Introduo Anlise Fitoqumica

Os produtos naturais possuem um papel importante, sendo uma das principais fontes de novas drogas nos prximos anos, pelas
seguintes razes:
a) incomparvel diversidade estrutural,
b) pequenas dimenses relativas de muitas molculas peso molecular ! "### $a),
c) grande variedade de propriedades farmacolgicas, como a capacidade de ser absorvida e metabolizada%
&rodutos naturais s'o metablitos secundrios extra(dos de plantas, organismos marin)os, microorganismos e animais%
O isolamento de produtos naturais ainda necessrio e urgente:
* +estado da arte,: metodologias para os processos de separa-'o e fracionamento%
&lanta: mil)ares de componentes
* .solamento: combina vrias tcnicas de separa-'o
* $ependem da solubilidade, volatilidade e estabilidade dos compostos a serem separados
Por qu estudar plantas?
&ossuem centenas de compostos,
&rodutos naturais biologicamente ativos constituem modelos para a s(ntese de um grande n/mero de frmacos,
$iversidade em termos de estrutura e de propriedades f(sicoqu(micas e biolgicas,
0stima*se que apenas 1#2 das plantas ten)am sido estudadas fitoquimicamente,
O 3rasil o pa(s com maior diversidade gentica vegetal do mundo, com mais de 44%### espcies catalogadas%
Mercado Mundial
$rogas de origem vegetal movimentam um mercado de 567 1",8 bil)es%
0uropa responsvel por 4#2 do mercado%
9itofrmacos e fitoterpicos s'o responsveis por "42 do receiturio mdico em pa(ses desenvolvidos e :#2 em pa(ses em
desenvolvimento%
1;:<*1;;8 nos 05=
* 4"# frmacos aprovados pelo 9$=
* 14> <#2) produtos naturais ou derivados
* ?12 dos frmacos antic@ncer derivados de produtos naturais
1;;? no 3rasil
* 567 : bil)es de faturamento na ind/stria farmacAutica
* "42 originados de medicamentos derivados de plantas
&esquisa 9itoqu(mica:
* Bon)ecer os constituintes qu(micos de espcies vegetais%
* =valiar a presen-a dos mesmos%
=nlise 9itoqu(mica &reliminar:
* &ode indicar os grupos de metablitos secundrios relevantes em uma espcie%
0tapas da &esquisa 9itoqu(mica:
Boleta do material vegetal C &repara-'o do material vegetal C 0xtra-'o =nlise fitoqu(mica preliminar C 9racionamento .solamento C
0lucida-'o estrutural
Coleta do material vegetal
&rimeira etapa da investiga-'o fitoqu(mica%
D essencial que se prepare uma exsicata para identifica-'o bot@nica%
* 0vitar partes afetadas por doen-as, parasitas e materiais estran)os%
Eegistrar local, )ora e data da coleta%
Fesmo utilizando material fresco, ) necessidade de prepara-'o de exsicata%
Preparao do material vegetal
Faterial fresco
* $etec-'o de alguns componentes espec(ficos%
* Gantagem: evita a presen-a de subst@ncias oriundas do metabolismo de morte da planta%
* $esvantagem: deve ser processado imediatamente ou conservado a baixas temperaturas%
Faterial seco
* Gantagem: maior estabilidade qu(mica%
* $esvantagem: cuidados especiais para interromper o metabolismo aps coleta da planta%
a) 0stabiliza-'o e secagem:
0stabiliza-'o: a desnatura-'o protica das enzimas celulares, seHa por a-'o de agentes desidratantes quanto pelo calor%
ObHetivo: impedir a a-'o enzimtica, evitando a altera-'o de compostos qu(micos originalmente presentes na amostra%
6ecagem: a retirada de gua da planta%
ObHetivos: impedir rea-es de )idrlise e de crescimento microbiano% = umidade residual depende do tipo de rg'o que constitui o
material vegetal%
= secagem se caracteriza pela exposi-'o a temperaturas relativamente baixas, normalmente inferiores a ?#IB, por longo per(odo de
tempo, geralmente em torno de > dias%
O material deve ser finamente dividido e disposto em camadas finas%
= secagem pode ser feita ao ar livre ou em estufas%
6ecagem ao ar livre
* D mais econJmica,
* Faior vigil@ncia para garantir uniformidade das condi-es,
* $eve ser realizada K sombra,
* Local seco e protegido de ataque de insetos ou contaminantes ambientais%
6ecagem em estufas
* 5tiliza*se estufas equipadas com termostato produzindo ar quente,
* Fanuten-'o da temperatura constante durante a secagem,
* 0stufas equipadas com sistema de circula-'o de ar s'o mais eficazes%
* = secagem propicia a redu-'o de peso e volume e facilita a moagem dos materiais%
b) Foagem:
Eedu-'o do material vegetal mecanicamente a fragmentos de pequenas dimenses%
= escol)a da dimens'o do material vegetal depende da textura do rg'o% Muanto mais r(gido forem os tecidos, maior o grau de divis'o
necessrio%
=s metodologias utilizadas para reduzir o taman)o do material vegetal s'o escol)idas conforme as caracter(sticas deste%
$ivis'o grosseira:
* 6eccionamento: tesouras, podes ou facas
* .mpacto: Eedu-'o a fragmentos por meio de c)oques repetidos por exemplo, no gral)
* Easura-'o: raspadores ou processadores de alimentos%
&ulveriza-'o:
