AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE

MICROORGANISMOS BIOFERTILIZANTES A
PARTIR DE MUESTRAS DE SUELO DE
CULTIVOS DE VITIS VINIFERA DE LA
LOCALIDAD DE MOQUEGUA









Aislamiento e identificacin de microorganismos biofertilizantes a partir de muestras de suelo
de cultivos de Vitis vinfera de la localidad de Moquegua

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INTRODUCCIN

En el Per, el cultivo de Vitis vinifera es sumamente importante para la fruticultura y la
produccin de pisco y vino, tal importancia se puede explicar pues en el ao 2006 las uvas
representaron la segunda fruta en valor de exportacin con un total de $ 48.6 millones.
La vid es cultivada en toda la costa peruana y la regin Moquegua es uno de los lugares en donde
este cultivo tan especial es cultivado con mucho esmero. Sin embargo el crecimiento y
rendimiento de la vid, al igual que la mayora de plantas de inters agrcola, muestran gran
dependencia del nitrgeno y el agua durante su ciclo vegetativo; por lo tanto el nitrgeno es un
factor determinante en el plan de fertilizacin de sntesis en el cultivo de algodn. No obstante, el
uso indiscriminado de fertilizantes nitrogenados genera problemas econmicos, sociales y
ambientales, y como consecuencia se ocasionan prdidas significativas en trminos de produccin.
El uso excesivo de agroqumicos constituye un contaminante perjudicial del suelo y de los
organismos que habitan en l.
El suelo es considerado un compuesto heterogneo definido por sus propiedades fsicas, qumicas
y biolgicas, que en el medio mantiene la interaccin y equilibrio dinmico entre sus
componentes. Se considera que los organismos del suelo, que estn conformados bsicamente
por bacterias, hongos y artrpodos, desempean una participacin importante en el ciclaje de
nutrientes. Los microorganismos del suelo tienen una importancia sobresaliente en condiciones
naturales, por su cantidad y principalmente por su amplio espectro de actividades, que en muchos
de los casos inciden en los seres superiores, compartiendo un hbitat determinado. Cuando al
sistema se incorporan plantas, las circunstancias para los microorganismos cambian radicalmente,
debido a que las plantas son las principales proveedoras de sustratos nutritivos para el suelo,
siendo aprovechados por los microorganismos cuando estos se encuentran cerca a la raz y se
desarrollan en ella. Por esta razn, la reduccin creciente del uso de fertilizantes de sntesis
qumica, solamente es posible mediante el empleo de tecnologas limpias. El aislamiento de
bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayora de los casos, mediante la
produccin de colonias aisladas en cultivos slidos. El crecimiento explosivo de las bacterias
permite producir un gran nmero de ellas a partir de una nica clula inicial de forma que, tras un
periodo de incubacin en las condiciones ambientales adecuadas, se produce una colonia
observable a simple vista y formada por individuos iguales (un clon bacteriano). Este tipo de
Aislamiento e identificacin de microorganismos biofertilizantes a partir de muestras de suelo
de cultivos de Vitis vinfera de la localidad de Moquegua

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tecnologas nos permiten identificar bacterias tiles en la fertilizacin de los suelos, en especial del
cultivo de Vitis vinfera.
























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CAPITULO I

ASPECTOS PRELIMINARES

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La contaminacin por fertilizantes se produce cuando stos se utilizan en mayor cantidad
de la que pueden absorber los cultivos, o cuando se eliminan por accin del agua o del
viento de la superficie del suelo antes de que puedan ser absorbidos. Los excesos de
nitrgeno y fosfatos pueden infiltrarse en las aguas subterrneas o ser arrastrados a
cursos de agua. Esta sobrecarga de nutrientes provoca la eutrofizacin de lagos, embalses
y estanques y da lugar a una explosin de algas que suprimen otras plantas y animales
acuticos.
En el suelo encontramos gran variedad de microorganismos dependiendo de los
materiales que lo compongan, de la textura del suelo, de la humedad de la profundidad.
El estudio de la abundancia y diversidad de los microorganismos del suelo ha presentado
un obstculo; los medios de cultivo adecuados. Muchos microorganismos no se pueden
aislar en cultivos convencionales.
Los microorganismos del suelo, son los componentes ms importantes de este.
Constituyen su parte viva y son los responsables de la dinmica de transformacin y
desarrollo. En un solo gramo de tierra, encontramos millones de microorganismos
beneficiosos para los cultivos. Estos microorganismos beneficiosos que se encuentran en
el suelo, son bacterias, actinomicetos, hongos, algas y protozoarios. Un suelo frtil es
aquel que contiene una reserva adecuada de elementos nutritivos disponibles para la
planta, o una poblacin microbiana que libere nutrientes que permitan un buen desarrollo
vegetal.
Si se utilizan ms mtodos de produccin sostenible, se podrn atenuar los efectos de la
agricultura sobre el medio ambiente. El aislamiento de bacterias a partir de muestras
naturales se realiza, en la mayora de los casos, mediante la produccin de colonias
aisladas en cultivos slidos. El crecimiento explosivo de las bacterias permite producir un
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gran nmero de ellas a partir de una nica clula inicial de forma que, tras un periodo de
incubacin en las condiciones ambientales adecuadas, se produce una colonia observable
a simple vista y formada por individuos iguales (un clon bacteriano). Este tipo de
tecnologas nos permiten identificar bacterias tiles en la fertilizacin de los suelos, en
especial del cultivo de Vitis vinfera.
2. JUSTIFICACION DEL PROBLEMA

