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UNIVERSIT DEGLI STUDI DI MILANO

Facolt di Scienze e Tecnologie


Corso di Laurea Magistrale in Biologia Molecolare della Cellula






Encefalopatia Spongiforme Bovina (BSE) induce il Misfolding
della Proteina Cellulare Prionica (PrP
C
) di addotte specie
resistenti ai prioni senza alterare le loro caratteristiche patologiche





Relazione di
XXXXXXXXX
Matricola n. XXXXXXXXX






ANNO ACCADEMICO 2013/2014
I. Introduzione

LEncefalopatia Spongiforme Bovina (BSE), anche conosciuta come Morbo o
Male della Mucca Pazza, una malattia cronica causata da un prione (dallinglese prion
= PRoteinaceus Infective ONly particle) che colpisce i bovini in maniera degenerativa e
irreversibile. Il prione una proteina che ha subito un processo denominato
misfolding (quando la proteina lascia la sua conformazione naturale) e forma un
isomero conformazionale che perde la funzione originale e a volte diventa tossica
allorganismo.
La BSE considerata una malattia di grande rilevanza sociale ed economica,
prima perch colpisce maggiormente un prodotto di grande importanza economica per
vari paesi, e poi perch questa malattia pu essere trasmessa in maniera naturale
alluomo ed agli altri animali domestici. Recentemente, la BSE stata comparata ad una
variante del Morbo di Cretzfeldt-Jacob che colpisce luomo.
Tuttavia, esistono alcune specie che, anche se sono esposte ai prioni da BSE,
non soccombono alla malattia, come le famiglie Canidae (cane, lupo) e Leporidae
(coniglio). Curiosamente, esiste un deficit di studi su queste specie rispetto alla
trasmissione naturale o sperimentale o sui meccanismi di resistenza al prione.
Altrimenti, la Proteina Cellulare Prionica (PrP
C
) di queste specie pu essere
misfoldata in vitro attraverso un processo chiamato PMCA (protein misfolding cyclic
amplification), il quale utilizza della sonicazione per indurre la formazione dei nuovi
prioni. Studi come questi sono importanti per prevedere il comportamento della BSE e
pu aiutare a stabilire la valutazione dei rischi nelle specie resistenti e anche nelluomo.
Obiettivo di questo lavoro in primo luogo analizzare le propriet biochimiche e
biologiche di nuovi prioni generati in vitro dopo il seeding dei cervelli di coniglio e di
cane omogeneizzati con la BSE classica.


II. Materiale e Metodi

Gli scienziati hanno prodotto i nuovi prioni per gli studi di replicazione prionica
in vitro utilizzando un campione omogeneizzato di cervello di bovino BSE-positivo
clinicamente affetto. Questo omogeneizzato stato mescolato con altri omogeneizzati di
cervello di coniglio e di cane per produrre i prioni in vitro via PMCA I prioni prodotti in
vitro (BSE-RaPrP
res
> coniglio; BSE-DoPrP
res
> cane) e i prioni dellomogeneizzato di
bovino BSE-positivo costituiscono prioni di primo passaggio. Parallelamente, per gli
studi di replicazione prionica in vivo, stato preparato un omogeneizzato di cervello di
topi inoculati con i prioni prodotti in vitro e con lomogeneizzato di cervello di bovino
BSE-positivo (lo stesso utilizzato per iniziare la reazione di PMCA). I prioni prodotti
dentro i topi inoculati costituiscono prioni di secondo passaggio. La caratterizzazione
biochimica dei prioni prodotti in vivo e in vitro stata fatta via Western Blotting.
Seguendo un protocollo specifico, con condizioni controllate di temperatura e
umidit, topi tgBov (che super-esprimono PrP
C
bovina) e tgHum (che super-esprimono
PNRP umana > metionina nel codon 129) sono stati inoculati secondo la seguente
tabella::

Modello Primo Passaggio Secondo Passaggio
tgBov
BSE-positivo BSE-positivo
BSE-RaPrP
res
BSE-RaPrP
res

BSE-DoPrP
res
BSE-DoPrP
res

BSE-negativo (controlle - ) -
tgHum
BSE-positivo -
BSE-RaPrP
res
-
BSE-DoPrP
res
-

I topi sono stati uccisi e vari tipi di analisi fatte, come limmunoistochimica e la
semiquantificazione delle lesioni istopatologiche.