* Bom gral: empregando ou n'o um intermedirio de pulveriza-'o%
* Foin)os: pinos, Hato de ar, discos, martelos, facas%
!trao
0xtra-'o significa retirar, de forma mais seletiva e completa poss(vel, as subst@ncias ou fra-'o ativa contida na droga vegetal,
utilizando, para isso, um l(quido ou mistura de l(quidos apropriados e toxicologicamente seguros%
O produto resultante dessa extra-'o slido*l(quido c)amada de solu-'o extrativa, que n'o deve ser confundida com o produto de
uma extra-'o l(quido*l(quido, quando s'o obtidas fra-es enriquecidas ou subst@ncias purificadas%
9atores que afetam a opera-'o de extra-'o:
* Baracter(sticas do material vegetal,
* Nrau de divis'o do material vegetal,
* O meio extrator solvente),
* Fetodologia%
Anlise "itoqumica preliminar
Blassicamente, a caracteriza-'o dos principais grupos de subst@ncias vegetais de interesse tem sido conseguida pela realiza-'o de
rea-es qu(micas que resultem no desenvolvimento de colora-'o eOou precipita-'o caracter(sticos%
=s rea-es feitas diretamente com o extrato bruto podem mascarar o resultado%
O fracionamento do extrato e o teste com as fra-es obtidas possibilita rea-es mais n(tidas%
= amostra pode precisar de um tratamento preliminar:
a) &arti-'o de subst@ncias entre duas fases imisc(veis, uma aquosa e outra org@nica,
b) 9orma-'o de sais com diferen-as de solubilidade em rela-'o Ks bases ou aos cidos que l)es deram origem%
Bom o avan-o dos mtodos de extra-'o e isolamento, na maioria das vezes, desnecessrio submeter extratos vegetais a tratamentos
qu(micos preliminares%
Fracionamento e Isolamento
Os processos de fracionamento de extratos vegetais com vistas ao isolamento de subst@ncias ativas podem ser monitorados por ensaios
direcionados para a avalia-'o de atividade biolgica%
9racionamento: o processo em que se consegue uma fra-'o parcialmente pura, ou seHa, obtm*se um grupo de subst@ncias%
.solamento: o processo em que se consegue uma subst@ncia ou composto puro%
&ara o fracionamento e isolamento das subst@ncias tAm*se dois grupos de mtodos que s'o mais comuns:
Partio por solventes: mais simples e barata, sendo utilizada para vrias finalidades%
M#todos cromatogr"icos: s'o mais variados, podendo ser utilizados para o fracionamento, purifica-'o e isolamento das subst@ncias%
lucidao estrutural
Os primeiros pesquisadores que se dedicaram K elucida-'o estrutural das subst@ncias n'o dispun)am das tcnicas de anlise
dispon(veis atualmente%
=s tcnicas atuais permitem a elucida-'o de estruturas extremamente complexas, com amostras da ordem de miligramas ou menos%
Os pioneiros levavam Ks vezes anos tentando purificar e identificar uma /nica subst@ncia%
Os mtodos eram pouco sens(veis%
Bonsumiam grandes quantidades de amostras, pois ela precisava ser submetida a transforma-es qu(micas diversas%
0ntre os mtodos f(sicos de anlise empregados atualmente na determina-'o estrutural est'o:
= 0spectrometria de Fassas 0F)%
= espectroscopia no 5ltravioleta 5G), Gis(vel e no
.nfravermel)o .G)%
= Eesson@ncia Fagntica Puclear de QidrogAnio e de Barbono 1< EFP de 1Q e de 1<B)%
a$ spectroscopia no In"ravermel%o &I'$
O espectro no .nfravermel)o .G) de uma subst@ncia org@nica corresponde ao conHunto de bandas de absor-'o apresentadas pela
amostra submetida K radia-'o infravermel)a e estas bandas correspondem Ks mudan-as na energia vibracional dos compostos%
= energia seletivamente absorvida da radia-'o .G provoca altera-es transitrias nas liga-es interatJmicas que podem sofrer
estiramentos ou deforma-es nos @ngulos de liga-'o%
$iversos grupos funcionais vibram e d'o origem a bandas de absor-'o caracter(sticas%
Bada grupo absorve luz em freqRAncia espec(fica%
=prender recon)ecer algumas bandas de absor-'o mais notveis%
=s freqRAncias em que ocorrem as vibra-es dependem da natureza das liga-es em particular, mas s'o tambm afetadas pela
vizin)an-a qu(mica e pela molcula como um todo%
= presen-a de insatura-es conHugadas ou n'o), sistemas aromticos e grupos funcionais espec(ficos pode ser verificada atravs de
bandas caracter(sticas, que tAm grande import@ncia na anlise estrutural%
($ spectroscopia de )M* de +, e de +-C
= espectroscopia de EFP de 1Q e de 1<B uma das ferramentas mais valiosas para a determina-'o estrutural de compostos
org@nicos contribuindo para o esqueleto da molcula%
&ermite a caracteriza-'o de n/cleos individuais e muito importante para a elucida-'o estrutural de todas as classes de produtos
naturais, incluindo metablitos secundrios vegetais%
Eesson@ncia magntica nuclear basicamente uma outra forma de espectroscopia de absor-'o%
Bampo magntico aplicado S absor-'o de radia-'o eletromagntica na regi'o de radiofrequAncia%
0spectro de EFP um registro grfico das frequAncias dos picos de absor-'o contra suas intensidades%