En la actualidad se vienen usando los agroqumicos de manera un tanto irracional, esta
situacin ha generado diversos problemas ambientales, relacionados con el suelo y los
microorganismos que habitan en l. El uso indiscriminado de fertilizantes qumicos se ha
incrementado notoriamente en todo el mundo. Sin embargo, cada vez se es mas
consiente sobre los impactos que ocasiona este tipo de agricultura basada en el sistema
actual. Muchos organismos benficos viven naturalmente en los suelos de los cultivos
fijando sustancias que luego la planta toma para formar su alimento. entones el
aislamiento de microorganismos biofertilizantes constituye una nueva tecnologa
sostenible que busca no solo fertilizar los suelos de ciertos cultivos , si no tambin se busca
que este tipo de mtodos ayuden a elevar los rendimientos y buscar de una vez la
solucin a este problema sumamente complejo.
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo General

Aislar e identificar microorganismos biofertilizantes a partir de muestras de suelo
de cultivos de Vitis vinfera de la localidad de Moquegua.
3.2. Objetivos Especficos


Seleccionar un medio de cultivo adecuado para el aislamiento de bacterias
fertilizantes.
Determinar la poblacin y porcentaje de bacterias fertilizantes presentes en el
suelo del cultivo de Vitis vinfera de la ciudad de Moquegua.
Caracterizar microscpicamente las bacterias fertilizantes.
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4. MARCO TEORICO

4.1. CRECIMIENTO MICROBIOLOGICO

4.1.1 REQUERIMIENTOS PARA EL CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS

Los requerimientos para el crecimiento microbiano pueden dividirse en
dos categoras: fsicos y qumicos.

4.1.2 REQUERIMIENTOS FSICOS

a) Temperatura
Existen organismos, como ciertas bacterias, que pueden desarrollarse en
temperaturas extremas donde sera imposible la supervivencia de cualquier
organismo eucarionte.
Los microorganismos se clasifican en tres grupos principales sobre la base de
sus lmites de temperatura preferidos: sicrfilos (microbios con afinidad con
el fro), mesfilos (microbios con afinidad por la temperatura moderada) y
termfilos (microbios por afinidad por el calor). Cada especie crece en
temperaturas mnima, ptima y mxima particulares. La temperatura mnima
de crecimiento es la temperatura ms baja a la cual crecer la especie. La
temperatura ptima de crecimiento es la temperatura a la cual la especie
crece mejor. La temperatura mxima de crecimiento es la temperatura ms
elevada a la cual es posible el crecimiento. Los organismos sicrofilas pueden
crecer a 0C pero tiene una temperatura ptima de 15C. Existe otro grupo
de microorganismos que pueden proliferar a 0C pero tiene temperaturas
ptimas ms elevadas (en general de 20 a 30C) y no crecen cuando la
temperatura supera los 40C, son los organismos sicrotrofos. Los mesfilos
crecen con una temperatura ptima de crecimiento de 25 a 40C, son los
ms comunes. Los termfilos son microorganismos capaces de crecer a
temperaturas elevadas. Muchos de ellos tienen temperaturas ptimas de
crecimiento de 50 a 60C. Varios mesfilos no pueden crecer a temperaturas
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inferiores a 45 C. Existen organismos que se denominan hipertermfilos y en
ocasiones termfilos extremos, viven en fuentes termales asociadas con la
actividad volcnica.

b) Presin osmtica
Los microorganismos requieren agua para crecer y estn constituidos por un
80-90 % de agua. La presin osmtica elevada tiene el efecto de eliminar el
agua necesaria de una clula. Cuando un microorganismo se encuentra en
una solucin que tiene una concentracin mayor de solutos que de la
clula ( el ambiente hipertnico , respecto de la clula ), el agua celular
atraviesa la membrana plasmtica y se difunde hacia una zona de mayor
concentracin de soluto. Esta prdida osmtica de agua causa plasmlisis o
reduccin del citoplasma de la clula.
La importancia de este fenmeno radica en que el crecimiento de la clula
se inhibe cuando la membrana plasmtica se separa de la pared celular. La
mayora de microorganismos deben ser cultivados en un medio constituido,
casi en su totalidad por agua. Por ejemplo, la concentracin de agar ( un
complejo de polisacridos aislado de algas marinas) utilizado para solidificar
los medios de cultivo microbiano suele ser de alrededor del 1.5 % . Si se
utilizan concentraciones mucho ms elevadas, el aumento de la presin
osmtica puede inhibir el crecimiento de algunas bacterias.
c) pH
La mayora de bacterias crecen mejor en un rango de pH estrecho cercano a
la neutralidad (de entre 6.5 y 7.5) y muy pocas bacterias crecen en un pH
cido (por debajo de 4). Los hongos filamentosos y las levaduras crecen en
valores de pH ms amplios que las bacterias, si bien su pH ptimo suele ser
menor que el de las bacterias, por lo general de cerca de 5 a 6. La alcalinidad
tambin inhibe el crecimiento microbiano. Cuando las bacterias se cultivan
en el laboratorio a menudo producen cidos que al final interfieren sobre su
propio crecimiento. Para neutralizar los cidos y mantener el pH adecuado
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se agregan al medio de cultivo sustancias qumicas que actan como
tampones o buffers.
4.1.3 REQUERIMIENTOS QUMICOS

