TIMP

Tissue Inhibitors of Metalleoprotease

Struttura, Funzione, Evoluzione
La Matrice Extracellulare
Ambiente in cui vivono le
cellule
Fornisce supporto
strutturale
Fornisce segnali e
informazioni vitali alle
cellule
Le componenti influenzano
direttamente il
comportamento delle
cellule
Fondamentale nel
coordinamento dei
movimenti durante lo
sviluppo
Le Metalloproteasi
Idrolizzano componenti della ECM
Coinvolte nel Turn-over e Omeostasi
della ECM
Giocano un ruolo fondamentale in
molti processi biologici

Collagene I II III

Laminine

Proteine di adesione (Caderine, Integrine)

Recettori di membrana
Ks

Tissue Inhibitors of MetalloProteinase
4 TIMP nei Mammiferi
P.M.= 21 28 Kda
Glicosilate nel RE Golgi Vescicole Esocitosi
Secrete Liberate nella ECM


Ancorate alla membrana
40% di Identit fra loro 50% tra TIMP 2 e 4
Omologhi nei Vertebrati
Struttura
Dominio Carbossi terminale
(CTD)
Dominio Ammino Terminale
(NTD)
3 Ponti Disolfuro
conservati
Non necessario
nellinibizione
Interazione
stabilizzante con
dominio
Hemopexinico delle
pro-MMPs e MT-MMP
3 Ponti disolfuro
conservati
Azione Inibente,
indipendente da
CTD
TIMP ricombinanti
(N-TIMP) sono
inibitori ad alta
affinit


Importante
nellininibizione delle
ADAM
Il Dominio NTD
Il Motivo OB-fold
Le 6 Cys che formano Caratteristiche della NTR-like Superfamily
3 ponti disolfuro
Origine comune o convergenza strutturale?






I TIMP sono inseriti allinterno degli introni delle
Sinapsine (SYN) con direzionalit inversa. Sinapsine
Eccezione: TIMP2 non contenuto in una sinapsina
ma contiene nel suo primo introne il gene DDC8
(Differential Dysplay Clone 8)
IL gene TIMP
Un Ruolo inatteso
I Timp formano complessi Specifici
con MT-MMPs
Questi complessi possono comunque
funzionare da inibitori di MMP
Il Complesso TIMP2- MT1-MMP
favorisce lattivazione proteolitica
di pro-MMP2
Non solo TIMP
Molte delle azioni biologiche dei TIMP non sono
riconducibili allazione inibente delle MMP:

TIMP 1 e 2: Erythroid potentiating activity (EPA)
Tutti i TIMP hanno attivit Antiangiogenica
TIMP1 e 2: Promuovono la crescita cellulare in alcuni tipi cellulari
ed hanno attivit antiapoptotica.
TIMP 3: induce Apoptosi

TIMP 1 e 2: sono tra i candidati
dei geni coinvolti nella plasticit
sinaptica
Tramite inibizione di ADAM 17
(Tumor Necrosis Factor Converting
Enzime)
Arresta la crescit dei tumori
Inibizione di ADAM10 (attivatore
di HER-2)
TIMP: an Ancient Family

4 TIMP
4 TIMP
10 TIMP
2 TIMP
1 TIMP
1 TIMP (NTD)
1 TIMP
3 TIMP
2 TIMP
TIMP sono presenti in tutto il regno animale
2 Domini (NTD e CTD)
La struttura si conservata Posizioni delle Cys
Dominio NTR-like
Maggiori variazioni tra TIMP degli Invertebrati che tra quelli
dei Vertebrati
Non c corrispondenza tra il numero di TIMP e la complessit dellorganismo
I Nematodi presentano un TIMP a singolo dominio
corrispondente allNTD dei Vertebrati Stesso pattern di Cys

II aa atipico
Forse non inibitore di MMP
Il TIMP ancestrale poteva essere
a singolo dominio?
No
LHydra presenta TIMPs a due domini
Levoluzione nei Vertebrati
I 4 TIMP dei Vertebrati sono derivati da duplicazioni di un TIMP ancestrale
comune a quello degli Artropodi
I 4 TIMP sono derivati da 3 duplicazioni, avvenute dopo la separazione tra
Artropodi e Deuterostomi.