Os espectros de EFP de 1Q e de 1<B s'o os mais utilizados e sua interpreta-'o permite caracterizar o n/mero e os tipos de tomos de
Q e de B, em fun-'o da localiza-'o e do desdobramento dos sinais correspondentes K absor-'o de energia eletromagntica%
Os espectros de EFP de 1Q e de 1<B s'o os mais utilizados e sua interpreta-'o permite caracterizar o n/mero e o tipos de tomos de
Q e de B, em fun-'o da localiza-'o e do desdobramento dos sinais correspondentes K absor-'o de energia eletromagntica%
= grande variedade de tcnicas dispon(veis de EFP BO6T, PO06T, QFMB, Q6MB, QF3B, .P0&U) permite identificar a
proximidade espacial ou mesmo conectividade de alguns tomos em particular, auxiliando dessa maneira, na montagem do quebra-
cabea constitu(do pelas diferentes partes da molcula%
c$ spectroscopia no .ltravioleta &.'$
= espectroscopia no 5ltravioleta 5G) basicamente mais uma tcnica de absor-'o, sendo simples e rpida%
5ma vez determinado o esqueleto carbJnico e o tipo de molcula, indica a presen-a de certos grupos funcionais, bem como a posi-'o
dos substituintes na molcula%
D uma tcnica muito /til para flavonides, porque proporciona informa-es sobre a presen-a e a posi-'o de grupamentos )idroxila no
sistema de anis, ao mesmo tempo em que possibilitam a diferencia-'o entre os vrios tipos de flavonides%
D uma tcnica utilizada tanto para a detec-'o quanto para o monitoramento da pureza de derivados flavJnicos durante o processo de
isolamento%
d$ spectrometria de Massas &M$
= espectrometria de massas Huntamente com a espectroscopia de EFP de 1Q e de 1<B uma das ferramentas mais valiosas para a
determina-'o estrutural de compostos org@nicos%
&ermite determinar a massa molecular e a frmula molecular de uma subst@ncia, alm de certas caracter(sticas estruturais como os
padres de fragmenta-'o%
= massa molecular permite estabelecer a frmula molecular da subst@ncia, enquanto o padr'o de fragmenta-'o pode aHudar a
caracterizar a presen-a, bem como a localiza-'o de certos grupos funcionais e cadeias laterais%
= espectrometria de massas utiliza apenas uma pequena quantidade de amostra, sendo rpida e simples%
= grande desvantagem por ser uma tcnica cara%
$as tcnicas instrumentais a /nica que n'o envolve radia-'o eletromagntica, por isso c)amada de espectrometria%
M#todos de !trao
0xtra-'o significa retirar, de forma mais seletiva e completa poss(vel, as subst@ncias ou fra-'o ativa contida na droga vegetal,
utilizando, para isso, um l(quido ou mistura de l(quidos apropriados e toxicologicamente seguros%
O produto resultante dessa extra-'o slido*l(quido c)amada de solu-'o extrativa, que n'o deve ser confundida com o produto de
uma extra-'o l(quido*l(quido, quando s'o obtidas fra-es enriquecidas ou subst@ncias purificadas%
9atores que afetam a opera-'o de extra-'o:
* Baracter(sticas do material vegetal,
* Nrau de divis'o do material vegetal,
* O meio extrator solvente),
* Fetodologia%
/rau de diviso do material vegetal0
* .nfluencia diretamente a eficiAncia da extra-'o,
* BonsistAncia das partes da planta bastante )eterogAnea ra(zes e caules s'o muito compactos, enquanto fol)as e flores s'o mais
delicadas),
* O poder de penetra-'o do solvente depende da consistAncia do tecido que forma o material vegetal quanto mais r(gido, mais dif(cil a
extra-'o),
* Muanto mais r(gido o material, menor deve ser sua granulometria%
1olvente0
* $eve ser o mais seletivo poss(vel,
* 0xtrai*se apenas subst@ncias deseHadas ou em maior quantidade,
* O con)ecimento do grau de polaridade do grupo de subst@ncias que se deseHa extrair determina o solvente ou mistura de solventes que
mais se aproxima do timo de seletividade para aquela extra-'o%
* Muando n'o se con)ece previamente o conte/do do material, faz*se sucessivas extra-es com solventes de polaridades crescentes, uma
extra-'o fracionada, obtendo*se subst@ncias com polaridades tambm crescentes%
* &oucas subst@ncias l(quidas s'o utilizadas na extra-'o de drogas vegetais,
* 9atores importantes: propriedades extrativas, toxicidade ou risco de manuseio, disponibilidade e custo do solvente%
* &ropriedades extrativas
Bompreendem a eficiAncia e seletividade com que o l(quido extrator dissolve, K temperatura ambiente, uma subst@ncia de interesse,
dependendo sobretudo dos par@metros de solubilidade do solvente e do soluto%
&raticamente todos os constituintes de interesse apresentam alguma solubilidade em solu-es metanlicas ou etanlicas a :#2, sendo
empregadas com frequAncia% = gua um dos l(quidos extratores mais empregados, sendo utilizada na extra-'o de subst@ncias
)idrof(licas, como aminocidos, a-/cares, alcalides na forma de sal, saponinas, )eteros(deos flavono(dicos e mucilagens% = extra-'o de