a) Carbono
Adems del agua, uno de los requerimientos ms importantes para el
crecimiento microbiano es el carbono. Este elemento constituye la estructura
bsica de la materia viva, es necesario para todos los compuestos orgnicos
que forman una clula viva. La mitad del peso seco de una clula bacteriana
tpica es carbono. Los quimiohetertrofos obtienen la mayor parte de su
carbono de la fuente de su energa, materiales orgnicos como protenas y
lpidos. Los quimioauttrofos y los fotoauttrofos obtienen su carbono del
dixido de carbono.
b) Nitrgeno, azufre y fosforo
Adems del carbono los microorganismos necesitan otros elementos para la
sntesis del material celular. EL nitrgeno constituye cerca del 14 % del peso
seco de una clula bacteriana y el azufre y el fosforo juntos constituyen
alrededor de otro 4 %. Algunas bacterias importantes, incluidas muchas de las
cianobacterias fotosintetizadoras, utilizan nitrgeno gaseoso (N
2
)
directamente de la atmosfera. Este proceso se denomina fijacin del
nitrgeno. Algunos organismos que pueden utilizar este mtodo viven
libremente, la mayora en el suelo, pero otros viven en forma cooperativa en
simbiosis, con las races de legumbres como el trbol, la soja, la alfalfa, los
frijoles y los guisantes. El nitrgeno fijado en la simbiosis es utilizado tanto
por la planta como por las bacterias.
El azufre se utiliza para sintetizar aminocidos que contienen azufre y
vitaminas como la tiamina y la biotina. El fsforo es esencial para la sntesis
de cidos nucleicos y los fosfolpidos de las membranas celulares. El potasio,
el magnesio y el calcio tambin son elementos necesarios para los
microorganismos, a menudo como cofactores para las enzimas.
c) Oligoelementos
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Los microorganismos requieren cantidades muy pequeas de otros
elementos minerales, como hierro, cobre, molibdeno y zinc, estos se
denominan oligoelementos. Casi todos son esenciales para las funciones de
ciertas enzimas, por lo general como cofactores.
d) Oxigeno
Los microorganismos que usan oxigeno molecular (aerobios) producen ms
energa a partir de los nutrientes que los que no utilizan oxigeno
(anaerobios). Los organismos que requieren oxgeno para vivir se denominan
aerobios estrictos.
Los aerobios estrictos estn en desventaja porque el oxgeno es poco soluble
en el agua de su ambiente. Por ende, muchas de las bacterias aerobias han
desarrollado o conservado la capacidad de continuar creciendo en ausencia
de oxgeno. Estos organismos se denominan anaerobios facultativos, quienes
pueden utilizar oxigeno cuando est presente pero pueden continuar
creciendo mediante la fermentacin o la respiracin anaerbica o la
respiracin anaerbica cuando no hay oxigeno disponible. Sin embargo, su
eficiencia en la produccin de energa disminuye en ausencia de oxgeno.
Los anaerobios estrictos son microorganismos que no pueden utilizar el
oxgeno molecular en las reacciones que producen energa.
e) Factores de crecimiento orgnico
Los compuestos orgnicos esenciales que un organismo no puede sintetizar
se conocen como factores de crecimiento orgnicos; pueden obtenerse
directamente del ambiente. Muchas bacterias pueden sintetizar la totalidad
de sus propias vitaminas y no dependen de fuentes externas. En cambio
algunas carecen de las enzimas necesarias para la sntesis de ciertas
vitaminas y para ellas esas vitaminas constituyen factores de crecimiento
orgnicos. Otros factores de crecimiento organices requeridos por algunas
bacterias son los aminocidos, las purinas y las pirimidinas.




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4.1.4 MEDIOS DE CULTIVO
Un medio de cultivo es aquel material nutritivo preparado para el
crecimiento de microorganismos en un laboratorio. Algunas bacterias
pueden crecer en cualquier medio de cultivo, otras requieren medios
especiales y otras no pueden crecer en ninguno de los medios inertes
existentes hasta ahora. Los microbios que se introducen en un medio de
cultivo para que comiencen a crecer se denominan inculos. Los
microbios que crecen y se multiplican en un medio de cultivo se
denominan cultivo. El medio que se va a sembrar debe ser estril , es
decir , en un principio no debe contener microorganismos viables , de
modo que el cultivo contenga solo los microbios ( y su descendencia )
que se agreguen al medio. Por ltimo el medio de cultivo sembrado debe
incubarse a la temperatura correcta.
Cuando se desea que las bacterias se desarrollen sobre un medio
solido se agrega un agente solidificante como el agar, que consiste en un
polisacrido complejo proveniente de una alga marina que se utiliza desde
hace mucho tiempo como espesante de alimentos como jaleas y helados.
El agar posee algunas propiedades muy importantes que lo convierten en
valioso para la microbiologa y nunca se encontr un sustituto
satisfactorio. Pocos organismos pueden degradar el agar, de modo que
permanece en estado slido. Adems, el agar se licua a una temperatura
de alrededor de 100C y a nivel del mar permanece lquido hasta que la
temperatura disminuye cerca de 40 C. Para el uso en el laboratorio el
agar se mantiene en baos de agua a 50 C. A esta temperatura no altera
a la mayor parte de las bacterias cuando se vierte sobre ellas. Una vez
que el agar se solidifica puede incubarse a temperaturas que se
aproximan a los 100C antes de que vuelva a licuarse, esta propiedad es
particularmente til cuando se desea cultivar bacterias termfilas. Los
medios de agar pueden usarse en tubos de ensayo o placas Petri. Los
tubos de ensayo se denominan tubos en pico de flauta o inclinados
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cuando el medio se solidifica manteniendo el tubo en un ngulo
adecuado para lograr una gran superficie para el crecimiento. Cuando el
agar se solidifica en un tubo de posicin vertical, se denomina profundo.
Los cultivos en placas Petri se realizan en placas poco profundas con una
tapa que cubre perfectamente la base para evitar la contaminacin.