I Mammiferi hanno ereditato tutte e 4 le isoforme
TIMP3 ha preservato maggiormente le funzioni ancestrali

(K. Brew et al.)
Drosophila: 2 MMP
1 TIMP
Il Timp di Drosophila sempre inserito nel gene della Sinapsina

Manca un ponte disolfuro

D-TIMP simile al TIMP3

D-TIMP inibisce entrambe
le MMP di Drosophila ed anche quelle Umane

Presenta una bassa attivit sulla Collagenase (MMP1)
Drosophila TIMP: modello degli invertebrati
TIMP fortemente espresso durante Sviluppo embrionale
La sottoespressione di TIMP necessaria durante la
metamorfosi per permettere:



Autolisi dei tessuti durante la Migrazione Assonica Rimodellamento dendritico
metamorfosi


Funzioni del TIMP in Drosophila
Mutanti TIMP
Creati tramite Transgenesi
sito specifica nel locus della
Sinapsina
I mutanti sono Subletali
con penetranza temperatura-
sensibile
Solo il 62% dei mutanti raggiunge
lo stadio adulto
Vitalit e Fertilit degli adulti sono drasticamente ridotte
32% presenta ali malformate


Stesso fenotipo dei mutanti
per le Integrine
(A. Godenschwege et al. 2000)
Alcuni mutanti presentano Fenotipi
simili ai mutanti dei Mammiferi
Distruzione della Funzione intestinale:







Alterazione dellespressione di MMPs e TIMP nei mammiferi
associata alla celiachia
Difetti nello sviluppo delle Trachee durante la Metamorfosi
Topi Mutanti TIMP 3 mostrano dilatazione
degli spazi aerei polmonari
Compromessa risposta fototattica



Topi mutanti TIMP2
non rispondo al
Condizionamento da paura
Topi mutanti TIMP1 hanno problemi
di memoria e apprendimento
Il TIMP di Ancylostoma
Presenta le due Cys conservate
Un solo dominio (NTD)
33% di identit e 50% di similarit con N-TIMP2,

Una delle proteine pi abbondanti nelle secrezioni del parassita
Potrebbe modulare le MMP nellospite
Gastrovascul
ar system
BBBB
Retractable
pharynx
La Planaria
Shmidtea mediterranea
Neoblasti
(marcatore Smedwi-1)
Blastema
Organizzazione del corpo a livello di
organi e sistemi
I Neoblasti allinterno del
parenchima sono circondati da una
ECM e migrano attraverso di essa

4 MMP: MMP1, MMP2, MT-MMPa,
MT-MMPb (Isolani et al, 2013)
Un solo TIMP

Analisi Bioinformatica sulla sequenza del TIMP di Planaria
mRNA-TIMP
Sequenza amminoacidica
Traduzione
Sequenza Proteica matura
Identificazione della
Sequenza proteica
Sequenza Proteica
Ricerca di domini conservati
Allineamenti con altri TIMP
Modello tridimensionale
Allineamento con i TIMP mammaliani
TI MP2_ CSCSPVHPQQAFCNADVVI RAKAVSEKEVDSGNDI - - YGNPI KRI QYEI KQI KMFKGE-
TI MP4_ CSCAPAHPQQHI CHSALVI RAKI SSEKVVPASADP- - - ADTEKMLRYEI KQI KMFKGFEK
TI MP3_ CTCSPSHPQDAFCNSDI VI RAKVVGKKLVKE- - - - - - - - GPFGTLVYTI KQMKMYRGFTK
TI MP1_ CTCVPPHPQTAFCNSDLVI RAKFVGTPEVNQ- - - - - - - - - TTLYQRYEI KMTKMYKGFQA
Pl anar i a CECKI ENFQQKFCSHDFVI I AKRVNSVMKLETFQSGLHNETFFSLQI KMKI MYNFKGFYS
* * : * : * . ** ** . . : * : : *



TI MP2_ - - - - KDI EFI YTAPSSAVCGVSLDVGGKKEYLI AGKAEGDGKMHI TLCDFI VPWDTLSTT
TI MP4_ V- - - KDVQYI YTPFDSSLCGVKLEANSQKQYLLTGQVLSDGKVFI HLCNYI EPWEDLSLV
TI MP3_ M- - - PHVQYI HTEASESLCGLKLEVN- KYQYLLTGRVY- DGKMYTGLCNFVERWDQLTLS
TI MP1_ LGDAADI RFVYTPAMESVCGYFHRSHNRSEEFLI AGKLQDGLLHI TTCSFVAPWNSLSLA
Pl anar i a DLT- KDNVKYYI SFMYGPCGSSLQLKRHRLYLI TGYI F- NKQMVVTSCNKVI SVNELNPL
. : . ** : : : . : : *. : : *.