determinadas subst@ncias ainda pode ser infuenciada pelo pQ do l(quido extrator% O exemplo clssico a extra-'o de alcalides
natureza alcalina) com solu-es cidas%
* Uoxicidade ou risco de manuseio
6olventes txicos como metanol e diclorometano devem ser pouco utilizados% O uso de clorofrmio deve ser o m(nimo poss(vel%
* $isponibilidade e custo do solvente
Muanto mais abundante e mais barato o solvente, mais ele pode ser utilizado, como por exemplo, gua e etanol%
Metodologia0
* Os fatores relacionados aos processos de extra-'o dizem respeito a agita-'o, temperatura e tempo necessrio para execut*los%
1% =gita-'o: pode diminuir o tempo do processo extrativo, H que esse depende de fenJmenos de difus'o,
"% Uemperatura: o aumento provoca um aumento da solubilidade das subst@ncias, por isso, os processos de extra-'o a quente
s'o mais rpidos% Limita-'o * muitas subst@ncias s'o instveis em altas temperaturas,
<% Uempo de extra-'o: varia em fun-'o da rigidez do material e seu estado de divis'o, natureza das subst@ncias a extrair, do
solvente e emprego ou n'o, de agita-'o e temperatura%
* Pa escol)a de um processo extrativo deve*se avaliar ainda, a eficiAncia, a estabilidade das subst@ncias extra(das, a disponibilidade dos
meios e o custo do processo escol)ido%
* 5ma das formas mais aceitas de classificar os processos de extra-'o segundo a sua eficiAncia: &rocessos de extra-'o parcial
extra-'o sem esgotamento): macera-'o e suas variveis, turbo*extra-'o% &rocessos de extra-'o exaustiva: permitem o esgotamento da
matria prima, como por exemplo, percola-'o, a extra-'o em contra*corrente, etc%
M#todos de !trao 12lido34quido
+5!tra6es a "rio
Os mtodos de extra-'o a frio a macera-'o e a percola-'o%
Os mtodos s'o realizados a baixas temperaturas%
&ode*se empregar agita-'o ou n'o%
a$ Macerao e metodologias derivadas0
D o mtodo no qual a extra-'o da matria*prima vegetal realizada em recipiente fec)ado, a baixas temperaturas, durante um per(odo
prolongado )oras ou dias), sob agita-'o ocasional e sem renova-'o do l(quido extrator%
&ela sua natureza, n'o conduz ao esgotamento da matria*prima vegetal, seHa devido a satura-'o do l(quido extrator ou ao
estabelecimento do l(quido difusional entre o meio extrator e a clula%
$iversas varia-es s'o con)ecidas obHetivando, essencialmente, o aumento da eficiAncia da extra-'o: Facera-'o din@mica: macera-'o
feita sob agita-'o mec@nica constante, Eemacera-'o: quando a opera-'o repetida utilizando o mesmo material vegetal, renovando*se
apenas o l(quido extrator%
Os principais fatores que influenciam a eficiAncia da macera-'o est'o vinculados:
* Faterial vegetal: quantidade, natureza, teor de umidade, taman)o da part(cula, capacidade de intumescimento%
* L(quido extrator: seletividade e quantidade%
* 6istema: propor-'o droga O l(quido extrator, temperatura, agita-'o, pQ, tempo de extra-'o%
=s drogas mais indicadas para serem extra(das por macera-'o s'o aquelas ricas em subst@ncias ativas que n'o apresentam uma
estrutura celular, como gomas, resinas e alginatos%
0m )omeopatia, na prepara-'o de tinturas*m'es, os l(quidos extratores preferidos s'o etanol e solu-es )idroetanlicas%
L(quidos volteis s'o raramente utilizados%
6olu-es )idroetanlicas com concentra-'o de etanol maior que "#2 para evitar crescimento microbiano%
($ Percolao e metodologias a"ins0
0ste mtodo tem como caracter(stica a extra-'o exaustiva das subst@ncias ativas% Pa percola-'o, a droga vegetal mo(da colocada em
um recipiente cJnico ou cil(ndrico percolador), de vidro ou de metal, atravs do qual feito passar o l(quido extrator%
O procedimento usual de percola-'o caracteriza a percola-'o simples e a percola-'o fracionada% O produto obtido o percolado%
= percola-'o uma opera-'o din@mica, indicada na extra-'o de subst@ncias, farmacologicamente ativas, presentes em pequenas
quantidades ou pouco sol/veis e quando o pre-o da droga relevante%
Garia-es: repercola-'o, percola-'o em bateria ou sequencial, extra-'o em carrossel e contra*corrente%
&ercola-'o simples:
* .ntumescimento da droga com o l(quido extrator, durante 1 ou " )oras, fora do percolador, * 0mpacotamento )omogAneo e n'o
compacto do percolador, * = altura do enc)imento deve ser na propor-'o e 4:1 em rela-'o ao di@metro mdio do recipiente,
* Gelocidade de fluxo em percoladores oficinais, considerando um taman)o de part(cula de 1 a < mm Lenta #,4 a 1 mLOminOVg)
Foderada 1 a " mLOminOVg) Epida " a 4 mLOminOVg)
* $esvantagem: quantidade de l(quido extrator requerido para esgotar a droga vegetal% 6olu-'o: uso de percoladores em srie%
&ercola-'o fracionada:
* .mplica na separa-'o das duas ou trAs primeiras fra-es do percolado, que contAm, normalmente, em torno de >4*:#2 das subst@ncias
pass(veis de extra-'o, das fra-es seguintes mais dilu(das%
