero de unidades / Y- 258
Retculo de ocular: nmero de intervalos) y anotarlo. 259
Se calibrar la escala del ocular para los distintos objetivos a utilizar. Cada objetivo del microscopio debe ser 260
calibrado de forma independiente. 261
Se recomienda calibracin interna con periodicidad anual y verificacin interna con frecuencia segn uso. 262

8
8.2 CMARAS DE RECUENTO ESPERMTICO (100 M DE PROFUNDIDAD). 263
Para el recuento espermtico se recomienda el uso de cmaras hemocitomtricas de 100 m de profundidad, 264
como la cmara de Neubauer improved (Figuras 18-21). 265
Segn las recomendaciones del la 5 edicin del manual de la OMS, para una evaluacin precisa de bajas 266
concentraciones de espermatozoides se requieren cmaras de recuento de gran volumen (100 m de 267
profundidad), dado que se incrementa notablemente la sensibilidad analtica en la evaluacin de la 268
concentracin. 269
Si se desea utilizar otras cmaras, alternativas a la Neubauer improved, debe demostrarse previamente su 270
validez mediante la comparacin de resultados con los obtenidos mediante el uso de la cmara de Neubauer 271
improved, as como la obtencin de resultados satisfactorios en programas de control de calidad externos. 272
Las cmaras de contaje espermtico reutilizables (Neubauer improved, Makler) deben calibrarse externamente 273
para la determinacin de la concentracin espermtica. Dicha operacin consiste en calibrar la rejilla central de 274
la cmara as como la altura de la misma. 275
Se recomienda calibracin externa con periodicidad anual. 276
Existen cmaras desechables disponibles en el mercado para la determinacin de la concentracin de 277
espermatozoides, con una profundidad de 100 um, con rejilla impresa o sin rejilla (en este caso se utilizan 278
rejillas de ocular para determinar la superficie de recuento, que son calibradas-verificadas segn se ha indicado 279
en el apartado 9.1.2). Tal como se ha establecido, debe demostrarse su validez para su uso en recuento 280
espermtico por comparacin con el hemocitmetro de Neubauer improved. 281
Las cmaras desechables de un solo uso no precisan ser calibradas. Debe solicitarse al fabricante o distribuidor 282
el certificado del control de calidad del lote de fabricacin. 283
8.3 CMARAS PARA EVALUAR LA MOVILIDAD ESPERMTICA (20 m de profundidad). 284
Para la evaluacin de la movilidad espermtica pueden utilizarse preparaciones de porta-cubreojetos u otro tipo 285
de cmaras comercializadas (cmaras desechables o inventariables). 286
Estas cmaras deben tener una profundidad mnima de 20 m, segn las recomendaciones del la 5 edicin del 287
manual de la OMS, para no limitar el movimiento de rotacin de los espermatozoides y permitir un correcto 288
desplazamiento de stos. 289
Si la cmara es muy profunda, presentar distintos planos focales y ser difcil evaluar los espermatozoides 290
dentro de un mismo plano. 291
8.3.1 CLCULO DE LA PROFUNDIDAD DE UNA PREPARACIN PORTA-CUBREOBJETOS EN FUNCIN 292
DEL VOLUMEN DE MUESTRA 293
Debe estandarizarse el volumen de la muestra de semen utilizado y las dimensiones del cubreobjetos para 294
conseguir de este modo la profundidad deseada (mnimo 20m). 295
Para calcular la profundidad de la preparacin porta-cubreobjetos, debe dividirse el volumen de muestra 296
depositada por el rea sobra la cual se extiende dicha muestra (tamao del cubreobjetos), mediante la siguiente 297
frmula: 298
P(m) =[Volumen muestra (mm
3
) / rea del cubreobjetos (mm
2
)] x 1000. 299
1 mm
3
=1 l 300

9
En la tabla I, a modo de ejemplo, se muestran las profundidades de distintas preparaciones en funcin de estas 301
dos variables: 302
8.3.2 CMARAS DESECHABLES DE 20 m DE PROFUNDIDAD 303
Hay dos tipos de cmaras desechables comercializadas, las de carga por capilaridad con cubreojetos sellado 304
sobre el portaobjetos (figura 22) y las de difusin por desplazamiento de la gota espermtica, en las que el 305
cubreobjetos se deposita sobre el portaobjetos y la muestra se extiende en toda su superficie debido al peso del 306
cubreobjetos (figura 23). 307
Las cmaras desechables de un solo uso no precisan ser calibradas. Debe solicitarse al fabricante o distribuidor 308
el certificado del control de calidad del lote de fabricacin. 309
Opcionalmente se pude verificar la profundidad de las cmaras de difusin por desplazamiento de la gota 310
utilizando la escala (Vernier) del mando micromtrico del microscopio (figura 24). Deben verificarse las 311
especificaciones tcnicas descritas en el manual del microscopio para conocer la equivalencia de las unidades 312
de dicha escala (1 o 2 m, segn microscopio). 313
Procedimiento: 314
- Realizar una marca de tinta en la parte superior del portaobjetos. 315
- Colocar el cubreobjetos que lleva impresa la rejilla. 316
- Medir el nmero de marcas de graduacin (en el mando del micromtrico) entre los dos puntos, enfocando 317
ambos puntos. 318
- Repetir la medicin 10 veces y calcular la media, desviacin estndar (SD) y coeficiente de variacin (CV). 319
- Comprobar la exactitud (la profundidad indicada en la cmara debe encontrase dentro del rango de 2 SD del la 320
media de las mediciones realizadas). 321
Se recomienda verificacin interna (opcional) con periodicidad segn uso 322
Este mismo procedimiento puede ser utilizado para verificar la profundidad de las cmaras de recuento 323
espermtico (Neubauer improved y otras equivalentes). En tal caso, por el diseo de estas cmaras, se medir 324
el nmero de marcas de graduacin entre los siguientes puntos: rejilla de la cmara (impresa en la parte 325
superior del portaobjetos) y una marca de tinta en la parte inferior del cubreobjetos. 326
8.3.3 CMARAS INVENTARIABLES DE 20 m DE PROFUNDIDAD 327
Se trata de una cmara de difusin por desplazamiento de la gota espermtica, de 20 um de profundidad, 328
reutilizable y con una caracterstica importante para su trazabilidad en el proceso de calibracin-verificacin 329
consistente en la identificacin (con nmero de serie) independiente tanto de la cmara como del cubreobjetos. 330
El cubreobjetos, dispone en su parte central de un rejilla de 1 mm
2
, subdividida en 100 cuadrados de 0,1 mm de 331
lado (figura 25). 332
En este tipo de cmaras debe verificarse el correcto posicionamiento del cubreobjetos por la presencia de la 333
iridiscencia (anillos de Newton) al presionar firmemente el cubreobjetos sobre los cuatro pilares de la cmara: 334
esta verificacin nos puede evidenciar problemas de variacin en la profundidad de la cmara. 335
Se recomienda calibracin externa con periodicidad anual. 336
337

