Sei sulla pagina 1di 18

1

Indice
Introduo ........................................................................................................................................... 2
Colorao ............................................................................................................................................ 3
Tipos de colorao ................................................................................................................................ 3
Tcnica da hematoxilina-eosina (HE) .................................................................................................. 4
Procedimentos para a colorao: ......................................................................................................... 4
Coloracao em Giemsa e May-Grnwald ............................................................................................ 5
Colorao rpida Giemsa .................................................................................................................... 6
Coloraao Wright ................................................................................................................................ 6
Colorao em lote com Hemastainer ................................................................................................. 7
Coloracao Amiloide ............................................................................................................................. 8
Coloraao de Gram ............................................................................................................................. 9
Coloracao de ferro ............................................................................................................................ 10
Coloracao pela prata modificado por Steiner-Steiner ...................................................................... 13
Concluso .......................................................................................................................................... 16
Bibliografia ........................................................................................................................................ 17

2

Introduo
No presente trabalho irei falar soubre a colorao esta e usada para classificar as bacterias
com base na morfologia e os diferentes tipos de colorao,os procedimentos para serem feitos
a colorao,.



















3

Colorao
Esta metodologia usada para classificar as bacterias com base na morfologia e na
reacopelo metodo de gram.
A colorao consiste numa etapa muito importante para a visualizao das estruturas do
tecido. Normalmente so utilizados corantes hidrossolveis, sendo necessrio, deste modo, a
remoo da parafina da pea que foi preparada nas etapas descritas anteriormente e que
permanece na lmina de vidro.
Existem muitos tipos de corantes, mas de um modo geral podem ser agrupados em trs
classes distintas (Gartner e Hiatt, 1999):

Tipos de colorao

Os corantes mais utilizados nos procedimentos histolgicos so a Hematoxilina e a
Eosina (HE).
Corantes que diferenciam os componentes cidos e bsicos das clulas;

Corantes especializados que diferenciam os componentes fibrosos da matriz
extracelular;Sais metlicos que precipitam nos tecidos.
A Hematoxilina uma base que cora, preferencialmente, componentes cidos das clulas em
um tom azulado escuro. Como os componentes cidos mais abundantes so o DNA e o RNA,
tanto o ncleo, quanto certas partes do citoplasma, se tornam azulados. Esses componentes
so chamados de basfilos.
A Eosina, ao contrrio, um cido que cora as estruturas bsicas da clula de rosa. Estas
estruturas so abundantes no citoplasma e so chamadas de acidfilas (Gartner e Hiatt, 1999).
Outros corantes so tambm utilizados em procedimentos de rotina em laboratrios, tais
como (Gartner e Hiatt, 1999):
Tricrmico de Masson - cora o ncleo de azul escuro, o citoplasma, a queratina e o msculo
de vermelho e o mucignio e o colgeno de azul claro;
Orcena - cora as fibras elsticas de marrom;
4

Weigert - cora as fibras elsticas de azul;
Prata - cora as fibras reticulares de preto;
Hematoxilina frrica - cora as estriaes dos msculos, os ncleos e os eritrcitos de preto;
cido peridico reativo de Schiff cora as molculas ricas em glicognio e carboidrato de
magenta;
Wright e Giemsa - especializado em clulas sangneas, cora de rosa os eritrcitos e os
grnulos eosinfilos, de prpura o ncleo dos leuccitos e grnulos basfilos e de azul o
citoplasma dos moncitos e dos linfcitos.
Para corar peas includas em parafina necessria a retirada da parafina e a hidratao da
pea.Este procedimento realizado a partir de uma seqncia de banhos em xilol, lcool e
gua, inversamente ao procedimento executado na etapa de incluso.
Aps a hidratao, os cortes so corados de acordo com o procedimento mais apropriado para
a anlise que ser realizada posteriormente.
Aqui sero abordadas as etapas do mtodo da hematoxilina-eosina, por ser o mais utilizado e
por ter um resultado final satisfatrio.
Tcnica da hematoxilina-eosina (HE)
Procedimentos para a colorao:
Embora as etapas possam ser definidas, o tempo em cada fase depende da qualidade e da
idade das solues dos corantes. Deste modo, poder ser observada nas etapas abaixo uma
variao muito grande em relao ao tempo que pode ser ajustado durante o procedimento no
laboratrio. De acordo com Junqueira e Junqueira (1983), as etapas so:
1. desparafinar e hidratar os cortes;
2. corar em hematoxilina entre 5 e 15min;
3. lavar em gua corrente por 10min;
4. corar em eosina entre 1 e 10min;
5. lavar em gua e desidratar em lcool 70% rapidamente;
5