4.1.4.1 MEDIOS DE CULTIVO QUIMICAMENTE DEFINIDOS
Un medio qumico definido es uno del que se conoce la composicin qumica exacta.
En el caso de un organismo quimiohetertrofo, el medio qumicamente definido
debe contener factores de crecimiento organices que acten como fuente de
carbono y energa. Los organismos que requieren varios factores de crecimiento se
describen como microorganismos con requerimientos especiales de crecimiento.
4.1.4.2 MEDIOS COMPLEJOS
Los medios qumicamente definidos suelen reservarse para el trabajo experimental
del laboratorio o para el crecimiento de bacterias auttrofas. Casi todas las bacterias
hetertrofas y los hongos, como aquellos con los que se trabaja en un curso de
introduccin al laboratorio, se cultivan de modo sistemtico en medios complejos,
compuestos por nutrientes como extractos de levaduras, carne o plantas o digeridos
de protenas de estas y otras fuentes. Si un medio complejo se halla en una forma
lquida se denomina caldo nutritivo. Cuando se agrega agar se denomina agar
nutritivo.
4.1.4.3 MEDIOS Y METODOS DE CRECIMIENTO PARA ANAEROBICOS
El cultivo de bacterias anaerobias plantea un problema especial. Dado que los
anaerobios podran morir por exposicin al oxgeno, deben emplearse medios
especiales denominados medios reductores. Estos medios contienen ingredientes
como el tioglicolato de sodio, que se combinan qumicamente con el oxgeno en el
medio de cultivo. Para lograr el desarrollo y el mantenimiento de cultivos puros de
anaerobios estrictos los microbilogos utilizan medios reductores fraccionados en
tubos de ensayo comunes con tapas bien ajustadas. Estos medios se calientan justo
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antes de su empleo para eliminar el oxgeno absorbido. Para los cultivos en placa Petri
se utilizan jarras especiales para anaerobios, esta es una tcnica relativamente nueva
que se utiliza para proporcionar un ambiente de anaerobiosis. Los investigadores
utilizan cmaras transparentes para anaerobios equipadas con llaves para su llenado
con gases inertes.

4.1.4.4 MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALES
Los medios selectivos estn diseados para suprimir el crecimiento de bacterias no
deseadas y favorecer el crecimiento de las deseadas. Por ejemplo el agar dextrozado
de Sabouraud, con un pH de 5.6 se utiliza para aislar hongos que se desarrollan mejor
que la mayor parte de las bacterias a este pH.
Los medios diferenciales permiten distinguir con mayor facilidad las colonias del
microorganismo deseado de otras colonias que crecen en la misma placa. De manera
similar, los cultivos puros de microorganismos tienen reacciones identificables con
los medios diferenciales, sean en tubos o en placas.
4.1.4.5 CULTIVO DE ENREQUECIMIENTO
En ocasiones es necesario utilizar un cultivo de enriquecimiento porque las bacterias
presentes en pequea cantidad pueden no detectarse, en especial si hay otras
bacterias presentes en cantidades muchos mayores. Esto sucede con frecuencia en
muestras de suelo o materia fecal. El medio de enriquecimiento para un cultivo
suele ser lquido y proporciona nutrientes y condiciones ambientales que favorecen
el desarrollo de un microbio particular pero no de otros. Es tambin un medio
selectivo pero est destinado a aumentar las cantidades muy pequeas del
microorganismo deseado hasta niveles detectables.
4.1.5 OBTENCION DE CULTIVOS PUROS
En teora una colonia visible se origina en una nica espora o clula vegetativa o en
un grupo de los mismos microorganismos adheridos entre s en agregados o
cadenas. El mtodo de aislamiento empleado con ms frecuencia para obtener
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cultivos puros es el mtodo de siembra por estra en placa. Se introduce un ansa de
inoculacin estril en un cultivo mixto que contenga ms de un tipo de microbio y se
lo distribuye en forma estriada sobre la superficie del medio nutritivo; las bacterias
se desprenden del ansa y pasan al medio. Las ltimas clulas que se desprenden del
ansa estn bastante separadas como para crecer en colonias aisladas. Estas colonias
pueden tomarse con un ansa de inoculacin y sembrarse en un tubo de ensayo que
contenga el medio nutritivo para formar un cultivo puro de un solo tipo de bacteria.
El mtodo por estra en placa funciona bien cuando el microorganismo que se desea
aislar est presente en grandes cantidades en relacin con la poblacin total, en
cambio cuando el microorganismo que se desea aislar est presente solo en
cantidades muy pequeas estas deben incrementarse mediante el empleo de un
enriquecimiento selectivo antes de que se lo pueda aislar con el mtodo de siembra
por estra en placa.
4.1.6.1. CRECIMIENTO DE CULTIVOS BACTERIANOS
La capacidad de representar de modo grafico las poblaciones enormes que se
producen como resultado del crecimiento de los cultivos bacterianos es una parte
esencial de la microbiologa.
4.1.6.2. DIVISON BACTERIANA
El trmino crecimiento bacteriano se refiere a un aumento de la cantidad de
bacterias, no a un aumento del tamao de las clulas individuales. Las bacterias
suelen reproducirse por fisin binaria.
Solo algunas especies bacterianas se reproducen por brotacion; forman una pequea
protuberancia inicial (un brote) que se agranda hasta que su tamao se aproxima al
de la clula parental y luego se separa. Algunas bacterias filamentosas (ciertos
actomicetos) se reproducen por formacin de cadenas de conidiosporas situadas
externamente en los extremos de los filamentos. Algunas especies simplemente se
fragmentan y estos fragmentos inician el crecimiento de clulas nuevas.
4.1.6.3 TIEMPO DE GENERACION
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El tiempo necesario para que una clula se divida y su poblacin se duplique se
denomina tiempo de generacin. Este tiempo vara considerablemente entre los
microorganismos y con las condiciones ambientales, como la temperatura.