75 !tra6es a quente em sistemas a(ertos
6'o exemplos de mtodos de extra-'o a quente em sistemas abertos a turbo * extra-'o, a infus'o e a decoc-'o%
Os mtodos s'o realizados com aquecimento e contato com o solvente quente durante um certo per(odo de tempo%
a$ 8ur(o 3 e!trao0
D o mtodo no qual a extra-'o ocorre com simult@nea redu-'o de taman)o de part(cula, resultado da aplica-'o de elevadas for-as de
cisal)amento, geradas no pequeno espa-o compreendido entre o estator e um rotor de alta velocidade de 4%### a "#%### rpm%
= redu-'o drstica do taman)o de part(cula e o conseqRente rompimento das clulas favorece a rpida dissolu-'o as subst@ncias
ativas%
O tempo de extra-'o fica na ordem de minutos, com quase total esgotamento da droga vegetal%
Gantagens: 6implicidade, rapidez e versatilidade do mtodo,
9cil utiliza-'o em processamentos em pequena e mdia escala%
$esvantagens:
* $if(cil separa-'o da solu-'o extrativa por filtra-'o,
* Nera-'o de calor durante o procedimento necessidade de controlar a temperatura, restringindo o uso de l(quidos volteis),
* Limita-'o quando se trata de caules, ra(zes e materiais de elevada dureza%
($ In"uso0
D o mtodo no qual a extra-'o se d pela permanAncia, durante certo tempo, do material vegetal em gua fervente, num recipiente
tapado%
D aplicvel a partes vegetais de estrutura mole, as quais devem ser contundidas, cortadas ou pulverizadas grosseiramente, conforme a
sua natureza, a fim de que possam ser mais facilmente penetradas e extra(das pela gua%
c$ 9ecoco0
D o mtodo no qual a extra-'o do material vegetal se d pelo contato, durante certo tempo, com o solvente normalmente a gua) em
ebuli-'o%
D um mtodo de emprego restrito, pois muitas subst@ncias ativas s'o alteradas por um aquecimento prolongado%
Bostuma*se empreg*la com materiais vegetais duros ou de natureza len)osa, como cascas, caule, raiz, sementes e frutos secos%
-5 !tra6es a quente em sistemas "ec%ados
6'o exemplos de mtodos de extra-'o a quente em sistemas fec)ados a extra-'o sob refluxo e extra-'o em aparel)o 6ox)let%
Os mtodos s'o realizados com aquecimento e contato com o solvente quente durante um certo per(odo de tempo%
a$ !trao so( re"lu!o0
D o mtodo no qual a extra-'o se d pelo contato do material vegetal com um solvente em ebuli-'o, em um aparel)o dotado de um
recipiente, onde ser colocado o material e o solvente, acoplado a um condensador%
Peste mtodo, o solvente evaporado durante o processo recuperado e volta ao conHunto%
$esvantagem: as subst@ncias ativas podem ser alteradas por um aquecimento prolongado%
($ !trao em aparel%o 1o!%let0
D utilizada, sobretudo, para extrair slidos com solventes volteis, exigindo o emprego do aparel)o de 6ox)let% 0m cada ciclo de
opera-'o, o material vegetal entra em contato com o solvente renovado%
Gantagens: 0xtra-'o altamente eficiente, 0mprego de uma quantidade reduzida de solvente em compara-'o com outros mtodos
extrativos%
$esvantagem: as subst@ncias ativas podem ser alteradas por um aquecimento prolongado%
Anlise Fitoqumica Preliminar
&ara algumas subst@ncias, em certos vegetais, pode*se realizar rea-es de caracteriza-'o diretamente sobre os tecidos do material
vegetal%
0ntretanto, na maioria das vezes, a caracteriza-'o de um determinado grupo de subst@ncias presentes em um vegetal s pode ser feita
aps sua extra-'o com um solvente adequado%
Blassicamente, a caracteriza-'o dos principais grupos de subst@ncias vegetais de interesse tem sido conseguida pela realiza-'o de
rea-es qu(micas que resultem no desenvolvimento de colora-'o eOou precipita-'o caracter(sticos%
&ara algumas rea-es, o extrato pode ser empregado diretamente, enquanto para outras, o solvente deve ser previamente retirado%
0ssas rea-es podem ser realizadas em tubos de ensaio ou por detec-'o cromatogrfica com reagentes espec(ficos%
=s rea-es feitas diretamente com o extrato bruto podem mascarar o resultado%
O fracionamento do extrato e o teste com as fra-es obtidas possibilitam rea-es mais n(tidas%
5m dos primeiros roteiros de anlise sistemtica de misturas complexas, foi proposto em 1:4# pelo qu(mico belga W% 6% 6tas e
modificado pelo farmacAutico alem'o 9% W% Otto%
O roteiro se baseia em dois princ(pios:
a) &arti-'o de subst@ncias entre duas fases imisc(veis, uma aquosa e outra org@nica,
b) 9orma-'o de sais com diferen-as de solubilidade em rela-'o Ks bases ou aos cidos que l)es deram origem%
O mtodo proposto por 6tas e Otto adequado para subst@ncias como alcalides, por exemplo%
0ntretanto, muitas subst@ncias s'o sens(veis a cidos e bases, o que impede o uso deste mtodo cumarinas)%
Bom o avan-o dos mtodos de extra-'o e isolamento, na maioria das vezes, desnecessrio submeter extratos vegetais a tratamentos
qu(micos preliminares%