6. diafanizar e montar em resina.

Montagem Final da Lmina:
Este processo consiste em depositar uma gota de resina lquida sobre o corte que est aderido
lmina de vidro e cobri-lo com uma lamnula. Nesta etapa deve-se evitar as bolhas de ar que
se formam na resina durante a colocao da lamnula. Finalmente a lmina catalogada. A
resina depois de seca garantir uma lmina permanente que poder durar anos.

Coloracao em Giemsa e May-Grnwald
As solues de Giemsa e May-Grnwald destinam-se a serem utilizadas na colorao de
esfregaos do sangue ou da medula ssea. As solues destinam-se utilizao em
diagnstico em vidro. O corante de Giemsa consiste numa soluo tampo de tiazina e
eosinato concebida para providenciar a colorao de elementos figurados do sangue de forma
semelhante ao produto original descrito por Giemsa.Este corante poder ser utilizado em
separado ou em conjunto com um corante de May-Grnwald.
PROCEDIMENTO:
Giemsa e May-Grnwald
1.Proceder diluio de 1:20 do corante Giemsa com gua desionizada. Para se obter uma
colorao mais azul, possvel utilizar gua tamponada com pH 7,2 em vez de gua
desionizada.
2. Colocar as lminas em corante de May-Grnwald durante 5 minutos.
3. Colocar as lminas em tampo fosfato ou tampo tris (2070 mmol/L), pH 7,2, durante 1,5
minutos.
4. Colocar as lminas na soluo de Giemsa diluda do passo 1 durante 15 a 20 minutos.
5.Passar as lminas BREVEMENTE por gua DESIONIZADA.
6. Deixar secar ao ar e examinar.

6

Giemsa standard
1. Fixar as lminas em metanol durante 5 a 7 minutos.
2.Secar ao ar.
3.Proceder diluio de 1:20 do corante Giemsa com gua desionizada. A cor pode ser
alterada atravs da diluio em tampo.
4. Colorar o esfregao durante 15 a 60 minutos.
5. Lavar em gua desionizada.
6. Deixar secar ao ar e examinar.
Colorao rpida Giemsa
1. Colocar o esfregao sanguneo seco ao ar em corante Giemsa no diludo durante 1 a 2
minutos.
2. Colocar em gua desionizada durante 2 a 4 minutos consoante a preferncia da cor.
3. Lavar em gua desionizada.
4. Deixar secar ao ar e examinar.

Coloraao Wright
O corante de Wright destina-se a ser utilizado na colorao de esfregaos do sangue ou da
medula ssea.As solues destinam-se utilizao em diagnstico in vitro. A colorao de
Wright consiste numa modificao da colorao de Romanowsky utilizada para a
diferenciao atravs da colorao dos elementos celulares do sangue. Quando os esfregaos
sanguneos so tratados conforme descrito no procedimento, o ncleo dos glbulos brancos e
o citoplasma assumem uma colorao caracterstica azul ou cor-de-rosa. Os corantes
purificados nas formulaes ACCUSTAIN da colorao de Wright eliminam a colorao
inconsistente e resultam em respostas cromognicas reproduzveis de lote para lote. Os
procedimentos apresentados neste folheto informativo descrevem a utilizao do corante de
Wright como um corante de imerso normal ou para utilizao nos corantes em lotes como,
por exemplo, o Hemastainer fornecido pela Geometric Data, o Midas II fornecido pela EM
Diagnostic Systems, Inc. e o Fisher Stainmaster fornecido pela Fisher Scientific.
7