4.1.6.4 FASES DE CRECIMIENTO
Cuando se inoculan lagunas bacterias en un medio de crecimiento lquido y se cuenta
la poblacin con intervalos, es posible graficar la curva de crecimiento bacteriano
que muestra el crecimiento de las clulas en funcin del tiempo.
a) FASE DE RETRASO
Durante un tiempo el nmero de clulas cambia muy poco debido a que las
clulas no se reproducen de inmediato en un medio nuevo. Este periodo de
escasa o nula divisin celular se denomina fase de retraso y puede durar 1
hora o varios das. Sin embargo durante este tiempo las clulas no estn
inactivas. La poblacin microbiana atraviesa un periodo de intensa actividad
metablica que comprende sobre todo la sntesis de enzimas y diversas
molculas.
b) FASE LOGARITMICA
Las clulas comienzan a dividirse y entran en un periodo de crecimiento o de
incremento logartmico denominado fase logartmica o fase de crecimiento
exponencial. La reproduccin celular alcanza una actividad mxima durante
este periodo y su tiempo de generacin llega a un mnimo constante. Como
el tiempo de generacin es constante, la representacin logartmica del
crecimiento durante esta fase exponencial es una lnea recta. La fase
logartmica tambin es el momento en que las clulas presentan mayor
actividad metablica y es la preferida en la produccin industrial donde, por
ejemplo, un producto debe ser producido de manera diferente. Sin embargo,
durante en la fase logartmica de crecimiento los microorganismos son mucho
ms sensibles a las condiciones adversas. La radiacin y muchos frmacos
antimicrobianos ejercen su efecto al interferir en algunos pasos importantes
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del proceso de crecimiento por lo tanto son ms perjudiciales para las clulas
durante esta fase.
c) FASE ESTACIONARIA
Si el crecimiento exponencial continuo sin control puede dar lugar a un
nmero de clulas extraordinariamente elevado. Pero en algn momento la
tasa de crecimiento disminuye, el nmero de muertes microbianas compensa
el de clulas nuevas y la poblacin se estabiliza. La actividad metablica de
las clulas que sobreviven tambin se torna ms lenta en esta fase.
d) FASE DE DECLINACION
Al final el nmero de muertes supera el nmero de nuevas clulas formadas y
la poblacin entra en la fase de declinacin o fase de declinacin logartmica.
Esta fase contina hasta que la poblacin disminuye a una pequea fraccin
de clulas ms resistentes o hasta que todas sus integrantes mueren.
Muchas clulas bacterianas a menudo involucionan durante esta fase, lo que
significa que su morfologa cambia de manera espectacular. Lo que dificulta
su identificacin. Algunas especies atraviesan toda la serie de fases en solo
unos pocos das, otras mantienen algunas clulas sobrevivientes casi
indefinidamente.

4.2 LA POBLACIN MICROBIANA DEL SUELO
Las propiedades ms evidentes de un suelo son las relacionadas con sus
componentes fsicos: las proporciones de arena, arcilla y materia orgnica,
especialmente. Cuando se analiza el perfil de un suelo con criterios biolgicos, las
consideraciones no suelen ir ms all del nivel alcanzado por la actividad de las
lombrices o de la intensidad con que las larvas de los insectos atacan a las races de
las plantas. La naturaleza microscpica de la mayor parte de los habitantes edficos
es la razn fundamental que explica la facilidad con que puede pasar inadvertida la
variada, compleja y continua actividad de los organismos vivos presentes en el suelo.
El pequeo tamao de los organismos edficos queda sin embargo, compensado por
su presencia en un nmero muy elevado (son densidad normal