III. Risultati

Sulla produzione dei prioni, gli scienziati hanno osservato che, prima di
presentare i campioni alla PMCA, non c stata una formazione significativa di prioni,
nonostante che la PrP
C
di coniglio presentasse una resistenza leggermente pi piccola
che la PrP
C
di cane.
Il risultato del Western Blotting ha confermato la produzione dei prioni dopo la
reazione di PMCA (BSE-RaPrP
res
> omogeneizzato di coniglio seeded da BSE-
positivo; BSE-DoPrP
res
> omogeneizzato di cane seeded da BSE-positivo; Cattle >
omogeneizzato dei topi inoculati con BSE-positivo; Scrapie > usato come riferimento
per determinare i diversi padroni elettroforetici; Control > omogeneizzato di cervello
bovino).


Sullanalisi con i topi, si pu dire che non c stata nessuna differenza
significativa nelle caratteristiche patobiologiche della BSE dopo la inoculazione nei topi
che super-esprimevano PrP
C
tra i prioni prodotti in vitro.
Il tempo di incubazione ha presentato una differenza significativa (diminuzione)
solo tra i topi BSE-RaPrP
res
e BSE-DoPrP
res
del primo passaggio e quelli del secondo
(riduzione pi accentuata tra i topi BSE-DoPrP
res
dei due gruppi).
I cervelli, quando analizzati nel microscopio, hanno presentato lesioni
spongiformi di vari misure in tutti i topi inoculati. Non c stata nessuna differenza a
questo punto tra primo e secondo passaggio. Nella figura seguente si pu vedere un
taglio istologico e la caratterizzazione istopatologica rivelando la PrP
d
nel secondo
passaggio. Il profilo delle lesioni molto simile.



Sui topi che portano il gene umano PRNP, linoculo BSE-positivo non ha
causato la malattia in nessun animale, come in accordo con altri dati gi pubblicati. L
inoculo BSE-DoPrP
res
ha presentato un risultato simile. Tuttavia, 2 animali in cui stato
inoculato la BSE-RaPrP
res
sono morti, presentando lesioni spongiformi e deposito di
PrP
d
come si pu vedere nell immagine seguente. Negli altri topi le lesioni erano
minime e si erano confuse con lesioni naturali dovute allet avanzata.





IV. Discussione

Le malattie prioniche sono conosciute da molto tempo, sia che influenzino
luomo direttamente o indirettamente. Il riconoscimento che la BSE sia una malattia che
si trasmette tra varie specie ha indicato le malattie prioniche come un grande problema
economico e di salute pubblica. Grandi quantit di soldi sono stati spesi in vari paesi sia
per eliminare gli animali malati, sia per cambiamenti radicali nelle politiche di controllo
delle malattie.
Tutti questi studi fatti sullesistenza naturale dei prioni non bastano per capire il
comportamento di queste proteine in determinate specie. La comunit scientifica
frenata dal fare qualsiasi affermazione sulla suscettibilit di un ospite ai vari prioni,
visto che non si pu affermare, ad esempio, che il cane sia resistente a tutti i tipi di
prioni.
Secondo gli autori, la BSE stata scelta per la sua propriet zoonotica e perch il
lignaggio del prione relativamente promiscuo e dimostra una infettivit in molte
specie.
Nei risultati, la PrP
C
del coniglio ha dimostrato una facilit notevole per cambiare la sua
conformazione, assumendo la forma prionica, La PrP
C
del cane invece ha dimostrato
una resistenza maggiore, suggerendo una immunit forte di questa specie alla BSE.
Il confronto tra il lignaggio BSE-positivo puro e i prioni prodotti in vitro ci
permette di dire che le propriet biochimiche del prione non cambiano nelle diverse
specie, per stato necessario lo studio in vivo per conferire sulle propriet
patobiologiche. Il topo che esprime il gene PRNP stato un modello chiave per dire che
la BSE aveva un comportamento diverso sul periodo di incubazione anche se manteneva
uguali altre caratteristiche, come il profilo di Western Blotting, massa molecolare, ecc. I
dati mostrano anche che la difficolt per ottenere la produzione dei prioni non interviene
sulla sua attivit patobiologica, come si vede nel caso del cane.
I risultati ottenuti con la BSE non permettono di inferire sul comportamento di
altri prioni adattati alle queste specie, ma si pu affermare che se la BSE infettasse un
cane o un coniglio, manterrebbe le sue caratteristiche patobiologiche, anche come un
suo potenziale zoonotico.

V. Riferimento

Questa relazione focalizzata sullarticolo intitolato Bovine Spongiform
Encephalopathy Induces Misfolding of Alleged Prion-Resistant Species Cellular Prion
Protein without Altering Its Pathological Features, di Vidal et al.