Procedimento:
I. Mtodo de imerso (Rpido Manual)
1. Colocar aproximadamente 50 mL de CORANTE DE WRIGHT numa jarra de Coplin.
2. Encher outra jarra de Coplin com gua desionizada.
3. Colocar o esfregao sanguneo completamente seco, com a rea em bisel para BAIXO, no
CORANTE DE WRIGHT durante aproximadamente 15 segundo.
4. Retirar as lminas do corante e colocar em gua desionizada, com a rea em bisel virada
para BAIXO, durante aproximadamente 30 segundos.
5. Passar brevemente por gua desionizada corrente e deixar secar bem ao ar antes se
proceder avaliao.

II. Mtodo de colorao horizontal (Manual)
1. Colocar o esfregao sanguneo completamente seco num suporte de colorao apropriado.
2. Imergir a lmina em 1 a 2 mL de CORANTE DE WRIGHT.
3. Aps decorridos 30 segundos, sem lavar o corante de Wright do Passo 2, adicionar um
volume igual de gua desionizada e misturar, soprando suavemente sobre a lmina.
4. Aps 1 minuto, lavar completamente com gua desionizada e deixar secar ao ar.

Colorao em lote com Hemastainer
. Tecnicas de Procedimentos:
SECES TECIDULARES DE PARAFINA MANUAL:
1. Desparafinar as lminas e hidratar em gua desionizada.
2. Proceder colorao em soluo de carbolfucsina durante 3045 minutos.
3. Lavar em gua desionizada para retirar a colorao em excesso.
8

4. Proceder diferenciao e realizar uma contracolorao em soluo de verde malaquite
durante 2 minutos.
5. Passar por gua corrente e deixar secar ao ar ou secar completamente.
6. Imergir em xilol e colocar soluo de proteco.

PROCEDIMENTO NO FORNO MICROONDAS H2100 ACCUMATE:
1. Desparafinar as lminas e hidratar em gua desionizada.
2. Colocar as lminas em 40 mL de soluo de carbolfucsina contida numa jarra de Coplin
plstica. Cobrir folgadamente a jarra com a tampa ou utilizar tampas ventiladas.
3. Colocar no microondas a 400 watts durante 30 segundos. Misturar com uma pipeta de
beral ou haste aplicadora. Deixar incubar durante 10 minutos.
4. Lavar em gua desionizada para retirar a colorao em excesso.
5. Colocar as lminas em 40 mL de soluo de verde malaquite durante1 minuto
temperatura ambiente.
6. Passar por gua corrente e deixar secar ao ar ou secar completamente.
7. Imergir em xilol e colocar soluo de proteco.

Coloracao Amiloide
O kit de colorao amilide, vermelho Congo destina-se a ser utilizado na determinao de
amilide nas seces tecidulares. Ambos os procedimentos padro e para microondas esto
descritos. Os reagentes de colorao amilide destinamse utilizao em diagnstico em
vidro.
O amilide, um grupo de protenas anormal de uma perturbao imunolgica, acumula-se
entre as clulas parenquimatosas do tecido conjuntivo resultando na amiloidose. possvel
detectar a existncia de amilide no tecido utilizando vermelho congo, um corante aninico
metacromtico. Os mtodos iniciais utilizando o vermelho congo implicavam o exame das
seces coradas com um microscpio polarizante.
9