10
9. BIBLIOGRAFA 338
1. JCGM 200:2012 Vocabulario Internacional de Metrologa: Conceptos fundamentales y generales, y 339
trminos asociados (VIM). Edicin del VIM 2008 con inclusin de pequeas correcciones. [en lnea]. 3 340
edicin en espaol. Madrid: Centro Espaol de Metrologa, 2012. [consultado 9 ene 2014]. 86 p. [Disponible 341
en: http://www.cem.es/sites/default/files/vim-cem-2012web.pdf] 342
2. Asociacin Espaola de Normalizacin y Certificacin. UNE-EN ISO 15189: Laboratorios Clnicos. 343
Requisitos particulares para la calidad y la competencia. Madrid: AENOR; 2007. 62 p. 344
3. Asociacin Espaola de Normalizacin y Certificacin. Sistemas de gestin de la calidad. Requisitos. 345
(ISO 9001:2008). Madrid: AENOR; 2008. 42 p. 346
4. Entidad Nacional de Acreditacin. Expresin de la incertidumbre de medida en las calibraciones. CEA- 347
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5. World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination and processing of human 350
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353
354

11
355
Figura 1.- Oculares. Ajuste de la distancia interpupilar. 356
357

12
358
Figura 2.- Oculares. Ajuste de las dioptrias. 359
360

13
361
Figura 3.- Condensador y diafragma de campo. 362
363

14
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365
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Figura 4.- Observacin del diafragma de campo, a travs de los oculares, en el centrado del condensador. 368
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15
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372
Figura 5.- Objetivos y diafragma de apertura. 373
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Figura 6.- Abertura del diafragma de condensador 376
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Figura 7.- Abertura del diafragma de condensador 386
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Figura 8.- Marca de Ph en revol ver del condensador de contraste de fases y filtro azul. 390
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19
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Figura 9.- Telescopio centrador 394
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Figura 10.- Centrado del anillo de fases del condensador respecto al anillo del objeti vo. 397
398
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400

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Figura 11.- Micrmetro de objeto (portaobjetos micromtrico) 403
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Figura 12.- Retcula de ocular 409
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Figura 13.- Vista de la retcula del ocular. 415
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Figura 14.- Colocacin de la retcula de ocular. 419
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421
422
Figura 15.- Portaobjetos micromtrico. 423
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425

26
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431
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Figura 16.- Retcula de ocular superpuesta con la escala graduada del micrmetro. 435
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437

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440
441
Figura 17.- Retcula de ocular (en forma de cuadrcula) superpuesta con la escala graduada del micrmetro. 442
443
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Figura 18.- Cmara hemocitomtica Neubauer improved 446
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Figura 19.- Disposicin de las cuadriculas en la cmara Neubauer improved 450
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Figura 20.- Cmara desechable sin rejilla (100 m profundidad) 453
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Figura 21.- Cmara desechable con rejilla (100 m profundidad) 456
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Figura 22.- Cmara de carga por capilaridad (ISAS-D4C20) 461
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463

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Figura 23.- Cmara de difusin por desplazamiento (CELL-VU DRM-600) 465
466
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34
468
Figura 24.- Escala (Vernier) del mando micromtrico del microscopio 469
470
471

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472
Figura 25.- Cmara de difusin por desplazamiento de la gota espermtica (SPERMTRACK-20) 473
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Volumen de
muestra
Tamao del
cubreobjetos
Superficie del
cubreobjetos
Profundidad de la
preparacin
10 l 22mm x 22 mm 484 mm
2
20,7 m
6,5 l 18 mm x18 mm 324 mm
2
20,1 m
11 l 21 mm x 26 mm 546 mm
2
20,1 m
25 l 24 mm x 50 mm 1200 mm
2
20,8 m
30 l 24 mm x 60 mm 1440 mm
2
20,8 m
478
Tabla I.- Profundidad de las preparaciones segn el volumen de muestra y el tamao del cubreobjetos 479
480
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