Caracteri:ao de algumas classes de compostos por m#todos qumicos
+5Cumarinas0
* $etec-'o em cromatografia em camada delgada BB$),
* =parecem manc)as de cores como azul, amarela e roxa, sob a-'o da luz 5G <?# nm), que podem ser real-adas aps exposi-'o ao
vapor de amJnio, ou revela-'o com XOQ a 42 em FeOQ%
* 0m solu-es alcalinas, desenvolvem colora-'o amarela, devido ao rompimento do anel lactJnico, que revertida pela adi-'o de
solu-'o cida%
75 Poli"en2is0
* 6'o subst@ncias redutoras e, portanto, oxidam*se com facilidade, resultando em subst@ncias coradas devido ao elevado grau de
conHuga-'o%
* 6ubst@ncias oxidantes podem ser empregadas para a caracteriza-'o de polifenis, tais como o cloreto frrico 9eBl<), que d a
colora-'o azul ou verde*azulada%
a$ Flavon2ides0
0nsaios cromticos:
* Eea-'o de cianidina, 6)inoda ou )idrogena-'o: consiste em adicionar um pequeno peda-o de magnsio a solu-'o alcolica cida da
subst@ncia%
Bolora-'o passa de amarelo para vermel)o%
* Eea-'o citro*brica ou Eeativo de Yilson: as solu-es cetJnicas de flavonas, flavonis e c)alconas adquirem tons amarelados e
fluorescAncia amarelo*esverdeada quando os cidos c(trico e brico s'o dissolvidos em acetona, ou solu-es vermel)o*alaranHado
quando os mesmos s'o dissolvidos em anidrido actico%
* Eea-'o com Q"6O8 concentrado: os compostos flavJnicos formam sais de oxJnio com cido sulf/rico concentrado, que podem ser
precipitados pela adi-'o de gua%
9ormam fortemente amareladas, laranHa a vermel)o e vermel)o a carmim, dependendo do tipo de flavonide%
* Eea-'o de Farini*3ettolo: o pentacloreto de antimJnio em tetracloreto de carbono reage de forma anloga% =s c)alconas formam
precipitados vermel)o escuro ou violceo e, as flavonas, precipitado amarelo ou laranHa%
0nsaios cromatogrficos em BB$:
* O adsorvente pode ser s(lica gel, poliamida ou celulose%
* = presen-a de flavonides no extrato vegetal bruto pode ser caracterizada pelo aparecimento de fluorescAncias sob a incidAncia de luz
5G "48 e <?4 nm)%
P& O &0N difenilboriloxietilamina 1,#2 em metanol, seguida de solu-'o de polietilenoglicol 8### 4,#2 em etanol): intensifica as
fluorescAncias dos flavonides quando observadas no 5G a "48 nm%
* Eeagente de 9olin*Biocalteau fosfomolibdato*fosfotungstato) seguido da exposi-'o aos vapores de amJnia o reagente de escol)a
para a detec-'o de flavonides, aparecendo manc)as azuladas ou acinzentadas%
($ 8aninos0
* Grios mtodos con)ecidos e tradicionais s'o usados para o recon)ecimento de taninos:
Ueste com solu-'o de gelatina a 12, contendo 1#2 de PaBl: fornece precipitado ou mesmo turva-'o%
&recipita-'o com alcalides, podendo ser usado solu-es de cinc)onina, cafe(na ou estricnina a 1*"2%
0nsaios cromticos:
* Eea-'o com cloreto frrico 9eBl<): os taninos )idrolisveis produzem, com solu-'o dilu(da de 9eBl< em meio bsico, uma forte
colora-'o azul, H taninos condensados em solu-'o aquosa resultam numa colora-'o verde, cuHa intensidade mais fraca do que dos
taninos )idrolisveis%
* Eeativo de 6tiasnZ QBl concentrado e formol): uma solu-'o de taninos mantida sob refluxo com QBl concentrado e formol por <#
minutos% Uaninos condensados formam precipitados e s'o separados por filtra-'o% = presen-a de cido glico no filtrado pode ser
verificada pela adi-'o de cloreto frrico%
* Eea-'o de 3orntrag[r: em solu-es alcalinas os compostos antraquinJnicos adquirem intensa colora-'o violeta a p/rpura, inclusive
com bases fracas como PQ8OQ%
* &ode*se tambm borrifar uma solu-'o aquosa alcalina sobre a superf(cie do vegetal, para caracterizar a presen-a de derivados
)idroxiantracAnicos%
-5 Alcal2ides0
* =s rea-es gerais para alcalides baseiam*se na forma-'o de complexos insol/veis precipitados)%
* Bomo os resultados falso*positivos s'o bastante comuns para essas rea-es, previamente o material a ser analisado deve ser submetido
a extra-es cido*base%
* Os alcalides podem ser detectados por diversos mtodos:
0xemplos:
Observa-'o da extin-'o de luz 5G em "48 nm, em placas de s(lica gel com indicador de fluorescAncia%
$etec-'o de fluorescAncia em <?? nm pode ser muito /til para diversos alcalides, como por exemplo, os alcalides do espor'o*de*
centeio%
* =s rea-es gerais empregam:
Eeagente de $ragendorff solu-'o de iodo*bismutato de potssio em cido dilu(do): precipitados laranHa*avermel)ados%
Eeagente de FaZer solu-'o de iodo*mercurato de potssio): precipitados brancos%
.odo*platinato de potssio: manc)as violeta a azul acinzentadas%
* =lcalides trop@nicos:
= rea-'o mais utilizada aquela desenvolvida por Gitali e Nerard, em que uma quantidade m(nima at #,###1 mg) de atropina,
)iosciamina e escopolamina tratada com QPO< concentrado e ao res(duo obtido, adiciona*se solu-'o de XOQ em 0tOQ% $esenvolve*