1. A modificao de Puchtler, na qual se baseia o procedimento da Sigma-Aldrich,
intensifica a colorao com vermelho congo, utilizando um pr-tratamento do tecido com
uma soluo alcalina de cloreto de sdio.
2. Em seguida, a seco avaliada com um microscpio de luz ou microscpio polarizante.
includa uma tcnica de colorao amilide para a colorao rpida em fornos
microondas.
Procedimentos:
1. Desparafinar e hidratar em gua desionizada.
2. Corar na Soluo de Hematoxilina de Mayer durante 10 minutos ou,soluo de
hematoxilina N. 3 de Gill durante 3 minutos.
3. Lavar em gua da torneira durante 5 minutos.
4. Colocar em soluo alcalina de cloreto de sdio durante 20 minutos.
5. Realizar uma colorao em soluo alcalina de vermelho Congo durante 20 minutos.
6. Lavar em 3 banhos de etanol absoluto.
7. Limpar em xilol e montar. Examinar microscopicamente.
Coloraao de Gram
Os reagentes de colorao de Gram foram concebidos para serem utilizados na delineao de
organismos gram-positivos e gram-negativos em pelculas e tecido. Os reagentes de
colorao de Gram destinam-se utilizao em diagnstico em vidro. A colorao de Gram
utilizada clinicamente para delinear dois grupos distintos de microorganismos. Os
microorganismos que retm o corante primrio (cristal violeta) so designados por gram-
positivos. Os microorganismos que perdem o corante primrio durante a fase de descolorao
so designados por gram-negativos. No se conhecem os mecanismos atravs dos quais os
organismos gram-positivos retm o corante primrio,embora se tenha quase a certeza que a
qumica e a estrutura das paredes celulares
estejam relacionadas. Foram descritas vrias modificaes ao mtodo original de Gram1.

10

Procedimento para tecidos :
1. Desparafinar as seces e hidratar em gua desionizada.
2. Colocar as lminas no suporte de colorao e cobri-las com soluo de cristal violeta, N.
de Catlogo HT90-1, durante 1 minuto.
3. Escoar a soluo de cristal violeta e lavar bem em gua desionizada.6. Proceder
diferenciao em lcool absoluto ou acetona.
7. Lavar em gua desionizada.
8. Cobrir as lminas com soluo de safranina O, N. de Catlogo HT90-4, durante 3060
segundos.
9. Passar por gua desionizada e secar as seces.
10. Cobrir as seces com soluo de tartrazina, N. de Catlogo HT30-2 durante 510
segundos.
11. Secar o corante em excesso.
12. Lavar em 2 banhos de lcool absoluto.
13. Limpar em xilol e montar.

Coloracao de ferro
A colorao de ferro da Sigma-Aldrich destina-se a ser utilizada na colorao histolgica do
ferro em esfregaos do sangue ou da medula ssea. Os reagentes de colorao de ferro
destinam-se utilizao em diagnstico em vidro. A colorao de ferro baseia-se na
reaco1 bem conhecida de azul da Prssia, em que o ferro inico reage ao ferrocianeto cido
produzindo uma cor azul. Ambos os procedimentos standard e um procedimento para
colorao rpida no microondas2-4 esto descritos.

Procedimentos :
Para as secoes de tecido :
11

1. Desparafinar e hidratar o tecido em gua desionizada.
2. Colocar as lminas em soluo de trabalho de colorao de ferro durante 10 minutos.
3. Lavar em gua desionizada.
4. Proceder colorao em soluo de trabalho de pararrosanilina durante 35 minutos.
5. Lavar em gua desionizada.
6. Desidratar rapidamente em lcool e xilol e montar

No forno mocroondas H2100 ACCUMATE:
1. Desparafinar as lminas e hidratar em gua desionizada. Nos casos de colorao de
esfregaos de sangue perifrico ou medula ssea, fixar em metanol durante 7 minutos e, em
seguida, hidratar em gua desionizada.
2. Colocar as lminas em 40 mL de soluo de trabalho de colorao de ferro contida numa
jarra de Coplin plstica. Cobrir folgadamente com a tampa antes de colocar no forno ou
utilizar jarras de Coplin com tampas com orifcios perfurados.
3. Colocar no microondas a 400 watts durante 30 segundos. Eliminar a soluo aps a
utilizao.
4. Lavar em gua desionizada.
5. Colocar as lminas em 40 mL de soluo de trabalho de pararrosanilina contida numa jarra
de Coplin plstica.
6. Colocar no microondas a 800 watts durante 10 segundos. Deixar incubar durante 2
minutos. Utilizar uma vez e eliminar.
7. Lavar as seces tecidulares em gua desionizada, desidratar rapidamente em lcool,
limpar em xilol e montar. Passar os esfregaos de sangue ou medula ssea por gua
desionizada e deixar secar ao ar.
12