TI MP2_ QKKSLNHRYQMGCE- CKI TRCPMI PCYI SSPDECLWMDWVTEKNI NGHQAKFFACI KRSD
TI MP4_ QRESLNHHYHLNCG- CQI TTCYTVPCTI SAPNECLWTDWLLERKLYGYQAQHYVCMKHVD
TI MP3_ QRKGLNYRYHLGCN- CKI KSCYYLPCFVTSKNECLWTDMLSNFGYPGYQSKHYACI RQKG
TI MP1_ QRRGFTKTYTVGCEECTVFPCLSI PCKLQSGTHCLWTDQLLQGSEKGFQSRHLACLPREP
Pl anar i a QAI GLFRQFYSNHCYFQNQCKKKNFCPI KLRSMSCLDKYGI CAPTMSENEVKCELI QRLV
* . : : . * : . . . : : :
NTD <- - ! - - > CTD


TI MP2_ GSCAWYRGAAPPKQEFLDI EDP
TI MP4_ GTCSWYRGHLPLRKEFVDI VQP
TI MP3_ GYCSWYRGWAPPDKSI I NATDP
TI MP1_ GLCTWQSLRSQI A- - - - - - - - -
Pl anar i a I FHSDLRKMPRI LRKKI KYSHN
:
Cisteine
aa identici
aa simili
foglietti
eliche
Regioni di
interazione
con MMP
(B. Zahan et al,
2002)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
S
i
m
i
l
a
r
i
t

c
o
n

S
m
e
d
-
T
I
M
P

(
%
)

*Con C.Elegans il confronto
stato eseguito considerando
soltanto il dominio NTD di
Planaria
Tra i TIMP umani, il TIMP3 In accordo con la teoria evolutiva
il pi simile a Smed-TIMP.
Tra gli invertebrati il TIMP dellHydra il pi vicino a Smed-TIMP: simili anche nel dominio CTD

Hydr a_ CMCMPVHPQSALCKAEYI I KAR- - - - VLSNKI I KVNNTDENFLNLGI PLPHHTVYKI LI N
Pl anar i a CECKI ENFQQKFCSHDFVI I AKRVNSVMKLETFQSGLHNETFFSLQI KMKI MYNFKGFYS
* * : *. : *. : : : * *: *: . : : : . : *. *: . * * : : * : .



Hydr a_ SVLKNANPSYRFNLQQI HSLHI PAAESNCGI QLEI GKLYLLTGKFEHSKLQMTNCDFHLK
Pl anar i a DLTKDNVKYY- - - - - - I SFMYGPCGSS- - - LQLKRHRLYLI TGYI FNKQMVVTSCNKVI S
. : *: * * : : *. . . * : **: : ***: ** : : . : : : *. *: : .



Hydr a_ WHQLTI DMI DGI NGKYD- - - CSCQI ATCMDGYCDNENACKWNLS- WDKSFEDCAYKHLNC
Pl anar i a VNELNPLQAI GLFRQFYSNHCYFQNQCKKKNFCPI KLRSMSCLDKYGI CAPTMSENEVKC
: : *. *: : : * * . . : * : . *. : . . : : . : : *
NTD <- - ! - - > CTD