bacterias
por gramo de suelo), por lo que, en definitiva, el resultado de la actividad biolgica es
fundamental en el comportamiento del suelo. Sin la actividad vital interrelacionada
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de las bacterias, actinomicetos, hongos, y algas (la microflora), de los protozoos y
nematodos (microfauna) y de los colmbolos, caros y restantes componentes de la
mesofauna, el suelo se convertira en un depsito en el que se acumularan las
plantas muertas sin posibilidad de reciclar los elementos nutritivos, como carbono,
nitrgeno y fosforo, necesarios para el crecimiento y desarrollo de la vegetacin.
Las plantas pueden crecer en medios totalmente estriles, pero solamente cuando se
adopten las medidas oportunas para reponer los elementos nutritivos a medida que
se vayan agotando como consecuencia de su absorcin por las races. Un suelo
naturalmente frtil es aquel en el que los organismos edficos van liberando
nutrientes inorgnicos, a partir de las reservas orgnicas o minerales, con velocidad
suficiente para mantener un crecimiento rpido en las plantas. Todos los organismos
del suelo presentan los atributos biolgicos fundamentales de nutricin, crecimiento,
reproduccin y muerte. La actividad biolgica de los suelos, resultante de estas
funciones, proporciona a las plantas superiores un medio ambiente adecuado para su
propio desarrollo.
2.2 NUTRICION DE LA MICROFLORA: ORGANISMOS AUTOTROFOS Y
HETEROTROFOS
Los organismos necesitan alimentos o nutrientes para alcanzar dos objeticos
diferentes: obtencin de energa para sus funciones fisiolgicas (catabolismo) y
formacin de sus tejidos (anabolismo). Algunos componentes de la microflora
pueden utilizar sustratos (alimentos) completamente diferentes para ambos
objetivos mientras otros componentes, como ocurre en la mayor parte de los
animales, se sirven del mismo material para ambos propsitos.
De acuerdo con las fuentes utilizadas para suministro de energa y de carbono, los
microorganismos pueden dividirse en cuatro categoras:
1. Organismos quimiohetertrofos (o quimioorgantrofos) que necesitan
nutrientes orgnicos preelaborados, como la glucosa.
2. Organismos fotohetertrofos (o fotoorgantrofos) que utilizan sustratos
orgnicos pero pueden obtener alguna energa a partir de la luz.
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3. Organismos fotoauttrofos (conocidos, tambin como fotosintticos o
fotolittrofos) que obtienen toda su energa de la luz.
4. Organismos quimioauttrofos (o quimiolittrofos) que obtienen energa de la
oxidacin de compuestos inorgnicos.
Las dos categoras de organismos auttrofos obtienen el carbono que necesitan
para la sntesis celular a partir del CO2 atmosfrico. Los hongos, la mayor parte de
las bacterias, los protozoos y todos los animales son hetertrofos mientras que las
algas, las plantas superiores y algunos grupos de bacterias son auttrofos. El
quimioautotrofismo est limitado a unos pocos tipos de bacterias pero el
significado agronmico de su actividad, como la oxidacin del amoniaco o nitrato,
es de considerable importancia. Algunos organismos auttrofos, como los que
realizan la oxidacin del amoniaco, pueden considerarse como estrictos u obligados
pues son prcticamente incapaces de realizar cualquier otra forma de nutricin,
mientras que otros se consideran auttrofos facultativos porque pueden cubrir, en
determinadas circunstancias, todas o parte de sus necesidades a partir de sustratos
orgnicos.
Los organismos fotoauttrofos se presentan en el suelo en dos grupos diferentes.
En uno, estn las algas y las cianobacterias (antiguamente denominadas algas
verde-azuladas) que realizan fotosntesis mediante pigmentos relacionados con la
clorofila de las plantas superiores y liberan oxgeno, en condiciones de adecuado
suministro, a partir de la fotolisis del agua. El otro grupo incluye determinadas
bacterias fotosintticas que no liberan oxgeno y actan sobre sustratos como el
sulfhdrico (SH2), por lo que su actividad est limitada a los suelos encharcados.
Muchas bacterias fotoauttrofos pueden fijar N2 atmosfrico mientras que los
restantes fotoauttrofos necesitan compuestos amoniacales o ntricos para
satisfacer sus exigencias en este elemento.
Las exigencias nutritivas de los organismos hetertrofos varan desde condiciones
sencillas a complejas. Organismos no especializados, como las bacterias
pseudomonas sp. O los hongos Mucor sp., obtener toda la energa y el carbono a
partir de azucares simples, como la glucosa, y el nitrogeno a partir de sales
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minerales, prefiriendo las amoniacales a los nitratos. Estos organismos pueden
producir todas las enzimas y los constituyentes celulares a partir de nutrientes
simples y, en consecuencia, poseen extraordinaria capacidad de sntesis. Se puede
ir ascendiendo en una escala de complejidad creciente en la que, para asegurar el
crecimiento, van siendo necesarios, cada vez, nutrientes ms especficos, como
amoniocidos y vitaminas. Ya que el fundamento bioqumicos de la actividad de la
mayor parte de los microorganismos es muy similar, el hecho de que una
determinada bacteria y hongo pueda crecer sin el aporte de un compuesto
especficos, por ejemplo la vitamina biotina, no debe interpretarse como que la
biotina no interviene en su metabolismo sino que el organismo es capaz de
autosintetizarla.
La prdida de la capacidad para sintetizar algunos compuestos esenciales est
dispersa entre muchos componentes de la microflora edfica en forma tan
aleatoria que no presentan ningn inters desde el punto de vista sistemtico. En
general, las exigencias de los diferentes organismos son una respuesta al suministro
habitual del alimento: cuanto ms especializado el origen, como ocurre, por
ejemplo., con un parasito bien adaptado o con un simbionte, ms probable es la
prdida de capacidad para sintetizar algunas enzimas que son producidas, sin
embargo, por organismos afines que usan fuentes trficas menos especializadas.
Asimismo, entre los organismos vivos presentes en el suelo hay una cantidad
sorprendentemente elevada que requiere vitaminas presintetizadas para su
desarrollo.
2.3. BACTERIAS
Las bacterias son los organismos ms numerosos en el suelo (se estiman
poblaciones viables de unos 200 millones de clulas por gramo de tierra) y son,