se colora-'o p/rpura, passando a vermel)o escuro e, finalmente incolor%
* =lcalides indlicos:
5m revelador utilizado o reagente de 0)rlic), que consiste na solu-'o de cloreto de p*dimetilaminobenzalde(do a 42 em etanol%
$esenvolve*se colora-'o laranHa a marrom%
;58riterpenos e ester2ides0
* = rea-'o de Liebermann*3urc)ard comumente empregada para a detec-'o de esterides e triterpenos, consistindo de anidrido
actico e cido sulf/rico concentrado%
* Bolora-'o que varia de azul ao verde%
* &ara a detec-'o de esterides insaturados, tambm pode ser empregada a rea-'o de 6alVo\sVZ cido sulf/rico concentrado)%
a$ 1aponinas0
* &ara detectar a presen-a de saponinas, emprega*se o teste de forma-'o de espuma, estvel na presen-a de cidos minerais dilu(dos%
($ /licosdeos cardiot<nicos0
* = detec-'o da presen-a de glicos(deos cardiotJnicos realizada atravs de uma rea-'o que caracteriza a existAncia do n/cleo
esteroidal Liebermann*3urc)ard), alm de outras que detectam a presen-a da lactona insaturada em B*1> e dos desoxi*a-/cares%
Fracionamento e Isolamento
Os processos de fracionamento de extratos vegetais com vistas ao isolamento de subst@ncias ativas podem ser monitorados por ensaios
direcionados para a avalia-'o de atividade biolgica%
9racionamento: o processo em que se consegue uma fra-'o parcialmente pura, ou seHa, obtm*se um grupo de subst@ncias%
.solamento: o processo em que se consegue uma subst@ncia ou composto puro%
=tualmente, o monitoramento tem sido feito por cromatografia l(quida de alta eficiAncia acoplada a espectrometria de massas
BL=0O0F) e resson@ncia magntica nuclear BL=0OEFP) %
0ssa combina-'o possibilita direcionar as opera-es de fracionamento para o isolamento de compostos considerados de maior
interesse em fun-'o dos dados espectrais%
&ara o fracionamento e isolamento das subst@ncias tAm*se dois grupos de mtodos que s'o mais comuns:
Partio por solventes: mais simples e barata, sendo utilizada para vrias finalidades%
M#todos cromatogr"icos: s'o mais variados, podendo ser utilizados para o fracionamento, purifica-'o e isolamento das subst@ncias%
Partio por solventes
D um processo muito antigo% $esde tempos remotos usado com diversas variantes para extrair, por exemplo, essAncias de flores%
Q mais de um sculo H vem sendo amplamente utilizada em diversos ramos +das ciAncias e das tecnologias,%
= parti-'o abrange uma gama de fenJmenos, que se estende desde a extra-'o de contaminantes metlicos por solventes em plantas, do
tratamento de efluentes industriais at a correla-'o do carter lipof(lico com as propriedades biolgicas de um determinado grupo de
subst@ncias%
D tambm con)ecida como extra-'o l(quido*l(quido%
D um mtodo mais simples, rpido e barato que os mtodos cromatogrficos convencionais%
5tiliza*se apenas um funil de separa-'o ou de decanta-'o) e os solventes apropriados para cada extra-'o%
&ode*se iniciar o fracionamento de um extrato vegetal atravs da parti-'o por solventes org@nicos de polaridade crescente ou atravs
da parti-'o cido*base%
= extra-'o l(quido*l(quido uma tcnica em que uma solu-'o aquosa ou )idroalcolica colocada em contato com um segundo
solvente org@nico imisc(vel com o primeiro solvente, a fim de colocar a transferAncia de um ou de mais de um soluto para o segundo
solvente%
0sse mtodo est baseado na propriedade f(sica da subst@ncia: a solubilidade%
= parti-'o implica numa dissolu-'o seletiva e distribui-'o entre as fases de dois solventes imisc(veis entre si%
= concentra-'o de cada um dos componentes em cada fase est relacionada com o coeficiente de parti-'o ou distribui-'o apresentado
por cada subst@ncia%
O coeficiente de parti-'o entre dois solventes imisc(veis entre si pode ser representado pela frmula% Vp] concentra-'o do soluto na
fase org@nicaOconcentra-'o do soluto na fase aquosa
= parti-'o utilizando*se mais de um solvente c)amada de extra-'o m/ltipla%
Os mel)ores rendimentos de extra-'o s'o obtidos quando o volume total de solvente a ser utilizado na parti-'o dividido em
al(quotas%
M#todos cromatogr"icos
6'o os procedimentos de separa-'o e isolamento mais amplamente utilizados atualmente%
.dentifica-'o e anlise de misturas e de subst@ncias isoladas: cromatogra"ia analtica%
.solamento de compostos: cromatogra"ia preparativa%
= cromatografia uma tcnica de separa-'o baseada na distribui-'o dos componentes de uma mistura entre um fluido fase mvel ou
eluente) e um adsorvente fase estacionria)%
= fase estacionria pode ser um slido ou um l(quido depositado num slido inerte, empacotado numa coluna aberta ou fec)ada) ou
espal)ado por uma superf(cie formando uma camada fina%
9ase estacionria: s(lica gel, alumina, poliamida% 9ase mvel eluente): solvente puro ou mistura de solventes%