Sideroblastos: Consistem em eritrcitos nucleados contendo, pelo menos, um grnulo azul de
pequena dimenso. Se os grnulos azuis se situarem volta do ncleo, trata-se de
sideroblasto em anel.
Sidercitos:Consistem em eritrcitos no nucleados contendo, pelo menos, um grnulo azul.
Ferro reticuloendotelial: Normalmente observado sob a forma de partculas azuis no
esfregao de medula ssea ou como partculas azuis no citoplasma ou clulas fagocitrias.

Coloracao pela prata
O kit de Colorao pela Prata Sigma-Aldrich destina-se a ser utilizado na demonstrao
histolgica de fungos, membrana basal e alguns organismos oportunistas.O KIt de Colorao
pela Prata foi concebido para Utilizao em diagnstico em vidro. Os procedimentos com
borato de metenamina de prata esto devidamente documentados.1,2 Geralmente, estes
procedimentos implicam a preparao de uma soluo elaborada antes da realizao do teste.
A estabilidade da soluo limitada e os resultados variam consideravelmente devido
natureza inconstante da impregnao por metal e da evoluo fotogrfica.
A Sigma-Aldrich oferece agora uma Colorao pela Prata que incorpora um sal de
metenamina de prata estvel para trabalhar em conjunto com tampo, reagente de viragem e
revelador. Desta forma, o laboratrio tem sua disposio um pacote nico para a
visualizao de fungos, membrana basal e organismos oportunistas como o caso de
Pneumocystis carinii. Alm disso, esto includas tcnicas com prata para a colorao rpida
em fornos microondas. Em resumo, os polissacardeos da membrana basal e parede celular
microbiana so oxidados em aldedos atravs do tratamento com cido peridico. O grupo de
aldedos,em pH alcalino, reduz o io prata em prata metlica. A lavagem com sais de ouro
forma um complexo de ouro mais estvel e a prata em excesso retirada atravs de uma
lavagem com tiossulfato.
Procedimentos :
1. Preparar a soluo de trabalho de metenamina de prata conforme descrito na seco
Preparao e colocar em banho-maria a 62C.
2. Desparafinar as seces tecidulares e rehidratar em gua desionizada.
13

3. Colocar as seces rehidratadas em soluo de cido peridico, N. de Catlogo HT100-1,
durante 5 minutos para os fungos ou organismos oportunistas ou durante 11 minutos para a
membrana basal.
4. Retirar as lminas e lav-las em 6 banhos de gua desionizada.
5. Para a demonstrao de fungos e organismos oportunistas, colocar as lminas em soluo
de trabalho de metenamina de prata pr-aquecida. Examinar microscopicamente ao fim de 20
minutos. Os fungos e os organismos oportunistas devero apresentar uma cor castanha escura
contra um fundo amarelo plido. Para a demonstrao da membrana basal, colocar as lminas
em soluo de trabalho de metenamina de prata pr-aquecida. Examinar microscopicamente
ao fim de 30 minutos.A membrana basal dever apresentar uma cor preta contra um fundo
castanho-amarelado escuro.
6. Retirar as lminas da soluo de trabalho de metenamina de prata depois de obtida uma
colorao estrutural adequada e passar 6 vezes por gua desionizada temperatura ambiente.
7. Proceder viragem das seces em soluo de cloreto de ouro, N. de Catlogo HT100-4,
durante 30 segundos.
8. Lavar 6 vezes em gua desionizada temperatura ambiente.
9. Colocar as seces em soluo de tiossulfato de sdio, N. de Catlogo HT100-5, durante 2
minutos.
10. Lavar bem em gua corrente.
11. Realizar uma contracolorao, de acordo com as preferncias pessoais, com soluo de
tartrazina, Verde resistente FCF, Verde suave SF amarelado, soluo de hematoxilina de
Harris ou soluo de eosina Y.
12. Desidratar em lcool, limpar em xilol, montar e examinar microscopicamente.