asimismo, los organismos que presentan mayor diversidad en su fisiologa. El
mtodo propuesto por Bergey en su Manual of determinative bacteriology es
aceptado, generalmente, como base para la taxonoma e identificacin de las
bacterias y actinomicetos. Desgraciadamente, la identificacin y clasificacin de
una bacteria aislada requiere informacin basada en su morfologa, nutricin,
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fisiologa y, en algunos casos, en sus reacciones inmunolgicas o, incluso, en sus
cidos nucleicos. Como consecuencia, la identificacin de todas las bacterias que
pueden aislarse incluso de una pequea muestra de tierra, es una labor
comparable a los trabajos de Hrcules. A pesar del tiempo que se lleva trabajando
en la microbiolgica del suelo, puede afirmarse con absoluta certeza que no han
sido aun totalmente caracterizados, en ningn suelo, los gneros y especies de
todas las bacterias presentes. Aunque esta afirmacin pueda parecer una flagrante
omisin, est plenamente justificada si se consideran los innumerables problemas
que esta caracterizacin plantea y el tiempo que los especialistas habran de
emplear para realizarla. Entre los problemas se presenta, primero la interrogante
de si todas las bacterias del suelo son susceptibles de aislamiento, ya que sin este
la identificacin es imposible, y ms tarde habr de tener en cuenta que las
poblaciones edficas son muy variables, tanto en el espacio como en el tiempo. No
existe, en consecuencia, gran interesa en dedicar demasiado tiempo, esfuerzo y
recursos a la descripcin detallada de una poblacin si un cambio de unos pocos
centmetros en su localizacin o ligeras diferencias en las fechas en que se toman
las muestras, puede modificar ampliamente los resultados.
Se estn desarrollado, constantemente, mtodos rpidos mejorados para la
identificacin de bacterias incluyndose en ellos, desde procedimiento que
permiten realizar veinte ensayos de nutricin a partir de una sola inoculacin
hasta mtodos muy sofisticados de identificacin bacteriana basados en
espectroscopa de masas por pirolisis, aunque estos mtodos estn, por el
momento, reservados a centro mdicos e industriales de importancia.
Dado que la identificacin total es impracticable, la mayor parte de los
conocimiento disponibles es relacin con las bacterias del suelo proceden de
investigaciones realizadas sobre amplias poblaciones de organismos utilizados
medios de caracterizacin sencillos, como pueden ser los diferentes tipos de
nutricin, o son el resultados del examen de muchos suelos estudiando un nmero
limitado de organismos, como los anaerobios o los degradadores de la celulosa.
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Como ejemplo de aproximacin a una clasificacin nutricional, disponemos de la
propuesta por lockhead y chase que utiliza siete medios nutritivos de complejidad
creciente e inocula, en cada uno, una seleccin fe bacterias (normalmente, unas
fluctuaciones ms importantes, dependiendo su nmero de sus estados de
actividad o quiescencia: los Bacillus sp. Y los Pseudomonas sp. Son ejemplos
caractersticos de esta categora. La agrupacin propuesta por winogradsky no
queda claramente definida ya que, en funcin de las condiciones del suelo, puede
considerarse frecuentemente a un microorganismo miembro de ambas categoras.
Hay otros grupos importante de bacterias del suelo que no aparecen en los
cultivos no selectivos sobre agar y de los que hemos obtenido conocimientos
mediante su cultivo en medios especializados. Muchas de las bacterias auttrofas,
como las que oxidan el amonio y los nitritos, Nitrosomonas sp., as como las que
oxidan el azufre, thiobacillus sp., solo pueden desarrollarse cuando se cultivan en
medios especializados.
Hay, tambin, bacterias en el suelo que se alimentan de otras especies bacterianas
comunes y, posiblemente, de otras clulas microbianas. Para ello, excretan
enzimas extracelulares que disuelven, o lisan, las membranas bacterianas y, a
continuacin, absorben los contenidos celulares. Algunas pertenecen a un grupo
de organismos muy pequeos y mviles, conocidos como Bdellovibrio, y otras a las
mixobacterias o bacterias mucosas tpicas de los gneros Myxococcus y
Poliangium. Las myxobacterias se han aislado, frecuentemente, a partir de suelos
cultivados y terrenos de praderas; conteos realizados por Singh proporcionaron
cifras que, en las condiciones que realizo la determinacin, van desde 2.000 hasta
80.000 por gramo de suelo.
Estas bacterias depredadoras no son las nicas especies de los myxobacteriales
presentes en el suelo, ya que muchas de las que descomponen la celulosa y la
quitina, como los Cytophaga sp., pertenecen a este grupo, aunque no ha podido
demostrase aun que puedan formar los caractersticos cuerpos reproductores de
las especies depredadoras.
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Un grupo importante de bacterias fotoauttrofas fijadoras de nitrgeno, las
cianobacterias, se presentan tambin en el suelo aunque desde antiguo se las
consideraba como algas (algas verde-azuladas). Por esta razn, a pesar de que
deberan estudiarse con las restantes bacterias, se describirn con las algas
verdaderas en una seccin prxima.
2.4. HONGOS
Los hongos constituyen el segundo e los dos grandes grupo de microorganismo del
suelo y el que predominen ellos o el grupo bacteria-actinomiceto, depende de las
condiciones locales, especialmente del pH y del contenido de humedad. Los
micelios de los hongos edficos no pueden verse, en los suelos normales de
cultivo, ni por el ojo humano directamente ni con ayuda de lupas, pero en los
suelos de bosques, pueden observarse, bajo las capas de hojarasca, trenzas de
micelios blancos, denominados Risomorfos, formadas por masas de filamentos
individuales (hifas) enmaraados. Preparaciones microscpicas del suelo
suspendidas en un gel o en resina, ponen de manifiesto las hifas y esporas de los
hongos edficos.
2.5. SISTEMATICA DE LA Vitis vinfera
La clasificacin de la Vitis vinifera es la siguiente:
Cuadro nro. 1: clasificacin taxonmica de Vitis vinfera
Taxonoma de Vitis vinfera
REINO Plantae
DIVISION magnoliophyta
CLASE Magnoliopsida
ORDEN Rhamnales
FAMILIA Ampelidacea
GENERO Vitis
ESPECIE Vitis vinifera
Fuente: propia
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5. HIPTESIS