= cromatografia de origem no termo grego chroma+graphein, gan)ou import@ncia como mtodo de separa-'o por volta de 1;#<,
com o bot@nico FiV)ail 6emenovic) Us\ett, nascido em =sti .tlia), sendo a sua fam(lia de origem russa%
$esenvolveu vrios trabal)os experimentais no dom(nio da separa-'o de extratos de plantas por adsor-'o diferencial em colunas%
Barbonato de clcio: fase estacionria
$issulfeto de carbono: eluente
Pestes experimentos, verificou*se a forma-'o de bandas de cores diferentes nas colunas utilizadas devido K adsor-'o diferencial dos
pigmentos corados, que migravam com velocidades diferentes e emergiam separadamente da coluna%
0ste investigador foi mais tarde considerado o pai da cromatografia devido K sua valiosa contribui-'o no desenvolvimento desta
tcnica%
= cromatografia tem in/meras aplica-es como mtodo de separa-'o%
= cromatogra"ia gasosa utilizada para separar componentes relativamente volteis como lcoois, cetonas, alde(dos e outros%
= cromatogra"ia lquida empregada normalmente para purificar produtos farmacAuticos, prote(nas, aminocidos, cidos nuclicos,
vitaminas e esterides%
C4A11IFICA=>? 9?1 P)?C11?1 C)?MA8?/)@FIC?1
= classifica-'o da cromatografia, segundo o modo de separao, leva em conta os princ(pios f(sicos e qu(micos na parti-'o dos
solutos entre as " fases%
a$Cromatogra"ia de adsoro0
=s separa-es ocorrem atravs de intera-es eletrostticas e for-as de Gan $er Yaals entre a fase estacionria slido) e os
componentes a separar da fase mvel l(quido ou gs)%
= natureza da fase estacionria pode ser muito diversa, s(lica gel, alumina ou celulose%
($ Cromatogra"ia de partio0
D baseada nas diferen-as de solubilidade dos componentes na fase estacionria l(quido) e na fase mvel l(quido)%
c$ Cromatogra"ia de permuta i<nica0
= separa-'o ocorre devido diferentes tendAncias dos componentes iJnicos ou ionizados permutarem com (ons da fase estacionria,
que, assim, s'o deslocados para a fase mvel%
= afinidade entre os (ons da fase mvel e o suporte pode ser controlada por altera-'o do pQ e da for-a iJnica do eluente%
d$ Cromatogra"ia de a"inidade0
Ocorre uma liga-'o molecular espec(fica e revers(vel entre o soluto e um ligante imobilizado na fase estacionria%
0sta tcnica utilizada especificamente para separar produtos biolgicos%
0x% liga-es enzimas*substratos, anticorpos com substratos e receptores de )ormJnios%
e$ Cromatogra"ia por e!cluso molecularA denominada tam(#m como "iltrao em gel ou separao por peneiras
moleculares0
6epara os componentes segundo o taman)o efetivo raio )idrodin@mico) das molculas%
Folculas grandes n'o penetram no interior do suporte part(culas porosas de gel) e movem*se mais rapidamente ao longo da coluna
de onde emergem primeiro%
=s molculas pequenas tAm a sua velocidade de deslocamento retardada porque penetram no gel, portanto, emergem da coluna mais
tardiamente%
= classifica-'o da cromatografia, segundo a nature:a da "ase m2vel, n'o leva em conta a fase estacionria%
a$Cromatogra"ia gasosa0
D uma tcnica que permite a separa-'o de subst@ncias volteis arrastadas por um gs atravs de uma fase estacionria%
= fase estacionria pode ser um slido ou um l(quido que propicia a distribui-'o dos componentes da mistura entre as duas fases
atravs de processos f(sicos e qu(micos, tais como a adsor-'o, diferen-as de solubilidade, volatilidade ou partil)a%
= fase mvel utilizado um gs, denominado gs de arraste, que transporta a amostra atravs da coluna cromatogrfica at ao
detector onde os componentes separados s'o detectados%
Os gases mais utilizados s'o o )idrogAnio, )lio e argJnio%
= cromatografia gasosa usada, em geral, para fins anal(ticos%
($ Cromatogra"ia lquida0
D uma tcnica adequada para a separa-'o dos componentes espcies iJnicas, macromolculas, constituintes termolbeis, ^) de
solu-es l(quidas e pode ser utilizada para fins anal(ticos, fins preparativos e em escala comercial%
= amostra inHetada na coluna usando uma micro*seringa na cromatografia anal(tica) ou uma vlvula de inHe-'o em sistemas
preparativos) e )omogeneamente distribu(da no topo da coluna%
= fase mvel transportando a amostra for-ada a passar atravs da coluna por uma a-'o externa, que pode ser:
= simples for-a da gravidade C cromatogra"ia de (ai!a presso5
5ma for-a mais intensa gerada por uma bomba B cromatogra"ia de alta presso tambm c)amada cromatogra"ia de alta
preciso &C4A$ de modo a superar a resistAncia da coluna ao escoamento da fase mvel%
Po processo de percola-'o os componentes os componentes migram com velocidades diferentes e s'o identificados K sa(da da
coluna num detector que fornece um registo cont(nuo da composi-'o da amostra analisada * cromatograma%
Os detectores mais usados s'o os fotomtricos 5G), de fluorescAncia C sens(veis a espcies que fluorescem * e os de (ndice de
refra-'o%