Hydr a_ ERSNRKVCQWNQKSSYKQCLLAEKLFNDV
Pl anar i a ELI QRLVI FHSDLRKMPRI LRKKI KYSHN
* : * * . : . : * : : . .
Il TIMP di Planaria
Presenta il dominio NTR-like conservato (E-value: 2,08x10
-10
)
Ha le due Cisteine (Cys1 e Cys3) che formano ponti disofuro
SP
NH
2 COOH
1
239
32
162
NTR
SP
IL Dominio NTD contiene il sito di Inibizione
Le due Cys1 e Cys3 sono altamente
conservate
Il secondo residuo (Thr2) interagisce
con il Glu scalzando lH
2
0
Il IV residuo Val4 contatta la
tasca S1
Clonaggio
Estrazione del mRNA
Random Primers
Sintesi del cDNA
(Trascrittasi inversa)
CGTGTTAACTCAGTTATGAAATT
GCACAATTGAGTCAATACTTTAA
GAAAATGCCAAGAATTCTGAG
CT TT TACGGTTCTTAAGACTC
5
3
3
5
CGTGTTAACTCAGTTATGAAATT
CT TT TACGGTTCTTAAGACTC
5
5
Primer Senso
Primer Antisenso
PCR
Denaturation (94C)
and anneal (55C)
Denaturation
and anneal
(72C)
Smed TIMP
Smed TIMP
Estrazione dal Gel
e Purificazione
Smed TIMP
+
Vettore plasmidico pGem-T Easy
Trasformazione Batterica
Cellula batterica di E.Coli
Crescita
Batterica
Selezione
Estrazione del DNA plasmidico
1. Lisi della cellula
EDTA Glucosio 50mM NaOH
SDS
Estrazione del DNA plasmidico
3. Filtrazione
2. Neutralizzazione e Precipitazione
Potassio Acetato
TIMP
Digestione del DNA
TIMP
Direzione del filamento Senso
Digestione del DNA
TIMP
TIMP
TIMP
Digestione del DNA
Plasmide
Enzima di restrizione (Apa I)
Buffer Apa I
Overnight a 37C
Plasmide linearizzato
TIMP
TIMP
Trascrizione dellRNA Sonda in vitro
TIMP
RNA
GTP
ATP
CTP

Sonda RNA marcata
UTP marcata con Digossigenina
Trascrizione dellRNA Sonda in vitro
Plasmide linearizzato
Buffer SP6
RNA Polimerasi SP6
DIG RNA labeling Mix
Inibitore Rnasi
Sonda RNA TIMP
Digestione del DNA con DNasi
Precipitazione dellRNA
2h a 37C
EDTA
LiCl
Etanolo
TIMP
Ibridazione in situ Whole mount
1. Scelta degli animali
3. Rimozione del muco
e uccisione degli animali
NAC (N-acetil-cisteina)
4. Fissazione
Formaldeide
5. Permeabilizazione
SDS, DTT
Proteinasi K
6. Sbiancamento
H
2
O
2
in Metanolo (O.N)
oppure
Formammide (poche ore)

2. Scelta del gene di controllo
7. IBRIDAZIONE:
fattori che influenzano il processo
Temperatura: T
m
dipende dal contenuto in GC
della sequenza

pH: valori di pH elevati sono pi stringenti

[Cationi monovalenti]: basse concentrazioni (0,01-0,2 M)
sono pi stringenti
T
m
= 16,6 log[NaCl] + 0,41(GC) + 81,5

[Cationi bivalenti]: stabilizzano fortemente il duplex RNA,
devono essere rimossi con agenti chelanti (EDTA)

Solventi organici (Formammide): diminuisce la stabilit del duplex RNA,
permettendo allibridazione di avvenire a Temperature inferiori.
T
m
= 16,6 log[NaCl] + 0,41(GC) + 81,5 0,72(% formammide)

Dextran solfato: aumento apparente della [Probe]

Lunghezza del probe
8. Lavaggi di stringenza:
Formammide, basse [NaCl], alte Temperature;
Per rimuovere le sonde non appaiate o che hanno
formato appaiamenti errati

9. Anticorpo anti-DIG:

In Blocking Solution, per saturare i siti aspecifici con
cui potrebbe interagire lanticorpo. Aumenta la
specificit del segnale.
10. Rivelazione:
Buffer e substrato(NBT/BCIP) per la Fosfatasi alcalina
11. Lavaggi e Post-fissazione
12: Disidratazione
Etanolo e Glicerolo (80%)
Formaldeide
Risultati
Intatte
Dorsale
Ventrale
Rigeneranti
Tronco 2d
Tronco 5d
Testa 2d
Coda 2d
Blastema
Blastema
Risultati
Cinetica di Legame
I TIMP sono lenti Inbitori Tight-Binding
Modello di inibizione non competitiva a 2 Stadi
Inibizione Reversibile
E + S ES E + P
+ +
I I

EI EIS
Ks
Kcat
Ki
Ki
Inibizione Tight Binding
EI*

Lemivita del Complesso TIMP-
MMP (EI*) stata stimata
essere di 1 Anno!!
Modello cinetico in
contraddizione con il modello
strutturale
I Stadio
II Stadio
Costante di dissociazione del
complesso: Ki = pM
Ki
#
Energia di Legame
Per la formazione del Complesso TIMP-MMP:
H >0 (sfavorevole), S>>0 (favorevole)



Non risulta un aumento S H2O (Cp = 0)


Aumento dinamicit del TIMP