Los microorganismos fertilizantes pueden ser aislados de suelos cultivados con Vitis
vinfera, localizados en el sector de Moquegua.

6. FORMULACIN

Es posible aislar microorganismos biofertilizadores de suelos cultivados con Vitis vinfera?

7. ANTECEDENTES


8. MATERIALES Y MTODOS

8.1. Participantes

La investigacin aqu detallada cuenta con la participacin de los estudiantes Nancy
Castillo, Carmen Centeno y Milagros Soto. La fase de laboratorio se desarrollar en
las instalaciones ubicadas en la universidad privada Jos Carlos Maritegui,
Moquegua, y al mismo tiempo en las instalaciones de la Universidad Nacional de
Moquegua, ubicada en Ilo.
8.2. Fase de campo

8.2.1 rea de Muestreo
Las muestras fueron recolectadas de una plantacin de Vitis vinfera de la regin
Moquegua, Provincia de Mariscal Nieto, la muestra fue extrada a unos 20 cm de
profundidad del suelo perteneciente a la rizsfora del suelo, una vez recolectadas las
muestras fueron trasladadas al laboratorio donde deben ser homogeneizadas para
luego ser usadas para el aislamiento de las bacterias.
8.3 Fase de Laboratorio

a) Materiales , equipos y reactivos

Tubos de ensayo
Vasos de precipitado de 250 y 500 ml
Matraces de 250 y 500 mL
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Probetas 10, 100 y 500 mL
Cajas Petri de vidrios estriles
Asas de siembra
Gradilla
Mechero
Esptula
Succionador para pipetas
Autoclave
Balanza Analtica
Microscopio, Portaobjetos y cubreobjetos
Agar Nutritivo y Agar nutritivo con 5% sucrosa
Agar Czapeck y Agar para hongos y levaduras
Agua destilada estril
Solucin salina al 9%
Papel para esterilizar (Kraft)
Bote de aluminio para esterilizar pipetas

b) Aislamiento de Microorganismos fertilizantes a partir de las Muestras de
Suelo por Dilucin Seriada
La muestra de suelo es usada para preparar diluciones seriadas. Para ello, se
pesan 10 gramos de la muestra de suelo, los que son colocados en una
botella con 90 mililitros de agua de llave estril (dilucin 1/10). La suspensin
de suelo se agita por 45 minutos. Una vez trascurrido ste tiempo, se
preparan las diluciones hasta llegar a 1/106. Cien micros litros de las
diluciones, 1/102, 1/103, 1/104, 1/105, y 1/106 se colocan y extienden por
cuadruplicado, sobre la superficie de las cajas Petri que contienen los dos
tipos diferentes de medio de cultivo (para hongos y bacterias). Los platos se
incubaron por 15 das a 25C.

c) Preparacin de medios de cultivo
Pesar los gramos necesarios de acuerdo a las instrucciones del fabricante para
preparar medios de Agar Nutritivo para bacterias y Agar para hongos y
levaduras Adicionar el agua destilada y calentar a ebullicin para disolver con
agitacin. Medir y ajustar el pH si es necesario.
Esterilizar en autoclave a 121 C por 15 min.
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Distribuir 20 mL de medio a cada caja de Petri, dejar solidificar y someter a
prueba de esterilizacin a 37 C
d) Realizacin de la Siembra
Dividida la placa en tres partes, sembrar en cada tercio el inculo tomado de
los cultivos crecidos. Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo
crecido y se toma una gota de inculo que se extiende sobre el agar de la
placa deslizando el asa suavemente por su superficie en zig-zag.

e) Incubacin
De los medios sembrados a 37 C hasta que haya habido crecimiento
bacteriano.

f) Observacin de los resultados
En primer lugar, observar a simple vista diversas caractersticas como el color
y el borde de las colonias crecidas en el agar as como el olor y la turbidez del
medio ya que en algunos casos suelen ser tpicos de un determinado tipo de
microorganismo y pueden servir de ayuda a la hora de su identificacin.


















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9. CRONOGRAMA
CUADRO NRO. 2: CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES DEL PROYECTO
ETAPAS
semana
1 semana 2
semana
3
semana
4
semana
5
semana
6
semana
7
semana
8
Semana
9
semana
10
Planteamiento del proyecto x x x
Recoleccin de muestras x
Aislamiento de microorganismos x
Preparacin de medios de cultivo x
Realizacin de siembra x
Crecimiento bacteriano x x
Seguimiento del crecimiento x x
Observacin en microoscopio x
Extraccin de ADN x
Identificacin de los organismos x
Inoculacin de bacterias a cultivo de vid x
RESULTADOS x
INFORME FINAL DEL PROYECTO x
Fuente: propia
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