Coloracao pela prata modificado por Steiner-Steiner
A Colorao pela prata modificada por Steiner-Steiner, destina-se a ser utilizada para a
demonstrao de bactrias espiroquetas e no filamentosas em seces de tecido embebidas
14

em parafina. Os reagentes de colorao pela prata destinam-se Utilizao em diagnstico
in vitro.
Alguns procedimentos documentados relativamente demonstrao de bactrias espiroquetas
e outros organismos oportunistas incluem Warthin-Starry, Dieterle e SteinerSteiner.1-3 Estes
procedimentos implicam, muitas vezes, a preparao de uma soluo elaborada e os
resultados podem variar consideravelmente.
O mtodo da consiste numa modificao do mtodo de Steiner-Steiner incluindo uma
aplicao no microondas para acelerar e acentuar a colorao pela prata nas seces
tecidulares. O calor produzido no forno microondas facilita a impregnao do nitrato de prata
nas seces tecidulares, resultando normalmente num fundo muito mais limpo do que com o
mtodo tradicional. Passar por gua corrente e deixar secar ao ar ou secar completamente. O
procedimento Steiner-Steiner modificado produz resultados de colorao reprodutveis e
consistentes.
Procedimento:
1. Utilizar jarras de Coplin de plstico quimicamente limpas.
2. Pr-aquecer 40 mL de nitrato de uranil, N. de Catlogo HT101-1 e 40 mL de soluo de
nitrato de prata, N. de Catlogo HT101-2, at atingirem uma temperatura de 60C.
3. Aquecer a Soluo de goma mstique, N. de Catlogo HT101-3, at atingir a temperatura
ambiente.
4. Desparafinar e hidratar as seces em gua desionizada.
5. Colocar as seces em soluo de nitrato de uranil pr-aquecida durante 15 minutos em
banho-maria a 60C.
6. Lavar em trs banhos de gua desionizada.
7. Colocar as seces em soluo de nitrato de prata pr-aquecida em banho-maria a 60C
durante 1,5 horas.
8. Lavar em trs banhos de gua desionizada.
9. Lavar em dois banhos, cada um com lcool a 95% e lcool absoluto.
15

10. Colocar as seces em soluo de goma mstique durante 5 minutos.
11. Retirar as lminas da soluo de goma mstique e deixar secar ao ar.
12. Preparar uma soluo de reduo, misturando 10 mL de soluo de goma mstique, N.
de Catlogo HT101-3, 25 mL de soluo de trabalho de hidroquinona e 5 mL de lcool
absoluto. Filtrar utilizando papel Whatman N. 54 ou papel de filtro equivalente e adicionar
200 l de soluo de nitrato de prata.
13. Aquecer a soluo de reduo numa jarra de Coplin plstica, sem lminas, em banho-
maria a 45C. Adicionar as seces soluo de reduo morna e incubar, no mximo,
durante 25 minutos.
14. Deixar as lminas assentarem na soluo de reduo temperatura ambiente at se obter
o grau de colorao preta pretendido, 1 a 2 minutos o ideal. Um perodo de incubao mais
longo opcional. Eliminar a soluo aps a utilizao.
15. Desidratar as seces em lcool.
16. Limpar em xilol e montar.











16

Concluso
Pude assim concluir que este teste serve para um diagnstico rapido presuntivo de um agente
infeccioso e tambem para avaliar a qualidade da amostra. Dependendo de cada tipo de
colorao,as celulas podem apresentar-se de varias coresos.




















17

Bibliografia
Hematology: Principles and Procedures, Sixth Edition, Brown AB, Lea & Febiger,
Philadelphia 1993 p101

STEVENS, Alan; LOWE, James. Histologia. So Paulo: Manole, 1995.


BECAK, Willy. JORGE PAULETE. Tcnicas de citologia e histologia. Rio de
Janeiro: Livros Tcnicos e Cientficos, 1976.














18



Indice