INTRODUCCION

La actividad de las enzimas y sus caractersticas se estudian en las clulas integras o en el

tubo de ensayo. Se han desarrollado tcnicas histoqumicas que permiten localizar y valorar
las enzimas intracelulares en cortes histolgicos. Gran parte de los conocimientos sobre las
enzimas proviene de su estudio en el tubo de ensayo.
Son varios los elementos capaces de influir en la accin de las enzimas, ya sea
acelerndolas o retardndolas, segn sus caractersticas.
Temperatura
La elevacin de la temperatura incrementa la velocidad de una reaccin catalizada por
enzimas. Al principio la velocidad de reaccin aumenta cuando la temperatura se eleva
debido al incremento de la energa cintica de la energa de las molculas reactantes.
Sin embargo, al final, la energa cintica de la enzima excede a la barrera energtica para
romper los enlaces dbiles de hidrogeno que conservan su estructura secundaria y terciaria.
A esta temperatura predomina la desnaturalizacin con prdida precipitada de la actividad
cataltica. Por tanto las enzimas muestran una temperatura ptima de accin. Los limites de
actividad para la mayor parte de las enzimas tiene lugar entre los 10C y 50C; la
temperatura optima para las enzimas en el cuerpo se hall alrededor de 37C.
El factor por el cual un proceso biolgico aumenta para un incremento de temperatura de
10C es el coeficiente de temperatura o Q10. El Q10 para la mayor parte de las enzimas
vara entre 1.5 y 3.
pH
La intensidad mxima de la actividad de la enzima, ocurre en el pH ptimo, con rpida
disminucin de la actividad a cada lado de este valor de pH. La actividad ptima
generalmente se observa entre los valores de 5 y 9.
El pH ptimo de una enzima puede guardar relacin con cierta carga elctrica de la
superficie, o con condiciones optimas para la fijacin de la enzima a su sustrato. Cuando
hay un exceso de iones hidrogeno, las enzimas los unen a sus molculas y ante un dficit
los ceden.
Este cambio tiene una doble consecuencia sobre la molcula. Como todas las protenas, las
enzimas desempean su funcin por los residuos de aminocidos; algunos confieren a su
superficie una distribucin de cargas elctricas.
Cuando la concentracin de iones hidrogeno es muy baja en comparacin con la
concentracin optima, la molcula los cede desapareciendo cargas positivas o apareciendo
cargas negativas en su superficie. Ante una concentracin elevada de iones hidrogeno,
algunos se fijan a la molcula desapareciendo cargas (-) o poniendo cargas (+) que no
existan.
As mismo al cambiar las cargas elctricas en los residuos de aminocidos se alteran los
lazos de unin dentro de la molcula variando su acomodo tridimensional con recuperacin
de la actividad de la enzima.
Transaminasas o transferasas
Este tipo de enzimas se encargan de transferirle grupo amino del glutamato a muchos -
cetocidos. La mayor parte de los aminocidos comunes se pueden formar por
transaminacin.
Durante la transaminacin, el grupo amino del aminocido donador pasa al -cetocido
aceptor, con lo cual se forma el -cetocido del aminocido donador y el aminocido del -
cetocido aceptor original.
OBJETIVO
Ver como es afectada la actividad enzimtica por los efectos producidos por los cambios de
pH y los cambios de temperatura.
MATERIAL
20 tubos de ensayo 2 vasos de precipitado 250 ml
4 pipetas graduadas 1 ml 4 pipetas de 5 ml
2 pipetas de 10 ml 1 pipeta Pasteur
2 tubos de centrifuga tubo homogenizador
gradilla parrilla
termmetro piceta
espectrofotmetro y celdas hielo
embudo de vidrio gasa
Material Biolgico
10 grs. De chicharos frescos
Reactivos
Sol. Amortiguadora de TRIS-HCl 40 mM, EDTA 0.25 mM, pH 7.5
Sol. Amortiguadora de TRIS-HCl 0.1 M, pH 7.5
Sol. Amortiguadora TRIS-HCl 0.1 M, pH 10
Sol. Amortiguadora de actico-acetato 0.1 mM, pH 5
Sol. NaOH 0.1 N
Sol. Patrn de cido Pirvico 0.5 mM
Sol. cida de 2,4-dinitrofenilhidrazina 1.5 mM
Sustrato para la enzima: a. asprtico 0.1 mM, -cetoglutarato 0.1mM, TRIS-HCl 0.1 M, pH
7.5
METODOLOGIA
OBTENCION DE LA ENZIMA
o Pesar 10 gramos de chicharos
o Picarlos y homogenizar con TRIS-HCl 40mM, pH 7.5
o Filtrar y centrifugar 3500 rpm, durante 5 minutos.
o El SN se debe mantener a una temperatura de 4C.
EFECTO DEL pH
o Se preparara la siguiente serie de tubos:
o la serie se junta con los incisos c y d, y se incuban a 37C durante 30
min.

tubo a (pH
5)
tubo b (pH
10)
sustrato 0.2 0.2
amortiguador pH 5 0.8 ----
amortiguador pH
10
---- 0.8
enzima 0.2 0.2
EFECTO DE LA TEMPERATURA
o Se preparara la siguiente serie de tubos:
o la serie se junta con los incisos b y d, y se incuban a 37C durante 30
min.

4 C 25 C 50 C
sustrato 0.2 0.2 0.2
amortiguador pH
7.5
0.8 0.8 0.8
enzima 0.2 0.2 0.2
CURVA PATRON DE ACIDO PIRUVICO
o Se prepara la siguiente serie de tubos:
o la serie se junta con los incisos b y c, y se incuban a 37C durante 30
min.
o

1 2 3 4 5 6
agua 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
patron ---- 0.1 0.2 0.4 0.8 1.0
sustrato 1 0.9 0.8 0.6 0.2 ----
Agregar a todos los tubos 1 ml de 2,4-dinitrofenilhidrazina
Agitar y dejar 20 minutos a temperatura ambiente
Agregar 5 ml de NaOH y agitar
Esperar 5 minutos y leer absorbancia a 505 nm.
RESULTADOS
o Los clculos que se presentan enseguida se utilizan para encontrar las
concentraciones por tubo, esto se realiza con la siguiente formula:
CiVi=CfVf
Los datos que se presentan en la tabla 1 se utilizaran para la construccin de
la curva patrn, tambin se ajustara la curva.
tabla 1.
tubo absorbancia
[patron]
mM
1 0 0
2 0.039 0.0416
3 0.060 0.0833
4 0.068 0.1666
5 0.090 0.333
6 0.106 0.4166
o Se construir una grafica de pH vs. Vo. Para esto se tiene que hacer los
siguientes clculos, de concentracin utilizando la ecuacin: y=0.0197x-
0.0086. Se sustituirn las absorbancias en la Y, y se convertirn los
resultados en mM a M.
Ahora tenemos que calcular la velocidad inicial. Esta se calculara con la
formula: .
En la tabla 2, se muestran los datos para hacer la grafica de pH vs. Vo.
tabla 2.
tubo absorbancia
[conc]
M
Vo
M/min.
pH 5 0.504 0.0251 0.0008366
pH 10 0.858 0.0431 0.001436
o En este punto se construir una grafica de temperatura vs. Vo. Con los
siguientes clculos se obtendrn los datos para hacer la grafica. Tambin se
utiliza la ecuacin de la curva patrn para hallar las concentraciones. Se
sustituirn las absorbancias en la Y, y se convertirn los resultados en mM a
M.
A continuacin se calculara la velocidad inicial, con la formula:



La tabla 3 muestra los datos que utilizaremos para la grafica de temperatura.
tabla 3.
tubo absorbancia
[conc]
M
Vo
min.
4 C 0.508 0.0253 0.0008433
25 C 0.536 0.0267 0.0008923
50 C 0.595 0.0297 0.000992
DISCUCION
Al realizar la prctica se tuvo mucho cuidado especialmente en la parte
donde se extrae la enzima, ya que de lo contrario los resultados no hubieran
sido satisfactorios. Al no haber tenido fallas en los procedimientos y al haber
comprobado los objetivos, entonces no parece haber mucho que discutir.
Se pudiera pensar que el objetivo que se trazo para la realizacin de esta
practica se logro casi satisfactoriamente. Ya que se observaron los cambios
que se llevan a cabo con el cambio del pH y el cambio de temperatura.
La teora nos indica que a temperaturas bajas la enzima pudiera llegar a
perder la actividad, esto seria momentneamente; entonces a temperaturas
altas, la enzima se desnaturalizara, pero, a una temperatura media (entre
unos 30C y 40C) la enzima funciona casi perfecta.
El pH es otro factor que influye en la manera de accionar de la enzima, pues,
como se menciona en la teora, cuando el pH es demasiado cido la enzima
trabajara menos, pero, a comparacin de un pH demasiado alcalino, la
enzima muestra actividad mayor que en la actividad mostrada a pH alcalino.
Los datos mostrados no dicen que de un pH 5 hacia abajo la enzima empieza
a perder actividad, y de pH 10 hacia arriba hace lo mismo, empieza a dejar
de trabajar. Esto nos lleva a pensar que al haber variaciones de aunque sean
dcimas, se puede afectar la manera de trabajar de la enzima. Por tanto, se
piensa que la practica estuvo bien realizada, al haber comprobado los
objetivos propuestos.
CONCLUSION
Con la realizacin de esta prctica pudimos darnos cuenta de los cambios
que puede sufrir la actividad enzimtica a causa de la variacin de pH y los
cambios de temperatura.
Podemos decir que el aumento de la actividad enzimtica, observado a 50C
o por encima de esta temperatura, es de corta duracin, ya que la enzima a
temperaturas muy altas como esta, tiende a perder sus propiedades y
desnaturalizarse, posteriormente se coagula la parte de la protena
enzimtica. Todo esto hace que desaparezca la actividad enzimtica.
Quiz a temperatura de 4C no tiene actividad la enzima, ya que a esta
temperatura la enzima se inhibe, al igual que las proteasas. Se puede pensar
que si las proteasas no trabajan a esta temperatura, entonces las
Transaminasas tampoco debieran trabajar, pues, tambin son enzimas.
Creemos que la mejor actividad enzimtica que se pudo haber obtenido
hubiera sido a una temperatura de 37C, ya que a esta temperatura la enzima
tiene una actividad optima. Ya que tericamente esta temperatura es la
adecuada para el funcionamiento de la enzima, nos hubiera dado un punto
ms de comparacin con las otras temperaturas. As, se podra ver en cual de
las temperaturas se llevo a cabo una mejor actividad enzimtica.
Al igual que los efectos causados por la temperatura, el pH tiene los suyos
que pueden alterar o favorecer la actividad de la enzima.
Esto se debe a que cuando el pH tiene tendencias alcalinas, la enzima
muestra una disminucin de la actividad. Caso contrario se observa a pH
cido, pues, la enzima se vio favorecida en su actividad, esto gracias al
medio cido en que se encontraba.
Podemos decir que nuestras observaciones nos llevan a decir que la
actividad enzimtica se vio disminuida en medios muy alcalinos, pero quiz
hubiera dejado de trabajar a un pH mucho mas alcalino; en cambio los
resultados obtenidos a un pH cido fueron de una mejor actividad, aunque
quiz, si hubiera sido un pH todava mas cido, la enzima hubiera dejado de
funcionar.
CUESTIONARIO
o segn los resultados, que sucede a pH acido y a pH alcalino. Dar una
breve explicacion.
Conforme el pH alcalino (de 10) va aumentando, la velocidad de reaccin de
la enzima disminuye, por lo tanto a pH cido (de 5) la velocidad de reaccin
de la enzima es ligeramente mayor en comparacin con la de pH 10.
o asi mismo, Qu efecto tuvo la temperatura?.
A medida que la temperatura va aumentando, la velocidad enzimtica es
mayor, sin embargo, existe un lmite, el que si se sobrepasa, puede tener
consecuencias que afecten a la enzima, como, desnaturalizacin y por lo
tanto puede perder su actividad.
BIBLIOGRAFA
MATHEWS, C. K. Y VAN HOLDE, K. E.
Bioqumica, McGraw Hill Interamericana, 2. Ed., Espaa, 1998.
WHITE, A., HANDLER, P., SMITH, E., HILL, R., LEHMAN, R.
Principios de Bioqumica, McGraw Hill, 1989.
MICROSOFT EXCEL 2002 (10.2614.2625)